CN113533273B - 一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用，该标记方法能够被应用于喹乙醇或者庆大霉素的检测中。本发明中制备的喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物结构更稳定，荧光信号更强，检测灵敏度更高。新型双功能螯合剂2‑S‑(4‑氨基苯)‑1，4，7，10四氮杂环壬烷‑1，4，7，10‑四乙酸具有四氮闭环结构特征，能更好的结合Eu3+离子，结合位点环形包围住Eu3+离子，复合物更稳定，荧光强度和信号更好，检测灵明度更高，检测效果更佳。
Description
技术领域
本发明属于荧光免疫分析技术领域，具体涉及一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用。
背景技术
喹乙醇(Olaquindox，OLA)是一种抗菌促生长剂，曾广泛应用于水产养殖，一度被称为“水产瘦肉精”。喹乙醇的毒副作用不容小觑，存在明显的遗传毒性和蓄积毒性，因此国内外相继制定了严格的使用规范和残留限量标准。尽管如此，抗菌促生长效果好且廉价的喹乙醇目前仍被违规添加使用。因此，加强喹乙醇的检测监督，特别是加强喹乙醇检测技术的研究极为必要。
喹乙醇的残留检测方法，主要包括传统的仪器分析和免疫分析两大类。其中仪器法主要包括光谱法、色谱法以及液质联用技术等，仪器分析准确度高、精密度强，但其样品前处理过程复杂繁琐、耗时长、需要专业技术人员操作、仪器试剂等价格昂贵，无法在基层得到极大推广。免疫分析技术凭借着其高效、快速、高灵敏度以及高特异性等优势广泛应用于小分子药物残留检测中。目前，酶联免疫吸附实验(ELISA)的应用最广泛、发展最成熟，关于ELISA的各种检测报道非常多，但国内外尚未有关于喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测方面的任何报道，因此开发一种喹乙醇时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)的检测方法有重要意义。
时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是近年来发展迅速的一种检测手段。现有技术中，采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法检测喹乙醇等物质，荧光性号较弱，灵敏度不高。
因此，提供一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法是非常必要和有意义的。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法及应用。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：
(1)将2-10mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸溶解于2mL，0.01mol·L-1、pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入200-700μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取10-30mg纯化后的单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
(4)将B液逐滴加入C液中，然后调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，0.01mol·L-1，pH＝7.4的HEPES缓冲液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.11-0.15g EuCl3·6H2O，用2-10mL超纯水配成EuCl3溶液，此为F液；
(7)取100-500μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用2-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
进一步地，所述单克隆抗体为喹乙醇单克隆抗体或者庆大霉素单克隆抗体。
一种提高喹乙醇时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：
(1)将2-10mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸溶解于2mL，0.01mol·L-1、pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入200-700μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取10-30mg纯化后的喹乙醇单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
(4)将B液逐滴加入C液中，然后调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，0.01mol·L-1，pH＝7.4的HEPES缓冲液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.11-0.15g EuCl3·6H2O，用2-10mL超纯水配成EuCl3溶液，此为F液；
(7)取100-500μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用2-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
一种提高庆大霉素时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：
(1)将2-10mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸溶解于2mL，0.01mol·L-1、pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入200-700μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取10-30mg纯化后的庆大霉素单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
(4)将B液逐滴加入C液中，然后调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，0.01mol·L-1，pH＝7.4的HEPES缓冲液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.11-0.15g EuCl3·6H2O，用2-10mL超纯水配成EuCl3溶液，此为F液；
(7)取100-500μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用2-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸在提高时间分辨荧光信号强度中的应用。
一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法在检测喹乙醇或者庆大霉素中的应用，所述标记方法为以上所述的方法。
本发明的有益效果是：
