CN117965527A - 提取血浆中游离核酸的方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种提取血浆中游离核酸的方法，包括将经裂解处理后的血浆样品与含有第一磁珠的第一溶液进行孵育，收集第二磁珠；对所述第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物；将所述纯化产物与含有第三磁珠的第二溶液进行孵育，收集第四磁珠；将所述第四磁珠进行醇沉纯化处理，得到所述的游离核酸。采用本发明所述的方法，能够用于从血浆中高效的分离和纯化DNA，并成功回收长度为50nt左右的全新游离DNA片段。

Description

提取血浆中游离核酸的方法、试剂盒及其应用

优先权信息

本申请请求2023年12月19日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为2023117614118的专利申请的优先权，并且通过参照将其全文并入此处。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种提取血浆中游离核酸的方法，一种试剂盒及其应用，一种建库方法和一种测序方法，更具体地，本发明涉及一种结合磁珠法和有机试剂抽提的提取血浆中游离核酸的方法。

背景技术

游离DNA(cfDNA)可以源自细胞的凋亡、坏死、分泌或主动释放等多种途径。除了肿瘤细胞，正常细胞也会在正常生理状态下释放一定量的游离DNA。游离DNA作为一种非侵入性的生物标志物，具有广泛的潜在应用价值。游离DNA是非随机片段化，分子长短不一，顶点位置在166bp或167bp，包含大量可用于无创产前检测和癌症检测的分子信息。cfDNA片段组学包含遗传学以外的信息，例如基因表达推断等。

目前新的研究发现，在人类血液中有一类长约50nt的新型游离DNA，它在健康人群和癌症患者中存在差异，因此，其有望成为一种新的液体活检和癌症诊断的生物标志物。此类游离DNA存在片段短、大部分为单链核酸的特征，用商品化血浆游离核酸提取纯化试剂盒难以回收，因为一般商品化试剂盒的提取产物基本在100bp以上长度的片段，而难以提取得到100bp以下长度的片段。这严重影响了此类新型游离DNA的研究进展，也是其晚于中长片段部分的游离DNA发现的主要原因。

本发明提供一种回收游离DNA完整片段长度的核酸提取、纯化方法，适用于提取、纯化50nt左右的单链新型游离核酸片段。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

基于目前现有技术难以在血浆中提取得到100bp以下长度的片段的问题，本发明提出了一种结合磁珠法和有机试剂抽提的血浆全片段游离核酸提取方法。利用磁珠在磁珠结合液中对小片段核酸的吸附能力和纯化能力，结合有机试剂抽提和醇沉法，对血浆中的DNA进行分离、纯化，回收包括50nt长度的新型游离DNA片段，达到提取纯化所有长度的游离DNA的效果。

具体地，发明人通过在磁珠结合液中使用高比例的醇类和高比例的磁珠，以达到增强超短片段的吸附回收。但采用此方法存在一个缺陷，即各种杂质也吸附在磁珠上，通过采用常见的磁珠法清洗步骤无法有效的将杂质清洗下来，使其无法得到较好的纯化，因此，发明人经过大量实验将纯化方法改为通过下游的其他纯化方式以达到纯化，所述下游纯化步骤为在磁珠结合后使用有机试剂抽提，抽提后进行高醇高磁珠比例纯化，纯化后再次进行乙醇沉淀纯化。由此，通过采用上述的步骤，能够有效的提取和纯化50nt左右的单链新型游离核酸片段。

因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种提取血浆中游离核酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将经裂解处理后的血浆样品与含有第一磁珠的第一溶液进行孵育，收集第二磁珠；对所述第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物；将所述纯化产物与含有第三磁珠的第二溶液进行孵育，收集第四磁珠；将所述第四磁珠进行醇沉纯化处理，得到所述的游离核酸。

本发明所述的方法，利用磁珠在第一溶液或第二溶液中对小片段核酸的吸附能力和纯化能力，结合有机试剂抽提和醇沉法，能够用于从血浆中高效的分离和纯化DNA，并成功回收长度为50nt左右的全新游离DNA片段。在此方法中，采用了一系列重要的步骤和关键试剂，以确保高度选择性和高效性。首先，通过特定的处理步骤，高效解离血浆蛋白与DNA的粘结，有利于去除与DNA结合的蛋白质、RNA和其他杂质分子，提高获得的核酸样本的纯度。接下来，运用一种创新的技术，即结合有机试剂抽提和醇沉法，能够选择性地富集和回收50nt长度的游离DNA片段，达到回收全片段游离核酸的效果，这是一项重要的突破。通过本发明的方法，研究人员和医学专业人员能够获得高质量的DNA样本，为进一步的分析和研究提供了可靠的基础，在研究、诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：第一磁珠、第三磁珠、第一溶液、第二溶液、洗脱液、抽提液、清洗液、助沉剂和无水乙醇。本发明所述的试剂盒具有方便、高效的特点，可以从血浆样品中可靠地提取目标DNA。该试剂盒采用了精心筛选和配制的试剂组合，经过优化的步骤和条件，能够有效地分离和纯化长度约为50nt的全新游离核酸片段，这一技术为基础研究、临床诊断和生物医学应用等领域提供了有力的工具和方法，为科学进步和医学进展做出了重要贡献。

在本发明的第三方面，本发明提出了第二方面所述的试剂盒在提取血浆游离DNA中的用途。本发明所述的试剂盒具有方便、高效的特点，可以从血浆样品中可靠地提取目标DNA。该试剂盒采用了精心筛选和配制的试剂组合，经过优化的步骤和条件，能够有效地分离和纯化长度约为50nt的全新游离核酸片段，这一技术为基础研究、临床诊断和生物医学应用等领域提供了有力的工具和方法，为科学进步和医学进展做出了重要贡献。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种建库方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第一方面所述的方法或第二方面所述的试剂盒提取血浆样本中游离DNA；将所述游离DNA进行连接接头处理和建库处理，以便获得测序文库。由前所述，采用本发明所述的方法或试剂盒，可以有效地分离和纯化长度约为50nt的全新游离核酸片段。这些片段具有重要的生物信息和潜在的应用价值。通过建立测序文库，能够获得长度约为50nt的全新游离核酸片段的准确序列信息，这些序列信息可以用于进一步的生物信息学分析；测序文库也为特定应用领域提供了重要的资源，如药物开发、疾病诊断、生物标记物发现等。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用第四方面所述的方法构建血浆样本的游离DNA测序文库；将所述测序文库进行测序处理；以及将测序处理结果与预定参考序列进行比对处理，以便获得血浆样本的游离DNA序列信息。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例采用市售试剂盒A提取的产物进行毛细管电泳片段分析的结果图；

