CN118127229A - 一种用于检测猪暂时热病毒的实时荧光定量pcr引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪暂时热病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及其应用。本发明针对猪暂时热病毒提供的引物探针组具有较高的特异性和扩增效率。基于上述引物探针组，本发明提供了猪暂时热病毒的检测试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法，能够实现猪暂时热病毒的特异、灵敏、快速检测，对于猪暂时热病毒感染的诊断和防控具有重要意义，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种用于检测猪暂时热病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术
弹状病毒科包括40多个属，暂时热病毒属是其中的1个，其所有成员都是从牛和噬血节肢动物中分离出来的。根据国际病毒分类委员会(ICTV)的最新报告，暂时热病毒属包括阿德莱德河病毒、贝里马病毒、牛暂时热病毒、金伯利病毒、普仲病毒、奥博第安病毒、亚塔病毒等在内的11个病毒种，以及最新发现的猪暂时热病毒(PoEV)。另外，已有文献报道在猪的血液中检测到阿德莱德河病毒抗体(4.2％，4/96)和牛暂时热病毒抗体(15.7％，36/230)。这些结果表明猪可能作为暂时热病毒感染的沉默宿主。
猪暂时热病毒是弹状病毒科、暂时热病毒属成员，为单股负链RNA病毒，其基因组全长约14.5kb，含有10个基因，其排列顺序为：3’-N-P-M-G-GNS-α1-α2-β-γ-L-5’，基因组间隔区大小在20nt-90nt之间。已有研究结果表明，家猪和野猪极有可能是PoEV的储存宿主，然而，家猪和野猪感染暂时热病毒的临床表现还未可知，是否会引起公共卫生问题也不清楚。目前，猪暂时热病毒尚无高效的检测方法，其诊断难度很大。开发猪暂时热的流行病学和诊断技术对于预防和控制这种新发传染病具有十分重要的意义，尤其是在养猪业方面，有利于做到早发现、早防治。因此，急需建立一种猪暂时热病毒快速精准的检测方法。PCR技术已成为核酸检测中广泛使用的分子生物学方法，但其存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。实时荧光定量RT-PCR不仅可以快速准确地定量检测病原，而且具有特异性强、敏感性高的优势。然而，目前尚无猪暂时热病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法。
发明内容
本发明提供一种用于检测猪暂时热病毒的实时荧光定量PCR引物探针组、试剂盒及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供用于检测猪暂时热病毒的引物探针组，所述引物探针组包含以下(1)和/或(2)中的引物探针组：
(1)引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
上述引物和探针的序列具体如下：
SEQ ID NO.1：ATATSAACCAAATGCCCAC；
SEQ ID NO.2：ACATGATGYCCAATGGTTCC；
SEQ ID NO.3：AATGATCCRATGGAATGGTTTGC；
SEQ ID NO.4：CAACATATAGATTGGCAAGG；
SEQ ID NO.5：GGTGCATCYTTGTTCATBCCTG；
SEQ ID NO.6：CACTATCAAATTATTCCGATGTGT。
上述(1)中的引物探针组为针对分离自野猪的暂时热病毒19AH-01毒株的全基因组序列设计。上述(2)中的引物探针组为针对分离自野猪的暂时热病毒19ShX-03毒株的全基因组序列设计。
具体地，上述(1)中的引物探针组所针对的靶序列如SEQ ID NO.7的1-154bp所示。
上述(2)中的引物探针组所针对的靶序列如SEQ ID NO.8的32-128bp所示。
上述(1)、(2)中引物探针组可在不同的实时荧光定量PCR反应体系中进行检测。
暂时热病毒19AH-01和19ShX-03为申请人前期通过病毒组的方法从外表健康的野猪中分离得到的2株猪暂时热病毒，与最近发现的家猪的暂时热病毒的基因组同源性仅为68.8％-82.7％，为新的暂时热病毒种。本发明以暂时热病毒19AH-01和19ShX-03基因组中保守性较高的N基因为靶基因设计特异性引物和探针，经筛选确定了上述检测效果最优的引物探针组，其具有较高的特异性和扩增效率。基于上述引物探针组建立了一种实时荧光定量PCR快速检测方法，为猪的暂时热病毒诊断提供一种有效、快速、特异及灵敏的方法。
本发明利用上述引物探针组对来自不同地区的野猪组织样品进行检测，检出了携带猪暂时热病毒的阳性样品，并对各阳性样品的病毒载量进行了检测。
为便于检测，以上所述的引物探针组中，所述探针标记有荧光基因。
优选地，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、ROX、LCRED640、LC RED705中的任意一种。
优选地，所述荧光基团标记在所述探针的5’和/或3’末端。
在本发明的一些实施方式中，所述探针的5’末端标记FAM，3’末端标记TAMRA。上述荧光基团的选择不构成对本发明的限制，本领域技术人员可根据需要选择任意的荧光基团。
第二方面，本发明提供用于猪暂时热病毒检测的靶序列，所述靶序列如SEQ IDNO.7的1-154bp所示，和/或，所述靶序列如SEQ ID NO.8的32-128bp所示。
