CN118291298A - 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用 - Google Patents

一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118291298A
CN118291298A CN202310011354.5A CN202310011354A CN118291298A CN 118291298 A CN118291298 A CN 118291298A CN 202310011354 A CN202310011354 A CN 202310011354A CN 118291298 A CN118291298 A CN 118291298A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactobacillus paracasei
formulation
liver
preparation
alcohol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310011354.5A
Other languages
English (en)
Inventor
舒希
张凤
王静
张真
邓雅丹
李婉竹
陈祖国
赵丽娟
谷名育
江远智
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd
Original Assignee
Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd filed Critical Chongqing Tianyou Dairy Co Ltd
Priority to CN202310011354.5A priority Critical patent/CN118291298A/zh
Priority to NL2035211A priority patent/NL2035211B1/en
Publication of CN118291298A publication Critical patent/CN118291298A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精性内脏损伤制剂中的应用。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24630。该副干酪乳杆菌能够显著增强酒精性肝损伤小鼠肝脏的抗氧化能力、预防酒精导致的肝损伤、恢复肝脏组织结构以及显著增强胃组织抗氧化能力、预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应和恢复胃黏膜的形态，从而达到缓解酒精性内脏损伤的目的；并且无副作用，安全性高。

Description

一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用。
背景技术
乙醇是中国白酒的和酒精饮料的主要成份，而肝脏是负责代谢乙醇的主要器官，绝大多数酒精在肝脏中分解代谢，会加速甘油三酯的形成，从而导致氧自由基的大量合成及脂肪沉积引发脂质过氧化反应，脂质过氧化反应是导致肝损伤的重要原因。另外，乙醇代谢的主要途径是转化为乙醛，当摄入过量酒精时，乙醇还可以通过激活CYP2E1并被其氧化，产生大量的活性氧ROS，对肝细胞造成氧化应激损伤；并且乙醇的代谢产物乙醛和ROS具有很高的毒性，能与生物大分子发生反应，导致细胞损伤；若细胞死亡后还可激活巨噬细胞和中性粒细胞，诱导炎症发生，进一步导致肝脏受到损害。
此外，由于乙醇其脂溶性的特点，从而非常容易导致胃损伤，所以酒精滥用可以导致严重的胃黏膜腐蚀，甚至引起胃损伤和萎缩性胃炎。高浓度的白酒甚至可以直接侵蚀胃黏膜。除此之外，在乙醇体内代谢过程中，中性粒细胞释放氧自由基导致内皮细胞损伤，这种环境抑制了胃损伤的修复，通过呼吸作用中性粒细胞继续产生大量氧自由基，形成一个恶性循环，引起血管壁破裂，进而引发胃溃疡和胃出血。所以，饮酒过量或饮酒不当会造成乙醇在体内代谢产生许多有害物质及大量自由基，给人体造成很大伤害，尤其是酒精性肝损伤和胃损伤。
目前，对酒精性肝损伤和胃损伤的预防和治疗的方法主要是戒酒、化学合成物辅助治疗和天然提取物辅助治疗等，但是现目前市面上现有的一些酒精性肝损伤和胃损伤的预防和治疗药物，尤其是化学合成物药物，其虽然有一定的功效，但是同时也会伴随着不同的副作用，对人体健康不利。因此，一种安全性高的预防和治疗酒精性肝损伤和胃损伤的产品是有必要的。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，可以作为或应用在一种安全性高的预防和治疗酒酒精性内脏损伤的产品中，其是从西藏拉萨牦牛酸乳分离得到，能够显著增强酒精性肝损伤小鼠肝脏的抗氧化能力，预防酒精导致的肝损伤，恢复肝脏组织结构；而且还可以显著增强胃组织抗氧化能力，预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应，恢复胃黏膜的形态，从而缓解酒精性内脏损伤。
为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24630。
本发明另一方面提供一种组合物，包括以下物质中的一种或多种组合：(a)上述的副干酪乳杆菌；(b)上述的副干酪乳杆菌的裂解物；(c)上述的副干酪乳杆菌的培养物；(d)上述的副干酪乳杆菌的发酵液。
本发明再一方面提供一种制剂，其包括上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物，以及载体；其中，载体为可药用载体或可食用载体。
本发明再一方面提供一种上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于缓解酒精内脏损伤制剂中的应用。
本发明再一方面提供一种上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于防醉和/或解酒的制剂中的应用。
本发明中的副干酪乳杆菌保藏信息如下：保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2022年04月01日；保藏编号：CGMCC No.24630；分类命名：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。
本发明有益效果包括：
(1)本发明提供的副干酪乳杆菌能够显著增强酒精性肝损伤小鼠肝脏的抗氧化能力、预防酒精导致的肝损伤、恢复肝脏组织结构以及显著增强胃组织抗氧化能力、预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应和恢复胃黏膜的形态，从而达到缓解酒精性内脏损伤的目的；并且无副作用，安全性高。
(2)本发明提供的副干酪乳杆菌能够显著延长机体醉酒时间和缩短醒酒时间，有效达到防醉和解酒的目的。
附图说明
图1为TY-W09的菌落形态；
图2为TY-W09的革兰氏染色结果；
图3为TY-W09的细胞粘附图；
图4为TY-W09对小鼠醉酒时间的影响；
图5为TY-W09对小鼠醒酒时间的影响；
图6为TY-W09对小鼠肝脏系数的影响；
图7为小鼠肝脏组织的HE染色；
图8为TY-W09对小鼠血清ALT活性的影响；
图9为TY-W09对小鼠血清AST活性的影响；
图10为TY-W09对小鼠血清TG含量的影响；
图11为TY-W09对小鼠血清TC含量的影响；
图12为TY-W09对小鼠肝脏中GSH含量的影响；
图13为TY-W09对小鼠肝脏中SOD活性的影响；
图14为TY-W09对小鼠肝脏中MDA含量的影响；
图15为TY-W09对小鼠肝脏中NRF2 mRNA相对表达量的影响；
图16为TY-W09对小鼠肝脏中HO-1mRNA相对表达量的影响；
图17为TY-W09对小鼠肝脏中CYP2E1 mRNA相对表达量的影响；
图18为蛋白条带图；
图19为TY-W09对小鼠肝脏中NRF2蛋白相对表达量的影响；
图20为TY-W09对小鼠肝脏中HO-1蛋白相对表达量的影响；
图21为TY-W09对小鼠肝脏中CYP2E1蛋白相对表达量的影响；
图22为小鼠胃组织的外观观察图；
图23为小鼠的胃黏膜损伤指数；
图24为TY-W09对小鼠胃组织中GSH含量的影响；
图25为TY-W09对小鼠胃组织中SOD活性的影响；
图26为TY-W09对小鼠胃组织中IL-6含量的影响；
图27为TY-W09对小鼠胃组织中IL-1β含量的影响；
图28为TY-W09对小鼠胃组织中TNF-α含量的影响；
上述图中，标有“*”代表两组之间存在统计学差异(p<0.05)，标有“**”代表两组之间存在统计学差异(p<0.01)，标有“***”代表两组之间存在统计学差异(p<0.001)，标有“****”代表两组之间存在统计学差异(p<0.0001)。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明中，副干酪乳杆菌也称副干酪乳杆菌TY-W09或TY-W09。
本发明中，术语“制剂”不仅仅是药用的药物制剂，也包括可食用的食物制剂或者保健品制剂。
本发明实施例提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24630。
需要说明的是，上述副干酪乳杆菌来源于西藏拉萨牦牛酸乳中，经革兰氏染色结果检测，其形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G+)；并且通过PCR扩增16S rDNA序列，测得其16SrDNA序列包含如SEQ ID NO.1所示序列，并进行同源性分析得，该菌种为副干酪乳杆菌。另外，其具有较强的胃液耐受能力和胆盐耐受能力，在胃液中的存活率可以达到111.76％，在胆盐中的生长效率可以达到25.63％，在100个细胞粘附TY-W09的数量为1852，即说明其在在机体中具有良好的消化道抗性和肠道定植能力。
本发明另一实施例提供一种组合物，包括以下物质中的一种或多种组合：(a)上述的副干酪乳杆菌；(b)上述的副干酪乳杆菌的裂解物；(c)上述的副干酪乳杆菌的培养物；(d)上述的副干酪乳杆菌的发酵液。
需要说明的是，上述组合物中，如上所述，副干酪乳杆菌TY-W09在机体中具有良好的消化道抗性和肠道定植能力，可以将其制备成可以用于食用或者药用的组合物。另外，当副干酪乳杆菌TY-W09制备成组合物时，可以是将该菌直接以活菌的方式引入到组合物中发挥作用，也可以是通过现有技术手段将该菌灭活后以灭活菌的形态引入到组合物中发挥作用；还可以是将该菌的裂解物引入到组合物中发挥作用；还可以是将该菌培养得到的蛋白质、肽、分泌物或代谢产物等产物引入到组合物中发挥作用；还可以是该菌发酵后的发酵液引入到组合物中发挥作用。在具体使用过程中，可以根据具体需要选择该菌不同的形态制备成组合物发挥作用。
在一些具体实施例中，上述组合物还包括益生菌、益生元、膳食纤维和中成药中一种或多种组合。
需要说明的是，上述副干酪乳杆菌TY-W09及其不同的形态还可以与益生菌、膳食纤维和药学活性化合物中一种或多种组合使用；比如，副干酪乳杆菌TY-W09可以与枯草芽孢杆菌、双歧杆菌或乳酸菌等联合使用使得组合物同时具备副干酪乳杆菌TY-W09和其他益生菌的功效；再比如，副干酪乳杆菌TY-W09可以与益生元联合使用，益生元可以为副干酪乳杆菌TY-W09提供能量来源，提高副干酪乳杆菌TY-W09的效果；再比如，副干酪乳杆菌TY-W09可以与膳食纤维联合使用，膳食纤维可以辅助副干酪乳杆菌TY-W09进行定植，从而提高副干酪乳杆菌TY-W09的效果；再比如，副干酪乳杆菌TY-W09还可以与中成药联合使用形成组合物，同时发挥副干酪乳杆菌TY-W09和中成药的作用。
本发明再一实施例提供一种制剂，其包括上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物，以及载体；其中，载体为可药用载体或可食用载体。
需要说明的是，可以将上述包含副干酪乳杆菌TY-W09及其不同形态的组合物添加药用载体或可食用载体制备成药物或可食用的食物或保健品。可药用载体或可食用载体均为本领域所已知的，可以需要根据剂型进行选择，比如制备片剂主要会使用到稀释剂(如淀粉、糊精、蔗糖或甘糖等)、吸收剂(硫酸钙、磷酸氢钙或轻质氧化镁等)、粘合剂(聚维酮、糖浆或羟丙甲纤维素等)、润湿剂(水等)或崩解剂(干淀粉、羟甲基淀粉钠或交联聚维酮等)等；比如制备液体剂主要会使用到增容剂、助悬剂、乳化剂或着色剂等。
在一些具体实施例中，制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂。
需要说明的是，上述片剂、丸剂、颗粒剂或胶囊剂等固体剂型可以是益生菌片、益生菌糖丸、益生菌粉或益生菌胶囊等产品形式；上述液体剂可以是益生菌饮料等产品形式；上述凝胶剂可以是益生菌果冻、益生菌奶盖或凝固型酸奶等产品形式。
本发明再一实施例提供一种上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于缓解酒精内脏损伤制剂中的应用。
本发明再一实施例提供一种上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于防醉和/或解酒的制剂中的应用。需要说明的是，本发明中的副干酪乳杆菌TY-W09不仅可以缓解酒精性内脏损伤，还具有解酒和醒酒的功效。在一些具体实施中，使用本发明中的副干酪乳杆菌TY-W09的小鼠酒精灌胃模型的醉酒时间较没有使用副干酪乳杆菌TY-W09的小鼠酒精灌胃模型的醉酒时间延长了约200％；醒酒时间减少了约40％，即本发明中的副干酪乳杆菌TY-W09具有显著的防醉和解酒功效。
在一些具体实施中，上述应用包括以下一种或多种组合的应用：(a)上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于增强肝脏组织抗氧化能力的制剂中的应用；(b)上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于增强胃组织抗氧化能力的制剂中的应用。
在一些具体实施中，上述应用(a)包括：上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于降低肝脏系数的制剂中的应用；和/或在制备用于减少ALT活性和/或AST活性和/或TG水平和/或TC水平的制剂的应用；和/或在制备用于增加肝脏组织中GSH活性和/或SOD活性和/或降低MDA水平的制剂中的应用；和/或提高NRF2和/或HO-1和/或降低CYP2E1的mRNA和蛋白表达水平的制剂中的应用；应用(b)包括：上述的副干酪乳杆菌或上述的组合物在制备用于增加胃组织中GSH活性和/或SOD活性的制剂中的应用；和/或降低胃组织中炎症因子TNF-α和/或IL-1β和/或IL-6含量的制剂中的应用。
需要说明的是，本发明中的副干酪乳杆菌TY-W09可以通过降低小鼠肝脏系数，减少血清中肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)活性、谷草转氨酶(AST)活性和血脂甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量，增加肝脏组织中具有抗氧化功能的谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量，显著提高核因子E2相关因子2(NRF2)、血红素氧合酶1(HO-1)和降低细胞色素P4502E1(CYP2E1)的mRNA和蛋白表达水平，从而增强酒精性肝损伤小鼠肝脏的抗氧化能力，预防酒精导致的肝损伤，恢复肝脏组织结构。
还需要说明的是，本发明中的TY-W09还能够通过增加胃组织中GSH含量和SOD活性，降低胃组织中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量，从而增强胃组织抗氧化能力，预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应，恢复小鼠胃黏膜的形态。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
实施例1TY-W09的分离纯化及鉴定
(1)实验材料
西藏拉萨牦牛酸乳：用无菌小勺取牧民家中自制的牦牛酸乳，将其装入含有适量无菌碳酸钙和可溶性淀粉的15mL无菌离心管中，搅拌均匀，冷藏运回实验室立即进行乳酸菌的纯化分离。
(2)TY-W09的分离纯化
吸取1mL样品于9mL无菌生理盐水中得到10-1的样品稀释液，再依次进行10倍梯度稀释至10-7，将10-5、10-6和10-7的稀释液涂布于MRS固体培养基上，37℃倒置培养48h；培养结束后，观察菌落形态，选取中等大小、凸起、边缘整齐、呈圆形的单菌落采用平板划线法分离菌株，重复上述步骤直至得到纯化菌株。
(3)形态结构观察
纯化后的菌株的菌落形态如图1所示，纯化后的菌株的菌落形态一致，表面光滑，边缘平整，呈半球形，颜色呈白色。
纯化后的菌株进行革兰氏染色，然后在10×100倍镜下观察到紫色细胞形态，结果如图2所示(图2做了灰度处理，原图为紫色)，形状呈杆状，判定为革兰氏阳性菌(G+)。
(4)PCR扩增16S rDNA序列
采用25μL反应体系进行PCR扩增：模板1μL、上游引物(10μM)1μL、下游引物(10μM)1μL、2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，用无菌超纯水补足至25μL。引物序列为：上游引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO.2)，下游引物TACGACTTAACCCCAATCGC(SEQ ID NO.3)。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃末端延伸10min。序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的PCR扩增产物进行测序，测得序列如SEQ ID No.1所示；使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对，结果显示，本发明中的菌株为副干酪乳杆菌。
实施例2TY-W09的消化道抗性和细胞粘附能力测定
(1)实验材料
副干酪乳杆菌TY-W09：分离自西藏拉萨牦牛酸乳，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.24630。
(2)TY-W09耐受pH＝3.0人工胃液的测定
菌株按2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h后，于4000r/min离心10min收集菌体沉淀，并重悬于等体积无菌生理盐水中，即为菌悬液。取1ml菌悬液与9ml人工胃液(0.2％Na Cl、0.35％胃蛋白酶1:10000，用1mol/L的HCl调节pH＝3，过滤除菌备用)混合，混匀后置于恒温振荡器中37℃、100r/min培养3h，采用倾注平板法分别测定0h和3h的活菌数。
益生菌进入人体肠道发挥其功能之前要先经过胃部(胃液pH在3.0左右，存留时间为1h-3h)，强酸性的胃部环境不利于益生菌的生存。因此，益生菌在强酸性环境中应具备一定的生存能力。上述实验结果显示，TY-W09在pH＝3.0的模拟胃液中培养3h的存活率为111.76％，具有非常强的胃液耐受性。
(3)TY-W09耐受0.3％胆盐的测定
菌株按2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h后，按2％的接种量分别接种于含0.0、0.3％猪胆盐的MRS-THIO培养基(MRS液体培养基中加0.2％的巯基乙酸钠)中，混匀后置于恒温振荡器中37℃、100r/min培养24h，计算其生长效率。
益生菌进入肠道后，会受到小肠中胆盐的抑制，人体肠道环境中胆盐浓度也在不停地变化着，波动范围在0.03％-0.3％。上述实验结果显示，TY-W09在浓度为0.3％的胆盐中的生长效率为25.63％，具备良好的胆盐耐受力。
(4)TY-W09细胞粘附能力的测定
正常培养HT-29细胞并传代，收集培养好的细胞，并用McCoy's 5A培养基(添加青霉素-链霉素和胎牛血清)重悬，采用血球计数板计数法调整细胞数至2×105个/mL；6孔培养板放入经酸洗并灭菌的盖玻片并向每孔各加入2mL的细胞悬液；过夜后，使用无菌PBS洗涤3次，加入菌悬液(菌液浓度为108CFU/mL)，孵育2h后无菌PBS洗涤5次，每孔中加入2mL甲醇室温固定1h，弃甲醇加入革兰氏染液。于显微镜下记录100个细胞所粘附的TY-W09总数(随机选取20个视野)，即为粘附值。
人体摄入益生菌后，在胃酸和胆汁消化作用下，益生菌的生长繁殖受到一定的影响，不可能在短时间内呈现较好的生长趋势。若益生菌具有很好的黏附能力，则能延长其在人体肠道内停留的时间，有利于菌株生长与繁殖，100个细胞所黏附菌株数量少于40个，说明该菌株无粘附能力；100个细胞粘附菌株数量在41-100个之间，说明该菌株粘附能力一般；100个细胞粘附菌株数量超过100个，说明该菌株粘附能力很强。细胞粘附能力的实验结果如图3所示，100个细胞粘附TY-W09的数量为1852，具备非常强的细胞粘附能力。
实施例3TY-W09的解酒、护肝和养胃功效
(1)实验材料
副干酪乳杆菌TY-W09：分离自西藏拉萨牦牛酸乳，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.24630。
小鼠模型：根据体重将小鼠随机分为3组(n＝10)，即空白组、酒精组和TY-W09组。TY-W09组连续28天每天灌胃1.0×109CFU/kg的TY-W09菌液，空白组和酒精组灌胃等量的生理盐水；第29天，每组小鼠在造模前禁食12小时，给予酒精组和TY-W09组一次性灌胃体积分数为50％的酒精溶液(12ml/kg)，空白组给予等量生理盐水，灌胃后小鼠均禁食不禁水，10小时后牺牲小鼠。
小鼠样本收集及处理：牺牲小鼠后摘眼球取血，于4℃静置1h，3000r/min离心15min，收集上层血清；同时收集小鼠肝脏和胃组织；将解剖后的小鼠肝脏在冰冷的生理盐水中漂洗拭干后称重，并取左叶完整切片用；取胃组织沿大弯剪开，洗净胃内容物，展开胃黏膜，用数码相机拍照。
(2)小鼠醉酒时间和醒酒时间记录
酒精灌胃后，记录各组小鼠翻正反射消失时间和恢复时间，计算出小鼠醉酒时间和醒酒时间，其中，醉酒时间：从灌胃到翻正反射消失的时间；醒酒时间：从翻正反射消失到恢复的时间；翻正反射：小鼠灌酒后一定时间将其背向下轻轻侧翻，若小鼠背向下的姿势保持30s以上，则认为翻正反射消失。
醉酒是由于血液中过高浓度的乙醇短时间内大量进入脑内，使大脑先处于兴奋状态逐渐转入抑制状态，大脑皮层下中枢的兴奋失去控制，引起认识、判断、运动障碍等一系列病理变化，小鼠醉酒后最直观的行为表现是翻正反射的消失与恢复，通过观察醉酒后翻正反射消失时间和恢复时间，确定TY-W09的解酒效果，初步确定其是否有解酒作用。结果如图4和图5所示，与酒精组相比较，TY-W09组可显著延长小鼠醉酒时间(延长约200％)(p<0.0001)，缩短醒酒时间(缩短约30％)(p<0.01)，该结果表明TY-W09具有防醉、解酒作用。
(3)小鼠肝脏系数的测定
采血后迅速剖取肝脏，用冰冷的生理盐水洗净，滤纸吸湿后称取肝脏湿重，计算肝脏系数(肝脏系数在一定程度上反映了肝脏的健康状况)，肝脏系数＝(肝脏质量/体总质量)×100％。
计算结果如图6所示，与酒精组相比，TY-W09组的肝脏指数显著降低(降低约9.5％)(p<0.001)，该结果表明TY-W09能够有效抑制酒精导致的小鼠肝脏系数升高。
(4)小鼠肝脏病理组织学观察
取小鼠肝脏左叶同一位置的完整组织，用质量分数为10％的多聚甲醛溶液固定后进行HE染色，在显微镜(400×)下观察组织病理形态变化。
观察情况如图7所示，空白组的肝细胞结构正常，核膜完整，肝细胞质内未见脂滴和炎性细胞浸润等现象；在酒精干预后，小鼠的肝细胞肿胀，出现明显脂肪变性，胞质空泡化，可见炎性细胞浸润和坏死；然而，TY-W09组小鼠肝脏脂肪变性较酒精组明显得到改善，肝细胞形态基本恢复，组织结构趋向正常，该结果表明TY-W09能够有效预防酒精导致的小鼠肝脏损伤。
(5)小鼠血清生化指标的测定
血清中ALT、AST、TG和TC都是肝脏损伤的常见生物标志物，使用试剂盒测定小鼠血清中ALT活性、AST活性、TG含量和TC含量，检测结果如图8、图9、图10和图11所示，与空白组相比，酒精组的血清中ALT活性、AST活性、TG含量和TC含量水平均显著升高，但TY-W09预处理显著阻止了ALT活性(p<0.0001)、AST活性(p<0.0001)、TG含量(p<0.001)和TC含量(P<0.01)水平的升高，该结果表明TY-W09能够有效预防酒精导致的小鼠肝脏损伤和血脂水平升高。
(6)小鼠肝脏抗氧化活性物质的测定
①抗氧化物质SOD活性、GSH含量和MDA含量
先使用BCA试剂盒(购自于上海碧云天生物技术有限公司)测试肝脏匀浆液的蛋白浓度；然后使用试剂盒测试匀浆中肝脏抗氧化物质SOD活性、GSH含量和MDA含量，测试结果如图12、图13和图14所示，与酒精组相比，TY-W09组小鼠肝组织匀浆中抗氧化物质SOD活性(p<0.0001)及GSH含量均升高(p<0.0001)，氧化应激导致的脂质过氧化产物MDA含量降低(p<0.001)。
②NRF2、HO-1和CYP2E1的mRNA表达水平测定
需要说明的是，NRF2作为一种转录因子，可通过增强一系列细胞保护基因的转录来减轻氧化应激。当机体代谢酒精时，NRF2介导的信号通路是抗氧化的关键信号通路。NRF2通过调节几种主要的抗氧化反应元件依赖性抗氧化机制，包括NQO1、HO-1，在细胞抗氧化防御中发挥关键作用。NRF2的丢失导致乙醛和肝脏脂肪变性的解毒能力显着降低；HO-1的mRNA和蛋白表达可以在受到氧化应激和细胞损伤后上调；CYP2E1的激活与增加的脂质过氧化、线粒体功能障碍和肝毒性有关。
所以，本发明实施例还使用TRIzol试剂提取肝脏组织的总RNA，并使用反转录试剂盒将其反转录为cDNA，通过荧光定量PCR仪检测目的基因NRF2、HO-1和CYP2E1的mRNA表达水平，引物序列如表1所示，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的mRNA的相对表达水平。
表1引物序列
上述小鼠肝脏中NRF2 mRNA、HO-1mRNA和CYP2E1 mRNA相对表达水平的检测计算结果如图15、图16和图17所示，与空白组相比，酒精组中NRF2和HO-1的mRNA相对表达水平显著降低，CYP2E1的mRNA相对表达水平显著增加。经TY-W09干预后，NRF2(p<0.01)、HO-1(p<0.05)和CYP2E1(p<0.05)的mRNA表达维持在正常水平。
③NRF2、HO-1和CYP2E1蛋白相对表达水平测定
Western-blot法测定小鼠肝脏组织蛋白表达水平：取适量小鼠肝脏，加入RIPA裂解液，于冰上充分研磨裂解；将裂解液于12000g、4℃离心10min，取少量澄清上清。根据测定的蛋白浓度，将所有样品统一到相同浓度，并加入SDS-PAGE电泳上样缓冲液，然后放在98℃中煮5min，使蛋白变性；将制备好的蛋白样品进行电泳实验；电泳条件为70V 30min，110V1.5h；电泳完成后于转膜槽中转膜，300mA2h。取出PVDF膜于5％的脱脂奶粉中室温封闭2h，TBST冲洗。β-actin、NRF2、HO-1、CYP2E1一抗于4℃孵育过夜。次日取出、洗膜后于水平摇床上二抗室温孵育1h；洗膜，ECL显色；使用Bio-Rad成像系统进行显影成像，结果如图18所示；
并且采用ImageJ软件计算各条带灰度值，并计算出NRF2、HO-1和CYP2E1蛋白的相对表达量，结果如图19、图20和图21所示，与空白组相比，酒精组中NRF2和HO-1蛋白相对表达水平显著降低，CYP2E1相对表达蛋白表达水平显著增加。经TY-W09干预后，NRF2(p<0.01)、HO-1(p<0.05)和CYP2E1(p<0.05)的蛋白相对表达维持在正常水平。
以上结果表明，TY-W09能够增强酒精性肝损伤小鼠肝脏的抗氧化能力，改善酒精所致小鼠肝脏氧化损伤，从而对酒精性肝损伤起到保护作用。
(7)小鼠胃黏膜损伤指数的测定
肉眼观察小鼠胃黏膜损伤情况，并用直尺测定胃黏膜损伤指数(胃黏膜损伤指数采用Guth法计算：每3个点状溃疡(出血糜烂性小点或黏膜缺损宽度小于1mm，称点状溃疡)计1分；条状出血：测量溃疡的最大长径和垂直于最大长径的最大宽径，二者的乘积即为溃疡指数。宽为1mm者每毫米长为1分；2mm宽者每毫米长为2分；3mm宽者每毫米长为3分，以此类推)。
各组小鼠胃黏膜损伤情况如图22所示，利用酒精诱导后的小鼠胃黏膜层会出现出血糜烂，与空白组相比，酒精组小鼠胃黏膜出现明显出血与糜烂；与酒精组相比，TY-W09组小鼠胃黏膜出血和糜烂现象得到明显的改善。
各组小鼠胃黏膜损伤指数如图23所示，TY-W09组与酒精组比，显著降低了小鼠胃黏膜损伤指数(p<0.01)。
以上结果表明，TY-W09能够预防酒精导致的小鼠胃黏膜损伤。
(8)小鼠胃组织氧化指标的测定
需要说明的是，胃黏膜在乙醇的作用下会产生大量的氧自由基，引起黏膜细胞的脂质过氧化，导致胃黏膜血流障碍，引发胃黏膜损伤。胃组织中的GSH和SOD等抗氧化物质能够维持机体抗氧化防御系统的平衡。
本发明实施例先使用BCA试剂盒(购自于上海碧云天生物技术有限公司)测试胃匀浆液的蛋白浓度；然后使用试剂盒测试胃匀浆中抗氧化物质SOD活性和GSH含量，检测结果如图24和图25所示，与酒精组相比，TY-W09组的SOD活性(p<0.01)和GSH含量(p<0.01)均显著增加。以上结果表明，TY-W09能够增强胃组织抗氧化能力。
(9)小鼠胃组织炎症因子水平的测定
需要说明的是，IL-6和IL-1β在损伤引起的炎症反应中发挥重要作用，与机体炎症反应、免疫调节等多种生理病理过程相关，IL-6和IL-1β水平高低可以反应机体炎症程度，并与抗炎治疗效果相关。TNF-α属于促炎细胞因子的一种，机体受到在内外环境的各种刺激后均能产生，在炎症反应过程中可增强其他炎性细胞因子的作用。
本发明实施例采用酶联免疫分析法，按照相应的ELISA试剂盒(购自于上海酶联生物科技有限公司)的相关操作说明进行检测小鼠胃组织中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平，检测结果如图26、图27和图28所示，与空白组相比，酒精组小鼠胃组织中IL-6(p<0.001)、IL-1β(p<0.0001)和TNF-α(p<0.01)水平显著升高；但在TY-W09干预后，小鼠胃组织中高水平的IL-6(p<0.0001)和IL-1β(p<0.001)和TNF-α(p<0.01)水平均显著降低，恢复至正常水平。以上结果表明，TY-W09能够有效预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应。
综上所述，本发明中的副干酪乳杆菌TY-W09具有良好的消化道抗性和肠道定植能力；其可显著延长小鼠醉酒时间，缩短醒酒时间，具有防醉和解酒作用；副干酪乳杆菌TY-W09还可以通过同时降低肝脏系数、减少血清中肝功能指标ALT和AST活性以及血脂TG和TC含量、增加肝脏组织中具有抗氧化功能的GSH含量和SOD活性、降低脂质过氧化物MDA含量、显著提高NRF2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平以及显著降低CYP2E1的mRNA和蛋白表达水平，从而协同发挥作用增强肝脏的抗氧化能力，改善酒精所致小鼠肝脏氧化损伤，恢复肝脏组织结构；此外，副干酪乳杆菌TY-W09还可以通过同时增加胃组织中GSH含量和SOD活性、降低胃组织中炎症因子(TNF-α、L-1β和IL-6)含量，从而协同增强胃组织抗氧化能力，预防酒精导致的小鼠胃组织炎症反应，恢复胃黏膜的形态。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (10)

1.一种副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.24630。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌，其特征在于，其16SrDNA序列包含如SEQ IDNO.1所示序列。
3.组合物，其特征在于，包括以下物质中的一种或多种组合：(a)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌；(b)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌的裂解物；(c)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌的培养物；(d)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌的发酵液。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，还包括益生菌、益生元、膳食纤维和中成药中一种或多种组合。
5.制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物，以及载体；其中，载体为可药用载体或可食用载体。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、凝胶剂、颗粒剂或液体剂。
7.权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于缓解酒精内脏损伤制剂中的应用。
8.权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于防醉和/或解酒的制剂中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，包括以下一种或多种组合的应用：(a)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于增强肝脏组织抗氧化能力的制剂中的应用；(b)权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于增强胃组织抗氧化能力的制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，应用(a)包括：权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于降低肝脏系数的制剂中的应用；和/或在制备用于减少ALT活性和/或AST活性和/或TG水平和/或TC水平的制剂的应用；和/或在制备用于增加肝脏组织中GSH活性和/或SOD活性和/或降低MDA水平的制剂中的应用；和/或提高NRF2和/或HO-1和/或降低CYP2E1的mRNA和蛋白表达水平的制剂中的应用；应用(b)包括：权利要求1或2所述的副干酪乳杆菌或权利要求3或4所述的组合物在制备用于增加胃组织中GSH活性和/或SOD活性的制剂中的应用；和/或降低胃组织中炎症因子TNF-α和/或IL-1β和/或IL-6含量的制剂中的应用。
CN202310011354.5A 2023-01-05 2023-01-05 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用 Pending CN118291298A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310011354.5A CN118291298A (zh) 2023-01-05 2023-01-05 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用
NL2035211A NL2035211B1 (en) 2023-01-05 2023-06-28 Lactobacillus paracasei and applications of lactobacillus paracasei in preparation for alleviating alcohol-induced visceral injury

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310011354.5A CN118291298A (zh) 2023-01-05 2023-01-05 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118291298A true CN118291298A (zh) 2024-07-05

Family

