CN118091145A - 一种吖啶酯结合物浓缩液和工作液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吖啶酯结合物浓缩液和工作液及其应用，属于化学发光免疫分析技术领域。其中，所述缓冲液为含有6~10‰无机盐、1~3‰防腐剂、0.5~2‰Tween 20、0.2~1‰Brij 35、3~8‰BSA和0.2~1‰EDTA‑Na2的MES缓冲液，所述缓冲液的浓度为100~200mmol/L，pH为6.0±0.1。本发明的缓冲液利用MES酸性体系，通过优化组分和含量，使得吖啶酯标记IL‑2R抗体和吖啶酯标记IL‑6抗体等吖啶酯结合物的稳定性显著提高，无论是浓缩液形式和工作液形式，均能够长期稳定保存。
Description
技术领域
本发明属于化学发光免疫分析技术领域，具体地，涉及一种吖啶酯结合物浓缩液和工作液及其应用。
背景技术
化学发光免疫分析法是近三十年来迅速发展起来的非放射性免疫分析方法，属于一种超高灵敏度的微量测定技术。它通过化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其他相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。化学发光免疫分析法一般使用直接发光或者酶促发光，其中吖啶酯是一种应用较广的一种直接发光的标记物。
吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，目前广泛应用于体外诊断技术当中。在碱性条件下，吖啶酯分子受到过氧化氢攻击生成二氧乙烷，分解为二氧化碳和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时会发出波长为430nm的光。利用这一性质，用吖啶酯标记抗体后，在碱性条件下以一个稳定的酰胺键与蛋白质结合形成吖啶酯结合物，加激发剂激活后发光，通过标准光度计收集光子来检测吖啶酯结合物。吖啶酯化学发光体系属于直接发光闪光型，发光时间短（小于2秒），可以实现快速检测且背景低、标记效率高。
吖啶酯结合物一般以浓缩液的形式保存，使用时稀释至工作浓度，形成工作液。然而，吖啶酯结合物的浓缩液稳定性较差，会导致在使用时工作液的RLU升高或者降低；并且，吖啶酯结合物的工作液稳定性也较差，导致工作液保存期限过短，不能满足检测需求。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种用于制备吖啶酯结合物浓缩液或工作液的缓冲液及其由其制备的稳定性突出的吖啶酯结合物浓缩液和吖啶酯结合物工作液。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种缓冲液在制备吖啶酯结合物浓缩液或工作液中的应用，所述缓冲液为含有6~10‰无机盐、1~3‰防腐剂、0.5~2‰ Tween 20、0.2~1‰ Brij 35、3~8‰ BSA和0.2~1‰ EDTA-Na2的MES缓冲液，所述缓冲液的浓度为100~200mmol/L，pH为6.0±0.1，所述吖啶酯结合物为吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
发明人在科研过程中发现，吖啶酯结合物并没有预期中稳定，在一般的缓冲液中易水解，由此导致保存时吖啶酯结合物浓度降低；进一步发现，无论是吖啶酯结合物浓缩液还是吖啶酯结合物工作液，都会出现上述不稳定的情况，导致吖啶酯结合物难以长期保存。并且，现有技术中的缓冲液，对于不同的吖啶酯结合物，具有不同的稳定性，而利用本发明的上述缓冲液，可能使得任意吖啶酯结合物的稳定性都非常高，尤其是针对吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述无机盐为NaCl、KCl、MgCl2和/或ZnCl2。在本发明的一些优选实施方案中，所述无机盐为KCl。
在本发明的一些实施方案中，所述防腐剂为KroVin系列防腐剂中的至少一种和/或ProClin系列防腐剂中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述KroVin系列防腐剂包括KroVin 100、KroVin 400、KroVin 500和KroVin 750；所述ProClin系列防腐剂包括ProClin 50、ProClin150、ProClin 200、ProClin 300、ProClin 950和ProClin 5000。
在本发明的一些实施方案中，所述缓冲液除上述提到的溶质外，不再包括其他溶质，尤其是不包括动物血清（包括但不限于山羊血清、小鼠血清）。
在本发明的一些优选实施方案中，所述Brij 35的浓度为0.3~0.5‰。
在本发明的一些优选实施方案中，所述EDTA-Na2的浓度为0.3~0.5‰。
在本发明中，所述吖啶酯结合物浓缩液和吖啶酯结合物工作液的区别仅在于所述吖啶酯结合物的浓度不同。在吖啶酯结合物浓缩液中，所述吖啶酯结合物的浓度为25~50μg/mL，优选为30μg/mL；在吖啶酯结合物工作液中，所述吖啶酯结合物的浓度为0.5~1μg/mL，优选为0.6μg/mL。
在本发明的一些实施方案中，所述吖啶酯结合物浓缩液通过向上述任一种缓冲液中加入25~50μg/mL所述吖啶酯结合物制备得到。
在本发明的一些实施方案中，所述吖啶酯结合物工作液通过向上述任一种缓冲液中加入0.5~1μg/mL所述吖啶酯结合物制备得到。在本发明的另一些实施方案中，所述吖啶酯结合物工作液通过将所述吖啶酯结合物浓缩液稀释50倍得到，具体地，利用制备所述吖啶酯结合物浓缩液相同的缓冲液进行稀释。
本发明第二方面提供一种吖啶酯结合物浓缩液，所述吖啶酯结合物浓缩液通过向上述任一种缓冲液中加入25~50μg/mL所述吖啶酯结合物制备得到，所述吖啶酯结合物为吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
在本发明中，所述吖啶酯结合物浓缩液的制备方法有多种其他形式，不限于向所述缓冲液中加入所述吖啶酯结合物，当然也可以是将上述缓冲液加入至含有所述吖啶酯结合物的容器中，还可以是与其他溶质一样在配制时就按比例加入，无论哪种制备形式，都应落入本发明的保护范围。
由此，本发明还提供一种吖啶酯结合物浓缩液，含有6~10‰无机盐、1~3‰防腐剂、0.5~2‰ Tween 20、0.2~1‰ Brij 35、3~8‰ BSA、0.2~1‰ EDTA-Na2和25~50μg/mL吖啶酯结合物，所述吖啶酯结合物浓缩液利用MES缓冲液，所述MES缓冲液的浓度为100~200mmol/L，pH为6.0±0.1。
本发明第三方面提供一种吖啶酯结合物工作液，所述吖啶酯结合物工作液通过向上述任一种缓冲液中加入0.5~1μg/mL所述吖啶酯结合物制备得到；或者，所述吖啶酯结合物工作液通过将本发明第二方面所述吖啶酯结合物浓缩液稀释50倍得到，具体地，利用制备所述吖啶酯结合物浓缩液相同的缓冲液进行稀释。