图2是根据本发明实施例采用市售试剂盒B提取的产物进行毛细管电泳片段分析的结果图；

图3是根据本发明实施例采用本发明所述的方法提取的产物进行毛细管电泳片段分析的结果图；

图4是根据本发明实施例采用本发明所述的磁珠结合液提取产物构建的文库的进行毛细管电泳片段分析的结果图；

图5是根据本发明实施例采用市售磁珠结合液提取产物构建的文库进行毛细管电泳片段分析的结果图。

图中，横坐标aligned time表示对齐时间，纵坐标fluorescence表示荧光强度。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b，或c中的至少一种(个)”，或，“a，b和c中的至少一种(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单项(个)，也可以是多项(个)。

在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

在本文中，术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，用来将目的如位置、对象等彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，“第一”、“第二”可以互换，如第一位点也可以被称为第二位点，对应地，第二位点称为第一位点。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

术语“游离核酸”(circulating cell-free DNA,cfDNA)又称循环DNA，指存在于血浆、血清或尿液等体液中的细胞外DNA。

本发明提出了一种提取血浆中游离核酸的方法、试剂盒、建库方法以及测序方法，下面将分别对其进行详细描述。

提取血浆中游离核酸的方法

本发明提出了一种提取血浆中游离核酸的方法。根据本发明的实施例，方法包括：将经裂解处理后的血浆样品与含有第一磁珠的第一溶液进行孵育，收集第二磁珠；对第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物；将纯化产物与含有第三磁珠的第二溶液进行孵育，收集第四磁珠；将第四磁珠进行醇沉纯化处理，得到的游离核酸。

本发明的方法，利用磁珠在第一溶液或第二溶液中对小片段核酸的吸附能力和纯化能力，结合有机试剂抽提和醇沉法，能够用于从血浆中高效的分离和纯化DNA，并成功回收长度为50nt左右的全新游离DNA片段。在此方法中，采用了一系列重要的步骤和关键试剂，以确保高度选择性和高效性。首先，通过特定的处理步骤，高效解离血浆蛋白与DNA的粘结，有利于去除与DNA结合的蛋白质、RNA和其他杂质分子，提高获得的核酸样本的纯度。接下来，运用一种创新的技术，即结合有机试剂抽提和醇沉法，能够选择性地富集和回收50nt长度的游离DNA片段，达到回收全片段游离核酸的效果，这是一项重要的突破。通过本发明的方法，研究人员和医学专业人员能够获得高质量的DNA样本，为进一步的分析和研究提供了可靠的基础，在研究、诊断和治疗等领域具有广泛的应用前景。

根据本发明的实施例，提取血浆中游离核酸的方法还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

在对裂解处理后的血浆样品或纯化产物进行孵育时，使用到的磁珠和溶液的具体成分如下：

根据本发明的实施例，第一磁珠、第三磁珠选自超顺磁性羧基纳米磁珠。超顺磁性羧基纳米磁珠能够选择性地结合和捕获经裂解处理后的血浆样品中的DNA，并且利用纳米颗粒的超顺磁性质，使其迅速团聚。由此，通过磁力作用，可将含有目标DNA的纳米颗粒集中分离出来，从而实现对DNA的富集和纯化。

根据本发明的实施例，第一溶液、第二溶液分别包含有机醇、离液盐、胍盐和乙二胺四乙酸的至少一种。为了使上述超顺磁性羧基纳米磁珠更好的发挥作用，第一溶液和第二溶液中创新性的加入了有机醇和离液盐，其中，有机醇能够有助于超顺磁性羧基纳米磁珠对长度小于100bp的小片段核酸的结合，离液盐能够促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构从而更好地与超顺磁性羧基磁珠结合。因此，采用本发明的第一溶液、第二溶液能够提高磁珠吸附微小片段的能力，从而达到吸附50nt左右长度的游离核酸片段。

需要说明的是，本发明的“第一溶液”、“第二溶液”为本发明实施例中的磁珠结合液，用于提供磁珠，并促进磁珠和血浆中的核酸样本的结合。

根据本发明的实施例，上述有机醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或环戊醇。将磁珠特别是超顺磁性羧基纳米磁珠与血浆样本在含有有机醇的溶液中混合，有机醇可以促进磁珠特别是顺磁性羧基纳米磁珠与血浆样本中核酸的结合，特别是增强对长度小于100bp的核酸小片段的结合能力。

为了能够达到更好地富集小片段核酸的目的，所述有机醇在所述第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％～85％。通过在第一溶液和/或第二溶液中加入高比例的醇溶液，能够使磁珠达到富集小片段核酸的目的。

为了使DNA分子更完全的暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，提高DNA分子与上述超顺磁性羧基纳米磁珠的结合率，所述离液盐在所述第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L。因此，能提高磁珠结合与小片段核酸的效率。

根据本发明的实施例，有机醇选自异丙醇。

根据本发明的实施例，离液盐选自氯化钠、六氟磷酸钠、硫氰酸钾或硫酸铜。本发明的第一溶液或第二溶液中加入上述离液盐能够促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构与羧基磁珠结合。

根据本发明的实施例，离液盐选自氯化钠。因此，氯化钠能促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构与羧基磁珠结合。

根据本发明的实施例，胍盐选自盐酸胍、三苯基胍、硫氰酸胍、氨基胍盐酸盐或碳酸胍。

在本发明的一些实施例中，第一溶液、第二溶液各自独立地包括异丙醇和氯化钠。因此，能够提高上述超顺磁性羧基纳米磁珠吸附血浆样品中长度小于100bp的小片段核酸的能力。

为了使上述超顺磁性羧基纳米磁珠能够更好地捕获小片段核酸，异丙醇在第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％～85％。因此，在离液盐存在的条件下，高浓度异丙醇的加入能使磁珠富集长度小于100bp的核酸小片段。

