CN118086361A - 基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，涉及基因工程技术领域，其中所述基因BcWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，通过抑制基因BcWRKY1的表达，促进基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片由绿变黄；而通过促进基因BcWRKY1的表达，抑制基因BcCLH2的表达，则可促使菜叶片由黄变绿；所述基因BcCLH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；本申请提供的基因有助于乌菜的遗传育种。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用。
背景技术
乌菜(Brassica campesttris L.ssp.chinesis(L.)Makino var.rosularis Tsenet Lee)是大白菜(B.campestris L.)的一个亚种，该品种原产于中国，主要分布在江淮流域。它是一种富含矿物质和维生素的营养蔬菜，并展现出五颜六色的叶子。乌菜黄化品种W7-2，在成株期常温下内叶一直保持绿色，经历低温之后，内叶逐渐转黄。转黄后的乌菜入口柔软多汁，品味更为鲜美。
因此研究乌菜转黄的分子机制，为培养乌菜黄化品种提供新的思路或理论依据，是急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，以解决现有技术中乌菜转黄的分子机制不明确等问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明的第一方面，提供一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，所述基因BcWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述应用包括：
通过抑制基因BcWRKY1的表达，促进基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片由绿变黄，或
通过促进基因BcWRKY1的表达，抑制基因BcCLH2的表达，促使菜叶片由黄变绿；
所述基因BcCLH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
进一步，所述抑制基因BcWRKY1的表达包括敲除基因BcWRKY1。
进一步，所述促进基因BcWRKY1的表达包括构建基因BcWRKY1的过表达载体。
进一步，所述乌菜品种为W7-2或WS-1。
本发明的第二方面，提供一种调控乌菜叶片内叶绿素酶活性的方法，该方法包括：
通过抑制所述基因BcWRKY1的表达，促进所述基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片内叶绿素酶活性提升，或
通过促进所述基因BcWRKY1的表达，抑制所述基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片内叶绿素酶活性降低。
本发明的第三方面，还提供一种基因BcWRKY1、基因BcWRKY1编码的蛋白或含有基因BcWRKY1的生物材料在制备用于促进乌菜叶片由绿转黄或由黄转绿的产品中的应用；所述基因BcWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述生物材料为质粒、表达载体或转基因细胞。
本发明的第四方面，还提供一种所述基因BcCLH2在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用。
进一步，所述应用包括：
促进基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片由绿变黄；或
抑制基因BcCLH2的表达，促使菜叶片由黄变绿。
本发明提供的一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，与现有技术相比，具备以下有益效果：
提供的基因BcWRKY1与乌菜叶片黄绿表型的调控相关，通过抑制或过表达基因BcWRKY1，能够用于控制乌菜叶片的黄绿表型，从而有助于培育目标叶片表型的乌菜新品种，为遗传育种提供了新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为基因BcCLH2的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为基因BcCLH2在三个时期的RT-qPCR分析和叶绿素酶活性测定对比图；
图3为基因BcCLH2的烟草瞬时表达分析和亚细胞定位图；
图4为基因BcCLH2的乌菜瞬时表达分析图；
图5为pAbAi-BcCLH2的自激活浓度筛选图；
图6为pAbAi-BcCLH2在乌菜的酵母cDNA文库中筛库结果图；
图7为酵母单杂交实验验证基因BcWRKY1和基因BcCLH2互作图；
