CN117925889A - 一种用于鉴定山桐子含油率的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定山桐子含油率的InDel分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记的应用，特别涉及一种用于鉴定山桐子含油率的InDel分子标记及其应用。本发明所要解决的一个技术问题是如何鉴定山桐子含油率。本发明的一个技术方案是InDel分子标记或检测所述InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定山桐子含油率中的应用，所述InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.3的第95‑100位所示的DNA分子。为进一步加速山桐子育种进程，确保山桐子油稳产高产，提高经济效益，本发明从分子层面上，开发出可用于山桐子幼苗含油率的快速检测引物，解决在山桐子幼苗期含油率鉴定的问题，从而提高育种效率，具有很大的应用潜力和较好经济价值。

Description

一种用于鉴定山桐子含油率的InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记的应用，特别涉及一种用于鉴定山桐子含油率的InDel分子标记及其应用。
背景技术
木本油料树种具有不与农争地、不与人争粮，能有效缓解粮油供需矛盾和进口压力。山桐子为木本油料树种，果实和种子含油率高，且富含亚油酸等多种不饱和脂肪酸，是一种理想的木本油料树种。
由于山桐子雌雄异株的生物学特性，每个山桐子种质资源具有独特的基因组信息，果实含油率浮动范围大，从22％到42％参差不齐，挖掘高含油率的骨干亲本材料是选育和培育突破性新品种的第一步。为快速鉴定已有山桐子种质资源含油率，开发山桐子高含油率的分子标记，为选育和培育突破性新品种奠定基础。同时，山桐子高含油率传统育种方法是等其挂果后，测定含油率，从而再决定杂交组合，期望获得高含油率材材料，再等挂果验证结果。如此以来，在山桐子童龄期就需要3-5年时间，整个育种周期超过20年，新品种的获得难以满足实际生产需求，严重制约了山桐子产业发展。
随着测序技术的不断发展，测序成本不断下降，通过高通量的测序，获得单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。以SNP为基础，开发分子标记，可定向筛选材料，优化选育体系，提高育种效率。酶切扩增多态性序列(C1eaved AmplifiedPolymorphic Sequences，CAPS)分子标记是以PCR为基础的共显性分子标记，它是根据已知位点的DNA序列设计特异的PCR引物，然后扩增出特定的DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所扩增的条带，进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)分析。由于SNP和限制性内切酶组合较多，增加了揭示多态性的机会，CAPS分子标记呈现共显性特征，可区分纯合基因型和杂合基因型；只需一对引物进行PCR扩增酶切，用琼脂糖电泳分析，整体操作简便快捷。将高含油率CASP分子标记应用到山桐子选育中，将为加快山桐子产业健康发展，筛选山桐子优良骨干亲本，在幼苗期快速鉴定出高含油率的杂交组合，优化选育体系，不仅能减少工作量，而且提高育种效率。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何鉴定山桐子含油率。
本发明首先提供了InDel分子标记或检测所述InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定山桐子含油率中的应用，所述InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.3的第95-100位所示的DNA分子。
其中，SEQ ID No.3的第95-100位由6个核苷酸组成。
上述应用中，所述物质为如下a)或b)：
a)含有扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物A；
b)含有扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记及其下游5个核苷酸残基在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物B和限制性内切酶SacⅠ酶。
上述应用中，所述PCR引物A可为引物对A，所述引物对A由正向引物A和反向引物A组成，所述正向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.3第95-100位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.3第95-100位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
进一步地，所述正向引物序列A具体可为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA，所述反向引物A具体可为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA。