本发明中制备的喹乙醇或庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物结构更稳定，荧光信号更强，检测灵敏度更高。新型双功能螯合剂2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸具有四氮闭环结构特征，能更好的结合Eu3+离子，结合位点环形包围住Eu3+离子，复合物更稳定，荧光强度和信号更好，检测灵明度更高，检测效果更佳。
附图说明
图1是DOTA、DTPA和EDTA的结构图。
图2是制备喹乙醇抗体标记复合物的路线示意图。
图3是制备庆大霉素抗体标记复合物的路线示意图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。基于本申请提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本申请所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
除非另作定义，本申请所涉及的技术术语或者科学术语应当为本申请所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本申请所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本申请所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；本申请所涉及的“连接”、“相连”、“偶接”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电气的连接，不管是直接的还是间接的。本申请所涉及的”多个“是指大于或者等于两个。“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，“A和/或B”可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。本申请所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
以下实施例中所采用的物质及检测仪器等均可以通过商业途径购得。
以下实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH＝7.4、0.01mol·L-1的磷酸盐缓冲液；实施例中所用的CBS缓冲液均为pH＝9.6、0.05mol·L-1的碳酸盐缓冲液；牛血清白蛋白简称BSA；卵清白蛋白简称OVA，钥孔血蓝蛋白简称KLH；喹乙醇简称OLA；庆大霉素简称GM。
实施例1
一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：
以喹乙醇抗体标记复合物(Eu3+-DOTA-OLA-mAb)的制备为例进行阐述：
(1)称取6mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸(p-NH2-Bn-DOTA，简称DOTA)，溶解于2mL 0.01mol·L-1、pH7.4的HEPES缓冲溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的喹乙醇单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
本实施例中，喹乙醇单克隆抗体(OLA-mAb)采用现有技术中的常规方法制备(参考文献：桑永玉，金仁耀；抗喹乙醇单克隆抗体的研制及其ELISA方法的建立；核农学报，2015，29(6):1081-1087)。腹水采用辛酸-硫酸铵法纯化后过protein A蛋白亲和层析柱纯化，冻干得到OLA-mAb冻干粉。
(4)将B液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2mol·L-1EuCl3溶液，此为F液；
(7)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
SDS-PAGE显示喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为26:1，表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:26。这说明，DOTA螯合剂分别与喹乙醇单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得喹乙醇抗体标记复合物(Eu3+-DOTA-OLA-mAb)。
效果检测：
喹乙醇时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(OLA-HS-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成5μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗板机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％(m/v)的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板4次并拍干。
c.加喹乙醇标样和Eu3+-DOTA-OLA-mAb：将系列浓度的喹乙醇标准液依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-DOTA-OLA-mAb)稀释到2.5μg·mL-1加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板4次并拍干；
d.加增强液：每孔加入增强液200μL，37℃避光振荡反应10min，使用时间分辨荧光分析仪检测；
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
各种试剂、物质的配制：
A.系列浓度的喹乙醇标准液：浓度依次为0ng·mL-1、0.01ng·mL-1、0.05ng·mL-1、0.1ng·mL-1、0.5ng·mL-1、1.0ng·mL-1、2.0ng·mL-1、4.0ng·mL-1、8.0ng·mL-1、16.0ngmL-1、32ng·mL-1，从OLA纯品中稀释得到，稀释液为含5％(v/v)甲醇的0 .01mol·L-1 pH7.4的磷酸盐缓冲液。
B.包被缓冲液CBS：即0.05mol·L-1 pH为9 .6的碳酸盐缓冲液，称取Na2CO31.49g，NaHCO32.93g，调PH至9.6，超纯水定容至1000mL。
C.封闭液：即含2％(m/v，g/mL)脱脂奶粉的0.01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
D.洗涤液：即含体积分数为0 .05％吐温-20的0 .01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
E.稀释液：即含体积分数5％甲醇的0.01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
F.增强液：称取120.0mgа-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)和386.6mg三辛基氧化膦(TOPO)，加入1.0mL无水乙醇将其溶解，再向其中加入2.78g邻苯二甲酸氢钾和少量去离子水，40℃溶解后加入11.8mL冰乙酸和5mL Triton X-100，最后用纯水定容至2000mL。调pH至3.0，用脱脂棉抽滤，将滤液静置过夜，4℃冰箱避光保存，备用。