在本发明的一些实施例中，异丙醇在第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％。

为了使DNA分子更完全的暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，提高DNA分子与上述超顺磁性羧基纳米磁珠的结合结合率，氯化钠在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L。因此，在此浓度范围内，能够使上述超顺磁性羧基纳米磁珠充分的吸附小片段核酸。

在本发明的一些实施例中，氯化钠在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L。

第一溶液、第二溶液中还可以各自独立地包括乙二胺四乙酸。其主要用于螯合金属离子，以防止金属离子与DNA的结合，保持DNA的稳定。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L。例如为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L。

根据本发明的实施例，第一溶液和第二溶液相同或不同。

为了使第一磁珠能够在第一溶液中更好的结合小片段核酸，第一磁珠和第一溶液的体积比为1:(4～10)。因此，在此比例范围内，能够在第一溶液的作用下增强第一磁珠吸附微小核酸片段的能力。

在本发明的一些实施例中，第一磁珠和第一溶液的体积比为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。

为了使第三磁珠能够在第二溶液中更好的结合小片段核酸，第三磁珠和第二溶液的体积比为1:(4～10)。因此，能够在第二溶液的作用下增强第三磁珠吸附微小核酸片段的能力。

在本发明的一些实施例中，第三磁珠和第二溶液的体积比为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。

为了使第一磁珠能够在第一溶液中更好的与裂解处理后的血浆样品中的小片段核酸结合，血浆样品、第一磁珠和第一溶液的体积比为(1～3):1:(4～10)。因此，能够使第一磁珠在与血浆样品中的微小核酸片段进行充分的结合。

为了使第三磁珠能够在第二溶液中更好的与纯化产物中的小片段核酸结合，纯化产物、第三磁珠和第二溶液的体积比为(1～5):1:(4～10)。因此，能够使第三磁珠与纯化产物中的微小核酸片段进行充分的结合。

为了获得高纯度的小片段核酸，对经过与血浆样品孵育后的第一磁珠，即第二磁珠进行有机试剂纯化处理。该处理过程包括以下步骤：1)洗脱：使用适当的洗脱液将第二磁珠上吸附的产物洗脱。优化洗脱液的成分和条件，以确保有效去除非目标物质。2)抽提：对洗脱的产物进行有机试剂抽提，以去除潜在的蛋白杂质。这样可有效提高目标核酸的纯度，实现核酸和蛋白质的分离。以上方法有助于优化核酸的纯化过程，以获得纯度较高的小片段核酸，即纯化产物。

有机试剂纯化处理过程的条件及使用到的试剂的具体成分如下：

为了获得高纯度的小片段核酸，对第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物，包括：采用洗脱液洗脱第二磁珠，收集洗脱产物；将洗脱产物和抽提液混合处理，收集上清液，并将上清液作为纯化产物。采用所述的有机试剂纯化处理步骤，有助于优化核酸的纯化过程，以获得纯度较高的小片段核酸。

根据本发明的实施例，洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的至少一种。其中，三羟甲基氨基甲烷在洗脱液中作为缓冲剂和溶解剂，可以维持适当的pH值和离子强度，促进核酸的溶解和稳定，并减少金属离子对核酸的干扰；乙二胺四乙酸在洗脱液中作为金属离子螯合剂、酶抑制剂和洗脱助剂，起到保护核酸、促进洗脱和调节溶液pH值的作用。因此，两者的结合能够有效将第二磁珠上吸附的微小核酸片段或其他杂质洗脱下来。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷在洗脱液中的浓度为5mmol/L～15mmol/L。例如为5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L。因此，三羟甲基氨基甲烷在此浓度范围内能更好的维持适当的pH值和离子强度，促进核酸的溶解和稳定。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.8。例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在洗脱液中的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L。例如为0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L、0.10mmol/L、0.11mmol/L、0.12mmol/L、0.13mmol/L、0.14mmol/L、0.15mmol/L。因此，乙二胺四乙酸在此浓度范围内能更好地起到保护核酸、促进洗脱和调节溶液pH值的作用。

根据本发明的实施例，抽提液包含苯酚、Buffer EX和异戊醇的至少一种。其中，苯酚是蛋白质的变性剂，经过反复抽提能够使蛋白质变性并抑制DNase活性，从而能在后续的离心处理将洗脱产物中的蛋白质与核酸分离，从而去除蛋白杂质；Buffer EX也具有变性蛋白的作用，此外还能够加速洗脱产物和抽提液混合后的有机相和水相分层，并可除去水相中的痕迹酚；异戊醇能降低抽提液的表面张力，减少气泡产生，并使离心后的三相维持稳定。因此采用本发明的抽提液，能够更好地变性洗脱产物中的蛋白，通过剧烈振荡，蛋白溶解在有机相，核酸溶解在水相，离心后分层，将洗脱产物中的蛋白杂质与核酸分离开来，通过回收核酸存在的水层，达到去除蛋白杂质的作用。

在本发明的一些实施例中，苯酚在抽提液中的体积分数分数45％～55％。例如45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％。因此，苯酚在此范围内能更完全地使洗脱产物中的蛋白质变性，并抑制DNase活性，从而能在后续的离心处理将洗脱产物中的蛋白质与核酸分离，从而去除蛋白杂质。

在本发明的一些实施例中，Buffer EX在抽提液中的体积分数为40％～50％。例如40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％。因此，Buffer EX在此范围内能够加速洗脱产物和抽提液混合后的有机相和水相分层，并可较完全的除去水相中的痕迹酚，从而保持核酸的完整性和稳定性。

在本发明的一些实施例中，异戊醇在抽提液中的体积分数为1％～3％。例如1％、2％、3％。因此，异戊醇在此范围内可以降低抽提液的表面张力，有助于提高抽提的效率和效果。

为了能够将洗脱产物中的蛋白质较完全的去除，得到纯度较高的小片段核酸，洗脱液与抽提液的体积比为1:(0.5～1.5)。例如为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。因此，在此体积比的作用下能够得到纯度较高的核酸片度溶液。

如前所述，上述的第二磁珠经过洗脱和抽提处理后，得到纯化产物。为了能够得到较高纯度的纯化产物中的小核酸片段，将纯化产物与第三磁珠在第二溶液中进行孵育，以使纯化产物中的小核酸片段能被第三磁珠较完全的吸附。在此过程中，本发明所用到的第三磁珠和第二溶液的具体成分如前所述。

纯化产物与第三磁珠进行孵育后，得到第四磁珠，第四磁珠吸附有小片段核酸，为了得到这些小片段核酸，将第四磁珠用洗脱液进行洗脱，洗脱产物进行醇沉纯化处理，即第四磁珠的洗脱产物在助沉剂和乙醇的作用下，进行低温孵育，能使包括小片段核酸在内的核酸沉淀下来，进行离心、清洗和洗脱，得到含有小片段核酸的溶液。

醇沉纯化处理过程及其使用的助沉剂的具体成分如下：

为了获得小片段核酸，对第四磁珠进行洗脱处理，包括：将第四磁珠与洗脱液进行混合处理，将混合处理产物进行孵育处理以及吸附处理，保留第四磁珠的洗脱产物。

为了获得小片段核酸，对第四磁珠的洗脱产物进行醇沉纯化处理，包括：将第四磁珠的洗脱产物与助沉剂、无水乙醇进行混合处理，将混合处理产物进行室温孵育、吸附、保留上清处理。

根据本发明的实施例，助沉剂包含氯化镁和糖原的至少一种。其中，氯化镁增加了核酸与水分子之间的离子相互作用力，有助于微小核酸片段聚集形成沉淀；糖原可以作为沉淀核酸的载体或抓取剂，在核酸提取或纯化过程中，糖原的存在可以提供一个物理性结构，有助于核酸分子聚集形成沉淀。因此，两者的结合能够提高微小核酸片段的沉淀效率，使其更容易从溶液中分离出来。

在本发明的一些实施例中，氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。因此，在此浓度范围内，有助于微小核酸片段在氯化镁的存在下聚集形成沉淀，实现核酸的分离和纯化。

在本发明的一些实施例中，氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L。

在本发明的一些实施例中，糖原在助沉剂中的浓度为10mg/mL～30mg/mL。因此，在此浓度范围内，有助于微小核酸片段在糖原的存在下聚集形成沉淀，实现核酸的分离和纯化。

在本发明的一些实施例中，糖原在助沉剂中的浓度为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL。

在本发明的一些实施例中，助沉剂和无水乙醇的体积比为1:(100～150)。因此，在此比例范围内，能够提高小片段核酸的沉淀效率，适量的乙醇加入到核酸溶液中可以改变其溶解性质，有助于核酸的沉淀和纯化。例如为1:100、1:105、1:110、1:115、1:120、1:125、1:130、1:135、1:140、1:145、1:150。

根据本发明的实施例，孵育处理的温度为-75℃～-85℃，孵育处理的时间为0.5h～1.5h。

根据本发明的实施例，离心处理的转速为18000g～20000g，离心处理的时间为15～25min。

为了获得纯度较高的小片段核酸，在醇沉纯化处理前，进一步包括：将第四磁珠进行至少一次洗涤处理，优选，进行两次洗涤处理。因此，能够将去除磁珠上非特异性结合物或用于结合或反应的试剂残留，从而提高目标物的纯度。

根据本发明的实施例，洗涤处理是在清洗液存在的条件下进行的。

根据本发明的实施例，清洗液选自80％～90％的乙醇。

为了获得纯度较高的小片段核酸，在醇沉纯化处理后进一步包括：将醇沉纯化处理产物的沉淀进行至少一次洗涤处理，优选，进行两次洗涤处理。因此，能够将去除磁珠上非特异性结合物或用于结合或反应的试剂残留，从而提高小片段核酸的纯度。

根据本发明的实施例，洗涤处理是在清洗液存在的条件下进行的。

根据本发明的实施例，清洗液选自80％～90％的乙醇。

如前所述，在使用第一磁珠吸附之前需要对血浆样品提前进行裂解处理，所述裂解处理过程中的条件及试剂具体成分如下：

根据本发明的实施例，裂解处理是在蛋白酶和裂解液存在的条件下进行的。其中，蛋白酶能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，降解天然蛋白质，且其效果较好；裂解液能够消化蛋白质，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。因此，在两者的协同的作用下，使蛋白质能够被降解为更小的片段，从而使DNA游离出来。

根据本发明的实施例，蛋白酶是以蛋白酶储液的形式提供的。

根据本发明的实施例，蛋白酶选自蛋白酶K。蛋白酶K切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，降解天然蛋白质，且效果较好。

为了更好地降解血浆样品中的蛋白质，蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL～25mg/mL。因此，在此浓度范围内，能够较好的降解蛋白质。

在本发明的一些实施例中，蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL。

根据本发明的实施例，裂解液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的至少一种。其中，三羟甲基氨基甲烷在裂解液中作为缓冲剂，用于维持适当的pH值；乙二胺四乙酸是一种螯合剂，可以与金属离子形成稳定的络合物，防止金属离子对蛋白质酶解的抑制作用，从而保持蛋白酶的活性；十二烷基肌氨酸钠能够解聚蛋白质，使其变为线性构象，从而使蛋白质易于被酶解为肽段；Triton X-100能够破坏细胞膜结构，并使蛋白质释放到溶液中。因此，裂解液能够消化蛋白质，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷在裂解液中的浓度为5mmol/L～20mmol/L。例如为5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L。因此，在此浓度范围内，能够有效地调节裂解液的酸碱度，提供合适的反应环境，并稳定蛋白质酶解过程中的pH值。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.6。例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在裂解液中的浓度为0.1mmol/L～5mmol/L。例如为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L。因此，在此浓度范围内，能有效地防止金属离子对蛋白质酶解的抑制作用，从而保持蛋白酶的活性。

在本发明的一些实施例中，十二烷基肌氨酸钠在裂解液中的体积分数为15％～30％。例如为15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％。因此，在此浓度范围内，能有效地使蛋白质被酶解为肽段。

在本发明的一些实施例中，Triton X-100在裂解液中的体积分数为6％～12％。例如为6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％。因此，在此浓度范围内，能有效地破坏细胞膜结构，并使蛋白质释放到溶液中。

为了能够将血浆样品中的蛋白质进行充分的裂解，血浆样品、蛋白酶和裂解液的体积比为(15～25):(1～3):(0.5～1.5)。因此，体积比在此范围内，能够使血浆样品中的蛋白质得到充分的裂解。

根据本发明的实施例，裂解处理是在55℃～65℃的条件下进行的。因此，能够使血浆样品中的蛋白质得到充分的裂解。

根据本发明的实施例，裂解处理的时间为20～40min。因此，能够使血浆样品中的蛋白质得到充分的裂解。

试剂盒

为了能够实现上述提取血浆中游离核酸的方法，本发明提出了一种试剂盒。该试剂盒包含上述提取血浆中游离核酸的方法中所涉及到的试剂。具体地，该试剂盒包括：第一磁珠、第三磁珠、第一溶液、第二溶液、洗脱液、抽提液、清洗液、助沉剂和无水乙醇。本发明的试剂盒具有方便、高效的特点，可以从血浆样品中可靠地提取目标DNA。该试剂盒采用了精心筛选和配制的试剂组合，经过优化的步骤和条件，能够有效地分离和纯化长度约为50nt的全新游离核酸片段，这一技术为基础研究、临床诊断和生物医学应用等领域提供了有力的工具和方法，为科学进步和医学进展做出了重要贡献。

根据本发明的实施例，试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，试剂盒进一步包括：蛋白酶和裂解液。其中，蛋白酶能够切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，降解天然蛋白质，且其效果较好；裂解液能够消化蛋白质，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。因此，在两者的协同的作用下，使蛋白质能够被降解为更小的片段，从而使DNA游离出来。

根据本发明的实施例，蛋白酶是以蛋白酶储液的形式提供的。

根据本发明的实施例，蛋白酶选自蛋白酶K。蛋白酶K切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，降解天然蛋白质，效果较好。

为了更好地降解血浆样品中的蛋白质，蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL～25mg/mL。因此，在此浓度范围内，能够较好的降解蛋白质。

在本发明的一些实施例中，蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL。

根据本发明的实施例，裂解液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的至少一种。其中，三羟甲基氨基甲烷在裂解液中作为缓冲剂，用于维持适当的pH值；乙二胺四乙酸是一种螯合剂，可以与金属离子形成稳定的络合物，防止金属离子对蛋白质酶解的抑制作用，从而保持蛋白酶的活性；十二烷基肌氨酸钠能够解聚蛋白质，使其变为线性构象，从而使蛋白质易于被酶解为肽段；Triton X-100能够破坏细胞膜结构，并使蛋白质释放到溶液中。因此，裂解液能够消化蛋白质，使核蛋白变性降解，从而使DNA从核蛋白中游离出来。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷在裂解液中的浓度为5mmol/L～20mmol/L。例如为5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L。因此，在此浓度范围内，能够有效地调节裂解液的酸碱度，提供合适的反应环境，并稳定蛋白质酶解过程中的pH值。

在本发明的一些实施例中，根据本发明的实施例，三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.6。例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在裂解液中的浓度为0.1mmol/L～5mmol/L。例如为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L。因此，在此浓度范围内，能有效地防止金属离子对蛋白质酶解的抑制作用，从而保持蛋白酶的活性。

在本发明的一些实施例中，十二烷基肌氨酸钠在裂解液中的体积分数为15％～30％。例如为15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％。因此，在此浓度范围内，能有效地使蛋白质被酶解为肽段。

在本发明的一些实施例中，Triton X-100在裂解液中的体积分数为6％～12％。例如为6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％。因此，在此浓度范围内，能有效地破坏细胞膜结构，并使蛋白质释放到溶液中。

根据本发明的实施例，第一磁珠、第三磁珠选自超顺磁性羧基纳米磁珠。超顺磁性羧基纳米磁珠能够选择性地结合和捕获经裂解处理后的血浆样品中的DNA，并且利用纳米颗粒的超顺磁性质，使其迅速沉降到样品底部。通过磁力作用，可将含有目标DNA的纳米颗粒集中分离出来，从而实现对DNA的富集和纯化。

根据本发明的实施例，第一溶液、第二溶液分别包含有机醇、离液盐、胍盐和乙二胺四乙酸的至少一种。为了使上述超顺磁性羧基纳米磁珠更好的发挥作用，第一溶液和第二溶液中创新性的加入了有机醇和离液盐，其中有机醇能够富集小片段核酸，有助于超顺磁性羧基纳米磁珠对长度小于100bp的小片段核酸的结合，离液盐能够促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构从而更好地与超顺磁性羧基磁珠结合。因此，采用本发明的第一溶液、第二溶液能够提高磁珠吸附微小片段的能力，从而达到吸附50nt左右长度的游离核酸片段。

根据本发明的实施例，有机醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或环戊醇。将磁珠特别是超顺磁性羧基纳米磁珠与血浆样本在含有有机醇的溶液中混合，有机醇可以促进磁珠特别是顺磁性羧基纳米磁珠对血浆样本中核酸的提取，特别是增强对长度小于100bp的核酸小片段的提取。

在本发明的一些实施例中，所述有机醇在所述第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％～85％。本发明第一溶液和/或第二溶液中加入高比例的醇溶液，能够使磁珠达到富集小片段核酸的目的。

为了使DNA分子更完全的暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，提高DNA分子与上述超顺磁性羧基纳米磁珠的结合结合率，所述离液盐在所述第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L。因此，能提高磁珠结合与小片段核酸的效率。

根据本发明的实施例，有机醇选自异丙醇。

根据本发明的实施例，离液盐选自氯化钠、六氟磷酸钠、硫氰酸钾或硫酸铜。本发明的第一溶液或第二溶液中加入离液盐能够促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构与羧基磁珠结合。

根据本发明的实施例，离液盐选自氯化钠。因此，氯化钠能促进DNA分子构象发生变化，暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，形成盐桥结构与羧基磁珠结合。

根据本发明的实施例，胍盐选自盐酸胍、三苯基胍、硫氰酸胍、氨基胍盐酸盐或碳酸胍。

在本发明的一些实施例中，第一溶液、第二溶液各自独立地包括异丙醇和氯化钠。因此，能够提高上述超顺磁性羧基纳米磁珠吸附血浆样品中长度小于100bp的小片段核酸的能力。