图8为双荧光素酶报告实验验证基因BcWRKY1和基因BcCLH2互作图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了解决现有技术中乌菜转黄机制不明确的问题，本申请的主要思路为：
提供一种与乌菜叶黄绿表型相关的基因BcWRKY1，通过上调或抑制该基因的表达，能够有效调控乌菜叶片由绿转黄或由黄转绿，从而为乌菜的遗传育种提供了新的思路。
本申请通过以下实施例，对本申请提供的基因BcWRKY1进行功能性验证。
实施例1
本实施例选取乌菜W7-2品种作为材料(W7-2在生长期间逐渐经历秋冬低温后叶片变黄)。
对乌菜W7-2进行以下操作：
将W7-2幼苗在26±2℃(白天)和20±2℃(夜晚)的温室中种植，光照强度为300μmol m-2s-1，相对湿度为70-80％；在此过程中，乌菜叶片保持绿色(令此过程中所得乌菜叶片对应状态为转黄前(G))。
将长至7-8片叶片的幼苗移栽于6±2℃(白天)和-1±2℃(夜间)、300μmol m-2s-1光强、70-80％相对湿度的低温生长室内，培养12d；在此过程中乌菜叶片逐渐由绿转黄(令此过程中所得乌菜叶片对应状态为转黄后(Y))。
然后，设置温度为26±2℃(白天)和20±2℃(夜晚)，光照强度为300μmol m-2s-1，相对湿度为70-80％，持续12d；在此过程中，乌菜叶片逐渐由黄转绿(令此过程中所得乌菜叶片对应状态为复绿后(RG))。
上述过程中，每3天从中心收集三片完全展开的幼叶。
1、对转黄前(G)、转黄后(Y)和复绿后(RG)三个时期的植物叶片进行总RNA提取及cDNA合成，具体方法为：
用提TakaRa RNA试剂盒分别提取三个时期样本的RNA，经过定量之后，用TRAN反转录试剂盒对RNA进行反转录，体系如表1。
表1
2、乌菜基因BcCLH2的克隆及回收纯化
在乌菜基因组获得基因BcCLH2的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示)，具体的：
用CE-Design软件根据基因序列和pCAMBIA2300载体序列设计好同源臂引物(F:SEQ ID NO.5；R:SEQ ID NO.6)，送通用公司合成引物序列。按表2体系加样，PCR程序为95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃2min，72℃5min。反应后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(图1)。按照TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的DNA片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)的回收。
表2
3、连接载体及转化大肠杆菌
按表3体系加样，吸打混匀，37℃连接30min，迅速放冰上，获得连接产物(包含pCAMBIA2300-BcCLH2和pCAMBIA2300)。将10μL连接产物加入到100μL大肠杆菌中，轻轻吸打混匀，冰上静置5min，42℃热激45～60s，迅速转移至冰上，静置2min。然后向离心管中加入700μL不含抗生素的LB，混匀后37℃200rpm复苏20min，取100μL的复苏液均匀涂布在含有100mg/mL Kan抗生素的培养基上，然后将培养基放入培养箱内，37℃倒置培养过夜。次日挑取8个单菌落于100mg/mL Kan的500μL LB的离心管中，37℃摇床摇5h至菌液浑浊，获得菌液。
表3
取上一步所得的菌液，利用基因上游引物F:SEQ ID NO.5以及载体下游引物R:SEQID NO.7按表4体系加样，PCR程序为95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃2min，72℃5min。反应后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定合格之后，送通用公司测序，若比对成功则基因成功连上载体了，返还菌液和质粒，按菌液跟甘油1:1比例混合，用液氮速冻，放在-80℃储存。
表4
4、农杆菌转化
取100μL农杆菌感受态，然后加入5μL前述所得连接产物(pCAMBIA2300-BcCLH2)，吸打混匀，依次置于冰上5min、液氮5min、37℃水浴5min，加700μL无抗生素的LB，28℃摇床震荡3h。6000rpm一分钟收菌，留取100μL上清并轻轻吸打重悬菌块涂布于含有100mg/mLKan(卡那霉素)和25mg/mL的rif(利福平)的LB板倒置于28度培养箱培养2天，挑取8个单菌落于100mg/mL Kan和25mg/mL的rif的500μL LB的离心管中，28℃摇床摇24h至菌液浑浊。按表4体系加样，PCR程序为95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃2min，72℃5min。反应后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定合格之后，按菌液跟甘油1:1比例混合，用液氮速冻，放在-80℃储存；获得农杆菌转化物。
实施例2
1、乌菜基因BcCLH2在不同时期下表达量的测定
对G，Y和RG三个时期的基因BcCLH2表达量进行测定，具体方法为：
根据SEQ ID NO.1所示基因BcCLH2的核苷酸序列，用Oligo7软件设计基因BcCLH2的荧光引物(BcCLH2-F:SEQ ID NO.8；BcCLH2-R:SEQ ID NO.9)，用于检测基因BcCLH2的表达量，并且以乌菜Actin作为内参基因，引物为F:SEQ ID NO.10；R:SEQ ID NO.11，引物序列送通用生物公司合成。qRT-PCR体系为：Green qPCR SuperMix 10μL，BcCLH2-F 0.4μL，BcCLH2-R 0.4μL，cDNA1μL，DEPC 8.2μL。qRT-PCR程序为：95℃30s，95℃5s，60℃15s，72℃10s，图像采集，循环40次，溶解曲线58℃to 95℃5s，图像采集。
2、叶绿素酶活性测定
称取0.1g样品，加入一1mL的PBS，用研磨机进行研磨。研磨充分之后，2000rpm离心20分钟，吸取上清于1.5ml离心管中。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；在酶标板上待测样品孔中先加入样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL，轻轻晃动混匀；每孔加入酶标试剂100μL，空白板除外；用封板膜封板后置37℃温育60分钟；将20倍浓缩液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干；每孔先加入显色剂A 50μL再加入显色剂B 50μl，轻轻振荡混匀37℃避光显色15min；每孔加终止液50μL，终止反应；以空白孔调0，450nm波长测量各孔的吸光度，测定应在加终止液后15min进行。
qRT-PCR分析结果如图2A所示，基因BcCLH2由G时期至Y时期，表达量明显上调，在而由Y时期至RG时期表达量明显下调，叶绿素酶活测定结果如图2B，可以发现叶绿素酶的活性由G时期至Y时期活性明显升高，而由Y时期至RG时期活性下降。
3、基因BcCLH2的烟草瞬时表达分析和亚细胞定位
Activation buffer的配制：MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)和MgCl2按5：1的比例进行混合，高温灭菌。将实施例1中所得农杆菌转化物在28℃摇床中过夜摇，菌液OD值达到0.8～1.0为宜，4000rpm离心8min，去上清，先用3ml的ddH2O悬浮，4000rpm离心8min，再用Activation buffer悬浮，4000rpm离心8min。以Activation buffer为对照，测定菌液的OD值，用Activation buffer调节菌液OD值为0.8～1.0。以菌液：AS＝1000：1的比例在菌液中加入AS(乙酰丁香酮)。28℃静止培养暗培养3h后注射本氏烟草。注射后，暗处理1天，光下培养2天左右后，在激光共聚焦观察其定位结果。此外，观察注射烟草之后的叶片表型，测量叶片色差值和总叶绿素含量；其中包括：
(1)色差值测定
颜色值的测定：种植后每3天在叶片上表面使用色度仪(DS-700D)测量叶片色度值，测量了10株植物，并在相同的叶片位置重复测量3次。采用CIELAB颜色坐标系统进行色彩数据分析。其中，色差值有三个代表色值：L*、a*、b*。L*表示亮度(黑白)，a*表示红绿，b*表示黄蓝。此外，还有两个色差：值H*(Hue角度)，值C*(Chroma)。
(2)叶绿素含量测定
光合色素(Chl a、Chl b)含量的测定采用Arnon法：将新鲜叶片研磨成粉末，然后加入2.5ml 80％丙酮和少量碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆。再添加3ml丙酮并在黑暗中静置3～5秒。取一张滤纸置于漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒将提取液倒入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中。用滴管吸取95％乙醇将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用95％乙醇沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，最后用95％乙醇定容至刻度。使用TU1950紫外可见分光光度计(PER-SEE，北京，中国)测量在646和663nm波长处的吸光度。其中，Chla(mg/g)、Chl b(mg/g)含量计算如下：
CChl a mg/L＝12.21×A663-2.81×A646；
CChl b mg/L＝20.13×A646-5.03×A663；
Chl a mg/g＝CChl a mg/L×V(L)/Mfresh；
Chl b mg/g＝CChl b mg/L×V(L)/Mfresh。
试验结果如图3所示，通过对本氏烟草瞬时表达基因BcCLH2，结果发现与对照相比，过表达基因BcCLH2的本氏烟草出现了褪绿现象(图3A)，可得过表达基因BcCLH2可使本氏烟草由绿转黄；色差值和总叶绿素含量如表5所示，与对照相比，L*Value值上调8.07％，b*Value值上调18.07％，a*Value值没有明显变化，总Chl含量下调52.6％，亚细胞定位结果显示基因BcCLH2定位在叶绿体中(图3B)。
