CN117965555A - 基因编辑家蚕BmRPA2在制备丝胶茧品系中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基因编辑家蚕BmRPA2在制备丝胶茧品系中的应用，通过利用CRISPR/Cas9技术，在家蚕后部丝腺对BmRPA2进行基因编辑，制备只生产丝胶的家蚕品系，可以简化生产工序、降低成本、显著提高生产效率，而且能确保产品质量的稳定性。后续在该品系中增量表达高附加值外源蛋白，也可极大简化纯化过程，这一突破将有助于推动丝胶蛋白在化妆品、生物、医学等多个领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因编辑家蚕BmRPA2在制备丝胶茧品系中的应用。
背景技术
蚕茧主要由丝素和丝胶构成，丝胶占比约20%-30%，丝素占比约70%-80%。丝胶作为一种天然材料，具有优良的性能，如生物相容性、可降解性和独特的生物学特性。通过在家蚕丝胶中特异性表达高附加值的外援蛋白，应用于组织修复、再生医学、手术粘合等多个生物医学领域。
蚕丝蛋白主要是由内层丝素蛋白和外层丝胶蛋白构成。为了去除丝素获取丝胶蛋白，缫丝行业的传统做法是，先通过碱法对蚕丝进行脱胶处理，然后通过酸析法回收丝胶。该过程不但程序复杂、对设备的要求高，而且存在回收效率低、回收产物质量差等问题。创制生产丝胶同时不生产丝素（即丝胶茧）的新型家蚕素材，可以有效解决以上问题，将为丝胶蛋白及丝胶中表达外源蛋白的提取和纯化带来革命性变化。复制蛋白A2（RPA2）是RPA的一个重要组成部分，在维持基因组稳定性和细胞正常生理功能中发挥重要作用，我们通过基因编辑技术，靶向RPA2制备生产丝胶茧的家蚕品系，可为开发新型生物医学材料提供理论基础和技术支持。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲除BmRPA2基因在制备丝胶茧品系中的应用；本发明的目的之二在于提供一种制备丝胶茧品系的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、敲除BmRPA2基因在制备丝胶茧品系中的应用，所述BmRPA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明优选的，所述敲除BmRPA2基因的方法是使用CRISPR/Cas9技术。
本发明优选的，所述敲除BmRPA2基因的方法是构建BmRPA2的sgRNA转基因载体，得到的sgRNA品系分别与中部丝腺特异性表达Cas9的家蚕品系MSG-Cas9或后部丝腺特异性表达Cas9品系PSG-Cas9杂交，筛选双光敲除个体。
本发明优选的，所述BmRPA2的sgRNA转基因载体由以下方法制得将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列退火后连入sgRNA表达载体。
2、一种制备丝胶茧品系的方法，在家蚕后部丝腺特异编辑BmRPA2基因，获得的家蚕品系为丝胶茧品系。
本发明的有益效果在于：本发明公开了敲除BmRPA2基因在制备丝胶茧品系中的应用，针对传统丝胶生产中的低效、高成本、品质不稳等老大难问题。通过基因编辑BmRPA2，创制只产生丝胶蚕茧的家蚕品系，该蚕茧不需要用繁琐的方法去除丝素蛋白，可以直接用于丝胶蛋白的提取纯化。通过本发明的实施，我们可为丝胶蛋白的提取纯化带来革命性变化，不但可以简化生产工序、降低成本、显著提高生产效率，而且能确保产品质量的稳定性。后续在该品系中增量表达高附加值外源蛋白，也可极大简化纯化过程。这一突破将有助于推动丝胶蛋白在化妆品、生物、医学等多个领域的应用。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为sgRNA转基因载体结构示意图（3 ×P3为眼部特异性启动子；EGFP为绿色荧光蛋白；SV40为终止密码子；U6为启动子；RPA2gRNA为设计引物；TTTTT为终止子）；
图2为阳性BmRPA2-sgRNA筛选，阳性个体的复眼在荧光显微镜下发出绿光；
图3为BmRPA2M-KO及BmRPA2P-KO品系筛选。
图4为WT与BmRPA2M-KO观察及检测（A：BmRPA2M-KO丝腺敲除形式检测；B：取L5D3的WT与BmRPA2M-KO丝腺进行表型观察；C：WT与BmRPA2M-KO丝腺重量统计；D：WT与BmRPA2M-KO茧形观察及茧层溶解尿素观察；A中蓝色字体序列（GGAGGATGAGGGCTGTACTC）为设计的sg序列，红色字体序列（TGG）为PAM（Protospacer adjacent motif）；D中能看见的白色絮状物是蚕茧中未溶解的丝素蛋白，WT的值被设置为100%，BmRPA2M-KO的值以其为标准进行换算。误差棒表示标准偏差，T检验的显著性差异为：ns（P>0.5）；***（P<0.001））。
