CN117965437A - 制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，包括以下步骤：分离步骤、将大鼠胎盘破碎至匀浆状态，得到大鼠胎盘组织块。培养步骤、对所述大鼠胎盘组织块进行离心后，对离心后的所述大鼠胎盘组织块进行培养。传代步骤、通过酶消化法对培养后的大鼠胎盘组织块进行传代，得到间充质干细胞。本发明提供的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其制备工艺简单、制备效率高，制备成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞制备技术领域，特别是涉及一种制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的诱导条件下可以分化形成多种组织来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成神经细胞等。间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，而且还具有自我更新、归巢、免疫调节、造血支持、分泌多种细胞因子、促进干细胞移植等多种生物学特性，是参与组织损伤修复和组织再生的重要细胞组成部分。
目前，可以从胎盘组织中提取间充质干细胞，即胎盘间充质干细(Placentalmesenchymal stem cells，PMSCs)。胎盘间充质干细胞在一定条件下可以分化成多种功能细胞，比如像APSC多能细胞，其在胚胎发育中来源于中胚层。但目前现有技术多通过人体的胎盘组织进行间充质干细胞的制备，制备效率较低，且操作过程繁琐，易掺入其它杂细胞，培养代次也较少，同时制备成本较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，并提供一种制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，以解决现有技术存在的制备工艺复杂、制备效率低、及制备成本高的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
分离步骤：将大鼠胎盘破碎至匀浆状态，得到大鼠胎盘组织块；
培养步骤：对所述大鼠胎盘组织块进行离心后，对离心后的所述大鼠胎盘组织块进行培养；
传代步骤：通过酶消化法对培养后的大鼠胎盘组织块进行传代，得到间充质干细胞。
进一步地，所述分离步骤包括：
提供经细菌真菌检测合格的大鼠胎盘，用生理盐水清洗所述大鼠胎盘，再用酒精浸泡所述大鼠胎盘，弃去酒精后，用生理盐水清洗所述大鼠胎盘；将清洗后的所述大鼠胎盘移入离心管中，并剪碎至匀浆状态，得到所述大鼠胎盘组织块。
进一步地，所述培养步骤包括：
在所述离心管中加入生理盐水，离心后转移部分所述大鼠胎盘组织块至培养瓶中，并在所述培养瓶中加入培养基，对所述大鼠胎盘组织块进行培养。
进一步地，在所述培养瓶中加入培养基后还包括：使所述大鼠胎盘组织块在所述培养瓶中分散均匀，并将所述培养瓶放入培养箱中进行培养。
进一步地，每间隔2-3天，弃掉所述培养瓶中的所述培养基，并加入新的培养基。
进一步地，所述传代步骤包括：
当所述大鼠胎盘组织块周围铺满原代细胞后开始传代培养；弃去所述培养瓶中的培养基，并加入生理盐水对铺满原代细胞的所述大鼠胎盘组织块进行洗涤；在所述培养瓶中加入胰蛋白酶后，将所述培养瓶放入培养箱中消化；
当细胞回缩后，终止消化；将所述大鼠胎盘组织块转移至离心管中，离心。
进一步地，所述传代步骤还包括：
弃掉离心管中的上清液，加入培养基，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液接种于培养瓶中，放入培养箱中培养，得到所述间充质干细胞。
进一步地，所述细胞悬液的接种密度为0.8～1.03×104个细胞/厘米2。
进一步地，所述制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法还包括细胞冻存步骤，所述细胞冻存步骤包括：
当所述间充质干细胞的融合度达到80％以上时，收集所述间充质干细胞进行冻存；