G：OLA-HS-OVA的制备：采用现有技术中常规的方法制备即可，具体地，
向三口圆底烧瓶中准确加入2.106g喹乙醇和1.60g琥珀酸酐，加入80mL吡啶，115℃下回流反应4h后减压蒸除吡啶，向剩余混合物中加入60mL冰蒸馏水，2mol·L-1HCl调pH至2.0～3.0，4℃下放置过夜。减压抽滤并用冰蒸馏水洗涤3次后抽干，得到的物质即为OLA-HS；
称取14.5mg OLA-HS溶于0.8ml DMF中，加入4.6mg NHS和8.2mg DCC，室温下避光
搅拌反应10h。将反应液离心(2000rpm，10min)，弃去沉淀，上清液为反应液a。
称取20mg OVA溶于5ml磷酸盐缓冲液(PBS，0 .01mol·L-1，PH7.4)中，此为反应液b。
将反应液b置于磁力搅拌器上，4℃下将0.6ml反应液a缓慢滴加到反应液b中，4℃搅拌反应过夜。次日将反应液置于透析袋内，0.01mol·L-1，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析4-5次，然后再用超纯水透析12h，离心弃沉淀，上清分装，得到OLA-HS-OVA，-20℃下保存备用。
实施例2
一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法，包括以下步骤：
以庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-DOTA-GM-mAb)的制备为例进行阐述：
(1)称取6mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸(p-NH2-Bn-DOTA，简称DOTA)，溶解于2mL 0.01mol·L-1、pH7.4 HEPES缓冲溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的GM-mAb冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
GM-mAb采用现有技术中的常规方法制备(参考文献：金仁耀，吴建祥；庆大霉素单克隆抗体的研制及其ELISA方法的建立；核农学报，2013，27(1):88-92)，通过制备腹水后，采用辛酸-硫酸铵粗纯化，再过Protein A亲和层析柱，冻干制备得到GM-mAb冻干粉。
(4)将B液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2mol·L-1EuCl3溶液，此为F液；
(7)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中，PBS(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为庆大霉素抗体标记复合物。
SDS-PAGE显示庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为21:1。表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:21。这说明，DOTA螯合剂分别与庆大霉素单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-DOTA-GM-mAb)。
效果检测
庆大霉素时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(GM-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成4μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗板机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％(m/v)的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板4次并拍干。
c.加庆大霉素标样和Eu3+-DOTA-GM-mAb标记物：将系列浓度的庆大霉素标准液依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-DOTA-GM-mAb)稀释到2μg·mL-1浓度加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板4次并拍干。
d.加增强液：每孔200μL，37℃避光振荡反应10min。
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
各种试剂的配制：
A .系列浓度的庆大霉素标准液：浓度依次为0ng·mL-1、1ng·mL-1、2ng·mL-1、4ng·mL-1、0.5ng·mL-1、8ng·mL-1、16ng·mL-1、32ng·mL-1、64ng·mL-1、128ng·mL-1从庆大霉素纯品中稀释得到，稀释液为0.01mol·L-1 pH7.4的磷酸盐缓冲液。
B.包被缓冲液：即0.05mol·L-1 pH为9.6的碳酸盐缓冲液，称取Na2CO3 1.49g，NaHCO3 2.93g，调PH至9.6，超纯水定容至1000mL。
C.封闭液：即含2％(m/v，g·mL-1)脱脂奶粉的0.01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
D.洗涤液：即含体积分数为0.05％吐温-20的0.01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
E.稀释液：0.01mol·L-1 pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。
F.增强液：称取120.0mgа-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)和386.6mg三辛基氧化膦(TOPO)，加入1.0mL无水乙醇将其溶解，再向其中加入2.78g邻苯二甲酸氢钾和少量去离子水，40℃溶解后加入11.8mL冰乙酸和5mL Triton X-100，最后用水定容至2000mL。调pH至3.0，用脱脂棉抽滤，将滤液静置过夜，4℃冰箱避光保存，备用。
G：GM-OVA合成：采用现有技术中常规的方法制备即可，具体地，
取20mg GM和12mg OVA，分别用1ml超纯水溶解后，将GM溶液逐滴加入OVA溶液中，边滴加边缓慢搅拌；称取62mg碳二亚胺(EDC)溶解于1ml超纯水中后逐滴加入上述混合液中，室温下搅拌反应4h，将反应产物装入透析袋中透析2d，每4h换液1次，换液4-5次后分装，-20℃保存。
对比例1
喹乙醇抗体标记复合物(Eu3+ -EDTA-OLA-mAb)的制备：
(1)称取7mg Aminobenzy-EDTA(以下简称EDTA)，溶解于2mL 0.01mol·L-1、pH7.4HEPES缓冲溶液，制得EDTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的OLA-mAb冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；
(4)将B液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2 mol·L-1EuCl3溶液，此为F液；
(7)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8000Da的透析袋中透析HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
