CN118127101A - 一种β-烟酰胺单核苷酸合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种β‑烟酰胺单核苷酸合成方法，包括：以大肠杆菌为宿主菌建立表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌；诱导表达所述基因工程菌并纯化，获得纯酶液；以烟酰胺核糖为底物，ATP为磷酸供体，并添加所述纯酶液构建β‑烟酰胺单核苷酸的合成体系，合成β‑烟酰胺单核苷酸；所述烟酰胺核糖激酶来源于绣球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的方法在较宽的温度范围下均有良好的合成效果，且使用的酶在弱碱性条件下相比现有NRK酶酶活高，本发明的方法在10min内可将底物烟酰胺核糖氯化物的转化率提高至80%以上，还可进一步联合PPK酶进行共催化，降低了ATP的供应，适合于产业应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸合成方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸（Nicotinamide mononucleotide，NMN）是人体内合成 NAD+的重要前体，通过转化为 NAD+来发挥其生理功能，与多种疾病紧密相关，其中 NMN 用于治疗衰老性疾病及延缓衰老是其研究最为热门的领域之一。NMN 已逐渐应用于保健食品和医学药物，通过调节生物体内 NMN 的水平，对心脑组织损伤、代谢性疾病、衰老及其相关老化化退行性疾病等有较好的预防、治疗和修复作用。
NMN 广泛存在于毛豆、西兰花、真菌、虾等天然食物中，但是食用天然食物摄入NMN的量，远不能达到使其对人体健康造成关键性的影响。因此将其应用于加工食品，可以为改善人体健康，预防疾病等起到重要的作用。由于合成问题，目前以 NMN 为主要成分的产品价格仍十分昂贵。合成 NMN 的方法中，相比于化学法合成 NMN，生物法因无有机溶剂残留也不存在手性问题，成为最环保无公害的合成方法。NMN的生物催化制备一般有两种途径，一种是以烟酰胺和磷酸核糖基焦磷酸为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成NMN。由于这两种前体的市场价格较高，也导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。另一种途径以烟酰胺核糖为底物，烟酰胺核糖激酶在ATP的作用下催化其成为烟酰胺单核苷酸。这种方法底物相对稳定，且成本较低。但仍然存在一些限制，例如高效率的酶制剂的缺乏，反应周期长、过程不稳定等问题，亟需开发高效率的新酶资源，并开发快速高效催化制备NMN的工艺。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足提供一种基于新型来源的烟酰胺核糖激酶的β-烟酰胺单核苷酸合成方法，以解决现有NRK耐热性能差、反应时间长、转化率低的问题，促进β-烟酰胺单核苷酸的高效催化合成。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种β-烟酰胺单核苷酸合成方法，包括：
以大肠杆菌为宿主菌建立表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌；
诱导表达所述基因工程菌并纯化，获得纯酶液；
以烟酰胺核糖为底物，ATP 为磷酸供体，并添加所述纯酶液构建β-烟酰胺单核苷酸的合成体系，合成β-烟酰胺单核苷酸；
所述烟酰胺核糖激酶来源于绣球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加Mg2+、Ca2+和K+中的一种或两种。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加Mg2+和Ca2+。
作为一种优选的实施方式，添加的金属离子终浓度为10-15mM。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中反应温度为40-65℃。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中反应温度为45-55℃。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中pH为5-8.5。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中pH为7.5-8.5。
作为一种优选的实施方式，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加PPK酶。
作为一种优选的实施方式，所述PPK酶添加量为终浓度0.1-0.2g/L。