上述应用中，所述PCR引物B可为引物对，所述PCR可为引物对B，所述引物对B由正向引物B和反向引物B组成，所述正向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.4第94-99位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ IDNo.4第94-99位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
进一步地，所述正向引物序列B具体可为核苷酸序列是SEQ ID No.1的单链DNA，所述反向引物B具体可为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA。
上述应用中，所述山桐子可为山桐子自交系。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法，包括以下步骤：
利用所述物质检测待鉴定山桐子材料基因组DNA中是否含有所述InDel分子标记，含有所述InDel分子标记的所述待鉴定山桐子的含油率高于不含有所述InDel分子标记的所述待鉴定山桐子。
本发明还提供了一种山桐子育种的方法，包括以下步骤：
利用所述物质检测待鉴定山桐子材料基因组DNA中是否含有所述InDel分子标记，选择含有所述InDel分子标记的所述山桐子材料进行育种。
上述鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法或上述育种方法中，所述待鉴定山桐子可为山桐子自交系。所述物质为如下a)或b)：
a)含有扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物A；
b)含有扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记及其后5个核苷酸残基在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物B和限制性内切酶SacⅠ酶。
上述鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法或上述育种方法中，所述PCR引物A可为引物对A，所述引物对A由正向引物A和反向引物A组成，所述正向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.3第95-100位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.3第95-100位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
进一步地，所述正向引物序列A具体可为如SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述反向引物A具体可为如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
上述鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法或上述育种方法中，所述PCR引物B可为引物对，所述PCR可为引物对B，所述引物对B由正向引物B和反向引物B组成，所述正向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.4第94-99位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.4第94-99位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
进一步地，所述正向引物序列B具体可为如SEQ ID No.1所示的单链DNA，所述反向引物B具体可为如SEQ ID No.2所示的单链DNA。
上述鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法或上述育种方法中，利用所述检测所述山桐子含油率InDel分子标记的物质来鉴定山桐子含油率，包括如下Q1或Q2的步骤：
Q1、以山桐子材料基因组DNA为模板，以所述PCR引物A扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记在内的山桐子基因组DNA片段；
Q2、以山桐子材料基因组DNA为模板，以所述PCR引物B扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记及其后5个核苷酸残基在内的山桐子基因组DNA片段得到PCR扩增产物并以限制性内切酶SacⅠ酶酶切。
本发明还提供了所述山桐子含油率InDel分子标记在山桐子种质资源分析或分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了PCR引物A或PCR引物B在山桐子种质资源分析或分子标记辅助育种中的应用。
上文中，所述分子标记辅助育种的目的包括培育含油率高的山桐子。
为进一步加速山桐子育种进程，确保山桐子油稳产高产，提高经济效益，本发明从分子层面上，开发出可用于山桐子幼苗含油率的快速检测引物，解决在山桐子幼苗期含油率鉴定的问题，从而提高育种效率，具有很大的应用潜力和较好经济价值。
附图说明
图1是本发明实施例1中IpSTP5基因的CAPS分子标记设计位点。
图2为本发明实施例1中IpSTP5的PCR产物进行酶切后的电泳图(M:DNA markerM600)。
图3为本发明实施例1中山桐子含油率分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所用山桐子材料为生长于北京香山中国科学院植物研究所的山桐子。
实施例1、IpSTP5单倍型分析及酶点设计
山桐子IpSTP5基因影响果实含油率。所用山桐子材料为生长于北京香山中国科学院植物研究所的山桐子，针对其中的高油材料和低油材料分别采用天根试剂盒(Cat:DP360)提取山桐子果实DNA。
以得到的山桐子高油材料DNA和山桐子低油材料DNA分别为模板，采用引物IpOC-M001-F和引物IpOC-M001-R组成的引物扩增IpSTP5基因片段。引物序列如下：
IpOC-M001-F：5’-CCTTTCCATGTCCTTGTCATT-3’(SEQ ID No.1，与SEQ ID No.3的第1-21位相同，与SEQ ID No.4的第1-21位相同)；
IpOC-M001-R：5’-ATGAGACCACTTGATGCAGC-3’(SEQ ID No.2，与SEQ ID No.3的第265-284位反向互补，与SEQ ID No.4的第259-278位反向互补)。
所述PCR扩增的反应体系及PCR反应程序如下：
表1普通PCR反应体系
反应组分 用量
2×Taq MasterMix 10μL
IpOC-M001-F 1μL
IpOC-M001-R 1μL
ddH2O 7μL
DNA 1μL
Total Volume 20μL
瞬时离心混合均匀，PCR反应采用步降(Touch down)退火程序，前10个循环的退火温度降低0.5℃。设定程序为：
表2普通PCR扩增程序
步骤 温度(℃) 时间 备注
预变性 95 5min
变性 95 30s
退火 62 30s -0.5℃
延伸 72 30s 10cyc
变性 95 30s
退火 62 30s
延伸 72 30s 24cyc
延伸 72 5min
保存 4 ∞
经测序，山桐子高油材料的PCR产物片段的核苷酸序列为SEQ ID No.3，将高油材料的单倍型称为单倍型I；山桐子低油材料的PCR产物片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4，将低油材料的单倍型称为单倍型II。
SEQ ID No.3
CCTTTCCATGTCCTTGTCATTCCTGTGAAGGCATAAAAGGACCCACCATTTGATTATAAAAGGTATTGTCATAGCTGGATGCCTAGGAGCCCTGGACTTAAGCTCTCTCTCTTGACTTAAATAAGTGCTCCTCCCTTGTTAATTTGGACTCCGAGGAAGAGTTAATCCAAGGAGAAAATGGCCGGAGGAGGTTTTGTTGCCGATGGACCTGCCAGTGGCTTTAACGGTAAGATAACTGTGTCAGTGGTGATCACCTGCATTGTTGCTGCATCAAGTGGTCTCAT
SEQ ID No.4
CCTTTCCATGTCCTTGTCATTCCTGTGAAGGCATAAAAGGACCCACCATTTGATTATAAAAGGTATTGTCATAGCTGGATGCCTAGGAGCCCTGAGCTCTCTCTCTTGACTTAAATAAGTGCTCCTCCCTTGTTAATTTGGACTCCGAGGAAGAGTTAATCCAAGGAGAAAATGGCCGGAGGAGGTTTTGTTGCCGATGGACCTGCCAGTGGCTTTAACGGTAAGATAACTGTGTCAGTGGTGATCACCTGCATTGTTGCTGCATCAAGTGGTCTCAT
将山桐子高油材料的IpSTP5基因片段(SEQ ID No.3，单倍型I)和山桐子低油材料的IpSTP5基因片段(SEQ ID No.4，单倍型II)比较差异位点，结果见图1，确定两份山桐子差异InDel分子标记为SEQ ID No.3的第95-100位，由6个核苷酸组成，具体序列如下：
InDel:5’-GACTTA-3’(SEQ ID No.3的第95-100位)。
对该InDel位点进行限制性内切酶选择，发现低油材料IpSTP5基因片段序列SEQID No.4的第94-99位为SacⅠ识别位点(见图1)，据此开发CAPS标记，具体如下：
(1)以IpOC-M001-F(SEQ ID No.1)和IpOC-M001-R(SEQ ID No.2)组成的引物扩增山桐子待测材料DNA模版，PCR反应体系见表1，PCR扩增程序见表2，获得PCR扩增产物。
(2)将PCR扩增产物以SacⅠ酶进行酶切，37℃孵育1小时，获得酶切产物。酶切反应体系见表3：
表3酶切反应体系
反应组分 用量
10×Buffer 1μL
PCR产物 3μL
Sac Ⅰ 0.2μL
ddH2O 5.8μL
Total Volume 10μL
(3)取8μL酶切产物，经2％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带为284bp的一条条带的山桐子待测材料是高油材料，目的条带为双条带(99bp和179bp)的山桐子待测材料是低油材料。
实施例2山桐子含油率鉴定
本实施例采用实施例1开发的CAPS标记进行山桐子含油率鉴定：
随机采收山桐子材料18份，120℃杀青30min，65℃烘干后采用核磁共振仪器检测果实含油率，实验进行了三次生物学重复，统计结果取三次的平均值。
采用天根试剂盒(Cat:DP360)提取该18份山桐子果实DNA，对该18份山桐子材料以实施例1开发的CAPS标记进行单倍型检测：
(1)以IpOC-M001-F(SEQ ID No.1)和IpOC-M001-R(SEQ ID No.2)组成的引物扩增山桐子待测材料DNA模版，PCR反应体系见表1，PCR扩增程序见表2，获得PCR扩增产物。
(2)将PCR扩增产物以SacⅠ进行酶切，37℃孵育1小时，获得酶切产物。酶切反应体系见表3。
(3)取8μL酶切产物，经2％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带为284bp的一条单条带的山桐子待测材料，其PCR扩增产物的序列为SEQ ID No.3，是高油材料；目的条带为双条带(99bp和179bp)的山桐子待测材料，其PCR扩增产物的序列为SEQ ID No.4，是低油材料。
结果见表4：
表4山桐子基因型和含油率测定结果
山桐子材料 电泳条带 单倍型 含油率(％)
IpH1 284bp I 27.09
IpH2 284bp I 28.74
IpH3 284bp I 34.67
IpH4 284bp I 35.88
IpH5 284bp I 38.02
IpH6 284bp I 33.80
IpH7 284bp I 38.09
IpH8 284bp I 37.59
IpH9 284bp I 30.24
IpL1 180bp+98bp II 18.90
IpL2 180bp+98bp II 20.27
IpL3 180bp+98bp II 15.14
IpL4 180bp+98bp II 19.40
IpL5 180bp+98bp II 20.18
IpL6 180bp+98bp II 27.64
IpL7 180bp+98bp II 23.01
IpL8 180bp+98bp II 17.52
IpL9 180bp+98bp II 23.70
统计如表4所示。结果表明，InDel位点的单倍型与含油率性状关联，表明通过该CAPS标记能够鉴定或辅助鉴定山桐子材料的含油率高低。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.InDel分子标记或检测所述InDel分子标记的物质在鉴定或辅助鉴定山桐子含油率中的应用，其特征在于：所述InDel分子标记是核苷酸序列如SEQ ID No.3的第95-100位所示的DNA分子。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为如下a)或b)：
a)含有扩增包含权利要求1所述山桐子含油率InDel分子标记在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物A；
b)含有扩增包含权利要求1所述山桐子含油率InDel分子标记及其下游5个核苷酸残基在内的山桐子基因组DNA片段的PCR引物B和限制性内切酶SacⅠ酶。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR引物A为引物对A，所述引物对A由正向引物A和反向引物A组成，所述正向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.3第95-100位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物A为与山桐子基因组DNA中SEQID No.3第95-100位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述正向引物序列A为核苷酸序列是SEQID No.1的单链DNA，所述反向引物A为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR引物B为引物对B，所述所述引物对B由正向引物B和反向引物B组成，所述正向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.4第94-99位所示双链DNA的上游特异结合的单链DNA，所述反向引物B为与山桐子基因组DNA中SEQ ID No.4第94-99位所示双链DNA的下游特异结合的单链DNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述正向引物序列B为核苷酸序列是SEQID No.1的单链DNA，所述反向引物B为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA。
7.一种鉴定或辅助鉴定山桐子含油率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
利用权利要求1-6任一中所述物质检测待鉴定山桐子材料基因组DNA中是否含有权利要求1中所述InDel分子标记，含有所述InDel分子标记的所述待鉴定山桐子的含油率高于不含有所述InDel分子标记的所述待鉴定山桐子。
8.一种山桐子育种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
利用权利要求1-6任一中所述物质检测待鉴定山桐子材料基因组DNA中是否含有权利要求1中所述InDel分子标记，选择含有所述InDel分子标记的所述山桐子材料进行育种。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述利用权利要求1-6任一中所述物质检测待鉴定山桐子材料基因组DNA中是否含有权利要求1中所述InDel分子标记，包括如下Q1或Q2的步骤：
Q1、以山桐子材料基因组DNA为模板，以所述PCR引物A扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记在内的山桐子基因组DNA片段；
Q2、以山桐子材料基因组DNA为模板，以所述PCR引物B扩增包含所述山桐子含油率InDel分子标记及其后5个核苷酸残基在内的山桐子基因组DNA片段得到PCR扩增产物并以限制性内切酶SacⅠ酶酶切。
10.权利要求1-6任一中所述的山桐子含油率InDel分子标记在山桐子种质资源分析或分子标记辅助育种中的应用。
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