由上可得，基因BcCLH2的过表达，可促使本氏烟草由绿转黄。
表5
4、基因BcCLH2的乌菜瞬时表达分析
按照烟草瞬时表达的方法注射乌菜常绿品种叶片‘WS-1’，观察注射之后的叶片表型，测量叶片色差值和总叶绿素含量。
通过对乌菜瞬时表达基因BcCLH2，结果如图4所示，与对照相比，过表达基因BcCLH2的乌菜叶片出现了转黄现象。色差值和总叶绿素含量如表6所示，与对照相比，L*Value值，a*Value值和b*Value值都明显上调，总Chl含量明显下调。这些结果表明，基因BcCLH2在乌菜内叶的叶绿素降解中起着关键作用(即基因BcCLH2的过表达，导致乌菜叶片由绿转黄)。
表6
实施例3
1、基因BcCLH2酵母文库筛选
从乌菜基因中提取基因BcCLH2的启动子序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，根据顺式作用元件分析，选取其中-1800～-1000片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)构建诱饵载体进行文库筛选，包括：
根据实施例1中的方法构建pAbAi-BcCLH2重组质粒，其中，引物序列为F:SEQ IDNO.12；R:SEQ ID NO.13；构建完成后，使用BbsI限制性内切酶将1ug pAbAi-BcCLH2重组质粒线性化，具体酶切体系如表7：
表7
酶切一个小时后，回收。按表8体系加样，吸打混匀，30℃水浴30min(15min时翻转6-8次混匀)，42℃水浴15min(7.5min时翻转6-8次混匀)。5000rpm离心40s弃上清，dd H2O400μL重悬，离心30s弃上清，dd H2O 50μL，涂布SD/-Ura平板，培养3-5天后挑选4-5个SD/-Ura平板上的单克隆，进行菌落PCR鉴定；其中，将Carrier DNA加样前还进行以下预处理：将其插入95℃金属浴5min，加热后快速插入冰上。经过琼脂糖凝胶电泳后确认插入条带大小是否正常。选择鉴定正确的单克隆进行AbA浓度筛选。鉴定引物:pAbAi-F:SEQ ID NO.14；pAbAi-R:SEQ ID NO.15。
表8
选择诱饵载体pAbAi-BcCLH2，在50ml YPDA(腺嘌呤硫酸盐酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中，30℃，230～250rpm，培养至OD600达到0.4～0.5。然后，收集Y1H Gold酵母细胞，用3ml 1.1×PEG/LiAc重悬。加入10μg酵母文库质粒(酵母文库是由上海欧易生物医学科技有限公司所构建)和50μLCarrier DNA混合。然后加入1×PEG/LiAc 2.5ml，30℃水浴培养45min；加入160μLDMSO(二甲基亚砜),42℃水浴培养20min；加入YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)3ml，30℃孵育90min。最后将细胞悬浮于1ml 0.9％NaCl溶液中。将培养的细菌稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，分别点在SD/-leu板和SD/-leu/150μL AbA*板，30℃孵育3-5天。当单克隆生长到1-2mm时进行克隆鉴定。结果如下：
重组质粒pAbAi-BcCLH2可以在SD/-Ura板上生长，表明重组质粒可以成功转化酵母细胞，150ng/ml AbA可以抑制背景菌的生长(图5)。Y1HGold(pAbAi-BcCLH2)在酵母文库中进行筛选。在SD/-Leu/AbA(150ng/ml)筛选上共筛选了33个克隆(图6)。通过阳性克隆测序筛选到基因BcWRKY1(转录因子，对应核苷酸序列如SEQ ID NO.4)。
3、酵母单杂交和双荧光素酶报告实验验证基因BcWRKY1和基因BcCLH2互作
(1)酵母单杂交实验
根据实施例1中的方法构建猎物载体pGADT7-BcWRKY1，引物序列为F:SEQ IDNO.16；R:SEQ ID NO.17。选择诱饵载体pAbAi-BcCLH2，在50ml YPDA(腺嘌呤硫酸盐酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)中，30℃，230～250rpm，培养至OD600达到0.4～0.5。然后，收集pAbAi-BcCLH2酵母细胞，用3ml 1.1×PEG/LiAc重悬。加入1μg pGADT7-BcWRKY1/pGADT7重组质粒、5μLCarrier DNA混合。然后加入1×PEG/LiAc 2.5ml,30℃水浴培养30min；加入20μLDMSO，42℃水浴培养15min；高速离心15s，弃上清。最后将细胞悬浮于100μL 0.9％NaCl溶液中。将培养的细菌稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，分别点在SD/-leu板和SD/-leu/150μLAbA*板，30℃孵育3-5天。