图5为WT与BmRPA2P-KO观察及检测（A：BmRPA2P-KO丝腺敲除形式检测；B：取L5D3的WT与BmRPA2P-KO丝腺进行表型观察；C：WT与BmRPA2P-KO丝腺重量统计；D：WT与BmRPA2P-KO丝蛋白相关基因检测；E：WT与BmRPA2P-KO茧形观察及茧层溶解尿素观察；A中蓝色字体序列（GGAGGATGAGGGCTGTACTC）为设计的sg序列，红色字体序列（TGG）为PAM（Protospaceradjacent motif）；E 中能看见的白色絮状物是蚕茧中未溶解的丝素蛋白，WT的值被设置为100%，BmRPA2P-KO的值以其为标准进行换算。误差棒表示标准偏差，T检验的显著性差异为：ns（P>0.5）；***（P<0.001））。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、构建BmRPA2的sgRNA转基因载体
从家蚕基因数据库Silk DB3.0获取BmRPA2的基因序列（SEQ ID NO.1），随后通过CCTOP在线分析网站设计gRNA序列，设计引物：
KO-RPA2-sgF：5’-AAGTGGAGGATGAGGGCTGTACTC-3’（SEQ ID NO.2）；
KO-RPA2-sgR：5’-AAACGAGTACAGCCCTCATCCTCC-3’（SEQ ID NO.3）。
将以上两条引物退火后形成双链连入gRNA表达载体（参见SanyuanMa. CRISPR/Cas9 mediated multiplex genome editing and heritablemutagenesis of BmKu70 inBombyx mori.2014），然后将U6-gRNA-TTTTT 替换pBac[U6-gRNA-gLMN, 3xp3-EGFP]载体（参见Yuanyuan Liu.Tissue-specific genome editing of laminA/C in the posteriorsilk glands of Bombyx mori.2017））上的PU6-gLMN-gRNA scaffold-T6获得BmRPA2基因的sgRNA表达载体，命名为
piggyBac[3×p3-EGFP-SV40-hr3-U6-BmRPA2gRNA-TTTTTT]载体（图1）。然后转化Trans1-T1感受态细胞，获得阳性克隆送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果显示成功将gRNA引物连接到酶切载体，得到piggyBac[3×p3-EGFP-SV40-hr3-U6-BmRPA2gRNA-TTTTTT]菌液，提取超纯质粒。
实施例2、sgRNA品系制备
将重组质粒piggyBac[3×p3-EGFP-SV40-hr3-U6-BmRPA2gRNA-TTTTTT]与辅助质粒A3H按照1:1混合，胚胎显微注射D9L蚕卵，无毒胶水封口，放置在25℃培养箱中孵育；
将G0代蚁蚕饲养至成虫，自交得到G1代蚕卵，25℃催青，六天后，在荧光显微镜下筛选眼部发绿光的阳性个体，命名为BmRPA2-sgRNA（图2）。
提取BmRPA2-sgRNA基因组，使用引物：U6-R：5’-AGCTGTCCAAGGAATGCG-3’（SEQ IDNO.4）；gRNA-F：5’-CGACTCGGTGCCACTTT-3’（SEQ ID NO.5）进行扩增，PCR反应条件为：98℃预变性5分钟，然后98℃变性5秒、53℃退火10秒、延伸30秒，共30个循环，最后延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，然后转化Trans1-T1感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果表明转基因家蚕中成功插入sgRNA表达片段。
实施例3、BmRPA2M-KO及BmRPA2P-KO品系制备
中部丝腺特异性表达Cas9的家蚕品系MSG-Cas9（参考王伟博士毕业论文《let-7microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制》，2019）和后部丝腺特异性表达Cas9品系PSG-Cas9（参考王伟博士毕业论文《let-7 microRNA调控家蚕丝腺发育的分子机制》，2019）都带有红色荧光报告基因，将BmRPA2-sgRNA蛾子分别与它们杂交，获得2种F1代蚕卵，25℃避光催青。
在荧光显微镜下筛选能够同时发出绿光和红色的双个体。BmRPA2-sgRNA与MSG-Cas9杂交F1双光个体命名为BmRPA2M-KO；BmRPA2-sgRNA与PSG-Cas9杂交F1双光个体命名为BmRPA2P-KO（图3）。
实施例4、BmRPA2M-KO及BmRPA2P-KO敲除形式检测
将BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO幼虫用桑叶饲养，五龄时解剖观察，收集丝腺材料；
提取BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO丝腺基因组，使用引物KO-JC-F：TAGTGGCTTACTCGCTTGA（SEQ ID NO.6），KO-JC-R：TGTCCCTTTATTCGTTTTC（SEQ ID NO.7）进行扩增，PCR反应条件为：98℃预变性5分钟，然后98℃变性10秒、51℃退火15秒、延伸30秒，共30个循环，最后延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，然后与pMD19-T载体连接，然后转化Trans1-T1感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物技术有限公司测序，测序结果与家蚕数据库中序列比对，结果如图4中A和图5中A所示。结果显示，BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO中RPA2基因均发生碱基缺失。
实施例5、BmRPA2M-KO及BmRPA2P-KO丝腺和蚕茧观察检测
（1）将BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO幼虫用桑叶饲养，五龄时解剖观察，相机拍照记录；结果如图4中B和图5中B所示。结果显示，BmRPA2M-KO组和BmRPA2P-KO的丝腺变小。
解剖称量家蚕丝腺重量，结果显示如图4中C和图5中C所示，结果显示BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO的家蚕丝腺重量显著减轻。
饲养幼虫至吐丝结茧，茧形观察，结果如图4中D所示和图5中E所示。结果显示，BmRPA2M-KO和BmRPA2P-KO的茧量变小。
取BmRPA2P-KO检测后部丝腺特异表达基因FibH、FibL、P25的含量，结果如图5中D所示。结果显示，FibH、FibL、P25的表达量均极其显著降低，含量不到对照的1%，表明敲除BmRPA2可以阻断丝素相关基因的表达。
实施例6、BmRPA2M-KO及BmRPA2P-KO蚕茧丝胶丝素含量检测
将BmRPA2M-KO、BmRPA2P-KO及WT的蚕茧烘干剪碎，分别称取相同重量的蚕茧，使用8M尿素加热溶解，充分溶解后，反复清洗残留物质，放65℃干燥箱烘干；称量剩余物质重量，计算丝胶丝素占比。结果如图4中D和图5中所示，结果显示BmRPA2M-KO用尿素溶解后只有少部分剩余物质，其丝胶比例降低；而BmRPA2P-KO用尿素溶解后变得透明，未见剩余物质，统计结果显示丝素比例极限著下降，仅为对照的2%左右，因此可以获得只产丝胶的家蚕品系。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.基因编辑家蚕BmRPA2在制备丝胶茧品系中的应用，其特征在于：所述BmRPA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述对BmRPA2基因编辑的方法是使用CRISPR/Cas9技术。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述对BmRPA2基因编辑的方法是构建BmRPA2的sgRNA转基因载体，得到的sgRNA品系与后部丝腺特异性表达Cas9品系PSG-Cas9杂交，筛选双光敲除个体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述BmRPA2的sgRNA转基因载体由以下方法制得将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列退火后连入sgRNA表达载体。
5.一种制备丝胶茧品系的方法，其特征在于：在家蚕后部丝腺特异编辑BmRPA2基因，获得的家蚕品系为丝胶茧品系。
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