CN118005755A - 一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 - Google Patents
一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118005755A CN118005755A CN202211411171.4A CN202211411171A CN118005755A CN 118005755 A CN118005755 A CN 118005755A CN 202211411171 A CN202211411171 A CN 202211411171A CN 118005755 A CN118005755 A CN 118005755A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- protein
- fermentation
- sequence
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003513 alkali Substances 0.000 title claims abstract description 79
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 129
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 121
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 117
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 38
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 29
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 2
- 230000001937 non-anti-biotic effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 94
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 229950003468 dupilumab Drugs 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical class [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000582398 Staphylococcus aureus Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白proteinA的Z结构域，其特征在于，所述Z结构域为SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；以及含有该Z结构域的proteinA。本发明获得的proteinA分子耐碱性更优良，亲和力高，可作为亲和层析的配基。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白proteinA。
背景技术
用于亲和色谱的Fc结合蛋白-金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA，简称SPA或protein A、蛋白A)是金黄色葡萄球菌表面的一种蛋白质，通过共价键连接到胞壁肽聚糖。由于能和人及多种哺乳动物IgG的Fc段结合，蛋白A与抗体的Fc段结合并不影响抗体对抗原的吸附活性，因此被广泛应用于抗体的亲和纯化。
野生型蛋白A基因编码序列由1464个碱基组成(不包括编码N端信号肽的108个碱基)，共编码488个氨基酸，分子量约为42kD左右。蛋白A不含有半胱氨酸，因此分子内部没有二硫键和巯基，属于一种单链多肽，通过共价键和金黄色葡萄球菌的肽聚糖连接。蛋白A包括E、D、A、B、C为5个高度同源的IgG结合结构域，它们之间约有65％～90％的同源性，每个结构域由大约58个氨基酸组成呈Z型的3个α螺旋束反向平行排列(分别为螺旋H1，H2，H3)，其三维结构通过疏水核稳定。
单个结构域均具备自主结合抗体IgG Fc片段能力。但是这种天然的蛋白A配体由于其稳定性和洗脱条件等问题而使其应用受到限制。蛋白A容易被微生物降解，对有机溶剂及pH的变化敏感，使得色谱柱的使用寿命变短；蛋白A亲和填料纯化IgG后需要在较低pH环境中才能洗脱下来，这会降低IgG的生物活性；在亲和分离过程中，蛋白A会从色谱柱上解脱下来，需要进一步纯化去除。
通常单抗纯化第一步所用的层析介质，就是层析介质材料与蛋白A偶联所得，由于其专一结合IgG，通常一步纯化后纯度和收率均可以达到90％以上，但是这种层析介质价格昂贵且不耐用，每步层析步骤后必须要进行清洁，以去除由发酵培养引入的宿主蛋白、宿主DNA等其他强吸附的杂质，目前最有效的清洗方式是0.5M氢氧化钠洗涤，但是使用强碱洗涤，交联于层析介质材料上protein A蛋白容易发生水解变性或脱落，碱处理多批次后，因proteinA脱落及蛋白变性水解可导致蛋白载量显著下降，给生产工艺稳健性带来较大的挑战。
目前国内外有多篇文献报道，通过对proteinA蛋白进行突变改造，获得了一些耐碱性较强的proteinA蛋白，如GE healthcare在专利申请US20200079878A1中指出，通过突变筛选获得了多个耐碱洗较强的proteinA蛋白片段，在0.5M NaOH碱洗300次，抗体载量仍能维持50％左右。专利申请CN103403020A将proteinA蛋白中至少一个天冬酰胺残基突变为组氨酸、丝氨酸、天冬氨酸或苏氨酸，所获得的的变体Ig结合蛋白经过0.5M NaOH碱处理27h后，与抗体的结合能力提高15％。专利申请CN104059133A在蛋白A的B结构域基础上进行突变筛选，获得的突变体经0.5M NaOH碱洗100次(约25h)，载量无明显变化。与目前的离子交换填料、反相层析填料等层析填料相比，目前的proteinA蛋白的耐碱性仍有较大的提升空间，仍需要一种耐碱性更优良的亲和蛋白A分子作为亲和层析的配基。
发明内容
针对以上技术现状，本发明通过突变筛选，提供了耐碱性更优良的用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白proteinA。具体发明如下：