结果如图7所示，pAbAi-BcCLH2+pGADT7和pAbAi-BcCLH2+pGADT7-BcWRKY1能够在SD/-leu板上长菌，证明pGADT7-BcWRKY1和pGADT7成功转化到Y1H Gold酵母细胞了；pAbAi-BcCLH2+pGADT7-BcWRKY1在SD/-leu/150μLAbA*板长出白色菌落，pAbAi-BcCLH2+pGADT7没长，证明基因BcWRKY1可以和基因BcCLH2互作。
(2)双荧光素酶报告实验
根据实施例1中的方法构建LUC-BcCLH2重组质粒和pCAMBIA2300-BcWRKY1，引物分别序列为LUC-BcCLH2-F:SEQ ID NO.18，LUC-BcCLH2-R:SEQ ID NO.19和pCAMBIA2300-BcWRKY1-F:SEQ ID NO.20，pCAMBIA2300-BcWRKY1-R：SEQ ID NO.21。将LUC-BcCLH2、pCAMBIA2300-BcWRKY1和pCAMBIA2300农杆菌转化物分别在28℃摇床中过夜摇，菌液OD值达到0.8～1.0为宜，4000rpm离心8min，去上清，先用3ml的ddH2O悬浮，4000rpm离心8min，再用Activation buffer悬浮，4000rpm离心8min，获得三种菌液。以Activation buffer为对照，测定各菌液的OD值，用Activation buffer调节各菌液OD值为0.8～1.0，获得三种目标菌液。以1：1的比例将LUC-BcCLH2对应目标菌液：pCAMBIA2300-BcWRKY1对应目标菌液混合，还有对照组LUC-BcCLH2对应目标菌液：pCAMBIA2300农杆菌转化物对应目标菌液以1：1比例混合，获得两混合菌液；最后以混合菌液：AS＝1000：1的比例在各混合菌液中加入AS(乙酰丁香酮)。28℃静止培养暗培养3h后同时注射在同一本氏烟草中同一叶片上的不同位置处。注射后，暗处理1天，光下培养2天左右后，在活体成像仪观察其发光情况(如图8)。
我们通过双荧光素酶测定来确定基因BcWRKY1如何调节基因BcCLH2的活性水平。结果显示，基因BcWRKY1负向调控基因BcCLH2的表达水平(图8)。
综上所述，本申请提供的一种基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，能够用于乌菜的遗传育种，为相关品种的培育提供了新的思路。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.基因BcWRKY1在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用，所述基因BcWRKY1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
通过抑制基因BcWRKY1的表达，促进基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片由绿变黄，或
通过促进基因BcWRKY1的表达，抑制基因BcCLH2的表达，促使菜叶片由黄变绿；
所述基因BcCLH2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制基因BcWRKY1的表达包括敲除基因BcWRKY1。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述促进基因BcWRKY1的表达包括构建基因BcWRKY1的过表达载体。
5.如权利要求1所述的应用，所述乌菜品种为W7-2或WS-1。
6.一种调控乌菜叶片内叶绿素酶活性的方法，该方法包括：
通过抑制权利要求1所述基因BcWRKY1的表达，促进权利要求1所述基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片内叶绿素酶活性提升，或
通过促进权利要求1所述基因BcWRKY1的表达，抑制权利要求1所述基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片内叶绿素酶活性降低。
7.基因BcWRKY1、基因BcWRKY1编码的蛋白或含有基因BcWRKY1的生物材料在制备用于促进乌菜叶片由绿转黄或由黄转绿的产品中的应用；所述基因BcWRKY1的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
8.如权利要求7所述的应用，所述生物材料为质粒、表达载体或转基因细胞。
9.权利要求2所述基因BcCLH2在调控乌菜叶片黄绿表型中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
促进基因BcCLH2的表达，促使乌菜叶片由绿变黄；或
抑制基因BcCLH2的表达，促使菜叶片由黄变绿。
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|---|---|---|---|
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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