为了使上述超顺磁性羧基纳米磁珠能够更好地捕获小片段核酸，异丙醇在第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％～85％。因此，在离液盐存在的条件下，高浓度异丙醇的加入能使磁珠富集长度小于100bp的核酸小片段。

在本发明的一些实施例中，异丙醇在第一溶液和/或第二溶液中的体积分数为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％。

为了使DNA分子更完全的暴露磷酸骨架上大量带负电荷的磷酸基团，提高DNA分子与上述超顺磁性羧基纳米磁珠的结合结合率，氯化钠在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L。因此在此浓度范围内，能够使上述超顺磁性羧基纳米磁珠充分的吸附小片段核酸。

在本发明的一些实施例中，氯化钠在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L。

第一溶液、第二溶液中还可以各自独立地包括乙二胺四乙酸。其主要用于螯合金属离子，以防止金属离子与DNA的结合，保持DNA的稳定。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在第一溶液和/或第二溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L。例如为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L。

根据本发明的实施例，第一溶液和第二溶液相同或不同。

根据本发明的实施例，洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的至少一种。其中，三羟甲基氨基甲烷在洗脱液中作为缓冲剂和溶解剂，可以维持适当的pH值和离子强度，促进核酸的溶解和稳定，并减少金属离子对核酸的干扰；乙二胺四乙酸在洗脱液中作为金属离子螯合剂、酶抑制剂和洗脱助剂，起到保护核酸、促进洗脱和调节溶液pH值的作用。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷在洗脱液中的浓度为5mmol/L～15mmol/L。例如为5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L。因此，三羟甲基氨基甲烷在此浓度范围内能更好的维持适当的pH值和离子强度，促进核酸的溶解和稳定。

在本发明的一些实施例中，三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.8。例如为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8。

在本发明的一些实施例中，乙二胺四乙酸在洗脱液中的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L。例如为0.05mmol/L、0.06mmol/L、0.07mmol/L、0.08mmol/L、0.09mmol/L、0.10mmol/L、0.11mmol/L、0.12mmol/L、0.13mmol/L、0.14mmol/L、0.15mmol/L。因此，乙二胺四乙酸在此浓度范围内能更好地起到保护核酸、促进洗脱和调节溶液pH值的作用。

根据本发明的实施例，抽提液包含苯酚、Buffer EX和异戊醇的至少一种。因此能够其中，苯酚是蛋白质的变性剂，经过反复抽提能够使蛋白质变性并抑制DNase活性，从而能在后续的离心处理将洗脱产物中的蛋白质与核酸分离，从而去除蛋白杂质；Buffer EX也具有变性蛋白的作用，此外还能够加速洗脱产物和抽提液混合后的有机相和水相分层，并可除去水相中的痕迹酚；异戊醇能降低抽提液的表面张力，减少气泡产生，并使离心后的三相维持稳定。因此采用本发明的抽提液，能够更好地变性洗脱产物中的蛋白，通过剧烈振荡，蛋白溶解在有机相，核酸溶解在水相，离心后分层，将洗脱产物中的蛋白杂质与核酸分离开来，通过吸取核酸存在的水层，达到去除蛋白杂质的作用。

在本发明的一些实施例中，苯酚在抽提液中的体积分数分数45％～55％。因此，苯酚在此范围内能更完全地使洗脱产物中的蛋白质变性，并抑制DNase活性，从而能在后续的离心处理将洗脱产物中的蛋白质与核酸分离，从而去除蛋白杂质。

在本发明的一些实施例中，苯酚在抽提液中的体积分数分数45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％。

在本发明的一些实施例中，Buffer EX在抽提液中的体积分数为40％～50％。因此，Buffer EX在此范围内能够加速洗脱产物和抽提液混合后的有机相和水相分层，并可较完全的除去水相中的痕迹酚，从而保持核酸的完整性和稳定性。

在本发明的一些实施例中，Buffer EX在抽提液中的体积分数为40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％。

在本发明的一些实施例中，异戊醇在抽提液中的体积分数为1％～3％。因此，异戊醇在此范围内可以降低抽提液的表面张力，有助于提高抽提的效率和效果。

在本发明的一些实施例中，异戊醇在抽提液中的体积分数为1％、2％、3％。

在本发明的一些实施例中，清洗液选自80％～90％的乙醇。例如为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％。

根据本发明的实施例，助沉剂包含氯化镁和糖原的至少一种。其中，氯化镁增加了核酸与水分子之间的离子相互作用力，有助于微小核酸片段聚集形成沉淀；糖原可以作为沉淀核酸的载体或抓取剂，在核酸提取或纯化过程中，糖原的存在可以提供一个物理性结构，有助于核酸分子聚集形成沉淀。因此，两者的结合能够提高微小核酸片段的沉淀效率，使其更容易从溶液中分离出来。

在本发明的一些实施例中，氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。因此，在此浓度范围内，有助于微小核酸片段在氯化镁的存在下聚集形成沉淀，实现核酸的分离和纯化。

在本发明的一些实施例中，氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.1mol/L、1.2mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L。

在本发明的一些实施例中，糖原在助沉剂中的浓度为10mg/mL～30mg/mL。因此，在此浓度范围内，有助于微小核酸片段在糖原的存在下聚集形成沉淀，实现核酸的分离和纯化。

在本发明的一些实施例中，糖原在助沉剂中的浓度为10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、30mg/mL。

建库方法

本发明提出了一种建库的方法。根据本发明的实施例，方法包括：利用前面的方法或前面的试剂盒提取血浆样本中游离DNA；将游离DNA进行连接接头处理和建库处理，以便获得测序文库。由前，采用本发明的方法或试剂盒，可以有效地分离和纯化长度约为50nt的全新游离核酸片段。这些片段具有重要的生物信息和潜在的应用价值。通过建立测序文库，能够获得长度约为50nt的全新游离核酸片段的准确序列信息，这些序列信息可以用于进一步的生物信息学分析；测序文库也为特定应用领域提供了重要的资源，如药物开发、疾病诊断、生物标记物发现等。

测序方法

本发明提出了一种测序方法。根据本发明的实施例，方法包括：利用前面的方法构建血浆样本的游离DNA测序文库；将测序文库进行测序处理；以及将测序处理结果与预定参考序列进行比对处理，以便获得血浆样本的游离DNA序列信息。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明实施例所需的试剂见表1所示：

表1

实施例1：磁珠法与有机试剂抽提结合的提取方法

本发明的磁珠法与有机试剂抽提结合用于血浆全片段游离核酸提取的方法具体步骤如下：

(1)样本准备：使用EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝采血管采集人外周静脉全血样本(该人外周静脉全血样本可以通过购买获得)，采集完毕后，采血管轻柔颠倒3～5次并及时放置2～8℃保存，须在8小时内进行血浆分离。样本分别使用1600g离心10分钟和16000g离心10分钟分离血浆。

(2)样本裂解：在步骤(1)分离的200μl血浆中加入20μl蛋白酶K(20mg/mL)和11μl裂解液，混匀15秒，60℃孵育30分钟；

(3)样本磁珠纯化：在步骤(2)产物中加入100μl磁珠和600μl结合液，混匀15秒，室温孵育10分钟，磁力架吸附5～10分钟，然后弃上清；

(4)样本有机试剂纯化：在步骤(3)产物中加入500μl洗脱液洗脱，然后加入500μl抽提液，混匀15秒，室温19000g离心5min，重新混匀15秒，室温19000g离心5min，取500μl上清；

(5)样本磁珠纯化：在步骤(4)产物中加入200μl磁珠和1200μl磁珠结合液，混匀15秒，室温孵育10分钟，磁力架吸附5～10分钟，弃上清，使用2mL清洗液清洗2次，弃掉清洗液后使用100μl水回溶；

(6)样本醇沉纯化：在步骤(5)产物中加入2μl助沉剂和250μl无水乙醇后，-80℃低温孵育1小时，孵育结束后4℃下19000g离心20min，弃上清，清洗液清洗沉淀2次，弃掉清洗液后加入20μl洗脱液，50℃孵育5分钟回溶。

实施例2：游离DNA提取的测试

(1)测试1：用稀释后的50bp ladder溶液模拟血浆分别使用市售试剂盒A、B(其中，试剂盒A是诺唯赞的血浆/血清核酸提取纯化试剂盒，试剂盒B是南科征途的血浆提取试剂盒)和本发明的方法进行游离DNA提取，对比本发明的方法和市售游离DNA提取纯化试剂盒对于100bp以下片段的提取效果。将试剂盒A、B以及本发明的方法提取的产物进行毛细管电泳片段分析，分析结果分别如图1、2和3所示，结果发现本发明与市售试剂盒A、B对比，对于50bp左右核酸片段的回收效果更佳。

(2)测试2：用200μl血浆分别使用市售试剂盒A、B和本方法提供的试剂盒进行游离DNA提取，产物构建二代测序文库，并进行上机测序，统计分析测序结果中30-70bp片段的占比。分析的结果见表2所示，根据真实血浆的测序分析结果，本方法提取的样本保留了更多的30-70bp范围的新型游离DNA片段，优于市售血浆游离DNA提取试剂盒A、B。

表2

对比例1：磁珠结合液的选择

用200μl血浆进行磁珠结合液的选择测试。分别使用市售血浆提取试剂盒(南科征途的血浆提取试剂盒)中的磁珠结合液和本发明的磁珠结合液，按照本发明的实验流程进行提取纯化。产物构建二代测序文库，文库产物进行毛细管电泳片段分析，对比200bp(插入片段约50bp)的片段峰。结果如图4、5所示，可见，使用本发明的磁珠结合液，能得到更多的微小片段。

对比例2：抽提液和助沉剂的选择

用3份血浆，每份均分为2份200μl，除抽提液外，其他流程均按照本发明的方法进行相同处理，1份使用苯酚、氯仿、异戊醇抽提，另1份使用苯酚、bufferEX、异戊醇提取，产物进行浓度和纯度检测，结果见表3所示，采用更安全的bufferEX替代氯仿能达到相同水平的提取效果。A260/A230偏低为糖原引起，不影响下游实验。

表3

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种提取血浆中游离核酸的方法，其特征在于，包括：

将经裂解处理后的血浆样品与含有第一磁珠的第一溶液进行孵育，收集第二磁珠；

对所述第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物；

将所述纯化产物与含有第三磁珠的第二溶液进行孵育，收集第四磁珠；

将所述第四磁珠进行醇沉纯化处理，得到所述的游离核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一磁珠、所述第三磁珠选自超顺磁性羧基纳米磁珠；

任选地，所述第一溶液、所述第二溶液分别包含有机醇、离液盐、胍盐和乙二胺四乙酸的至少一种；

任选地，所述有机醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或环戊醇，优选，选自异丙醇；

任选地，所述离液盐选自氯化钠、六氟磷酸钠、硫氰酸钾或硫酸铜，优选，选自氯化钠；

任选地，所述胍盐选自盐酸胍、三苯基胍、硫氰酸胍、氨基胍盐酸盐或碳酸胍；

任选地，所述有机醇在所述第一溶液中的体积分数为75％～85％；

任选地，所述离液盐在所述第一溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述第一溶液包含异丙醇和氯化钠，且所述异丙醇在所述第一溶液中的体积分数为75％～85％，所述氯化钠在所述第一溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述第一溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L；

任选地，所述有机醇在所述第二溶液中的体积分数为75％～85％；

任选地，所述离液盐在所述第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述第二溶液包含异丙醇和氯化钠，且所述异丙醇在所述第二溶液中的体积分数为75％～85％，所述氯化钠在所述第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述第二溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L；

任选地，所述第一溶液和所述第二溶液相同或不同；

任选地，所述第一磁珠和所述第一溶液的体积比为1:(4～10)；

任选地，所述第三磁珠和所述第二溶液的体积比为1:(4～10)；

任选地，所述血浆样品、所述第一磁珠和所述第一溶液的体积比为(1～3):1:(4～10)；

任选地，所述纯化产物、所述第三磁珠和所述第二溶液的体积比为(1～5):1:(4～10)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述第二磁珠进行有机试剂纯化处理，得到纯化产物，包括：采用洗脱液洗脱所述第二磁珠，收集洗脱产物；将所述洗脱产物和抽提液混合处理，收集上清液，并将所述上清液作为所述纯化产物；

任选地，所述洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的至少一种；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱液中的浓度为5mmol/L～15mmol/L；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.8；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述洗脱液中的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L；