本发明提供了一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白proteinA的Z结构域，其中所述Z结构域为SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述Z结构域为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14～SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20～SEQ ID NO：22、SEQID NO：24～SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述Z结构域为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述Z结构域为SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
本发明中，作为实施方案之一，所述Z结构域为SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种所述含有Z结构域的耐碱性Fc结合蛋白proteinA；作为实施方案之一，所述proteinA包括2～8个重复的Z结构域；本发明中，作为实施方案之一，所述proteinA包括3～6个重复的Z结构域；本发明中，作为实施方案之一，所述proteinA包括4个重复的Z结构域。
本发明中，作为实施方案之一，所述proteinA蛋白的C末端进一步连接一个或多个半胱氨酸，优选一个半胱氨酸。
本发明中，作为实施方案之一，所述proteinA蛋白具有SEQ ID NO：30～SEQ IDNO：53中任一所示的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46～SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50～SEQID NO：53中任一所示的氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列，进一步优选SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列，最佳SEQID NO：46。
本发明还提供了前述任一proteinA蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)合成proteinA重组载体质粒；
(2)大肠杆菌的转化和制备；
(3)发酵表达proteinA重组菌株；
(4)proteinA重组菌株发酵样品的纯化。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)进一步包括：所述proteinA突变分子设计为Z结构域的4个重复序列，并在突变体分子的C末端引入半胱氨酸，同时蛋白N端插入OmpA信号肽和DsbA连接肽；在基因序列的N端加上NdeI酶切位点、C端加上XhoI酶切位点，连接至大肠杆菌表达载体pET-29a(+)中，构建proteinA突变体重组质粒pET-29a(+)-OmpA信号肽-DsbA连接肽-(proteinA突变体分子)-4-C。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)进一步包括：将步骤(1)合成的proteinA突变体的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，构建proteinA重组表达菌株：取1μl 0.08ng/μl的合成质粒加入至50μl的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激60s，再次冰浴3min后，加入500μl无抗LB液体培养基，37℃150rpm恢复培养1h；
取恢复培养后的菌液100μ1涂布于含50μg/ml Kan的LB固体培养基，放置于37℃培养箱，倒置培养过夜；挑取培养过夜平板中的单克隆进行接种于50mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基，每个菌株挑取两个单克隆，37℃220rpm摇瓶培养，同时进行菌落PCR验证，使用Easy Taq为DNA酶，T7为扩增引物，对目的基因进行验证；
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖浓度为1％，上样孔加8μ1样品，同时以DL2000 Marker作为对照，1×TAE缓冲液，电压120V，电流108mA，电泳30min。电泳结束后，将胶置于溴化乙锭溶液中染色10min，观察电泳结果，发现条带大小均在1000bp左右，与预期987bp吻合；
将培养至一定浓度的proteinA重组表达菌株与60％的无菌甘油进行混匀，分装1ml至5支1.5mL无菌离心管，将proteinA突变体的表达菌株保藏于超低温冰箱。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(3)进一步包括：取步骤(2)中制备的proteinA重组菌株接种于LB无抗培养基进行摇瓶培养，制备一级种子液、二级种子液，待二级种子OD在0.8～3之间，将二级菌液转移至接种瓶；将接种瓶中的菌液接种至5L发酵罐进行分批发酵，分阶段控制诱导后发酵液pH：于30-37℃培养3-10小时后使用0.1mM IPTG诱导培养物，诱导后通气量增加至3L/min，溶氧恒定30％，诱导0-8小时控制发酵液pH为5.0±0.1～7.0±0.1、优选7.0(±0.1)，于28℃培养8.0小时后通过加入28％氨水和3M盐酸，将发酵液pH控制在3.5±0.1～4.5±0.1、优选4.0(±0.1)，28℃培养17小时结束发酵。
本发明还提供一种proteinA蛋白的发酵方法，所述方法包括：
将含proteinA蛋白的菌液接种至发酵罐进行分批发酵，分阶段控制诱导后发酵液pH：于30-37℃培养3-10小时后使用IPTG诱导培养物，诱导后通气量增加至3L/min，溶氧恒定30％，诱导0-8小时保持发酵液pH为5.0±0.1～7.0±0.1、优选7.0(±0.1)，于28℃培养8.0小时后，保持发酵液pH控制在3.5±0.1～4.5±0.1、优选4.0(±0.1)，25-30℃培养17小时结束发酵。
本发明中保持pH的方法可以为本领域常用方法，包括但不限于28％氨水和/或3M盐酸进行调剂。