同样地，在本发明中，所述吖啶酯结合物工作液的制备方法也有多种其他形式，不限于向所述缓冲液中加入所述吖啶酯结合物，当然也可以是将上述缓冲液加入至含有所述吖啶酯结合物的容器中，还可以是与其他溶质一样在配制时就按比例加入，无论哪种制备形式，都应落入本发明的保护范围。
由此，本发明还提供一种吖啶酯结合物工作液，含有6~10‰无机盐、1~3‰防腐剂、0.5~2‰ Tween 20、0.2~1‰ Brij 35、3~8‰ BSA、0.2~1‰ EDTA-Na2和0.5~1μg/mL吖啶酯结合物，所述MES缓冲液的浓度为100~200mmol/L，pH为6.0±0.1。
本发明第四方面提供本发明第二方面所述的吖啶酯结合物浓缩液或本发明第三所述的吖啶酯结合物工作液在制备化学发光免疫分析的试剂盒中的应用。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
现有技术中，吖啶酯结合物无论是浓缩液形式还是工作液形式，随着保存时间的增加，都会出现吖啶酯结合物水解导致浓度降低，从而难以长期保存。本发明用于制备吖啶酯结合物浓缩液或工作液的缓冲液利用MES酸性体系，通过优化组分和含量，使得吖啶酯标记IL-2R抗体和吖啶酯标记IL-6抗体等吖啶酯结合物的稳定性显著提高，无论是浓缩液形式还是工作液形式，长期保存性能仍然稳定。其中，浓缩液和工作液在2~8℃保存至1年，整体检测信号值偏差的绝对值仍在5%以内；在37℃保存12天，整体检测信号值偏差的绝对值仍在10%以内，表明稳定性非常高。
另一方面，现有技术中的缓冲液，对于不同的吖啶酯结合物，具有不同的稳定性，例如本发明实施例1中配方#0的缓冲液，吖啶酯标记IL-6抗体在其中进行保存时稳定性相对较好，但吖啶酯标记IL-2R抗体在其中进行保存时稳定性显著较差。利用本发明的上述缓冲液，可能使得任意吖啶酯结合物在其中保存时稳定性都非常高，尤其是针对吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
附图说明
图1示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存90天的测试结果。
图2示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存90天的测试结果。
图3示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃保存1年的测试结果。
图4示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃保存1年的测试结果。
图5示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在37℃保存12天的测试结果。
图6示出了配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在37℃保存12天的测试结果。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其他的组分、步骤或过程的存在，且与这些其他的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，除了对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
术语“偏差”是指吖啶酯标记抗体浓缩液或吖啶酯标记抗体工作液保存一定时间后，相对于第0天时用于免疫荧光检测时的检测信号值的变化，即：
。
术语“检测信号值变化不大”、“检测信号值变化较小”、“检测信号值相对比较稳定”、“检测信号值稳定性较好”等均是指检测信号值偏差的绝对值不大于10%。
术语“检测信号值变化较大”、“检测信号值不稳定”等均是指检测信号值偏差的绝对值大于10%。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 用于保存吖啶酯结合物的缓冲液的稳定性测试
1. 缓冲液
一般用于保存吖啶酯标记的抗体/抗原的缓冲液的配方（配方#0）如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
2. 吖啶酯结合物浓缩液和工作液
本实施例利用上述缓冲液分别制备吖啶酯标记IL-2R抗体（Thermo、14-0259-82）浓缩液和吖啶酯标记IL-6抗体（Thermo、M620）浓缩液，其中，各吖啶酯标记抗体浓缩液中相应吖啶酯标记抗体的浓度均为：30μg/mL。
将上述吖啶酯标记抗体浓缩液利用上述缓冲液稀释50倍，得到吖啶酯标记抗体工作液，由此，各吖啶酯标记抗体工作液中相应吖啶酯标记抗体的浓度均为：0.6μg/mL。
3. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试，测试方法如下：将工作液放置于全自动化学发光仪器的试剂盘中，将IL-6（BioLegend，570804）校准品以及IL-2R（Thermo、RP-75591）校准品放入日立杯中，设置重复测试次数，然后点击开始测试，测试完成后，整理实验数据。
后续实施例的测试均采用与上述相同的方法。
结果如表1和表2所示。
表1 配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表2 配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表1和表2可知，配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存时，各浓度点（整体）检测信号值（RLU）持续升高，最大偏差达到97.18%；配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存时，本底（零浓度缓冲液）检测信号值偏差相对较大，其他各浓度点检测信号值基本不变。
4. 工作液的稳定性
将配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱中保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表3和表4所示。
表3 配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表4 配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表3和表4可知，配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存时，整体检测信号值持续升高，并且在2～8℃以及37℃中表现一致；配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃保存时，本底检测信号值有持续升高的趋势，在14天时，偏差达到159.23%。配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在37℃保存3天时，本底检测信号值升高，偏差达到193.78%。