第三方面，本发明提供以上所述的引物探针组或所述靶序列在制备猪暂时热病毒的检测试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供猪暂时热病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的引物探针组。
优选地，所述试剂盒还包含阳性质粒标准品；所述阳性质粒标准品包含携带SEQID NO.7所示序列的质粒和/或携带SEQ ID NO.8所示序列的质粒。
优选地，所述试剂盒还包含实时荧光定量PCR检测所需的其他试剂，包括但不限于反应缓冲液、DNA聚合酶和水等。上述试剂可单独包装，或以预混液(Mix)的形式混合存在。
以上所述的试剂盒在用于检测猪暂时热病毒时的方法如下：以待测样品的cDNA为模板，利用所述试剂盒进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有猪暂时热病毒和/或其水平。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQ ID NO.1-2所示引物的终浓度为0.08-0.16μM，SEQ ID NO.3所示探针的终浓度为0.27-0.4μM。
进一步优选地，所述实时荧光定量PCR的25μL反应体系包括如下组分：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5μL，模板2μL，SEQ ID NO.3所示探针(10μM)0.7μL，SEQ ID NO.1-2所示引物(10μM)各0.4μL，ddH2O补足25μL。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQ ID NO.4-5所示引物的终浓度为0.27-0.4μM，SEQ ID NO.6所示探针的终浓度为0.16-0.25μM。
进一步优选地，所述实时荧光定量PCR的25μL反应体系包括如下组分：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5μL，模板2μL，SEQ ID NO.6所示探针(10μM)0.6μL，SEQ ID NO.4-5所示引物(10μM)各0.7μL，ddH2O补足25μL。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应程序包括：95℃、60s；95℃、10s，58℃、45s，42个循环。
第五方面，本发明提供一种非疾病诊断和治疗目的的检测猪暂时热病毒的方法，所述方法包括：以待测样品的cDNA为模板，利用以上所述的引物探针组或所述试剂盒进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有猪暂时热病毒和/或其水平。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQ ID NO.1-2所示引物的终浓度为0.08-0.16μM，SEQ ID NO.3所示探针的终浓度为0.27-0.4μM。
进一步优选地，所述实时荧光定量PCR的25μL反应体系包括如下组分：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5μL，模板2μL，SEQ ID NO.3所示探针(10μM)0.7μL，SEQ ID NO.1-2所示引物(10μM)各0.4μL，ddH2O补足25μL。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQ ID NO.4-5所示引物的终浓度为0.27-0.4μM，SEQ ID NO.6所示探针的终浓度为0.16-0.25μM。
进一步优选地，所述实时荧光定量PCR的25μL反应体系包括如下组分：Premix ExTaqTM(Probe qPCR)12.5μL，模板2μL，SEQ ID NO.6所示探针(10μM)0.6μL，SEQ ID NO.4-5所示引物(10μM)各0.7μL，ddH2O补足25μL。
优选地，所述实时荧光定量PCR的反应程序包括：95℃、60s；95℃、10s，58℃、45s，42个循环。
本发明中，所述待测样品的cDNA的获得方法包括：提取待测样品的总RNA，经反转录得到cDNA。
本发明的有益效果至少包括：本发明针对猪暂时热病毒提供的引物探针组具有较高的特异性和扩增效率。基于上述引物探针组，本发明提供了猪暂时热病毒的检测试剂盒和实时荧光定量PCR检测方法，能够实现猪暂时热病毒的特异、灵敏、快速检测，对于猪暂时热病毒感染的诊断和防控具有重要意义，具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4中实时荧光定量PCR方法的特异性检测结果，其中，a：PoEV；b-m：ASFV、CSFV、PPV7、PCV3、PBoV3、ALSV、JMTV、RABV、PRV、BVDV、PRRSV和ddH2O。
图2为本发明实施例5中引物探针组1的实时荧光定量PCR的灵敏性检测结果。
图3为本发明实施例5中引物探针组2的实时荧光定量PCR的灵敏性检测结果。