本发明还提供了一种免疫吸附剂，其中前述的proteinA蛋白偶联至固相载体。作为实施方案之一，所述固相载体选自天然或经改造的聚合物，如琼脂糖、葡聚糖等；或者合成的聚合物，如聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇等；或者无机物基质的载体，如陶瓷、二氧化硅等。作为实施方案之一，所述固相载体的形式包括微球、滤膜、芯片、或毛细管。
本发明还提供了前述的免疫吸附剂用于制备治疗临床自身免疫性疾病或其它与人体内Ig相关的疾病的治疗剂的用途。
本发明还提供了前述proteinA蛋白用于在抗体或Fc融合蛋白纯化中作为亲和层析填料配基的用途。作为示例性的说明，本发明所述的proteinA蛋白的亲和层析填料配基可用无菌氢氧化钠或饱和碳酸钠或饱和碳酸氢钠溶液清洗和消毒，延长吸附柱的使用寿命。
本发明还提供了一种多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸编码前述任一的Z结构域或proteinA蛋白。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述的表达载体，或其基因组中整合有前述的多核苷酸。
本发明的多核苷酸、表达载体或宿主细胞中，作为实施方案之一，所述编码前述Z结构域的多核苷酸具有SEQ ID NO：57～SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列；优选SEQID NO：57、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67～SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73～SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，更优选SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，进一步优选SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，最佳SEQ ID NO：73。
本发明的多核苷酸、表达载体或宿主细胞中，作为实施方案之一，所述编码前述proteinA蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO：83～SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93～SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99～SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103～SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，更优选SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，进一步优选SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，最佳SEQ ID NO：99。
本发明中涉及到的proteinA的Z结构域、proteinA蛋白分子的序列的非限制性示例如下表所示：
本发明中涉及的其他序列如下表所示：
技术效果
本发明获得的proteinA分子耐碱性强，亲和力高，可作为亲和层析的配基；与现有技术US20200079878A1公开的耐碱性proteinA分子相比：本发明获得的(G8)-4耐碱性更好，(G5-C1)-4耐碱性相近，碱处理24h的(F4-C1)-4耐碱性更好，在与抗体的亲和力方面，(G8)-4、(F4-C1)-4、(G5-C1)-4的亲和力更好。
附图说明
图1：0.5M NaOH碱处理C1不同时间反相色谱图；
图2：0.5M NaOH碱处理C1不同时间反相色谱X轴移图；
图3：O.5M NaOH碱处理C2不同时间反相色谱图；
图4：C1(PA30-4)蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2902-48h：C1空白对照48h；T2902-48h：C1碱处理48h；C2902-24h：C1空白对照24h；T2902-24h：C1碱处理24h；
图5：(G8)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2924-48h：(G8)-4空白对照48h、T2924-48h：(G8)-4碱处理48h、C2924-24h：(G8)-4空白对照24h、T2924-24h：(G8)-4碱处理24h；
图6：(G5-C1)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2931-48h：(G5-C1)-4空白对照48h、T2931-48h：(G5-C1)-4碱处理48h、C2931-24h：(G5-C1)-4空白对照24h、T2931-24h：(G5-C1)-4碱处理24h；
图7：(G2-C1)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2921-48h：(G2-C1)-4空白对照48h、T2921-48h：(G2-C1)-4碱处理48h、C2921-24h：(G2-C1)-4空白对照24h、T2921-24h：(G2-C1)-4碱处理24h；
图8：(F4-C1)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2919-48h：(F4-C1)-4空白对照48h、T2919-48h：(F4-C1)-4碱处理48h、C2919-24h：(F4-C1)-4空白对照24h、T2919-24h：(F4-C1)-4碱处理24h；
图9：(F4)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2918-48h：(F4)-4空白对照48h、T2918-48h：(F4)-4碱处理48h、C2918-24h：(F4)-4空白对照24h、T2918-24h：(F4)-4碱处理24h；
图10：(F1)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2912-48h：(F1)-4空白对照48h、T2912-48h：(F1)-4碱处理48h、C2912-24h：(F1)-4空白对照24h、T2912-24h：(F1)-4碱处理24h；