任选地，所述抽提液包含苯酚、Buffer EX和异戊醇的至少一种；

任选地，所述苯酚在所述抽提液中的体积分数分数45％～55％；

任选地，所述Buffer EX在所述抽提液中的体积分数为40％～50％；

任选地，所述异戊醇在所述抽提液中的体积分数为1％～3％；

任选地，所述洗脱液与所述抽提液的体积比为1:(0.5～1.5)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇沉纯化处理包括：将所述第四磁珠与助沉剂、无水乙醇进行混合处理，将混合处理产物进行孵育处理以及离心处理；

任选地，所述助沉剂包含氯化镁和糖原的至少一种；

任选地，所述氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L；

任选地，所述糖原在所述助沉剂中的浓度为10mg/mL～30mg/mL；

任选地，所述助沉剂和所述无水乙醇的体积比为1:(100～150)；

任选地，所述孵育处理的温度为-75℃～-85℃，所述孵育处理的时间为0.5h～1.5h；

任选地，所述离心处理的转速为18000g～20000g，所述离心处理的时间为15～25min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解处理是在蛋白酶和裂解液存在的条件下进行的；

任选地，所述蛋白酶是以蛋白酶储液的形式提供的；

任选地，所述蛋白酶选自蛋白酶K；

任选地，所述蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL～25mg/mL；

任选地，所述裂解液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的至少一种；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷在所述裂解液中的浓度为5mmol/L～20mmol/L；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.6；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述裂解液中的浓度为0.1mmol/L～5mmol/L；

任选地，所述十二烷基肌氨酸钠在所述裂解液中的体积分数为15％-30％；

任选地，所述Triton X-100在所述裂解液中的体积分数为6％-12％；

任选地，所述血浆样品、所述蛋白酶和所述裂解液的体积比为(15～25):(1～3):(0.5～1.5)；

任选地，所述裂解处理是在55℃～65℃的条件下进行的；

任选地，所述裂解处理的时间为20～40min。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在所述醇沉纯化处理前，进一步包括：将所述第四磁珠进行至少一次洗涤处理，优选，进行两次洗涤处理；

任选地，所述洗涤处理是在清洗液存在的条件下进行的；

任选地，所述清洗液选自80％～90％的乙醇。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，在所述醇沉纯化处理后进一步包括：将醇沉纯化处理产物的沉淀进行至少一次洗涤处理，优选，进行两次洗涤处理，得到所述游离DNA；

任选地，所述洗涤处理是在清洗液存在的条件下进行的；

任选地，所述清洗液选自80％～90％的乙醇。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括：第一磁珠、第三磁珠、第一溶液、第二溶液、洗脱液、抽提液、清洗液、助沉剂和无水乙醇。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：蛋白酶和裂解液；

任选地，所述蛋白酶是以蛋白酶储液的形式提供的；

任选地，所述蛋白酶选自蛋白酶K；

任选地，所述蛋白酶K储液的浓度为15mg/mL～25mg/mL；

任选地，所述裂解液包含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基肌氨酸钠和Triton X-100的至少一种；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷在所述裂解液中的浓度为5mmol/L～20mmol/L；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.6；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述裂解液中的浓度为0.1mmol/L～5mmol/L；

任选地，所述十二烷基肌氨酸钠在所述裂解液中的体积分数为15％-30％；

任选地，所述Triton X-100在所述裂解液中的体积分数为6％-12％；

任选地，所述第一磁珠、所述第三磁珠选自超顺磁性羧基纳米磁珠；

任选地，所述第一溶液、所述第二溶液分别包含有机醇、离液盐、胍盐和乙二胺四乙酸的至少一种；

任选地，所述有机醇选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇或环戊醇，优选，选自异丙醇；

任选地，所述离液盐选自氯化钠、六氟磷酸钠、硫氰酸钾或硫酸铜，优选，选自氯化钠；

任选地，所述胍盐选自盐酸胍、三苯基胍、硫氰酸胍、氨基胍盐酸盐或碳酸胍；

任选地，所述有机醇在所述第一溶液中的体积分数为75％～85％；

任选地，所述离液盐在所述第一溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述第一溶液包含异丙醇和氯化钠，且所述异丙醇在所述第一溶液中的体积分数为75％～85％，所述氯化钠在所述第一溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述第一溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L；

任选地，所述有机醇在所述第二溶液中的体积分数为75％～85％；

任选地，所述离液盐在所述第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述第二溶液包含异丙醇和氯化钠，且所述异丙醇在所述第二溶液中的体积分数为75％～85％，所述氯化钠在所述第二溶液中的浓度为0.5mol/L～2mol/L；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述第二溶液中的浓度为0.1mmol/L～1mmol/L；

任选地，所述第一溶液和所述第二溶液相同或不同；

任选地，所述洗脱液包含三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸的至少一种；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷在所述洗脱液中的浓度为5mmol/L～15mmol/L；

任选地，所述三羟甲基氨基甲烷的pH值为7.2～7.8；

任选地，所述乙二胺四乙酸在所述洗脱液中的浓度为0.05mmol/L～0.15mmol/L；

任选地，所述抽提液包含苯酚、Buffer EX和异戊醇的至少一种；

任选地，所述苯酚在所述抽提液中的体积分数分数45％～55％；

任选地，所述Buffer EX在所述抽提液中的体积分数为40％～50％；

任选地，所述异戊醇在所述抽提液中的体积分数为1％～3％；

任选地，所述清洗液选自80％～90％的乙醇；

任选地，所述助沉剂包含氯化镁和糖原的至少一种；

任选地，所述氯化镁在助沉剂中的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L；

任选地，所述糖原在所述助沉剂中的浓度为10mg/mL～30mg/mL。

10.权利要求8或9所述的试剂盒在提取血浆游离DNA中的用途。

11.一种建库方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1-7任一项所述的方法或权利要求8-9任一项所述的试剂盒提取血浆样本中游离DNA；

将所述游离DNA进行连接接头处理和建库处理，以便获得测序文库。

12.一种测序方法，其特征在于，包括：

利用权利要求11所述的方法构建血浆样本的游离DNA测序文库；

将所述测序文库进行测序处理；以及

将测序处理结果与预定参考序列进行比对处理，以便获得血浆样本的游离DNA序列信息。