在培养瓶中加入生理盐水，对所述间充质干细胞进行清洗；
在所述培养瓶中加入胰蛋白酶后，将所述培养瓶放入培养箱中消化；
当细胞回缩后，终止消化；将细胞悬液收集到离心管中，离心；
弃掉上清液，加入细胞冻存液，使细胞悬浮，采用冻存管分装暂存。
进一步地，所述制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法还包括大鼠胎盘分离步骤：
提供孕龄18至22天的大鼠，将所述大鼠处死后，将大鼠置于酒精中浸泡，分离所述大鼠的胎盘。
根据本发明的技术方案可知，本发明的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，通过对大鼠胎盘进行分离、培养和传代来制备大鼠胎盘间充质干细胞，其操作步骤简单，制备成本低廉，制备效率高。
附图说明
图1为本发明实施例制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法的流程示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
如图1所示，为本发明实施例的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法的流程示意图。
本发明实施例的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法包括以下步骤：
S1、大鼠胎盘分离步骤：提供孕龄18～22天的大鼠，将大鼠处死后，将大鼠置于酒精中浸泡，分离大鼠的胎盘。
具体地，在本实施例中，包括：
S1.1、准备步骤：首先准备试剂，包括浓度为75％的酒精及培养基。再准备耗材，包括手术刀、无菌纱布、直角钳、组织剪、无齿手术镊、无菌垫片、离心管、妊娠期雌大鼠。还要准备相应设备，本实施例中所有设备为生物安全柜。
S1.2、操作前确认：对试剂及耗材、仪器、设备进行确认，确保信息一致，物料充足、仪器设备均完好且在有效期内。
S1.3、物料传入：开启生物安全柜，将培养基、试剂、试验用具除去外包装，用75％酒精消毒外表面，放入生物安全柜内。无菌操作分装培养基到50ml的离心管中，每管分装20ml的培养基备用。
S1.4、处死大鼠：取孕龄18-22天左右的大鼠，比如可选用孕龄20天的大鼠，将大鼠处死备用。
S1.5、浸泡消毒：将处死后的大鼠在75％酒精中浸泡30分钟左右，浸泡前清除大鼠肛门外的大便，以减小污染风险。
S1.6、解剖大鼠，分离胎盘：打开生物安全柜，无菌纱布平铺其上。酒精浸泡消毒后的大鼠尸体，并将其仰放于无菌纱布上，一手持直角钳夹起腹部表皮，一手持剪刀清理周边鼠毛。沿腹部正中线至生殖器前端剪开表皮，用手术刀轻轻划开腹腔膜。用剪刀靠近子宫端分离出大鼠胎盘，置于已装有培养基的离心管内，浸泡清洗约30秒后，转移到新的含培养基的离心管内，并做好标记，将离心管放入储存盒进行储存，每个储存盒中放置一个离心管，每个离心管中放有一个大鼠胎盘。
S2、分离前准备：
S2.1、试剂：75％医用酒精、大鼠胎盘间充质干细胞用培养基、生理盐水、浓度为0.25％的胰蛋白酶、以及细胞冻存液。
S2.2、设备：生物安全柜、冷冻离心机、培养箱、电动助吸器、细胞计数仪、倒置显微镜、及冷藏冷冻冰箱。
S2.3、耗材：消毒手术器械、150mm培养皿、50ml离心管、移液管、T175培养瓶、T25、T75培养瓶、100μm细胞筛网。
S3、分离步骤：将大鼠胎盘破碎至匀浆状态，得到大鼠胎盘组织块。
S3.1、操作准备：将洁净A级生物安全柜照紫外线杀菌30分钟后打开；检查所需仪器设备(酒精灯、电动助吸器)是否正常，检查试剂耗材是否齐全，并将其放于指定位置。在37℃的培养箱中预温大鼠胎盘干细胞用培养基，准备适量的生理盐水。
S3.2、将储存盒打开，拿出离心管，取离心管内的10ml保存液做细菌真菌检测，将剩余保存液倒入废液缸中。待检测合格后，取出胎盘，用生理盐水清洗胎盘1次，然后用500ml浓度为75％的酒精将胎盘浸泡2分钟，弃去酒精后用生理盐水再清洗胎盘2次。
S3.3、清洗后，将胎盘转移入50ml的离心管中，剪碎至匀浆状态，得到大鼠胎盘组织块。
S4、培养步骤：对大鼠胎盘组织块进行离心后，对离心后的大鼠胎盘组织块进行培养。
S4.1、将装有胎盘的离心管内补充生理盐水至45ml，以1200r/min的转速，升9降7(以9档升速，以7档减速)，离心5分钟。离心后用移液管吸取1ml的大鼠胎盘组织块，并将其转移至T75培养瓶(培养面积为75cm2的培养瓶)中，对大鼠胎盘组织块进行分装，并在每个培养瓶中加入15ml培养基。
S4.2、旋紧培养瓶的瓶盖，并轻轻晃动培养瓶，尽量使大鼠胎盘组织块分散均匀，通过显微镜进行观察拍照，并将培养瓶放入37℃、5％浓度CO2的培养箱中培养。
S4.3、对大鼠胎盘组织块培养3天后，目测观察是否有培养基浑浊污染现象。
S4.4、培养第7至10天后，在显微镜下观察培养瓶中的组织和细胞。观察大鼠胎盘组织块是否有细胞爬出，若有，则进行拍照记录，全部细胞观察完毕后，弃掉培养瓶中的培养基，并按15ml/瓶的量在培养瓶中加入新的培养基。并每间隔2-3天，弃掉培养瓶中的培养基，再加入新的培养基。
S5、传代步骤：通过酶消化法对培养后的大鼠胎盘组织块进行传代，得到间充质干细胞。
S5.1、通过倒置显微镜观察细胞形态和融合度，确定细胞是否可以进行第一次传代。当大鼠胎盘组织块周围铺满原代细胞后即可进行传代培养，并拍照记录。在第二次以上的传代培养中，需要细胞融合度达到80％以上。
S5.2、将T175培养瓶放在生物安全柜中，将大鼠胎盘组织块转移至该培养瓶中，弃掉旧的培养基，加入适量生理盐水，对铺满原代细胞的大鼠胎盘组织块清洗3次以上。
S5.3、在培养瓶中加入浓度0.25％的胰蛋白酶，每瓶的加入量为3ml，将培养瓶放置到37℃、5％浓度CO2的培养箱中消化1至2分钟，当细胞明显回缩后，轻轻晃动培养瓶(轻拍)，使细胞在培养瓶内脱落。
S5.4、在培养瓶中加入2倍细胞体积的培养基，终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液经细胞筛网过滤后收集到容量为50ml的离心管中，在离心管中补充生理盐水至45ml，离心，转速1200rpm，时间5min。
S5.5、弃掉离心管中的上清液，加入适量间充质干细胞用培养基于离心管内，用吸管轻轻吹打，避免细胞沉淀，使细胞悬浮均匀，并对细胞进行计数。
S5.6、将细胞悬液接种于T175培养瓶中，每瓶接种约1.4～1.8×106个细胞，细胞悬液的接种密度约为0.8～1.03×104个细胞/厘米2，旋紧瓶盖。将培养瓶放回37℃、浓度5％CO2的培养箱中继续培养，得到间充质干细胞。
S6、细胞冻存步骤：当间充质干细胞的融合度达到80％以上时，收集间充质干细胞进行冻存。在培养瓶中加入生理盐水，对间充质干细胞进行清洗。在培养瓶中加入胰蛋白酶后，将培养瓶放入培养箱中消化。当细胞回缩后，终止消化；将细胞悬液收集到离心管中，离心。弃掉上清液，加入细胞冻存液，使细胞悬浮，采用冻存管分装暂存。
S6.1、从培养箱中取出培养瓶，在倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达到80％以上的融合度时，可以收集细胞进行冻存，并拍照记录。
S6.2、在生物安全柜中打开培养瓶的瓶盖，用移液管收集细胞培养的上清液于容量50ml的离心管中，并进行无菌检测。
S6.3、取适量生理盐水加入培养瓶，清洗细胞3次。
S6.4、每T175培养瓶中加入3ml浓度为0.25％的胰蛋白酶，将培养瓶放置到培养箱中消化1～2分钟，当细胞明显回缩后，轻轻晃动培养瓶(轻拍)使细胞从培养上瓶脱落。
S6.5、在培养瓶中加入2倍细胞体积的培养基，终止消化，将细胞悬液收集到50ml的离心管中，取少量细胞悬液进行计数，离心，转速1200rpm，时间5分钟。
S6.6、细胞离心时准备细胞冻存液，细胞冻存液的体积根据细胞计数结果进行计算，细胞冻存密度为5×106个/ml。
S6.7、离心后弃掉上清液。在培养瓶中加入适量细胞冻存液，调整细胞密度为5×106个/ml。用吸管轻轻吹打，防止细胞沉淀，使细胞悬浮均匀。若需要，则取1.5ml的细胞悬液做流式细胞检测。
S6.8、每个冻存管分装1/4ml，旋紧管盖，放置4℃条件下暂存。
S6.9、做完细胞收集工作，将冻存管转入程控降温盒，放入-80℃冰箱进行冻存，24h后转入液氮罐。
本发明实施例的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其操作步骤简单，杂细胞较少，且培养代次可以达到10代，相比现有技术的制备方法培养代次得到显著提高。通过大鼠胎盘提取间充质干细胞的制备成本较低，其培养代次的显著提高可以节约胎盘资源，提高同一根胎盘间充质干细胞产量，制备效率也较高。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的优选的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离步骤：将大鼠胎盘破碎至匀浆状态，得到大鼠胎盘组织块；
培养步骤：对所述大鼠胎盘组织块进行离心后，对离心后的所述大鼠胎盘组织块进行培养；
传代步骤：通过酶消化法对培养后的大鼠胎盘组织块进行传代，得到间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述分离步骤包括：
提供经细菌真菌检测合格的大鼠胎盘，用生理盐水清洗所述大鼠胎盘，再用酒精浸泡所述大鼠胎盘，弃去酒精后，用生理盐水清洗所述大鼠胎盘；将清洗后的所述大鼠胎盘移入离心管中，并剪碎至匀浆状态，得到所述大鼠胎盘组织块。
3.根据权利要求2所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述培养步骤包括：
在所述离心管中加入生理盐水，离心后转移部分所述大鼠胎盘组织块至培养瓶中，并在所述培养瓶中加入培养基，对所述大鼠胎盘组织块进行培养。
4.根据权利要求3所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，在所述培养瓶中加入培养基后还包括：使所述大鼠胎盘组织块在所述培养瓶中分散均匀，并将所述培养瓶放入培养箱中进行培养。
5.根据权利要求3或4所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，每间隔2-3天，弃掉所述培养瓶中的所述培养基，并加入新的培养基。
6.根据权利要求1所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述传代步骤包括：
当所述大鼠胎盘组织块周围铺满原代细胞后开始传代培养；弃去所述培养瓶中的培养基，并加入生理盐水对铺满原代细胞的所述大鼠胎盘组织块进行洗涤；在所述培养瓶中加入胰蛋白酶后，将所述培养瓶放入培养箱中消化；
当细胞回缩后，终止消化；将所述大鼠胎盘组织块转移至离心管中，离心。
7.根据权利要求6所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述传代步骤还包括：
弃掉离心管中的上清液，加入培养基，得到细胞悬液；
将所述细胞悬液接种于培养瓶中，放入培养箱中培养，得到所述间充质干细胞。
8.根据权利要求1所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，所述细胞悬液的接种密度为0.8～1.03×104个细胞/厘米2。
9.根据权利要求7所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，还包括细胞冻存步骤，所述细胞冻存步骤包括：
当所述间充质干细胞的融合度达到80％以上时，收集所述间充质干细胞进行冻存；
在培养瓶中加入生理盐水，对所述间充质干细胞进行清洗；
在所述培养瓶中加入胰蛋白酶后，将所述培养瓶放入培养箱中消化；
当细胞回缩后，终止消化；将细胞悬液收集到离心管中，离心；
弃掉上清液，加入细胞冻存液，使细胞悬浮，采用冻存管分装暂存。
10.根据权利要求1所述的制备大鼠胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于，还包括大鼠胎盘分离步骤：
提供孕龄18～22天的大鼠，将所述大鼠处死后，将大鼠置于酒精中浸泡，分离所述大鼠的胎盘。
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