图11：(F11)-4蛋白纯化样品0.5M NaOH常温处理24h和48h反相色谱图，C2908-48h：(F11)-4空白对照48h、T2908-48h：(F11)-4碱处理48h、C2908-24h：(F11)-4空白对照24h、T2908-24h：(F11)-4碱处理24h。
具体实施方式
以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
实施例
实施例1：Fc结合蛋白-金黄色葡萄球菌proteinA突变体筛选
野生型proteinA的Z结构域(阴性对照)：
VDNKFNKEQQ NAFYEILHLP NLNEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK；
对照组1的Z结构域(C1的Z结构域)：
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
对照组2的Z结构域(C2的Z结构域)：
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
以野生型proteinA的Z结构域为出发点，针对Q9、Q10、N11、A12、F13、Y14、E15、L17、H18、N23、N28、A29、F30、I31、Q32、K35、D36、Q40、A42、N43、L44、K50、L51进行饱和突变，筛选出六个热点位点N11、N23、Q32、D36、N43、L44，通过对野生型proteinA的Z结构域、C1的Z结构域和C2的Z结构域序列比对，结合一代建库筛选得到的热点位点，以C2的Z结构域作为突变模板，对其中的Q32、D36、K42、A43和I44这5个位点同时突变建库，通过两轮突变建库和噬菌体文库筛选，Fc片段筛选和IgG抗体筛选分别获得6个Unique序列，突变区域集中在C2的Z结构域的Q32、D36、K42、A43和I44，再以C1的Z结构域为突变模板，将针对C2的Z结构域获得的突变组合应用于C1的Z结构域序列上，最后，共获得12个针对Fc片段的proteinA突变分子和12个针对IgG抗体的proteinA突变分子(见表1和表2)。(Unique定义为：至少有一个突变位点的氨基酸不同。)
表1针对Fc片段的proteinA突变分子亲和力排序
表2针对IgG抗体的proteinA突变分子亲和力排序
实施例2：proteinA突变体的基因合成及载体质粒构建
采用DNA全序列合成法人工合成ProteinA重组载体质粒(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。将实施例1中的24个proteinA突变体分子、C1的Z结构域、C2的Z结构域设计为4个重复序列(见表3)，并在突变体分子和阳性对照分子C1、C2的C末端引入一个半胱氨酸，同时蛋白N端插入OmpA信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：81所示)和DsbA连接肽(氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：82所示)。在基因序列的N端加上NdeI酶切位点、C端加上XhoI酶切位点，连接至大肠杆菌表达载体pET-29a(+)中，构建proteinA突变体重组质粒pET-29a(+)-OmpA信号肽-DsbA连接肽-(proteinA突变体分子)-4-C，阳性对照C1重组质粒pET-29a(+)-OmpA信号肽-DsbA连接肽-C1-C，阳性对照C2重组质粒pET-29a(+)-OmpA信号肽-DsbA连接肽-C2-C。
表3
实施例3：大肠杆菌重组表达菌株的转化和制备
将实施例2获得的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，构建proteinA重组表达菌株：取1μl 0.08ng/μl的合成质粒加入至50μl的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激60s，再次冰浴3min后，加入至500μl无抗LB液体培养基，37℃ 150rpm恢复培养1h。
取恢复培养后的菌液100μl涂布于含50μg/ml Kan的LB固体培养基，放置于37℃培养箱，倒置培养过夜。挑取培养过夜平板中的单克隆进行接种于50mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基，每个菌株挑取两个单克隆，37℃，220rpm摇瓶培养，同时进行菌落PCR验证，使用Easy Taq为DNA酶，T7为扩增引物，对目的基因进行验证。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖浓度为1％，上样孔加8μl样品，同时以DL2000 Marker作为对照，1×TAE缓冲液，电压120V，电流108mA，电泳30min。电泳结束后，将胶置于溴化乙锭溶液中染色10min，观察电泳结果，发现条带大小均在1000bp左右，与预期987bp吻合。
将培养至一定浓度的proteinA重组表达菌株取1ml接种于二级50mL含50μg/mlKan的LB液体培养基，每个单克隆做两个平行，37℃，220rpm摇瓶培养。取剩余菌液与60％的无菌甘油进行混匀，分装1ml至5支1.5mL无菌离心管，将阳性对照分子和24个proteinA突变体的表达菌株保藏于超低温冰箱。
实施例4：proteinA重组表达菌株的摇瓶筛选
从超低温冰箱中取出实施例3中保藏的阳性对照分子C1、C2菌株和24个proteinA突变体表达菌株，取100μl接种于50mL含50μg/ml Kan的LB液体培养基，37℃，220rpm摇瓶培养，待菌液OD生长至0.6～0.8进行IPTG诱导，诱导浓度为0.5M，诱导温度为28℃，诱导时间为16h。
取0h、16h的诱导菌液4ml，12000g离心5min，对发酵上清和破碎沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果显示阳性对照菌株和proteinA重组表达菌株在16h发酵上清中有明显目的蛋白表达。
实施例5：proteinA重组菌株摇瓶样品的纯化
对实施例4中的阳性对照分子C1菌株和24个proteinA突变体表达菌株的诱导16h菌液进行离心，4000rpm离心20min，取离心上清，分别加入等体积不同浓度的硫酸铵溶液，对应硫酸铵浓度见表4，混匀后将pH调至7.0作为疏水层析上样样品。使用Uniphenyl 50M作为疏水层析填料，胶回收试剂盒重力柱作为容器，层析柱体积约400μl，使用A液：20mMNa2HPO4·12H2O+(等硫酸铵浓度)(NH4)2SO4+10mM EDTA-2Na，pH7.0进行填料的离心平衡，加入3～4次等柱体积的A液进行平衡后，可进行后续proteinA摇瓶样品纯化。