本发明的方法使用一种全新来源的烟酰胺核糖激酶，其拥有较高的催化活性，且通过控制催化过程，在50℃高温条件和弱碱性环境下，10min内的催化转化率达81%。该方法反应速度快，转化率高，与PPK偶联使用，可以大幅度降低底物成本，适合产业应用。
附图说明
图1为重组表达质粒pGEX-SpaNRK的图谱。
图2为SPANRK蛋白表达纯化图。
图3为NMN合成路线。
图4为不同金属离子及组合下烟酰胺核糖激酶（SPANRK）催化活性图。
图5为不同温度下烟酰胺核糖激酶催化活性图。
图6为不同pH下烟酰胺核糖激酶催化活性图。
图7为最佳条件下烟酰胺核糖激酶（SPANRK）催化液相结果图。
具体实施方式
实施例1 绣球菌（Sparassis crispa）烟酰胺核糖激酶的筛选
NR是牛奶中存在的一种天然产物，可以增加NAD+的生物合成，在哺乳动物系统中NR的回收途径主要依赖于NRK基因产物编码的特定激酶对NR进行磷酸化。通过蛋白结构分析，我们发现能够实现NR磷酸化的关键是NRK中的一段高保守序列，称为P环基序。所有物种中的NRK都具有这个保守结构域，并且能够在体外催化NR合成NMN。因此，为了挖掘了新来源并且催化效果较好的NRK，对NCBI上搜索所得的部分NRK进行初步筛选。将每个NRK氨基酸序列提交到网站初步预测结构，随后将结构提交至hotspotwizard网站，根据网站预测结果，现已被专利报道并使用的三种NRK（KPNRK、KLUNRK、HNRK）在P环基序附近具有较大的活性口袋，并且底物通道也分布在活性口袋中。依据这种结构特点，在57种异源NRK的初步预测结构中，选择类似的活性口袋较大，并且有狭长的底物通道分布其中的NRK，确定研究对象为来源于绣球菌（Sparassis crispa）的烟酰胺核糖激酶基因SPANRK。
实施例2 构建含烟酰胺核糖激酶重组质粒的大肠杆菌细胞
对绣球菌（Sparassis crispa）烟酰胺核糖激酶SPANRK的核苷酸序列进行密码子优化，合成带有密码子优化后的核苷酸序列的质粒，重组质粒命名为pGEX-SpaNRK。所述密码子优化后的烟酰胺核糖激酶（由安徽通用生物技术公司合成）的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。将烟酰胺核糖激酶基因经通用生物技术公司合成，与经BamH I和XholI限制性内切酶酶切后的pGEX-6P-1质粒连接，重组质粒结构如图1所示。采用热激法，将重组质粒导入Escherichia coli BL21(DE3)感受态中，获得工程菌。
实施例3 烟酰胺核糖激酶的表达纯化
将实施例2构建得到的工程菌接种于LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1-2 h直至菌体浓度OD600达到0.4-0.6时加入菌液体积千分之一的IPTG，进行低温诱导培养（20℃，150rpm，20h）。
收集湿菌体，用配制的大肠杆菌破碎Buffer（50 mM Tris，300 mM NaCl，10%甘油，pH 7）重悬菌体，浓缩倍数在20倍左右，于冰上超声破碎菌悬液，超声时间5s，间隙5s，功率25%，总工作时间15min。高速低温离心破碎液，收集上清粗酶液。
由于烟酰胺核糖激酶C端带有His标签，所述粗酶液使用镍柱进行纯化，浓度由低到高的咪唑溶液可以以此洗脱挂柱的杂蛋白和目标蛋白，本实施例中收集50mM咪唑镍柱洗脱液（图2），利用SDS- PAGE蛋白电泳检测其中蛋白的纯度与浓度。
实施例4 以烟酰胺核糖为底物酶法合成β-烟酰胺单核苷酸
烟酰胺核糖激酶基因工程大肠杆菌经过IPTG诱导表达目的蛋白后可以直接使用菌体在催化体系中全细胞催化合成β-烟酰胺单核苷酸。菌体浓度为0.02mg/L，催化温度37℃，900rpm，时间2.5h。
本实施例中使用纯酶液进行催化，合成路线如图3，将实施例3收集所得烟酰胺核糖激酶纯酶液用于初步的酶催化，酶浓度0.2mg/mL，温度37℃，pH7，转速900rpm，时间5min，底物添加5g/L NR（烟酰胺核糖），12.5mM六偏磷酸钠，12.5mM七水硫酸镁，5mM ATP。初步获得的比酶活为1.18U/mg左右。（1U定义为单位时间内（1min）生产1umol产物NMN所需的酶量。）
实施例5 酶激活剂组合提升烟酰胺核糖激酶催化效果
不同离子对酶催化过程具有不同的激活效果，本发明选用Na+、Mg2+、Ca2+、K+、Cu2+、Fe3+等离子对催化过程进行调控，在酶活反应体系中加入金属离子，使其终浓度为12.5 mM，其他条件为：酶浓度0.2mg/mL，37℃，pH7，转速900rpm，时间5min，底物添加以5g/L NR（烟酰胺核糖）和5mM ATP为基础。结果如图4所示，单离子添加选出效果最好的离子，它们是Mg2+、Ca2+和 K+，随后组合三种离子获得最佳离子添加组合。最终获得NR，ATP，MgSO4，CaCl2的底物添加组合，该组合下酶催化活性提高了1倍以上。
实施例6 烟酰胺核糖激酶在高温环境中的催化效果
工业生产中常高温环境，若催化剂可以在高温环境进行高效催化，对后续的工业应用有利。本实施例考察SPANRK在不同温度下的活性。
温度梯度设定为20℃，25℃，30℃，37℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，其他条件为：酶浓度0.2mg/mL，pH7，转速900rpm，时间5min，底物添加5g/L NR（烟酰胺核糖），12.5mM六偏磷酸钠，12.5mM七水硫酸镁，5mM ATP。结果如图5所示，温度梯度下烟酰胺核糖激酶比酶活呈现抛物线式变化，其中在50℃条件下仍具有较高酶活，且比常规条件酶催化反应所展现的比酶活都高。同时，本申请进一步表达了被广泛研究的来源于Homo sapiens的NRK（HNRK），并在相同催化条件下，探究HNRK的酶学性质。尽管HNRK在55℃时具有最高酶活，但是随着温度的降低，HNRK的相对酶活较SPANRK下降幅度大，酶活低于SPANRK。
实施例7 烟酰胺核糖激酶在略碱环境中的催化效果
工业生产中也会遇到酸碱面临高温环境，本实施例考察SPANRK在不同pH下的活性。
pH梯度设定为5，6，7，8，9，其他条件为：酶浓度0.2mg/mL，37℃，转速900rpm，时间5min，底物添加5g/L NR（烟酰胺核糖），12.5mM六偏磷酸钠，12.5mM七水硫酸镁，5mM ATP。结果如图6所示，五种pH条件下，pH8是该酶最适反应pH条件，其呈现最高的比酶活。同时SPANRK也可以耐受pH为5的酸性环境，但活性略有下降。在相同的催化反应体系下，HNRK在pH为中性的条件下具有最高酶活。但相较于SPANRK，其耐碱性较差，pH8时，其相对酶活降至20%左右。
实施例8 最优条件下的酶催化
基于前几种实例的探究结果，最终以50℃，pH8，底物5g/L NR，5 mM ATP，12.5mMMgSO4，12.5mM CaCl2为SPAMRK的最佳酶催化条件，在足量底物下催化合成β-烟酰胺单核苷酸，测算其比酶活为6.14 U/mg，相较于初始比酶活提升了5.2倍。在添加适量烟酰胺核糖底物和足量的ATP时，使用最佳条件催化，反应10min，结果（图7）显示SPANRK催化底物到目标产物的转化率可达81%。同时，在最优酶催化条件下，测得HNRK的比酶活以及转化率如下。结果显示，HNRK的酶活仅为5.5U/mg，低于SPANRK，并且转化率也低于SPANRK。
| 酶 | NMN（g/L） | 比酶活（U/mg） | 转化率（%） |
| HNRK | 5.01 | 5.5 | 77 |
| SPANRK | 5.27 | 6.14 | 81 |
β-烟酰胺单核苷酸的HPLC检测方法：
色谱柱：Agilent SB-C18，5μm，4.6×150mm；初始流速：0.8mL/min；分析时间：25min；检测波长：260nm；进样体积：10μl；柱温：25℃；流动相B：0.05mol/L磷酸二氢钾。
实施例9 偶联PPK酶的催化效果
为降低底物ATP的消耗，在实施例7的SPANRK催化体系中加入PPK酶，将反应消耗的ATP回收利用，降低底物成本。PPK酶来源于Escherichia coli K-12 MG1655。结果显示，当反应体系中加入终浓度为0.15g/L的PPK酶后，在转化率不变的情况下，NMN的产量为原产量的1.5倍。
Claims (10)
1.在一种β-烟酰胺单核苷酸合成方法，其特征在于，包括：
以大肠杆菌为宿主菌建立表达烟酰胺核糖激酶的基因工程菌；
诱导表达所述基因工程菌并纯化，获得纯酶液；
以烟酰胺核糖为底物，ATP 为磷酸供体，并添加所述纯酶液构建β-烟酰胺单核苷酸的合成体系，合成β-烟酰胺单核苷酸；
所述烟酰胺核糖激酶来源于绣球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加Mg2+、Ca2+和K+中的一种或两种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加Mg2+和Ca2+。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，添加的金属离子终浓度为10-15mM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中反应温度为40-65℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中反应温度为45-55℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中pH为5-8.5。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中pH为7.5-8.5。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸的合成体系中添加PPK酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PPK酶添加量为终浓度0.1-0.2g/L。
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