由此可见，配方#0的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液以及吖啶酯标记IL-6抗体工作液表现出了不同的不稳定性，表明配方#0的缓冲液的普适性不强。为解决该问题，在以下实施例中，发明人对缓冲液的配方进行调整和优化。
实施例2 缓冲液pH的调整对稳定性的影响
发明人在配方#0中Tris的基础上，调整了缓冲液的pH值。结果发现，pH在7.5～9.0之间均与实施例1具有相同的检测结果，表明pH值对稳定性的影响不大。
实施例3 将Tris-HCl缓冲体系替换为PBS缓冲体系
1. 缓冲液
发明人将实施例1配方#0的Tris-HCl缓冲体系替换成PBS缓冲体系，得到新的缓冲液的配方（配方#1），如下：
以1000mL计，包括14.42g Na2HPO4·2H2O、2.23g NaH2PO4·2H2O、9g NaCl、2gProclin 300、1g Tween 20、5g BSA，pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表5和表6所示。
表5 配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表6 配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表5和表6可知，配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存时，所有浓度点检测信号值偏差较配方#0时降低，2～8℃放置3天，各浓度点检测信号值持续升高，最大偏差接近60%；配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存时，各浓度点检测信号值降低，本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表7和表8所示。
表7 配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表8 配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表7和表8可知，配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃保存时，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近50%；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过284%。配方#1的缓冲液制备的有吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差约8%；37℃放置3天，整体检测信号值变化不大，偏差绝对值在6%以内。
由此可见，配方#1的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液，本底检测信号值偏差有所下降，但仍不能满足检测的要求。
实施例4 将Tris-HCl缓冲体系替换为MOPS缓冲体系
1. 缓冲液
发明人将实施例1配方#0的Tris-HCl缓冲体系替换成MOPS缓冲体系，得到新的缓冲液的配方（配方#2），如下：
以1000mL计，包括20.93g MOPS、9g NaCl、5g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA，pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表9和表10所示。
表9 配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表10 配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表9和表10可知，配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存时，2～8℃放置3天，各浓度点检测信号值持续升高，升幅相对于配方#0虽有降低，但最大偏差仍接近30%（26.83%）；配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存时，各浓度点检测信号值基本不变，本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表11和表12所示。
表11 配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表12 配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表11和表12可知，配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃保存时，整体检测信号值偏差不大，实时稳定性较好，最大偏差绝对值在6%以内（5.385%）；37℃放置3天，整体检测信号值下降，最大偏差绝对接近18%（-17.57%）。配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，整体检测信号值变化不大，短期内实时稳定性较好，最大偏差约6%（6.08%）；37℃放置3天，整体检测信号值下降，最大偏差绝对值接近20%（-19.22%）。
由此可见，配方#2的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液以及吖啶酯标记IL-6抗体工作液，本底检测信号值偏差有进一步下降，但仍不能满足检测的要求。
实施例5 将Tris-HCl缓冲体系替换为MES缓冲体系
1. 缓冲液
发明人将实施例1配方#0的Tris-HCl缓冲体系替换成MES缓冲体系，得到新的缓冲液的配方（配方#3），如下：
以1000mL计，包括21.1g MES、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA，pH为6.0±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表13和表14所示。
表13 配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表14 配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表13和表14可知，配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存时，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近12%（11.53%）；配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存时，各浓度点检测信号值基本不变，本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表15和表16所示。
表15 配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表16 配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表15和表16可知，配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置14天，实时稳定性较差，最大偏差超过16%（16.12%）；37℃放置3天，最大偏差（本底检测信号值偏差）接近20%（19.69%）。配方#3的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差接近8%；37℃放置3天，本底检测信号值偏差接近12%。
综合比较实施例3~实施例5，将Tris-HCl缓冲体系分别替换为PBS缓冲体系、MOPS缓冲体系和MES缓冲体系后，浓缩液和工作液表现出不同的稳定趋势：
对于制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液，各缓冲体系下检测信号值均没有太大变化，但对于制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液，对于PBS缓冲体系，在2~8℃保存时，所有浓度点检测信号值偏差较配方#0时降低，2～8℃放置3天，各浓度点检测信号值持续升高，最大偏差接近60%；MOPS缓冲体系检测信号值最大偏差接近30%，而MES缓冲体系检测最大信号值偏差为12%左右。
对于制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液，对于PBS缓冲体系，2～8℃放置14天本底检测信号值偏差约8%；37℃放置3天，整体检测信号值变化不大，偏差绝对值在6%以内；对于MOPS缓冲体系，2～8℃放置14天，整体检测信号值变化不大，短期内实时稳定性较好，偏差6%以内，37℃放置3天，整体检测信号值下降，偏差接近20%；对于MES缓冲体系，2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差接近8%；37℃放置3天，本底检测信号值偏差接近12%。对于制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液，对于PBS缓冲体系，在2~8℃保存14天，最大检测信号值偏差接近50%，37℃放置3天，检测信号值偏差最大更是超过284%；对于MOPS缓冲体系，在2~8℃保存14天，检测信号值偏差绝对值在6%以内，37℃放置3天，整体检测信号值下降，检测信号值偏差接近20%；对于MES缓冲体系，在2~8℃放置14天，偏差在6%左右；37℃放置3天，偏差接近20%。
以上结果表明，将Tris-HCl缓冲体系替换为不同的缓冲体系后，对吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液和吖啶酯标记IL-2R抗体工作液的稳定性产生了不同的影响，对于吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液，MES缓冲体系为最佳选择，而对于吖啶酯标记IL-2R抗体工作液，MOPS缓冲体系和MES缓冲体系效果相当。这种不一致性仍然会对实际应用带来不便和不良影响，促使发明人对缓冲液的其他组分进行优化。
实施例6 将NaCl替换为KCl
1. 缓冲液
发明人将实施例1配方#0中的NaCl替换成KCl，得到新的缓冲液的配方（配方#4），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g KCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将利用配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表17和表18所示。
表17 配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表18 配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表17和表18可知，配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值同样持续升高，实时稳定性有所改善，最大偏差降低至80%以下（76.56%）；配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值同样基本不变，本底检测信号值稳定性也变得更好。
3. 工作液的稳定性
将配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表19和表20所示。
表19 配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表20 配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表19和表20可知，配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，但偏差低于配方#0，实时稳定性有较大改善，最大偏差接近100%（98.92%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差降低至266%以下（265.22%）。配方#4的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差接近40%（38.73%）；37℃放置3天，本底检测信号值偏差接近81%（80.95%），相对于配方#0显著降低。
以上结果表明，缓冲液中NaCl替换成KCl，检测信号值偏差显著降低，这是发明人不曾预料到的，因为NaCl和KCl性质类似，通常情况下可以任选其一，但在本实施例中，发明人证明使用KCl的效果更好。然而，单纯将缓冲液中NaCl替换成KCl，改进效果十分有限，促使发明人对其他组分进行优化。
实施例7 增加表面活性剂Tween 80
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加一种表面活性剂Tween 80，得到新的缓冲液的配方（配方#5），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、1gTween 80、5g BSA，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表21和表22所示。
表21 配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表22 配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表21和表22可知，配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近80%（77.52%）；配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值基本不变，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表23和表24所示。
表23 配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表24 配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表23和表24可知，配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近111%（110.08%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近240%（238.10%）。配方#5的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差接近44%（43.99%）；37℃放置3天，本底检测信号值偏差仍较大，接近110%（109.97%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加Tween 80，稳定性虽有提高，但十分有限，影响实际应用。
实施例8 增加表面活性剂Brij 35
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加另外一种表面活性剂Brij 35，得到新的缓冲液的配方（配方#6），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、0.1gBrij 35、5g BSA，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出利用配方#6的缓冲液稀释至工作液浓度进行测试。结果如表25和表26所示。
表25 配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表26 配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表25和表26可知，配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近70%（67.84%）；配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值基本不变，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表27和表28所示。
表27 配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表28 配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表27和表28可知，配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过95%（95.25%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近180%（176.34%）。配方#6的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值偏差超过20%（21.10%）；37℃放置3天，本底检测信号值升高幅度较大，偏差接近70%（69.41%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加Brij 35，同样地，稳定性虽有提高，但检测信号值偏差仍然超出实际检测要求，影响实际应用。
综合实施例7和实施例8，发明人尝试添加两种不同的表面活性剂，发现添加Brij35对吖啶酯标记抗体稳定性的改善更明显，但仍然十分有限，促使发明人对其他组分进行优化。
实施例9 增加螯合剂EDTA-Na2
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加螯合剂EDTA-Na2，得到新的缓冲液的配方（配方#7），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA、0.1g EDTA-Na2，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出利用配方#7的缓冲液稀释至工作液浓度进行测试。结果如表29和表30所示。
表29 配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表30 配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表29和表30可知，配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近50%（48.15%）；配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值基本不变，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表31和表32所示。
表31 配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表32 配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表31和表32可知，配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过110%（110.08%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过170%（170.12%）。配方#7的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值升高，偏差超过15%（15.16%）；37℃放置3天，本底检测信号值升高，偏差接近50%（47.98%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加螯合剂EDTA-Na2，同样地，稳定性虽有提高，但十分有限，影响实际应用。
实施例10 增加螯合剂DTPA
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加螯合剂DTPA，得到新的缓冲液的配方（配方#8），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA、0.1g DTPA，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出利用配方#8的缓冲液稀释至工作液浓度进行测试。结果如表33和表34所示。
表33 配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表34 配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表33和表34可知，配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，本底检测信号值偏差超过25%（25.80%）；配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值略有升高，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表35和表36所示。
表35 配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表36 配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表35和表36可知，配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近55%（54.01%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过157%（157.63%）。配方#8的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值升高最多，偏差接近12%（11.98%）；37℃放置3天，本底检测信号值升高仍最明显，偏差接近25%（24.03%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加螯合剂DTPA，同样地，稳定性虽有提高，但十分有限，影响实际应用。
综合实施例9和实施例10，发明人尝试添加两种不同的螯合剂，发现添加DTPA对吖啶酯标记抗体稳定性的改善更明显，但是会降低信噪比，为6.5左右，灵敏度降低，促进发明人对其他组分进行优化。
实施例11 增加山羊血清
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加山羊血清，得到新的缓冲液的配方（配方#9），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA、10g 山羊血清，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表37和表38所示。
表37 配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表38 配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表37和表38可知，配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过55%（55.58%）；配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值基本不变，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表39和表40所示。
表39 配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表40 配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表39和表40可知，配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过74%（74.94%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过107%（107.73%）。配方#9的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值升高最多，偏差超过35%（35.28%）；37℃放置3天，本底检测信号值升高仍最明显，偏差接近62%（61.71%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加山羊血清，同样地，稳定性虽有提高，但十分有限，影响实际应用。
实施例12 增加小鼠血清
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上增加小鼠血清，得到新的缓冲液的配方（配方#10），如下：
以1000mL计，包括12.12g Tris、9g NaCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、5g BSA、10g小鼠血清，浓盐酸调节pH为7.2±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表41和表42所示。
表41 配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表42 配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表41和表42可知，配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近55%（54.23%）；配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，本底检测信号值偏差绝对值超过8%（-8.16%），但是会降低信噪比，仅2.5左右，灵敏度降低。
3. 工作液的稳定性
将配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表43和表44所示。
表43 配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表44 配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表43和表44可知，配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近85%（83.96%）；37℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差接近210%（209.27%）。配方#10的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，本底检测信号值升高最多，偏差接近30%（26.57%）；37℃放置3天，本底检测信号值升高仍最明显，偏差接近80%（78.26%）。
由此可见，在缓冲液中单纯添加小鼠血清，同样地，稳定性虽有提高，但十分有限，影响实际应用。
综合实施例11和实施例12，发明人尝试添加两种不同的动物血清，发现添加山羊血清对吖啶酯标记抗体稳定性的改善更明显，但仍然十分有限，促使发明人对其他组分进行优化。
实施例13 替换缓冲体系、替换KCl、增加山羊血清、Brij 35和EDTA-Na2
基于实施例3~实施例12的优化过程，发明人尝试同时选择改变多个组分，以期获得使得吖啶酯标记抗体更加稳定的缓冲液。
1. 缓冲液
发明人在实施例1的基础上将Tris-HCl体系替换为MES缓冲体系，加入Brij 35、EDTA-Na2和山羊血清并替换NaCl为KCl，得到新的缓冲液的配方（配方#11），如下：
以1000mL计，包括21.1g MES、9g KCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、0.1g Brij35、5g BSA、0.3g EDTA-Na2、10g山羊血清，pH为6.0±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表45和表46所示。
表45 配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表46 配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表45和表46可知，配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值持续升高，实时稳定性较差，最大偏差超过30%（30.28%）；配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，整体检测信号值变化不大。
3. 工作液的稳定性
将配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表47和表48所示。
表47 配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表48 配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表47和表48可知，配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值变化不大，最大偏差不到7%（6.37%）；37℃放置3天，本底检测信号值偏差接近30%（29.35%）。配方#11的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，各浓度点检测信号值变化不大；37℃放置3天，各浓度点检测信号值偏差绝对值为15%~20%。
由此可知，通过替换缓冲体系和无机盐，同时增加山羊血清、Brij 35和EDTA-Na2能够提高吖啶酯标记抗体的稳定性，但仍不够理想。
实施例14 替换缓冲体系、替换KCl、增加Brij 35和EDTA-Na2
1. 缓冲液
发明人在实施例13的基础上去除山羊血清（山羊血清的成本较高），得到新的缓冲液的配方（配方#12），如下：
以1000mL计，包括21.1g MES、9g KCl、2g Proclin 300、1g Tween 20、0.1g Brij35、5g BSA、0.3g EDTA-Na2，pH为6.0±0.1。
吖啶酯标记抗体及其浓缩液和工作液的配制方法同实施例1。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表49和表50所示。
表49 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
表50 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃保存的测试结果
由表49和表50可知，配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置3天，整体检测信号值较稳定，偏差绝对值在6%以内；配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值基本不变，并且本底检测信号值稳定性较好。
3. 工作液的稳定性
将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液置于2~8℃冰箱保存至14天，分别于第0天、第7天和第14天进行测试。另外，分别将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至3天，分别于第0天、第1天和第3天进行测试。结果如表51和表52所示。
表51 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
表52 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃和37℃保存的测试结果
由表51和表52可知，配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置3天，整体检测信号值偏差绝对值均在5%以内；37℃放置3天，整体检测信号值变化偏差绝对值仍均在5%以内。配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置14天，整体检测信号值偏差不大，最大仅为5.17%；37℃放置3天，整体检测信号值偏差也不大，最大仍为5.17%。
由此可见，在本实施例中，通过更换为MES缓冲体系和无机盐，同时增加螯合剂EDTA-Na2和Brij 35，制备得到的吖啶酯标记IL-2R抗体和吖啶酯标记IL-6抗体的浓缩液和工作液的稳定性均非常好。
实施例15 长期保存实验
1. 缓冲液
采用实施例14的吖啶酯标记抗体浓缩液和工作液进行测试。
2. 浓缩液的稳定性
浓缩液一般置于2~8℃保存，将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体浓缩液置于2~8℃冰箱保存至90天，分别于第0天、第10天、第30天、第60天和第90天取出稀释至工作液浓度进行测试。结果如表53、表54和图1、图2所示。
表53 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液中在2~8℃保存90天的测试结果
表54 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液中在2~8℃保存90天的测试结果
由表53、表54和图1、图2可知，配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体浓缩液在2~8℃放置90天，整体检测信号值较稳定，偏差绝对值在5%以内；配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体浓缩液在2~8℃放置时，各浓度点检测信号值较稳定，偏差绝对值同样在5%以内。
3. 工作液的稳定性
将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于2~8℃冰箱保存1年，分别于第0天、第10天、第30天、第60天、第90天、第180天、第240天和第365天进行测试。结果如表55、表56和图3、图4所示。
表55 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃保存1年的测试结果
表56 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在2~8℃保存1年的测试结果
由表55、表56和图3、图4可知，配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在2~8℃放置1年，整体检测信号值偏差绝对值在5%以内。配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液2～8℃放置1年，整体检测信号值偏差绝对值也在5%以内。
另外，分别将配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记抗体工作液置于37℃恒温培养箱保存至12天（37℃加速1天，相当于2～8℃保存1.5个月），分别于第0天、第5天、第8天和第12天进行测试。结果如表57、表58和图5、图6所示。
表57 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在37℃保存12天的测试结果
表58 配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液在37℃保存12天的测试结果
由表57、表58和图5、图6可知，配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体工作液在37℃放置12天，整体检测信号值变化不大，偏差绝对值不超过10%。配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-6抗体工作液37℃放置12天，整体检测信号值偏差绝对值也在10%以内。
由此可见，在本实施例中，通过更换为MES体系和无机盐，同时增加了其中EDTA-Na2以及Brij 35的含量，得到的配方#12的缓冲液制备的吖啶酯标记IL-2R抗体和吖啶酯标记IL-6抗体的浓缩液和工作液的稳定性均非常好，能够保存时间较长，超出本领域技术人员预期。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1. 一种缓冲液在制备吖啶酯结合物浓缩液或工作液中的应用，其特征在于，所述缓冲液为含有6~10‰无机盐、1~3‰防腐剂、0.5~2‰ Tween 20、0.2~1‰Brij 35、3~8‰ BSA和0.2~1‰EDTA-Na2的MES缓冲液，所述缓冲液的浓度为100~200mmol/L，pH为6.0±0.1，所述吖啶酯结合物为吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述无机盐为NaCl、KCl、MgCl2和/或ZnCl2。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防腐剂为KroVin系列防腐剂中的至少一种和/或ProClin系列防腐剂中的至少一种。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述KroVin系列防腐剂包括KroVin 100、KroVin 400、KroVin 500和KroVin 750；所述ProClin系列防腐剂包括ProClin 50、ProClin150、ProClin 200、ProClin 300、ProClin 950和ProClin 5000。
5. 根据权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于，所述Brij 35的浓度为0.3~0.5‰。
6.根据权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于，所述EDTA-Na2的浓度为0.3~0.5‰。
7.根据权利要求1~4任一所述的应用，其特征在于，所述吖啶酯结合物浓缩液通过向所述的缓冲液中加入所述吖啶酯结合物制备得到。
8.一种吖啶酯结合物浓缩液，其特征在于，通过向权利要求1中所述的缓冲液中加入25~50μg/mL所述吖啶酯结合物制备得到，所述吖啶酯结合物为吖啶酯标记IL-2R抗体或吖啶酯标记IL-6抗体。
9.一种吖啶酯结合物工作液，其特征在于，利用所述权利要求1中所述的缓冲液将权利要求8所述的吖啶酯结合物浓缩液稀释50倍得到。
10.权利要求8所述的吖啶酯结合物浓缩液或权利要求9所述的吖啶酯结合物工作液在制备化学发光免疫分析的试剂盒中的应用。
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-
2024
- 2024-04-28 CN CN202410521394.9A patent/CN118091145B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
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| CN118091145B (zh) | 2024-06-21 |
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