表4阳性对照分子C1和24个proteinA突变分子加入的硫酸铵浓度
将10mL上样样品依次上样至重力柱，多次2000rpm离心30s，将目标蛋白富集于重力柱上，加入3CV的A液使柱子再平衡，2000rpm离心30s。加入3CV的B液(10mM Na2HPO4·12H2O+10mM EDTA-2Na，pH7.0)，2000rpm离心30s，洗脱纯化样品。最后加入1mL的B液，2000rpm离心30s后收集350μl洗脱样品。
实施例6：proteinA重组菌株摇瓶纯化样品的耐碱性评价
将实施例5中收集到的纯化样品各分成两份，实验组加入终浓度为0.5M的NaOH，空白对照组加入等体积无菌水，常温放置24h后用3M HCl将pH调回7.0。对实验组样品和空白对照组样品进行反相色谱检测，发现24个proteinA突变分子中，有8个分子经碱处理后因耐碱性较差样品峰无法积分，对剩余16个proteinA突变分子和阳性对照分子C1的样品峰进行积分，通过比较proteinA突变分子和阳性对照分子C1的相对半峰宽，筛选出7个耐碱性相对较好的proteinA突变分子，分别为(F4-C1)-4、(G5-C1)-4、(G8)-4、(F11)-4、(F4)-4、(F1)-4、(G2-C1)-4。24个proteinA突变分子和阳性对照分子C1碱处理24h的相对半峰宽见表5，相对半峰宽为碱处理的样品与未进行碱处理的样品的半峰宽的比值。
表5 24个proteinA突变分子和阳性对照分子C1碱处理24h相对半峰宽
实施例7：5L发酵罐表达proteinA重组菌株
根据实施例6的摇瓶纯化样品耐碱性评价结果，从超低温冰箱取出实施例3中保藏的阳性对照分子C1、C2菌株和7个目标分子(F4-C1)-4、(G5-C1)-4、(G8)-4、(F11)-4、(F4)-4、(F1)-4、(G2-C1)-4的proteinA突变体表达菌株进行一级种子液接种，取1ml菌液接种于50mL LB无抗液体培养基，37℃，220rpm摇瓶至菌液OD在0.8～3之间，进行二级种子液接种，取1ml一级种子液接种于100mL LB无抗液体培养基，37℃，220rpm摇瓶至菌液OD在0.8～3之间，将二级菌液倒入接种瓶。将接种瓶中的菌液接种至5L发酵罐进行分批发酵，分阶段控制诱导后发酵液pH：于35℃培养3小时后使用0.1mM IPTG诱导培养物，诱导后通气量增加至3L/min，溶氧恒定30％，诱导0-8小时控制发酵液pH为7.0(±0.1)，于28℃培养8.0小时后通过加入28％氨水和3M盐酸，将发酵液pH控制在4.0(±0.1)，28℃培养17小时结束发酵。
实施例8：proteinA重组菌株发酵样品的纯化
对实施例7中的阳性对照分子C1、C2菌株和7个proteinA突变体表达菌株的16h发酵样品进行离心，取发酵液离心上清325ml，加入75ml硫酸铵溶液，使得硫酸铵终浓度为1.0M，混匀后调pH7.0作为待上样样品，进行疏水层析。采用40mL层析柱进行疏水层析，使用Uniphenyl 50M作为疏水层析填料，A液(20mM Na2HPO4·12H2O+1.0M(NH4)2SO4+10mM EDTA-2Na，pH7.0)为平衡液，B液(10mM Na2HPO4·12H2O+10mM EDTA-2Na，pH7.0)为洗脱液。控制流速3ml/min，用100％的A液冲洗3个柱体积，使柱子平衡，将400ml样品进行上样，上样结束后，用100％的A液冲洗3个柱体积，使柱子再平衡，用100％的B液冲洗3个柱体积，将纯化蛋白洗脱，在出峰明显处收集纯化样品。
实施例9：proteinA突变体发酵纯化样品的耐碱性评价
将实施例8中收集到的阳性对照分子C1发酵上清纯化样品通过0.5M NaOH分别处理1h、3h、4h、5h，阳性对照分子C2发酵上清纯化样品通过0.5M NaOH分别处理1h、3h、5h，将pH调至中性后，进行反相色谱检测，结果如图1，图2，图3所示，C2的耐碱性较C1更差，峰宽变化更明显，碱处理不同时间的半峰宽数据见表6，表7，因此在后续进行proteinA突变分子耐碱性评价时，以C1作为阳性对照分子进行实验。
表6 0.5M NaOH碱处理C1不同时间结果汇总
表7 0.5M NaOH碱处理C2不同时间结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2 | 77324 | 73.07 | 3323 | 0.33 | 1 |
| 1h | 103593 | 66.62 | 2623 | 0.54 | 1.636 |
| 3h | 74562 | 58.31 | 2125 | 0.53 | 1.606 |
| 5h | 76641 | 61.78 | 2125 | 0.5 | 1.727 |
将实施例8中收集到的7个proteinA突变分子发酵上清纯化样品，阳性对照分子C1(MS20200079878A1中SEQ ID NO：30)纯化样品各分成两份，一份为实验组，加入6M NaOH使得NaOH终浓度为0.5M，一份为空白对照组，加入等体积水，分别放置24和48h后，调碱处理样品pH为7.0，将耐碱性筛选24h样品和48h样品进行反相色谱检测，其半峰宽数据见表9-表15，HLPC图谱见图4-11，其中根据(G8)-4从峰型变化和相对半峰宽数值，耐碱性优于阳性对照分子C1。相对半峰宽为样品半峰宽与空白对照半峰宽的比值。
表8 0.5M NaOH碱处理C1 24h和48h结果汇总
注：C2902-48h：C1空白对照48h；T2902-48h：C1碱处理48h；C2902-24h：C1空白对照24h；T2902-24h：C1碱处理24h
表9 0.5M NaOH碱处理(G8)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2924-24h | 4968233 | 100.00 | 267101 | 0.28 | 1 |
| T2924-24h | 4734332 | 95.29 | 225097 | 0.34 | 1.21 |
| C2924-48h | 4468561 | 89.84 | 227903 | 0.29 | 1.04 |
| T2924-48h | 4621820 | 93.03 | 193087 | 0.38 | 1.36 |
注：C2924-48h：(G8)-4空白对照48h、T2924-48h：(G8)-4碱处理48h、C2924-24h：(G8)-4空白对照24h、T2924-24h：(G8)-4碱处理24h
表10 0.5M NaOH碱处理(G5-C1)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2931-24h | 5416971 | 100.00 | 381932 | 0.20 | 1 |