图4为本发明实施例7中野猪组织样品中PoEV的实时荧光定量PCR的部分检测结果，其中，阳性1和阳性2分别代表标准质粒pUC19-N1和pUC19-N2。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的主要试剂和仪器信息如下：TRIzolTM试剂(美国英杰生命技术有限公司，货号15596018CN)、逆转录酶M-MLV、pMDTM18-T Vector Cloning Kit和Premix ExTaqTM(Probe qPCR)(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号2641A、6011和RR390A)、实时荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司，型号Mx3000P)。
实施例1猪暂时热病毒特异性引物和探针的设计和合成
根据分离自野猪的暂时热病毒(19AH-01和19ShX-03)的相对保守的N基因序列设计引物和探针，由于这两个毒株之间N基因的核苷酸序列同源性只有77％，与已知序列同源性最高为78％，无法找到一段可以用来扩增所有的猪暂时热病毒的保守序列，因此，参考荧光定量PCR引物和探针的设计原则，针对两个毒株的N基因分别设计了多对引物和探针，并对其检测效果进行分析和对比，经筛选，针对两个毒株各确定了检测效果最优的1对引物和探针(表1)，其中，引物探针组1的序列分别如SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3所示，引物探针组2的序列分别如SEQ ID NO.4-5和SEQ ID NO.6所示。引物和探针由吉林省库美生物科技有限公司合成。
表1荧光定量PCR引物和探针序列信息
实施例2阳性质粒标准品的制备
构建含有表1中的引物探针组所针对的靶序列的质粒作为阳性质粒标准品，具体方法如下：
将目的片段1(204bp)和目的片段2(128bp)送至吉林省库美生物科技有限公司合成，并连接至pUC19载体上，分别标记为pUC19-N1和pUC19-N2。
片段1(SEQ ID NO.7，204bp)：
片段2(SEQ ID NO.8，128bp)：
其中，SEQ ID NO.7的1-154bp为引物探针组1扩增得到的靶序列，SEQ ID NO.8的32-128bp为引物探针组2扩增得到的靶序列。
经测序正确的阳性质粒pUC19-N1和pUC19-N2，测定其浓度，计算其拷贝数(拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)均为1.0×1010copies/μL，将其按照10倍倍比稀释至浓度为100copies/μl，分装并于-20℃保存备用。
实施例3实时荧光定量PCR方法的建立
针对TAKARA的Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)优化引物和探针浓度、退火温度、时间等条件，荧光定量PCR的初始反应体系见表2。
表2荧光定量PCR反应体系
初始反应条件为：95℃、60s；(95℃、10s，60℃、60s)42个循环。
1、加入上下游引物体积的优化
反应体系总体积为25μL，其中，Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)为12.5μL，阳性质粒标准品作为模板(2μL)，探针(10μM，1μL)，对加入上、下游引物(10μM)体积进行优化，分别设置0.2μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、1μL。
2、加入探针体积的优化
对加入探针(10μM)体积进行优化，分别设置0.2μL、0.4μL、0.5μL、0.6μL、0.7μL、0.8μL、1μL。
3、退火温度的的优化
对退火温度进行摸索，分别设置56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃。
4、变性时间的优化
对变性时间进行摸索，分别设置5s、10s。
5、退火时间的优化
对退火时间进行摸索，分别设置30s、45s、60s。
结果如表3、表4、表5、表6、表7所示，按照优化条件，比较Ct值大小，Ct值最小者视为最佳反应条件。
表3引物体积优化
结果显示，当引物探针组1中的上下游引物各加入0.4μL，引物探针组2中的上下游引物各加入0.7μL时，Ct值最小。
表4探针体积优化
结果显示，当引物探针组1中的探针加入0.7μL，引物探针组2中的探针加入0.6μL时，Ct值最小。
表5退火温度优化
结果显示，当退火温度为58℃时，引物探针组1和2的Ct值均最小。
表6退火时间优化
结果显示，当退火时间为45s时，引物探针组1和2的Ct值均最小。
表7变性时间优化
结果显示，当变性时间为10s时，引物探针组1和2的Ct值均最小。
基于上述优化结果，检测猪暂时热病毒的最佳反应条件为：95℃、60s；(95℃、10s，58℃、45s)42个循环。
实施例4实时荧光定量PCR检测方法的特异性分析
以非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒7型(PPV7)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪博卡病毒3型(PBoV3)、阿龙山病毒(ALSV)、狂犬病病毒(RABV)、猪轮状病毒A型(PRV-A)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、荆门蜱病毒(JMTV)以及猪暂时热病毒(PoEV)的阳性核酸(阳性质粒标准品)为反应模板，PoEV阳性核酸为阳性对照，ddH2O为阴性对照，利用实施例3中建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性分析。
结果如图1所示，仅PoEV阳性核酸出现了特异性扩增曲线，其余病毒均未出现特异性扩增曲线，表明该方法具有良好的特异性。