ID=87378617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310011354.5A Pending CN118291298A (zh) 2023-01-05 2023-01-05 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN118291298A (zh)
NL (1) NL2035211B1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108203702A (zh) * 2016-12-20 2018-06-26 北京中科星冠生物技术股份有限公司 一种复合益生菌解酒饮料及其专用复合益生菌
CN111662850B (zh) * 2020-07-10 2022-03-15 江南大学 一株能够缓解酒精性肠道损伤的副干酪乳杆菌及其应用
KR20220011937A (ko) * 2020-07-22 2022-02-03 (주)지에프씨생명과학 숙취 해소 효능을 갖는 락토바실러스 파라카제이 gfc_gfv5 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물
CN114032193B (zh) * 2020-08-24 2022-06-07 汤臣倍健股份有限公司 一种副干酪乳杆菌207-27及其应用
CN113337430B (zh) * 2021-06-04 2022-03-11 青岛诺森生物技术有限责任公司 一株副干酪乳杆菌nsl0201及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
NL2035211A (en) 2023-07-27
NL2035211B1 (en) 2023-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Bifidobacteria exert species-specific effects on constipation in BALB/c mice
CN110604749B (zh) 动物双歧杆菌a12及其在控制糖尿病或高血脂症特别是体重增加或肥胖中的应用
CN110331119B (zh) 两歧双歧杆菌ccfm1063及其应用
CN110964653B (zh) 一种可调节肠道菌群平衡的副干酪乳杆菌et-22
CN106535908A (zh) 包括动物双歧杆菌亚种乳酸菌lmg p‑28149的组合物
CN107325997B (zh) 具有头孢抗性且高表达Sir2蛋白的长双歧杆菌及其应用
CN108624523A (zh) 胚芽乳酸杆菌tci378及其于减脂及改善肠胃功能的应用
CN114574406B (zh) 鼠李糖乳杆菌菌株wka55及其在制备防治酒精性肝损伤制品方面的用途与产品
CN110023484B (zh) 一种假小链状双歧杆菌及其培养方法和应用
CN114181864A (zh) 一种鼠李糖乳杆菌hf01及其应用
CN109593678B (zh) 长双歧杆菌yh295及其在制备降低腹型肥胖风险产品中的应用
CN116987644A (zh) 一株具有抗氧化作用的发酵粘液乳杆菌及应用
CN111280252A (zh) 长双歧杆菌长亚种、含其的组合物及用途
CN113197311B (zh) 一种乳酸菌组合物及其制备方法
CN113797232A (zh) 具有缓解胰岛素抵抗功能的组合物及其应用
TW202302134A (zh) 諾麗果發酵物於製備改善體態及肌膚狀況之組合物之用途
CN118240686A (zh) 一种缓解结肠炎的发酵乳杆菌xy18及其应用
CN116004454B (zh) 植物乳杆菌j26及其组合物在缓解慢加急性酒精性肝损伤中的应用
CN114574407B (zh) 动物双歧杆菌乳亚种wkb99及其在制备改善代谢综合征制品方面的应用和产品
CN118291298A (zh) 一种副干酪乳杆菌及其在缓解酒精内脏损伤制剂中的应用
AU2020343019A1 (en) Dietary supplement to promote gut health
Stanojević et al. Oral treatment with Lactobacillus rhamnosus 64 during the early postnatal period improves the health of adult rats with TNBS-induced colitis
Niu et al. The alleviative effects of viable and inactive Lactobacillus paracasei CCFM1120 against alcoholic liver disease via modulation of gut microbiota and the Nrf2/HO-1 and TLR4/MyD88/NF-κB pathways
CN116590181B (zh) 一种改善微塑料污染引起的炎症反应的副干酪乳杆菌及其应用
TWI831348B (zh) 甜菜根發酵物用於製備抑制血管鈣化組合物的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination