CN117947131A - 一种高活性低粘度的海参肽及其双向酶解制备方法和应用 - Google Patents
一种高活性低粘度的海参肽及其双向酶解制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种高活性低粘度的海参肽及其双向酶解制备方法和应用。所述双向酶解制备方法的步骤包括：取新鲜海参清洗、切块、均质后得到海参匀浆；调节海参匀浆的pH，加入蛋白酶和混合糖酶，酶解后灭酶，得到海参酶解液；向海参酶解液中加入活性炭进行脱色，超滤后得到海参脱色液；将海参脱色液通过有机膜系统分离纯化，并浓缩，收集浓缩液干燥，得到海参肽。利用本发明的方法制备得到的海参肽生物活性高、粘度小、品质好且制备简单，并且无皮肤刺激性，表现出较好的皮肤修护活性，能够用于化妆品、护肤品的制备，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶解技术领域，尤其涉及一种高活性低粘度的海参肽及其双向酶解制备方法和应用。
背景技术
海参是我国传统滋补佳品，随着我国海参养殖业的繁盛，海参深加工的要求逐渐提高。海参中胶原蛋白富含多种非必须氨基酸，具有抗疲劳、抗氧化、增强免疫力、降血脂、抗血栓等生物活性。海参肽的生物活性与分子量大小密切相关，分子量较小抗氧化活性较好。当海参经过酶解得到2-10氨基酸组成的海参肽，具有分子量小、粘度小、溶解性好、稳定性高、生物利用度高等优点。
酶解是海参肽主要的加工形式，可显著提高海参肽的生物利用度。市场上利用酶解技术对海参进行深加工，形成一系列的海参延伸产品，但是海参酶解液通常存在酶解时间长、酶解不彻底、酶解液粘度高，会严重影响产品后期操作工艺，如脱色、浓缩、过滤等，也会严重影响产品后期稳定性，带来一系列问题。海参体壁中除了含有高活性的蛋白，还含有大量的岩藻聚糖，岩藻聚糖会导致海参酶解液粘度高，影响蛋白的水解效率，使得海参肽分子量较大，因此加工过程中糖组分在去除是否彻底，也严重影响了海参肽的品质。
传统糖酶与蛋白酶的协同作用，多采用加入单一糖酶，加入方式多采用分步加入，虽然解决了糖组分的干扰，但增加了操作步骤，在提高海参肽提取率的同时，使得操作繁琐，加工工艺更加复杂。本发明采用的是混合糖酶与蛋白酶同步酶解法，既提高了蛋白酶解速率，又避免了增加操作工艺的复杂，解决了生产中海参肽制备的实际问题。
发明内容
本发明提供了一种高活性低粘度的海参肽及其双向酶解制备方法和应用。本发明解决了海参抗氧化活性肽制备过程中粘度高的技术问题，并制备得到了抗氧化活性高、提取率高、品质好的海参肽。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种高活性低粘度的海参肽的双向酶解制备方法，其包括以下步骤：
(1)取新鲜海参，经清洗、切块、均质后得到海参匀浆；
(2)调节所述海参匀浆的pH，加入蛋白酶和混合糖酶，酶解后灭酶，得到海参酶解液；
(3)向所述海参酶解液中加入活性炭进行脱色，超滤后得到海参脱色液；
(4)将所述海参脱色液通过有机膜系统分离纯化，并浓缩，收集浓缩液干燥，得到海参肽。
进一步的，所述步骤(2)中蛋白酶为风味蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种。
进一步的，所述步骤(2)中蛋白酶的固形物含量为3000-8000U/g。
进一步的，所述步骤(2)中混合糖酶是纤维素酶、果胶酶、β葡聚糖酶中的两种组成的，其混合质量比为1:0-5:1。
进一步的，所述步骤(2)中混合糖酶是由纤维素酶与果胶酶以1:2～1:5的质量比组成的。
进一步的，所述步骤(2)中混合糖酶的添加量为海参匀浆体积的0.02～0.15％。
进一步的，所述步骤(2)中调节海参匀浆的pH至4-8；所述酶解温度为35～60℃，酶解时间为2-6h。
进一步的，所述步骤(3)中活性炭的添加量为海参酶解液体积的0.5～1.5％。
进一步的，所述步骤(3)中脱色温度为50～70℃，脱色时间为20～60min。
本发明还提供了所述的双向酶解制备方法制备得到的海参肽，其总蛋白含量大于90％，分子量为524Da-680 Da。
本发明还提供了所述的海参肽在制备修护皮肤屏障损伤和/或保湿的护肤品和/或化妆品中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明提供了一种向海参匀浆中加入混合糖酶与蛋白酶联合应用，同步酶解的方法来制备海参肽，在海参多糖被降解的同时，海参中的蛋白同步被降解，海参体壁释放大分子糖的同时，大分子蛋白不断被分解，释放出活性肽，不仅提高活性肽的释放速率，提高了酶解液澄清度，降低酶解液粘度，经过后期脱色及分级膜系统过滤，可得到澄清透明的海参抗氧化肽溶液，酶解液经纯化分级，得到的海参肽生物活性高、粘度小、品质好且制备简单。
另外，本发明经实验证实，经同步酶解制得的海参肽无皮肤刺激性，且可以通过上调3D皮肤细胞FLG及AQP基因的表达量，起到保湿以及皮肤修护的功效，进而能够用于化妆品、护肤品的制备，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为海参肽制备条件筛选。
图2为各因素交互作用的响应面图。
图3为海参肽对皮肤修护基因表达量的影响。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
实施例1
取新鲜海参，清洗除沙后，切成小块，称重，按照1：4(m/w)比例加超纯水，均质，制备得到海参匀浆。调节海参匀浆pH至中性，按照4200U/g固形物含量的比例加入风味蛋白酶，45℃，酶解6h，灭酶，得到海参酶解液。海参多糖会影响酶解液的粘度，因此，需要选择不同糖苷酶对其进行酶解，使海参中皂苷分解为次级苷。将粗酶解液过滤，调节pH至6，按照0.12％加入混合糖酶(纤维素酶与果胶酶质量比为1:2)，50℃，酶解3.6h，灭酶20min，调节pH至中性，过滤，得到海参肽酶解液。向上述酶解液中加入1.2％活性炭，70℃，脱色50min后，10000r/min冷冻离心10min，收集上清，过0.45μm膜超滤，得到海参脱色液。使用有机膜系统分离纯化及浓缩，将海参脱色液依次过1000/700/500/200Da有机膜，温度控制10～20℃，压力0.25MPa，流速1.6mL/s，收集浓缩液，得到海参肽终酶解液。将上述液体在平板中冻存，进一步真空冷冻干燥，得到精制海参肽SCOP1。
实施例2
取新鲜海参，清洗除沙后，切成小块，称重，按照1：4(m/w)比例加超纯水，均质，制备得到海参匀浆。调节海参匀浆pH至中性，按照5700U/g固形物含量的比例加入菠萝蛋白酶，50℃，酶解5h，灭酶，得到海参酶解液。将粗酶解液过滤，调节pH至5，按照0.12％加入混合糖酶(纤维素酶与果胶酶质量比为1:4)，57℃，酶解4.0h，灭酶15min，调节pH至中性，过滤，得到海参肽酶解液。向上述酶解液中加入0.5～1.5％活性炭，70℃，脱色50min后，10000r/min冷冻离心10min，收集上清，过0.45μm膜超滤，得到海参脱色液。使用有机膜系统分离纯化及浓缩，将海参脱色液依次过1000/700/500/200Da有机膜，温度控制10～15℃，压力0.22MPa，流速1.4mL/s，收集浓缩液，得到海参肽终酶解液。将上述液体在平板中冻存，进一步真空冷冻干燥，得到精制海参肽SCOP2。
实施例3
取新鲜海参，清洗除沙后，切成小块，称重，按照1：4(m/w)比例加超纯水，均质，制备得到海参匀浆。调节海参匀浆pH至5.6，按照4750U/g固形物含量的比例加入风味蛋白酶，同时按照0.12％加入混合糖酶(纤维素酶与果胶酶质量比为1:5)，60℃，酶解2.7h，灭酶20min，得到海参酶解液。向上述酶解液中加入1.5％活性炭，60℃，脱色40min后，10000r/min冷冻离心10min，收集上清，过0.45μm膜超滤，得到海参脱色液。使用有机膜系统分离纯化及浓缩，将海参脱色液依次过1000/700/500/200Da有机膜，温度控制18℃，压力0.25MPa，流速1.5mL/s，收集浓缩液，得到海参肽终酶解液。将上述液体在平板中冻存，进一步真空冷冻干燥，得到精制海参肽SCOP3。
实施例4
取新鲜海参，清洗除沙后，切成小块，称重，按照1：4(m/w)比例加超纯水，均质，制备得到海参匀浆。调节海参匀浆pH至6.8，按照4100U/g固形物含量的比例加入菠萝蛋白酶，同时按照0.12％加入混合糖酶(纤维素酶与果胶酶质量比为1:3)，45℃，酶解3.25h，灭酶15min，得到海参酶解液。向上述酶解液中加入1.5％活性炭，60℃，脱色min后，10000r/min冷冻离心10min，收集上清，过0.45μm膜超滤，得到海参脱色液。使用有机膜系统分离纯化及浓缩，将海参脱色液依次过1000/700/500/200Da有机膜，温度控制10～20℃，压力0.21MPa-0.26MPa，流速0.2～1.8mL/s，收集浓缩液，得到海参肽终酶解液；将上述液体在平板中冻存，进一步真空冷冻干燥，得到精制海参肽SCOP4。
以上四个实施例中的条件为以抗氧化指标为标准进行筛选得到的高活性海参肽制备方案，具体筛选流程如下，首先，对糖苷酶进行优选和最适配比方案进行实验筛选，分别选择β-葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶按照不同比例添加，控制总添加量为底物质量0.05％的条件进行酶解试验，以海参为原料，以超氧阴离子自由基清除率为指标，确定最佳混合糖酶制剂添加量及比例。结果如图1所示，当果胶酶和纤维素酶组合时其抗氧化活性更好，且比例为2:1时其活性最高。进而，以此混合糖酶比例，进一步通过响应面分析糖酶和蛋白酶最适配合方案，响应面设计应用Design-Expert 11.0软件Box-Behnken中心组合实验设计原理设计三因素三水平的响应面优化实验，采用超氧阴离子测试盒进行检测。实验结果如表1所示。
表1响应面分析实验设计及结果
| 排序 | 酶解时间 | 混合糖苷酶添加量 | 蛋白酶酶活 | 超氧阴离子清除率％ |
| 1 | 2.00 | 0.02 | 5000.00 | 30.946 |
| 6 | 6.00 | 0.07 | 2000.00 | 54.1723 |
| 8 | 6.00 | 0.07 | 8000.00 | 58.1936 |
| 3 | 2.00 | 0.12 | 5000.00 | 68.4921 |
| 15 | 4.00 | 0.07 | 5000.00 | 58.3864 |
| 14 | 4.00 | 0.07 | 5000.00 | 59.0943 |
| 9 | 4.00 | 0.02 | 2000.00 | 57.8962 |
| 5 | 2.00 | 0.07 | 2000.00 | 53.9836 |
| 4 | 6.00 | 0.12 | 5000.00 | 63.9332 |
| 11 | 4.00 | 0.02 | 8000.00 | 46.6261 |
| 13 | 4.00 | 0.07 | 5000.00 | 57.8833 |
| 7 | 2.00 | 0.07 | 8000.00 | 53.8745 |
| 10 | 4.00 | 0.12 | 2000.00 | 67.3452 |
| 16 | 4.00 | 0.07 | 5000.00 | 63.9257 |
| 17 | 4.00 | 0.07 | 5000.00 | 59.2236 |
| 2 | 6.00 | 0.02 | 5000.00 | 52.7489 |
| 12 | 4.00 | 0.12 | 8000.00 | 69.5487 |
通过Design-Expert软件对表1的数据进行分析，得到结果如表2所示。以超氧自由基清除率为响应值，经回归拟合后，方差分析结果得出模型P<0.01，说明回归模型显著，失拟项P＝0.0981，不显著，说明该模型与实际实验拟合较好。所以，可以利用此回归方程确定高活性海参肽的多酶解工艺，各因素交互作用的响应面图见图2。
表2回归模型方差分析
根据响应面试验结果，软件分析确定的最佳条件排前四的如表3所示，因此，按照响应面筛选条件得到了实施例1-4。
表3海参肽制备解决方案
实施例5
实施例1-4的海参肽基本成分的测定分别根据国标GB/T 5009.5-2016、GB/T9695.31-2008、GB/T 5009.6-2016、GB 5009.3-2016、GB5009.4-2016方法测定。
实施例1-4的海参肽的分子量的测定采用HPLC方法，条件如下：
色谱仪：Agilent 1260，配有紫外检测器和GPC软件处理系统；
色谱柱：TSKgel G2000SWXL(7.8mm*30cm，粒径5μm)；
流动相：乙腈：水(pH 2.0)3：7；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL；
柱温：30℃；检测波长：220nm。
取样品和相对分子量校正曲线所用标准品：尿嘧啶(MW112)、谷胱甘肽(MW307)、杆菌肽(MW1422)、抑肽酶(MW6511)、细胞色素C(MW12384)、牛血清白蛋白Ⅴ(MW68000)各1mg，分别溶于1mL的纯水中，用0.45nm微孔滤膜过滤后进样。结果通过GPC软件进行分析。
海参肽的基本成分组成和分子量结果见表4。海参肽是由90.57％的总蛋白、2.80％水分、4.12％的灰分、0.19％的脂质、2.05％的总糖组成的，其分子量为524Da。说明，本发明制备的海参肽纯度高，分子量小。
表4海参肽基本成分分析
| 样品 | 总蛋白 | 水分 | 灰分 | 脂质 | 总糖 | 分子量 |
| SCOP1 | 90.57±4.17 | 2.80±0.25 | 4.12±0.31 | 0.19±0.09 | 2.05±0.24 | 524Da |
| SCOP2 | 89.65±2.05 | 3.60±0.48 | 3.67±0.33 | 0.10±0.02 | 1.55±0.44 | 674Da |
| SCOP3 | 90.25±3.56 | 3.00±0.35 | 4.02±0.30 | 0.18±0.04 | 1.80±0.20 | 582Da |
| SCOP4 | 87.45±1.33 | 4.50±0.54 | 3.82±0.55 | 0.30±0.12 | 1.75±0.30 | 625Da |
实施例6
依据SN/T 4577-2016《化妆品皮肤刺激性检测重建人体表皮模型体外测试方法》对实施例1-4的海参肽进行活性成分皮肤刺激/腐蚀性评估。
1、采用皮肤刺激性(SIT-Skin Irritation Test)测试，按照标准方法，采购博溪公司的3D重组皮肤细胞模型EpiKutis，按照SIT-Skin Irritation Test流程进行检测。收到3D重组皮肤后，将之置于6孔板中，小孔上下分别加入EpiRecovery培养基0.5ml和1ml，在二氧化碳培养箱中孵育18±3h，接着加入25μL PBS润湿模型表面后各孔加25mg各海参肽样品及阳性对照(SDS)，阴性对照为仅加培养基的样品，于超净台放置准确计时30±1min后，用1ml PBS清洗模型表面，重复15次，随后镊子夹出模型，放入新的6孔板，并加入0.9mLEpiRecovery孵育42h后，将模型转移至新24孔板，加入0.3mL 5mg/ml的MTT工作液，在二氧化碳培养箱中37℃孵育3h±5min后，吸弃MTT溶液，每孔加200μL PBS清洗，重复3次，接着再次转到新24孔板，在3D重组皮肤细胞模型EpiKutis的内表面，加2mL异丙醇，用薄膜密封，在4℃放置18h后，枪头刺穿模型，在下室中混匀，吸200μL异丙醇浸提液，在570nm下检测其OD值。
4种海参肽的皮肤刺激性结果分析如表5，实施例1-4的海参肽均对体外重组3D皮肤细胞增殖有促进作用，并且无细胞毒性，且细胞存活率均高于50％，说明本发明制备的海参肽无刺激性。
表5参肽的皮肤刺激性结果
| 相对组织活力平均值 | 判断(≤50％有刺激性) | |
| SCOP1 | 128.43％±31.20％* | 无刺激性(NI) |
| SCOP2 | 92.40％±13.62％* | 无刺激性(NI) |
| SCOP3 | 105.25％±10.50％ | 无刺激性(NI) |
| SCOP4 | 112.35％±16.20％ | 无刺激性(NI) |
| 阴性对照 | 100.00％±22.41％ | 无刺激性(NI) |
| 阳性对照 | 8.59％±1.47％ | 刺激性(I) |
实施例7海参肽皮肤修护功效评估
本实施例对实施例1-4制备的海参肽的皮肤修护作用进行检测，皮肤接触刺激性因素时，会导致皮肤屏障发生临床型的急性损伤，导致皮肤干燥，出现红斑现象。本实施例利用常用表面活性剂十二烷基磺酸钠(SLS)模拟刺激性类皮肤损伤，通过活性物处理后组织形态以及屏障相关蛋白指标来评价海参肽的修护功效。
将复苏好的模型转移至含有0.9mL EpiGrowth培养基的6孔板中，分为模型对照组、海参肽1组(200μg/mL)、海参肽2组(200μg/mL)和阴性对照组，每组3个平行。吸取200μLSLS溶液(4mg/mL)和200μL样品混匀，将25μL SLS-样品混合液缓慢滴加于模型表面作为样品组；以25μL SLS溶液(2mg/mL)作为模型对照组，阴性对照组(无菌PBS)不进行给药处理。给药结束后在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。孵育完成后，收集模型培养液，环切取下重组皮肤模型，分别进行后续RNA提取、蛋白表达情况分析检测细胞模型中皮肤修护功效相关基因FLG和AQP3的转录水平，进而对海参肽皮肤修护功效进行评价。
结果如图3所示，海参肽(SCOP1和SCOP2)均可以通过上调3D皮肤细胞FLG及AQP基因的表达量，聚丝蛋白(filaggrin，FLG)是CE组装过程中关键的成分，FLG除了是皮肤屏障的结构性组成外，还能够在Caspase-14水解形成天然保湿因子，因此也起到了保湿以及皮肤修护的功效。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种高活性低粘度的海参肽的双向酶解制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜海参，经清洗、切块、均质后得到海参匀浆；
(2)调节所述海参匀浆的pH，加入蛋白酶和混合糖酶，酶解后灭酶，得到海参酶解液；
(3)向所述海参酶解液中加入活性炭进行脱色，超滤后得到海参脱色液；
(4)将所述海参脱色液通过有机膜系统分离纯化，并浓缩，收集浓缩液干燥，得到海参肽。
2.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋白酶为风味蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中蛋白酶的固形物含量为3000-8000U/g。
4.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合糖酶是纤维素酶、果胶酶、β葡聚糖酶中的两种组成的，其混合质量比为1:0-5:1。
5.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中混合糖酶的添加量为海参匀浆体积的0.02～0.15％。
6.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中调节海参匀浆的pH至4-8；所述酶解温度为35～60℃，酶解时间为2～6h。
7.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中活性炭的添加量为海参酶解液体积的0.5～1.5％。
8.根据权利要求1所述的双向酶解制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中脱色温度为50～70℃，脱色时间为20～60min。
9.权利要求1-8任一项所述的双向酶解制备方法制备得到的海参肽，其特征在于，所述海参肽的总蛋白含量大于90％，分子量为524Da-680 Da。
10.权利要求9所述的海参肽在制备修护皮肤屏障损伤和/或保湿的护肤品和/或化妆品中的应用。
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