CN1193023A

CN1193023A - 硫酸酯化箬叶多糖及其制备方法

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Publication number: CN1193023A
Application number: CN98101638A
Authority: CN
Inventors: 陈春英; 蒋岩; 周井炎; 邵一鸣; 徐辉碧; 张辉; 裴丽健
Original assignee: CHINESE PREVENTIVE MEDICINE ACADEMY
Current assignee: CHINESE PREVENTIVE MEDICINE ACADEMY
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 1998-09-16
Anticipated expiration: 2018-04-24
Also published as: CN1067405C

Abstract

本发明公开了一种由主体结构为α(1→3)－D－木糖和β(1→6)－D－半乳糖构成的箬叶多糖经硫酸酯化后的产物。该酯化的多糖可保护MT－4细胞免受人免疫缺陷病毒1型(HIV－1),即艾滋病病毒感染,可以有效保护受病毒感染的细胞,使其不发生病变,抑制感染细胞中病毒的复制。同时,本发明还公开了制备上述硫酸酯化箬叶多糖的方法,该方法通过箬叶多糖的无水甲酰胺或吡啶溶液,以吡啶－N－磺酸为硫酸酯化试剂,由SO₃取代箬叶多糖羟基中的H,而得到硫酸酯化箬叶多糖,方法简单,原料易得,生产成本低,具有广阔的工业开发前景。

Description

硫酸酯化箬叶多糖及其制备方法

本发明涉及一种具有抗艾滋病病毒(HIV)活性的多糖及其制备方法，确切的是涉及一种硫酸酯化箬叶多糖及其制备方法。

多糖在医药上作为免疫调节剂用来治疗肿瘤、肝炎，具有降血脂、抗血栓、抗消化溃疡、降血糖、诱导干扰素的产生、促进造血功能恢复以及促进蛋白质和核酸的生物合成等方面的生物活性等功能是已知的。

多糖的来源很广，但对不同类型的竹叶多糖药理活性的研究主要集中在我国和日本。自六十年代以来，日本学者对竹叶(Sasaalbomarginata Makino et Shibata)多糖提取液进行了大量的药理活性研究，其提取液的主要成分为多糖、叶绿素、木质素及矿物质等(Nakahara W等，GANN，1964 55卷，第283-288页；Kuboyama N等，Folia pharmacol.Japan，1981，77卷，第579-596页；Ohizumi T等J.of Medical Society of Japan，1986，49卷，第315-321页；Shibata M等，Folia pharmacol.Japan，1975，71卷，第481-490页)。该提取液对动物移植性实体型肿瘤具有显著的抑制作用，并且还发现具有良好的抗炎症、抗溃疡、增强食欲及抗痉挛作用。此外，对急性病毒性肝炎患者有较好的疗效。日本将竹叶和芦荟提取液加工成一种保健饮料，并申请了专利(JP05,184,339)。

根据联合国公布的数字(96年)表明，在过去15年中，已有近600万人死于艾滋病。目前，世界上有近2790万人患上艾滋病或感染病毒，其中大部分集中在医疗条件较差的亚洲和非洲。世界上每天平均有8500人感染上艾滋病病毒。我国截止至1997年10月已有艾滋病病毒(HIV)感染者8303例，艾滋病人209例，估计实际感染数会超过报告数字的10倍。如不及时加以控制和治疗，结果将不堪设想。

目前，世界上还没有治疗艾滋病的理想的特异性药物。迄今，通过美国医药管理局(FDA)批准，且在国际上应用较广的药品有两类：一类是逆转录酶抑制剂，主要有叠氮胸苷(AZT)、双脱氧次黄苷(ddI)及双脱氧胞苷(ddC)及D₄T，另一类是HIV蛋白酶抑制剂，这两类药物可以延缓疾病发展及死亡，但不能根治。由于这些药物的副作用较大，易产生耐药性，且价格昂贵(大于5000美元/年/人)，所以不适合于长期、大量临床应用，特别是在广大的发展中国家(感染者占全球的90％以上)，不具有实用价值。

近年来，国外有报道表明硫酸酯化多糖具有抗艾滋病病毒作用而引起人们的广泛重视。目前，许多经硫酸酯化的多糖，如香菇多糖、地衣多糖、古旋糖酐、裂褶多糖、木聚糖等的硫酸酯具有明显的体外抑制HIV-1的作用。Yoshida等人在体外培养人T淋巴细胞株MT-4的实验结果表明，未经硫酸酯化的香菇多糖和产碱杆菌多糖在500μg/ml浓度下几乎对HIV-1没有抑制作用，MT-4细胞感染HIV-1的阳性率大于90％。而硫酸酯化多糖在10μg/ml浓度以上时，可完全保护MT-4细胞免受HIV-1感染(Yoshida O.等，BiochemicalPharmacology，1988，37卷，第2887-2981页)。日本Ajinomoto公司开发的Curdlan硫酸酯(CRDS)是以1-3-β-D-葡萄糖为主链，硫含量为14.1％的硫酸酯多糖，已进入I期临床试验，能很好地为病人所耐受(Gordon M.等，J.Medicine，1995，26卷，第97-131页)。但是仍存在许多缺陷，如增加p24抗原的产生等副作用，从而限制了其使用。

因此，寻找用于制备新的、有效的、毒性小及成本低的抗HIV-I药物的化学物质，成为人们所关注的问题。

本发明的目的是为了提供一种具有有效抗艾滋病毒活性并且毒性小的硫酸酯化多糖以用于制备抗HIV-I的药物。

本发明的另一目的是提供一种制备上述硫酸酯化多糖的工艺方法，以便能大量、简易、低成本地生产上述产物。

本申请的发明人，经过长期试验研究，达到了上述目的。提供了一种具有有效抗艾滋病病毒活性，且毒性很小的硫酸酯化箬叶多糖。

本发明的硫酸酯化箬叶多糖是由箬叶多糖经硫酸酯化后得到的。箬叶多糖是由禾本科植物箬竹(Indocalamus tesselatus(Munro)Keng f.)的叶中制备，该植物在我国主要分布在长江流域等地。箬叶的功用治清热止血，解毒消肿，《本草纲目》记载：箬叶″甘寒，无毒″，″主治男女吐血、衄血、呕血、咯血、下血。又通小便，利肺气，喉痛，消痈肿″。

本发明的硫酸酯化箬叶多糖是由主体结构为α(1→3)-D-木糖和β(1→6)-D-半乳糖构成的箬叶多糖经硫酸酯化后的产物，其主体结构如下：

其中R为H或SO₃ ^-n为115

本发明硫酸酯化箬叶多糖经高效凝胶渗透色谱法(HPLC-GPC)测得多糖每个单糖单位的羟基被硫酸根取代度(DS)为0.16-2.88，较佳为1.0-2.0，含硫量为2.8-20.1％(重量)，较佳为10.0-17.0％(重量)。

本发明产物的分子量在反应中多糖未发生降解及交联聚合情况下，随含硫量不同而有变化。如含硫量为9.6％(重量)时，测得重均分子量Mw为24.4万，数均分子量Mn为11.1万，当含硫量为15.5％(重量)时，测得重均分子量Mw为30.4万，数均分子量Mn为14.5万，因此，分子量可以由含硫量计算得出。

表1列出了本发明硫酸酯化箬叶多糖的性质。

表1硫酸酯化箬叶多糖的性质化合物元素分析(％) 分子量比旋光度粘度

GPC Mw Mn Mw/mn (H₂O，/cm³·g^-1

C H S (×10^-4) 0.5％)箬叶多糖 37.39 6.11 17.4 20.0 8.5 2.55 -43.0 8.0硫酸酯化箬叶多糖 26.62 4.49 9.6 17.4 24.4 11.1 2.20 -43.2 8.3硫酸酯化箬叶多糖 27.43 5.07 15.5 17.4 30.4 14.5 2.10 -44.0 17.6红外光谱(KBr，cm^-1)3370(O-H)，1650，1420，1240(S＝0)，1050，820(c-o-s)，890(吡喃环)。

本发明硫酸酯化箬叶多糖对艾滋病病毒的抑制结果如下，在HIV-1/MT4培养系中箬叶多糖的细胞毒性浓度为5mg/ml，硫酸酯化箬叶多糖为2.5mg/ml，对细胞毒性小。病毒吸附抑制实验的结果表明：没有硫酸酯化的箬叶多糖在较高浓度，即0.32mg/ml时，可抑制HIV导致的细胞病变(如表2所示)。硫酸酯化后的箬叶多糖在10μg/ml以上可完全保护MT4细胞免受HIV的感染，有效率可提高32倍。在感染细胞抑制实验中，没有硫酸酯化的箬叶多糖，不能抑制感染细胞中病毒的复制(资料未列出)，硫酸酯化后的箬叶多糖可以有效地保护受HIV-1攻击的细胞，使其不发生病变，有效地抑制感染细胞中病毒的复制(表3)，使病毒的感染滴度下降2-3个对数(表4)。量效实验表明它的抗病毒作用与剂量呈正相关关系(表5)。

初步体内毒性实验结果表明：在剂量1g/kg体重/d，箬叶多糖表现出毒性较低，死亡率较小，小鼠可耐受，但伴随有毒性反应，给药后小鼠不活泼，毛发光泽度下降，少数便稀。硫酸酯化箬叶多糖毒性较大，灌胃组死亡一半(表5)。在低剂量100mg/kg体重/d(箬叶多糖)和50mg/kg体重/d(硫酸酯化箬叶多糖)，两种物质连续给药28天均没有毒性反应。

上述本发明的硫酸酯化箬叶多糖与已知的硫酸酯化多糖不同，已知的硫酸酯化多糖主要是抑制游离病毒向细胞吸咐，对感染细胞内的病毒复制没有明显的抑制作用。而在HIV感染者及艾滋病病人体内99％的病毒存在于细胞内。因此，治疗药物的靶标必须是感染细胞。本发明的硫酸酯化箬叶多糖的最大优点在于既可以抑制病毒的吸附，又可以控制感染细胞中病毒的复制，因而将本发明的化合物用于制备新的、有效的、毒性小而成本低的抗HIV-1药物，具有良好的开发与应用前景。

此外，本申请还提供了一种专门用于制备上述硫酸酯化箬叶多糖的方法，该方法将由天然箬叶中提取的箬叶多糖作为原料，在无水甲酰胺或吡啶中，以吡啶-N-磺酸为硫酸酯化试剂进行酯化反应得到硫酸酯化箬叶多糖产物。该方法的具体工艺如下；

将固体箬叶多糖以1∶50重量比溶解于无水甲酰胺或吡啶中，以硫酸酯化试剂和每个单糖单位为1-14∶1的摩尔比在搅拌下滴入硫酸酯化试剂吡啶-N-磺酸中，室温搅拌下反应2-4小时后，继续于45-100℃加热反应1-8小时，反应结束冷却后加1-2倍体积水稀释，再用2.5mol/L NaOH水溶液中和至pH＝8.0，然后将该混合物用透析袋(截留分子量为10000)经自来水透析三天，蒸馏水透析一天，袋内未透过液经冷冻干燥得浅黄色固体粉和产物硫酸酯化箬叶多糖。上述方法中，反应时的pH值由所用硫酸酯化剂的量所决定，通常为1-5，当硫酸酯化试剂比例较高，酸度大(pH＜1)，温度较高时，多糖易被氧化、分解，产物颜色加深而变成红褐色，但羟基取代度高(DS＝2.88)，大部分OH均被硫酸酯化。若硫酸酯化试剂比例太低，产率较高，但取代度低(DS＝0.16).采用反应温度45℃可得到较佳的结果。

上述方法中所述的吡啶-N-磺酸，是通过在三颈瓶中，在冰浴上剧烈搅拌下，按1-3∶1的体积比将氯磺酸滴入到吡啶中得到，此时有大量HCl释放，瓶中有白色固体硫酸酯化试剂即吡啶-N-磺酸。

上述方法中所述的箬叶多糖，其制备工艺如下：

将干箬叶捣碎后在乙酸乙酯中浸泡过夜，以去除表面脂质，分离掉乙酸乙酯后，洗尽UY晾干，加入5％(重量)NaOH(含0.05％(重量)NaBH₄)溶液在N₂保护下加热至60℃提取，保持3小时，然后离心分离，提取液用冰乙酸中和再次离心分离浓缩上清液，加入乙醇沉淀多糖，放置4小时后，离心得棕黑色粗多糖，再溶于少量蒸馏水，用浓氨水调pH＝8.0于40-50℃搅拌下滴入20％H₂O₂脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7.0，用Savag方法(氯仿∶戊醇为4∶1混和振荡)等体积萃取除去蛋白质，浓缩至小体积，置于透析袋(截留分子量为10000)中，用自来水透析3天，蒸馏水透析一天，经冷冻干燥得淡黄色箬叶多糖。经测定，其重均分子量Mw为20万，数均分子量Mn为8.5万。

由于箬叶中多糖多以半纤维素形式存在，本发明采用NaOH水溶液提取，产率可大大提高。在提取过程中，采用还原剂NaBH₄及N₂气保护，短时间进行提取，从而有效地避免了多糖的降解。

采用H₂O₂在温和条件下进行脱色，改进了常规的采用活性炭、离子变换柱等方法脱色，避免了这两种方法中吸附性大、产率低、脱色效果不理想等缺点。

本发明所用箬叶来源于我国鄂西恩施地区，原料采集容易，每年平均可大量采集。本发明工艺方法较为简单，所采用的化学试剂价格低廉，不用特殊设备，生产成本低，有利于工业进一步开发利用。

以下的实施例进一步说明了本发明的产品及方法，其中所用的试剂除有特殊说明外，均为一般化学纯试剂，所用百分数均为重量百分数。

实施例1

取干箬叶500g(含水量小于1重量％)捣碎，用500ml乙酸乙酯浸泡过液，以除去表面脂质。除去乙酸乙酯后，洗尽晾干。加入5％NaOH(含0.05％NaBH₄)溶液1L提取，在N₂气保护下，加热至60℃，保持3小时。3000rpm离心10分钟，分离提取液和残渣，提取液用冰乙酸中和。再次3000rpm离心10分钟，分离得沉淀及上清液，将上清液浓缩至100-150ml，加入4倍体积95％乙醇沉淀多糖，放置4小时后，离心得棕黑色粗多粗多糖。再溶于少量蒸馏水，用浓氨水调pH＝8，于50℃搅拌下滴入20％H₂O₂脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7。用Savag方法(氯仿二戊醇为4∶1，混和振荡)等体积萃取蛋白质5次以后，直至紫外光谱检测无蛋白质(280nm)和核酸(260nm)等杂质吸收峰。浓缩至小体积，置于透析袋(截留分子量为10000，Sigma公司)中，用自来水透析3天，蒸馏水透析1天，除去无机盐及低分子杂质。袋内未透过液经冷冻干燥，得淡黄色箬叶多糖2.22g(产率0.444％)。

实施例2

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将1.0ml氯磺酸缓慢滴入到1.0ml吡啶中，有大量白色HCl释放，瓶中有白色固体吡啶-N-磺酸生成，反应约30-40min。在冰浴下可保存一周。

(2)称取100mg箬叶多糖，溶解于5ml无水甲酰胺中，搅拌下滴加(1)中，100℃反应1小时。反应结束，冷却后加10ml H₂O和7.5ml 2.5mol/L NaOH中和调pH＝8.0。该混合物用透析袋(截留分子量为10,000)对自来水透析3天，蒸馏水透析1天，袋内未透过液经冷冻干燥后即得红褐色固体粉末产物，32.5mg硫酸酯箬叶多糖。含S20.1％，每个单糖单位的的羟基取代度(DS)为2.88，即糖链上的自由羟基大部分被硫酸根基团所取代。

实施例3

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将0.21ml氯碘酸缓慢滴入到0.1ml吡啶中，有大量白色HCl释放，瓶中有白色固体生成，反应约10min。

(2)称取100mg箬叶多糖，溶解于10ml无水吡啶中，搅拌下滴加(1)中，室温反应2.5小时，45℃反应2小时。反应结束，同实施例1中(2)处理得浅黄色固体粉末产物122.5mg硫酸酯多糖，含S9.6％，DS为0.72。

实施例4

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将0.3ml氯磺酸缓慢滴入到0.1ml吡啶中，有大量白色HCl释放，瓶中有白色固体生成，反应约15min。在冰浴下可保存一周。

(2)称取100mg箬叶多糖，溶解于5ml无水甲酰胺中，搅拌下滴加(1)中，室温反应2.5小时，45℃反应2小时。反应结束，同实施例1中(2)处理得浅黄色固体粉末产物32.2mg硫酸酯多糖，含S13.9％，DS为1.27。实施例5

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将2.1ml氯磺酸缓慢滴入到1ml吡啶中，有大量白色HCl释放，瓶中有白色固体生成。

(2)称取1g箬叶多糖，溶解于50ml无水甲酰胺中，搅拌下滴加(1)中，室温反应2.5小时，60℃反应4小时。反应结束，同实施例中(2)处理得浅黄色固体粉末产物740mg硫酸酯多糖，含S15.5％，DS为1.57。实施例6

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将5ml氯磺酸缓慢滴入到2.5ml吡啶中，有大量白色HCl释放，瓶中有白色固体生成。

(2)称取2.57g箬叶多糖，溶解于125ml无水甲酰胺中，搅拌下滴加(1)中，室温反应2.5小时，60℃反应4小时.反应结束，同实施例1中(2)处理得浅黄色固体粉末产物2.41g硫酸酯多糖，含S 13.6％，DS为1.23。实施例7

(1)在三颈瓶中，在冰浴剧烈搅拌下将2.1ml氯磺酸缓慢滴入1ml吡啶中，有大量白色HCI释放，瓶中有白色固体生成。

(2)称取1g箬叶多糖，溶于20ml无水吡啶中，搅拌下滴加(1)中，室温反应8小时。反应结束，同实施例1中(2)处理得浅黄色固体粉末产物847mg硫酸酯多糖，含S 2.8％，DS为0.16。

对本发明的硫酸酯化箬叶多糖产物进行了抗病毒活性试验，以下列出了试验的实例，其中所用的硫酸酯化箬叶多糖均是含硫量为15.5％(重量)，取代度(DS)为1.57。

例1

(1)以HIV-1病毒引起的MT4细胞病变(CPE)作为评价药效的指标。在96孔微量培养板中将药物以RPMI-1640培养液作2倍系列稀释，每孔100μl，每个浓度平行3孔。同时设细胞以及病毒对照，分别加入RPMI-1640培养液150μl及100μl。然后加入50μl 200TCID₅₀病毒液(细胞对照除外)及50μl细胞。37℃，5％CO₂条件下培养。6天后观察CPE。实验重复3次。

(2)药物对细胞毒性；将被检药物在96孔微量培养板中以RPMI-1-1640培养作2倍系列稀释，每孔100μl，每个浓度各3孔；然后加入100μl MT-4细胞。37℃培养6天后，以台盼蓝染色法计数活细胞数。细胞数低于正常对照组的75％被认为显示细胞毒性。将导致细胞毒性的最小药物浓度作为毒性浓度。结果见表2。表2.箬叶多糖对HIV-1感染MT4细胞的抑制作用

化合物细胞毒性浓度有效抑制浓度

(mg/ml) (mg/ml)

箬叶多糖 5 0.32硫酸酯化箬叶多糖 2.5 0.010例2

以HIV-1(200 TCID₅₀)接种于MT-4细胞(1×10⁶/ml)，37℃孵育1小时，洗净后，将细胞接种于96孔微量培养板(含硫酸酯化箬叶多糖：625μg/ml)。6天后，观察细胞病变，收集培养上清，测定p24抗原及细胞存活率。实验1-4同时设对照组，细胞病变均为+，细胞存活率小于30％，p24抗原抑制率为0。结果见表3。

表3.硫酯酯化箬叶多糖对HIV感染的MT-4细胞的保护作用和抑制病毒复制的作用

细胞病变细胞存活率1(％) p24抗原抑制率(％)对照组 + ＜30 0实验1 - 131.4 未做实验2 - 100.5 未做实验3 - 118.0 78.5实验4 - 105.0 84.4

例3

以HIV-1(200 TCID₅₀)接种于MT-4细胞(1×10⁶/ml)，37℃孵育1小时，洗净后，将细胞接种于96孔微量培养板(板内含有硫酸酯化箬叶多糖：10或160μg/ml)。培养一周，每三天换液1次(液体中含有初始浓度的药物)，收集培养上清，将其再接种于MT-4细胞，培养一周，观察细胞病变，计算TCID₅₀。结果见表4。

表4.硫酸酯化箬叶多糖可以使病毒的感染滴度下降2-3个对数

硫酸酯化箬叶多糖(μg/ml) TCID₅₀

160 10¹

10 10²

0 10⁴例4

以HIV-1(200 TCID₅₀)接种于MT-4细胞(1×10⁶/ml)，37℃孵育1小时，洗净以后，将细胞接种于96孔微量培养板(板内含有不同浓度的药物)。培养6天，收集上清，测定p24抗原及细胞存活率(表5)。表5.硫酸酯化箬叶多糖对感染细胞的保护作用和对病毒复制的抑制

作用与剂量呈正相关关系硫酸酯化箬叶多糖(μg/ml) 细胞存活率(％) p24抗原抑制率(％)

0 10 0

0.6 20 0

2.5 35 0

10 50 30

40 70 45

156 90 55

625 100 78例5

药物体内毒性实验

(1)取C57BL/6雌性小鼠30只，随机分为3组，每组10只，用药物观察7天，采用灌胃给药方式。设正常对照组及药物组，正常对照组给等量生理盐水。每只0.5ml，剂量1g/kg/d，连续7天。观察动物在实验前、后的体重变化，活动能力、毛发光泽及粪便状况，计算存活率(表6)。

(2)取C57BL/6雌性小鼠50只，随机分为5组，每组10只。用药物观察7天，采用灌胃和腹腔注射两种给药方式。设正常对照组及药物组，正常对照组给等量生理盐水。每只0.5ml，剂量50-100ml/kg/d，连续28天。观察动物在实验前、后的体重变化，活动能力、毛发光泽及粪便状况，计算存活率(表6)。表6.箬叶多糖及硫酸酯化箬叶多糖对C57BL/6J小鼠的毒性实验结果

分组剂量给药方式小鼠数量死亡率存活率

mg/kg/d 实验前实验后 Death Survival(％)

对照组灌胃 10 10 0 100箬叶多糖 1000 灌胃 10 8 2 80硫酸酯化箬叶多糖 1000 灌胃 10 5 5 50

对照组灌胃 10 10 0 100箬叶多糖 100 灌胃 10 10 0 100硫酸酯化箬叶多糖 50 灌胃 10 10 0 100

对照组腹腔注射 10 10 0 100箬叶多糖 100 腹腔注射 10 10 0 100硫酸酯化箬叶多糖 50 腹深注射 10 10 0 100

Claims

1、一种硫酸酯化箬叶多糖，所述多糖是由主体结构为α(1→3)-D-木糖和β(1→6)-D-半乳糖构成的箬叶多糖经硫酸酯化后的产物，其主体结构如下：

其中R为H或SO₃ ^-n为115

2、权利要求1所述的硫酸酯化箬叶多糖，其特征在于所述多糖每个单糖单位的羟基被硫酸根取代度为0.16-2.88，含硫量为2.8-20.1％(重量)。

3、权利要求1所述的硫酸酯化箬叶多糖，其特征在于所述多糖每个单糖单位的羟基被硫酸根取代度为1.0-2.0，含硫量为10.0-17.0％(重量)。

4、一种制备权利要求1所述硫酸酯化箬叶多糖的方法，其特征在于所述方法包括如下工艺步骤：

将固体箬叶多糖溶解于无水甲酰胺或吡啶中，以硫酸酯化试剂和每个单糖单位为1-14∶1的摩尔比在搅拌下滴入硫酸酯化试剂吡啶-N-磺酸中，室温搅拌下反应2-4小时后，继续于45-100℃加热反应1-8小时，反应结束冷却后加水稀释，再用NaOH水溶液中和至pH＝8.0，然后将该混合物用透析袋经自来水透析三天，蒸馏水透析一天，袋内未透过液经冷冻干燥即得本发明产物。

5、权利要求4所述的方法，其特征在于所述固体箬叶多糖是由以下方法制得：

将干箬叶捣碎后在乙酸乙酯中浸泡过夜，分离掉乙酸乙酯后加入5％(重量)NaOH(含0.05％(重量)NaBH₄)溶液在N₂气保护下加热至60℃提取，然后离心分离，提取液用冰乙酸中和后再次离心分离，浓缩上清液，加入乙醇沉淀多糖，放置4小时后，离心得棕黑色粗多糖，再溶于少量蒸馏水，用氨水调pH＝8.0，于40-50℃搅拌下滴入20％H₂O₂脱色，然后用稀HCl中和至pH＝7.0，用Savag(氯仿∶戊醇为4∶1混和振荡)等体积萃取除去蛋白质后浓缩至小体积，置于透析袋中，用自来水透析3天，蒸馏水透析1天，经冷冻干燥得到纯箬叶多糖产物。

6、权利要求4所述的方法，其特征在于所述硫酸酯化试剂吡啶-N-磺酸是由以下方法制得：

在三颈瓶中，在冰浴上剧烈搅拌下，按1-3∶1的体积比将氯磺酸滴入到吡啶中，此时有大量HCl释放，瓶中有白色固体即吡啶-N-磺酸。

7、权利要求4所述的方法，其特征在于所述固体箬叶多糖溶于无水甲酰胺或吡啶的重量比为1∶50。

8、权利要求4所述的方法，其特征在于在所述室温下反应2-4小时后，继续反应时加热温度为45℃。