| T2931-24h | 4230159 | 78.09 | 227836 | 0.26 | 1.3 |
| C2931-48h | 4897745 | 90.41 | 314945 | 0.20 | 1 |
| T2931-48h | 3895442 | 71.91 | 153363 | 0.37 | 1.85 |
注：C2931-48h：(G5-C1)-4空白对照48h、T2931-48h：(G5-C1)-4碱处理48h、C2931-24h：(G5-C1)-4空白对照24h、T2931-24h：(G5-C1)-4碱处理24h
表11 0.5M NaOH碱处理(G2-C1)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2921-24h | 403877 | 100.00 | 24472 | 0.24 | 1 |
| T2921-24h | 294484 | 72.91 | 12715 | 0.42 | 1.75 |
| C2921-48h | 380794 | 94.28 | 22750 | 0.24 | 1 |
| T2921-48h | 287653 | 71.22 | 10283 | N/A | N/A |
注：C2921-48h：(G2-C1)-4空白对照48h、T2921-48h：(G2-C1)-4碱处理48h、C2921-24h：(G2-C1)-4空白对照24h、T2921-24h：(G2-C1)-4碱处理24h
表12 0.5M NaOH碱处理(F4-C1)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽(％) | |
| C2919-24h | 647060 | 100.00 | 39139 | 0.25 | 1 |
| T2919-24h | 480053 | 74.19 | 23177 | 0.27 | 1.08 |
| C2919-48h | 582717 | 90.05 | 31531 | 0.26 | 1.04 |
| T2919-48h | 368749 | 56.99 | 11479 | 0.57 | 2.28 |
注：C2919-48h：(F4-C1)-4空白对照48h、T2919-48h：(F4-C1)-4碱处理48h、C2919-24h：(F4-C1)-4空白对照24h、T2919-24h：(F4-C1)-4碱处理24h
表13 0.5M NaOH碱处理(F4)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2918-24h | 3250584 | 100.00 | 195581 | 0.30 | 1 |
| T2918-24h | 3198878 | 98.41 | 96037 | 0.49 | 1.63 |
| C2918-48h | 3250493 | 99.99 | 186435 | 0.41 | 1.37 |
| T2918-48h | 2915301 | 89.68 | 74645 | 0.68 | 2.27 |
注：C2918-48h：(F4)-4空白对照48h、T2918-48h：(F4)-4碱处理48h、C2918-24h：(F4)-4空白对照24h、T2918-24h：(F4)-4碱处理24h
表14 0.5M NaOH碱处理(F1)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2912-24h | 777072 | 100.00 | 56054 | 0.22 | 1 |
| T2912-24h | 643238 | 82.78 | 25848 | 0.44 | 2.00 |
| C2912-48h | 754291 | 97.07 | 47084 | 0.34 | 1.55 |
| T2912-48h | 585450 | 75.34 | 18046 | 0.63 | 2.86 |
注：C2912-48h：(F1)-4空白对照48h、T2912-48h：(F1)-4碱处理48h、C2912-24h：(F1)-4空白对照24h、T2912-24h：(F1)-4碱处理24h
表15 0.5M NaOH碱处理(F11)-4 24h和48h结果汇总
| 峰面积 | 相对峰面积(％) | 峰高(μV) | 半峰宽(min) | 相对半峰宽 | |
| C2908-24h | 255494 | 100.00 | 19452 | 0.20 | 1 |
| T2908-24h | 189928 | 74.34 | 8884 | 0.41 | 2.05 |
| C2908-48h | 213229 | 83.64 | 15062 | 0.23 | 1.15 |
| T2908-48h | 159336 | 62.36 | 6406 | 0.83 | 4.15 |
注：C2908-48h：(F11)-4空白对照48h、T2908-48h：(F11)-4碱处理48h、C2908-24h：(F11)-4空白对照24h、T2908-24h：(F11)-4碱处理24h
表16 0.5M NaOH碱处理不同时间相对半峰宽比对表
实施例10：proteinA纯化样品的亲和力评价
将(G8)-4proteinA纯化样品，阳性对照分子C1(GE公司US20200079878A1中SEQ IDNO：30)纯化样品进行SPR亲和力检测。使用氨基偶联试剂盒，将配体Dupilumab单抗在Biacore CM5上固定化，固定量分别为1000RU和3300RU。控制结合时间为60s，解离时间为600s，样品流速为30μl/min，(G8)-4、(G5-C1)-4、(F4-C1)-4、C1对Dupilumab单抗的结合速率常数、解离速率常数、平衡解离常数见表17，由表中亲和力常数KD数据可知，(G8)-4、(G5-C1)-4、(F4-C1)-4分子与Dupilumab单抗的亲和力较C1分子高。
表17针对Dupilumab单抗的SPR亲和力检测结果
| 配体 | 样品 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| Dupilumab | (G8)-4 | 1.697E+05 | 2.572E-04 | 1.516E-09 |
| Dupilumab | (G5-C1)-4 | 1.804E+05 | 2.935E-04 | 1.627E-09 |
| Dupilumab | (F4-C1)-4 | 1.928E+05 | 2.774E-04 | 1.439E-09 |