实施例5实时荧光定量PCR检测方法的灵敏性分析
以1×100-1×109copies/μL(10倍稀释)的阳性质粒标准品为模板，ddH2O为阴性对照，利用实施例3建立的实时荧光定量PCR方法进行灵敏性实验，确定检测的最低拷贝数。
结果如图2和图3所示，引物探针组1和2对PoEV的检出最低限度为10.0copies/μL，当有明显的扩增曲线且Ct值分别小于36.35和37.26时，判断为阳性；当无扩增曲线且无Ct值时，判断为阴性；当有明显的扩增曲线且Ct值处于36.35-42和37.26-42时，判断为可疑，需重新确证。引物探针组1和2的标准曲线扩增效率分别为93.7％和89.2％，相关系数分别为0.997和0.998，扩增曲线Ct值下降的梯度均一，说明该检测方法具有较高的灵敏性。
实施例6实时荧光定量PCR检测方法的重复性分析
取三个不同拷贝数的阳性质粒标准品(1×105、1×106和1×107)进行批间和批内重复性实验，每个样品设置三个平行重复，并设立阴性、阳性对照。计算反应结果的平均Ct值、标准差和变异系数，评估已建立的实时荧光定量PCR方法的重复性效果。
结果见表8，组内和组间的变异系数(CV)均小于3％，组内的CV值范围是0.18％-1.95％，组间CV值范围是0.25％-0.58％，阴性对照无特异性扩增，表明在组内和组间均具有良好的重复性。
表8实时荧光定量PCR对于不同拷贝数的样品的重复性分析
实施例7野猪组织样品的暂时热病毒(PoEV)的检测
利用实施例3中建立的方法对野猪组织样品的暂时热病毒(PoEV)进行检测，具体如下：
提取待测样品RNA并反转录为cDNA：按照Simply P总RNA提取试剂盒说明书提取待测样品中的总RNA，将提取的RNA使用TAKARA反转录试剂进行cDNA的扩增，反应体系见表9。
表9反转录体系
利用实施例3中建立的实时荧光定量PCR方法对野猪组织样品进行检测，同时提取阳性野猪样品的各个组织样品RNA反转录为cDNA，并检测其各个组织样品的病毒拷贝数。
对中国南方和北方地区24个省份共采集367头野猪的组织样品进行PoEV检测。结果如图4所示，共检出5份阳性样品，阳性率为1.36％(5/367)，其中，利用引物探针组1检测19AH-01和20GX-05样品为阳性，利用引物探针组2检测19ShX-02，19ShX-03和20HaiN-01为阳性。此外，对阳性野猪的各个组织样品进行了病毒载量的检测，结果表明，PoEV在各个组织中均有分布，且可引起病毒血症(表10)。
表10野猪不同组织样品中携带PoEV的病毒载量
注：ND代表没有样品检测。
本发明首次在野猪中检测到PoEV，表明家猪和野猪可能是PoEV的储存宿主，对人类生命健康具有潜在威胁。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.用于检测猪暂时热病毒的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包含以下(1)和/或(2)中的引物探针组：
(1)引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)引物序列如SEQ ID NO.4-5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针标记有荧光基因。
3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、ROX、LC RED640、LC RED705中的任意一种。
4.用于检测猪暂时热病毒的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQ ID NO.7的1-154bp所示，和/或，所述靶序列如SEQ ID NO.8的32-128bp所示。
5.权利要求1～3任一项所述的引物探针组或权利要求4所述的靶序列在制备猪暂时热病毒的检测试剂盒中的应用。
6.猪暂时热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任一项所述的引物探针组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性质粒标准品；
所述阳性质粒标准品包含携带SEQ ID NO.7所示序列的质粒和/或携带SEQ ID NO.8所示序列的质粒。
8.一种非疾病诊断和治疗目的的检测猪暂时热病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的cDNA为模板，利用权利要求1～3任一项所述的引物探针组或权利要求6或7所述的试剂盒进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有猪暂时热病毒和/或其水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQID NO.1-2所示引物的终浓度为0.08-0.16μM，SEQ ID NO.3所示探针的终浓度为0.27-0.4μM；
和/或，所述实时荧光定量PCR的反应体系中，SEQ ID NO.4-5所示引物的终浓度为0.27-0.4μM，SEQ ID NO.6所示探针的终浓度为0.16-0.25μM。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序包括：95℃、60s；95℃、10s，58℃、45s，42个循环。
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