SDS-PAGE显示喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为11:1，表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:11。这说明，EDTA分别与喹乙醇单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得喹乙醇抗体标记复合物。
效果检测：
喹乙醇时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(OLA-HS-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成5μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗扳机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板并拍干。
c.加喹乙醇标样和Eu3+-EDTA-OLA-mAb标记物。将系列浓度的OLA标准液依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-EDTA-OLA-mAb)稀释到2.5μg·mL-1浓度加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板并拍干；
d.加增强液：每孔200μL，37℃避光振荡反应10min。
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
对比例2
喹乙醇抗体标记复合物(Eu3+-DTPA-OLA-mAb)的制备：
(1)称取7mg p-NH2-Bn-DTPA(以下简称DTPA)，溶解于2ml 0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES缓冲溶液，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的OLAmAb冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；所述OLA-mAb溶液的制备方法及浓度等与实施例1中的相同。
将B液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(4)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中用HEPES(0.01mol·L-1 pH7 .4)透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，溶液透析换液5-6次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(5)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2mol·L-1 EuCl3溶液，此为F液；
(6)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中用HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
SDS-PAGE显示喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明喹乙醇时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为9:1，表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:9。这说明，DTPA分别与喹乙醇单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得喹乙醇抗体标记复合物(Eu3+-DTPA-OLA-mAb)。
效果检测：
喹乙醇时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(OLA-HS-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成5μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗扳机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％(m/v)的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板4次并拍干。
c.加喹乙醇标样和Eu3+-DTPA-OLA-mAb标记物。将系列浓度的OLA标准液依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-DTPA-OLA-mAb)稀释到2.5μg·mL-1浓度加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板4次并拍干；
d.加增强液：每孔200μL，37℃避光振荡反应10min，使用时间分辨荧光分析仪检测；
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
对比例3
庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-EDTA-GM-mAb)的制备：
(1)称取7mg Aminobenzy-EDTA(以下简称EDTA)，溶解于2mL 0.01mol·L-1、pH7.4HEPES缓冲溶液，制得EDTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的GM-mAb冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；所述GM-mAb溶液的制备方法及浓度等与实施例2中的相同。
(4)将B液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析换液5-6次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2mol·L-1EuCl3溶液，此为F液；
(7)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中，PBS(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为庆大霉素抗体标记复合物。
SDS-PAGE显示庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为8:1，表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:8。这说明，EDTA分别与庆大霉素单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-EDTA-GM-mAb)。
效果检测
庆大霉素时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(GM-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成4μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗板机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％(m/v)的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板4次并拍干。
c.加庆大霉素标样和Eu3+-EDTA-GM-mAb标记物：将系列浓度的庆大霉素标准液依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-EDTA-GM-mAb)稀释到2μg·mL-1浓度加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板4次并拍干。
d.加增强液：每孔200μL，37℃避光振荡反应10min。
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
对比例4
庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-DTPA-GM-mAb)的制备：
(1)称取7mg p-NH2-Bn-DTPA，溶解于2ml 0.01mol·L-1、pH7.4 HEPES缓冲溶液，制备成DTPA螯合剂溶液，此反应液为A液；
(2)向A液中加入550μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取20mg纯化后的GM-mAb冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液(0.01mol·L-1，pH7.4)，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；所述GM-mAb溶液的制备方法及浓度等与实施例2中的相同。
(4)将AB液逐滴加入C液中，然后使用NaOH调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，HEPES(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析换液5-6次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.121g EuCl3·6H2O，用10mL超纯水配成浓度为3.3×10-2mol·L-1EuCl3溶液，此为F液；
(7)取250μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中，PBS(0.01mol·L-1 pH7.4)溶液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用5-10ml的0.01mol·L-1，pH7 .4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为庆大霉素抗体标记复合物。
SDS-PAGE显示庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的电泳条带比单一的蛋白条带有滞后拖尾现象，说明庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物的分子量比单一蛋白分子量要大，说明偶联成功。通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)方法测定Eu3+含量，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定偶联物蛋白浓度后转化为摩尔浓度计算结合比为10:1，表示个数比，蛋白分子:Eu3+＝1:10。这说明，DTPA分别与庆大霉素单克隆抗体、Eu3+结合，成功制得庆大霉素抗体标记复合物(Eu3+-DTPA-GM-mAb)。
效果检测
庆大霉素时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)测定，测定步骤如下：
a.包被：包被原(GM-OVA)用CBS(0.05mol·L-1，pH9.6)稀释成4μg·mL-1浓度包被于96孔板，每孔100μL，37℃恒温培养箱中孵育2h，洗板机洗板4次并拍干(下同)。
b.封闭：每孔加入用PBS(0.01mol·L-1，pH7.4)配制2％(m/v)的脱脂牛奶300μL，37℃孵育30min，洗板4次并拍干。
c.加庆大霉素标样和Eu3+-DTPA-GM-mAb标记物：将系列浓度的庆大霉素标准液(即GM标准品)依次加入孔中，每孔50μL；将铕标抗体(Eu3+-DTPA-GM-mAb)稀释到2μg·mL-1浓度加入孔中，每孔50μL，振荡30s后置于37℃培养箱中孵育1h，洗板4次并拍干。
d.加增强液：每孔200μL，37℃避光振荡反应10min。
e.读数并分析：读取荧光计数值(CPS)，建立标准曲线并计算IC50值和IC10值。
喹乙醇和庆大霉素时间分辨荧光免疫分析方法测定结果详见下表。
表1不同的抗体标记复合物进行时间分辨荧光免疫分析的测定结果
由表1可知，与对比例1-2相比，本发明实施例1中制备得到的喹乙醇荧光抗体复合物的结合比较高，结构更稳定，IC10、IC50较低，而且采用DOTA为双功能螯合剂制备的荧光标记抗体复合物信号值CPS比采用DTPA和EDTA螯合剂衍生物制备的荧光标记抗体复合物信号值CPS高。
同样地，与对比例3-4相比，实施例2中制备的庆大霉素的荧光抗体复合物的结合比也是最高的，而且其检测分析的灵敏度也是最佳的，信号强度最大。综上，可以说明采用DOTA作为双功能螯合剂制备的复合物离子结合率高，复合物稳定，荧光信号强，建立的TRFIA免疫分析方法的检测灵敏度更高。
本领域的技术人员应该明白，以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (1)
1.一种提高时间分辨荧光信号强度的标记方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)将2-10mg 2-S-(4-氨基苯)-1，4，7，10四氮杂环壬烷-1，4，7，10-四乙酸溶解于2mL，0.01mol·L-1、pH＝7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，制得DOTA螯合剂溶液，此溶液为A液；
(2)向A液中加入200-700μL 20mmol·L-1的戊二醛溶液，室温避光反应过夜，此溶液为B液；
(3)称取10-30mg纯化后的单克隆抗体冻干粉，溶解于3ml HEPES溶液，HEPES溶液浓度0.01mol·L-1，pH7.4，室温下磁力搅拌混匀，此为C液；所述单克隆抗体为庆大霉素单克隆抗体；
(4)将B液逐滴加入C液中，然后调节pH值至9.0，后在4℃下避光搅拌反应4-6h，此为D液；
(5)将D液装入截留分子量为8KDa的透析袋中，0.01mol·L-1，pH＝7.4的HEPES缓冲液透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，后吸取透析袋中的反应液，此为E液；
(6)称取0.11-0.15g EuCl3·6H2O，用2-10mL超纯水配成EuCl3溶液，此为F液；
(7)取100-500μL F液加入E液中，室温避光反应4-6h后置于截留分子量为8KDa的透析袋中透析，透析每隔4h换液1次，共换液4-5次，再用30KDa的超滤离心管7000-9000rpm离心3-5次，用2-10ml的0.01mol·L-1，pH7.4的HEPES溶液复溶，所制备的反应液为庆大霉素时间分辨荧光免疫标记抗体复合物。
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