| Dupilumab | C1 | 1.436E+05 | 3.535E-04 | 2.461E-09 |
Claims (15)
1.用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白proteinA的Z结构域，其特征在于，所述Z结构域为SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
优选SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14～SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20～SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
更优选SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQID NO：20、SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
进一步优选SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：27中任一所示的氨基酸序列；
最佳SEQ ID NO：20。
2.含有权利要求1所述Z结构域的蛋白proteinA，其特征在于，蛋白proteinA包括2～8个、优选3～6个、最优选4个重复的Z结构域。
3.根据权利要求2所述的proteinA蛋白，其特征在于，所述proteinA蛋白的C末端进一步连接一个或多个半胱氨酸，优选一个半胱氨酸。
4.根据权利要求2所述的proteinA蛋白，其特征在于，所述proteinA蛋白为SEQ ID NO：30～SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列；
优选SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40～SEQID NO：44、SEQ ID NO：46～SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50～SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列；
更优选SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列；
进一步优选SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：53中任一所示的氨基酸序列；
最佳SEQ ID NO：46。
5.一种免疫吸附剂，其中权利要求2～4所述的proteinA蛋白偶联至固相载体。
6.根据权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体选自天然或经改造的聚合物，优选琼脂糖或葡聚糖；或者合成的聚合物，优选聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯醇；或者无机物基质的载体，优选陶瓷或二氧化硅。
7.根据权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体的形式包括微球、滤膜、芯片、或毛细管。
8.权利要求5～7所述的免疫吸附剂用于制备治疗临床自身免疫性疾病或其它与人体内Ig相关的疾病的治疗剂的用途。
9.权利要求2～4所述的proteinA蛋白用于在抗体或Fc融合蛋白纯化中作为亲和层析填料配基的用途。
10.一种权利要求2～4所述的proteinA蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)合成proteinA重组载体质粒；
(2)大肠杆菌的转化和制备；
(3)发酵表达proteinA重组菌株；
(4)proteinA重组菌株发酵样品的纯化。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)进一步包括：取步骤(2)制备的proteinA重组菌株接种于LB无抗培养基摇瓶培养，制备一级种子液、二级种子液，待二级种子液OD在0.8～3之间，将二级菌液转移至接种瓶；将接种瓶中的菌液接种至5L发酵罐进行分批发酵，分阶段控制诱导后发酵液pH值：于30-37℃培养3-10小时后使用0.1mM IPTG诱导培养物，诱导后通气量增加至3L/min，溶氧恒定30％，诱导0-8小时控制发酵液pH为5.0±0.1～7.0±0.1、优选7.0(±0.1)，于28℃培养8.0小时后，将发酵液pH控制在3.5±0.1～4.5±0.1、优选4.0(±0.1)，28℃培养17小时结束发酵。
12.一种权利要求2～4所述proteinA蛋白的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：
将含proteinA蛋白的菌液接种至发酵罐进行分批发酵，分阶段控制诱导后发酵液pH：于30-37℃培养3-10小时后使用IPTG诱导培养物，诱导后通气量增加至3L/min，溶氧恒定30％，诱导0-8小时保持发酵液pH为5.0±0.1～7.0±0.1、优选7.0(±0.1)，于28℃培养8.0小时后，将发酵液pH控制在3.5±0.1～4.5±0.1、优选4.0(±0.1)，25-30℃培养17小时结束发酵。
13.一种多核苷酸或包含该多核苷酸的表达载体，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的Z结构域或权利要求2～4任一所述的proteinA蛋白。
14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求13所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求13所述的多核苷酸。
15.根据权利要求13或14中任一所述的多核苷酸、表达载体、或宿主细胞，其特征在于，所述编码权利要求1所述的Z结构域的多核苷酸具有SEQ ID NO：57～SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQID NO：67～SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73～SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，更优选SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，进一步优选SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：80中任一所示的核苷酸序列，最佳SEQ ID NO：73；或
所述编码权利要求2～4任一所述的proteinA蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO：83～SEQID NO：106中任一所示的核苷酸序列，优选SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93～SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99～SEQ ID NO：101、SEQ IDNO：103～SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，更优选SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，进一步优选SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：106中任一所示的核苷酸序列，最佳SEQ ID NO：99。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211411171.4A CN118005755A (zh) | 2022-11-10 | 2022-11-10 | 一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211411171.4A CN118005755A (zh) | 2022-11-10 | 2022-11-10 | 一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118005755A true CN118005755A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90943569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211411171.4A Pending CN118005755A (zh) | 2022-11-10 | 2022-11-10 | 一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118005755A (zh) |
-
2022
- 2022-11-10 CN CN202211411171.4A patent/CN118005755A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111315887B (zh) | 免疫球蛋白结合性蛋白质 | |
| CN101463358B (zh) | 一种腈水合酶基因簇及其应用 | |
| CN114262697B (zh) | 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 | |
| EA025689B1 (ru) | Способ высокой экспрессии рекомбинантного белка в генно-инженерных бактериях и его применение | |
| CN118005755A (zh) | 一种用于亲和色谱的耐碱性Fc结合蛋白 | |
| CN113801239A (zh) | 多肽标签、高度可溶性的重组腈水解酶及其在医药化学品合成中的应用 | |
| CN112391364B (zh) | 一种高活力谷氨酰胺转氨酶突变体及其制备方法 | |
| CN107201354A (zh) | 一种中性蛋白酶及其基因和应用 | |
| EP1981978B1 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
| FI103132B (fi) | Menetelmä rekombinantti-IgA-proteaasin valmistamiseksi | |
| CN116478969A (zh) | 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 | |
| CN113480622A (zh) | 一种重组肺炎球菌溶血素制备及纯化的方法 | |
| CN105602977A (zh) | 高活性人细胞因子Eotaxin-2的制备方法及应用 | |
| CN108218996A (zh) | 重组蛋白及其纯化制备方法 | |
| JP2011135777A (ja) | イムノグロブリン結合タンパク質 | |
| RU2811436C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pETZ, обеспечивающая синтез и секрецию рекомбинантного белка A, и рекомбинантный белок A, используемый для иммунохимических анализов | |
| KR20030034136A (ko) | 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 | |
| CN116640743B (zh) | 一种核酸内切酶及其应用 | |
| KR102690771B1 (ko) | PETase의 세포외 분비용 재조합 균주 | |
| CN116497050A (zh) | 敲除sigW基因在提高地衣芽胞杆菌生产Protein A蛋白中的应用 | |
| CN110878116B (zh) | 一种稳定的重组心肌肌钙蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN112522234B (zh) | 一种限制性内切酶FseI的制备方法 | |
| CN118530975A (zh) | 一种热稳定性改善的内溶素多肽 | |
| CN116731130A (zh) | 一种破伤风毒素或其变体的纯化方法 | |
| CN118562768A (zh) | 一种纤维素-褐藻酸结合模块ukd及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |