CN109750117B - 番茄花青素合成相关基因Aft的功能型分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了番茄花青素合成相关基因Aft的功能型分子标记及其应用。本发明所提供的特异引物对由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有番茄基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子，引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。应用本发明提供的分子标记，能快速筛选出具有花青素的番茄材料，从而加速番茄新品种的育成步伐。本发明具有重要的理论意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于植物分子育种领域，具体涉及番茄花青素合成相关基因Aft的功能型分子标记及其应用。
背景技术
花青素和番茄红素是两类重要的植物色素，也是公认的具有促进健康功能的抗氧化剂。病理学研究表明这两类物质具有促进健康、防治疾病的功能，在癌症、心血管类疾病、糖尿病等代谢类疾病的防控方面具有明显效果。
番茄(Solanum lycopersicum)是重要的果实类蔬菜作物，深受各国消费者的喜爱。普通栽培番茄果实一般只积累番茄红素，不积累花青素。而一些野生种番茄果实只积累花青素，不积累番茄红素。为进一步提高番茄果实的抗氧化能力和健康保健功能，育种家将野生种番茄和栽培番茄进行杂交，培育出果实中同时含有花青素和番茄红素的番茄材料，并对相关基因位点进行了挖掘。Aft(Anthocyanin fruit)、Abg(Aubergine)和atv(atroviolacium)是目前发现参与果实花青素积累的重要基因位点，分别源自野生番茄种智利番茄(Solanum chilense)、类番茄茄(Solanum lycopersicoides)和契斯曼尼番茄(Solanum cheesmaniae)。由于Abg影响植物的育性，紫黑果番茄育种大多采用Aft和atv这两个位点。遗传学分析表明，Aft位于10号染色体，为功能获得性突变，呈显性；而atv位于7号染色体，为功能缺失性突变，呈隐性。这两个位点存在互作关系，只有植株同时含有Aft和atv，果皮才能积累大量花青素呈紫黑色。因此，培育紫黑果番茄就必须先确保Aft和atv两个位点的存在，而相应分子标记的开发对缩短周期，提高育种效率具有重要意义。
目前，已克隆到Atv基因(Gene ID：Solyc07g052490)，其编码一个R3-MYB类转录因子，是花青素合成途径的抑制子。契斯曼尼番茄来源的atv基因在编码区存在一个4bp的插入突变，导致不能翻译出有正常功能的蛋白，进而丧失对花青素合成途径的抑制作用。根据这4bp的差异，开发出atv基因的功能型分子标记用于该位点的辅助选择。而Aft基因尚未克隆，仅知道其与10号染色体的一个R2R3-MYB基因簇连锁。一部分学者认为Aft基因可能是基因簇中的ANT1的基因，也有学者认为其可能是基因簇中的AN2基因。目前有一些与Aft连锁的分子标记，而这些标记大多基于ANT1基因或AN2基因的核苷酸序列多态性设计，不能百分之百与Aft位点共分离。因此，克隆Aft基因并开发其特异的功能型分子标记，可以克服当前连锁标记在准确性方面的不足，实现Aft位点的精准选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于鉴定待测番茄是否含有花青素的分子标记。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了特异引物对。
本发明所提供的特异引物对，可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有番茄基因组中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下a3)或a4)：
a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。
所述特异引物对的功能可为如下b1)-b7)中的任一种：
b1)鉴定待测番茄携带等位基因AFT和/或等位基因aft；
b2)辅助筛选携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种；
b3)辅助筛选携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b4)辅助筛选携带所述等位基因aft且携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b5)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b6)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b7)辅助筛选不具有花青素的番茄品种。
所述特异引物对用于扩增下述与番茄花青素相关的分子标记。
本发明还保护一种试剂盒，包括上述任一所述特异引物对和限制性内切酶AvaII。
所述试剂盒中还可包括用于PCR扩增的常规试剂和/或用于基因组提取的常规试剂和/或用于琼脂糖凝胶电泳的常规试剂和/或用于限制性内切酶酶切的常规试剂。
所述试剂盒的功能可为如下b1)-b7)中的任一种：
b1)鉴定待测番茄携带等位基因AFT和/或等位基因aft；
b2)辅助筛选携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种；
b3)辅助筛选携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b4)辅助筛选携带所述等位基因aft且携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b5)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b6)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b7)辅助筛选不具有花青素的番茄品种。
本发明还保护上述任一所述特异引物对或上述任一所述试剂盒的应用，可为如下b1)-b7)中的任一种：
b1)鉴定待测番茄携带等位基因AFT和/或等位基因aft；
b2)辅助筛选携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种；
b3)辅助筛选携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b4)辅助筛选携带所述等位基因aft且携带所述等位基因AFT的番茄品种；
b5)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b6)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b7)辅助筛选不具有花青素的番茄品种；
所述等位基因AFT可为如下c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)序列表中序列1所示的DNA分子；
c2)序列表中序列5所示的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
c4)与c1)或c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子；
所述等位基因aft可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)序列表中序列2所示的DNA分子；
d2)序列表中序列6所示的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
d4)与d1)或d2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
应用所述特异引物对或所述试剂盒鉴定待测番茄携带等位基因AFT和/或等位基因aft的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、待测番茄携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft，如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段、待测番茄携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT，如果酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段、待测番茄携带所述等位基因aft和所述等位基因AFT。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助筛选携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、待测番茄为候选的携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种，否则待测番茄不为候选的携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft的番茄品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助筛选携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段、待测番茄为候选的携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种，否则待测番茄不为候选的携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT的番茄品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助筛选携带所述等位基因aft且携带所述等位基因AFT的番茄品种的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段、待测番茄为候选的携带所述等位基因aft和所述等位基因AFT的番茄品种，否则待测番茄不为候选的携带所述等位基因aft和所述等位基因AFT的番茄品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助鉴定待测番茄是否含有花青素的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段、待测番茄含有花青素，如果酶切产物中不具有483bp的片段、待测番茄不含有花青素。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助筛选具有花青素的番茄品种的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段、待测番茄为候选的具有花青素的番茄品种，否则待测番茄不为候选的具有花青素的番茄品种。
应用所述特异引物对或所述试剂盒辅助筛选不具有花青素的番茄品种的方法如下：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中不具有483bp的片段、待测番茄为候选的不具有花青素的番茄品种，否则待测番茄不为候选的不具有花青素的番茄品种。
本发明还保护与番茄花青素相关的分子标记，可为以待测番茄的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对扩增得到的DNA片段。所述分子标记具体可为所述等位基因AFT和/或所述等位基因aft。
本发明还保护所述分子标记的应用，可为如下b5)-b7)中的任一种：
b5)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b6)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b7)辅助筛选不具有花青素的番茄品种。
应用所述分子标记辅助鉴定待测番茄是否含有花青素的方法如下：如果所述待测番茄基因组中具有所述等位基因AFT、待测番茄含有花青素；如果所述待测番茄基因组中不具有所述等位基因AFT、待测番茄不含有花青素。
应用所述分子标记辅助筛选具有花青素的番茄品种的方法如下：如果所述待测番茄基因组中具有所述等位基因AFT、待测番茄为候选的具有花青素的番茄品种，否则待测番茄不为候选的具有花青素的番茄品种。
应用所述分子标记辅助筛选不具有花青素的番茄品种的方法如下：如果所述待测番茄基因组中不具有所述等位基因AFT、待测番茄为候选的不具有花青素的番茄品种，否则待测番茄为候选的具有花青素的番茄品种。
所述等位基因AFT和/或所述等位基因aft也属于本发明的保护范围。
本发明还保护所述等位基因AFT和/或所述等位基因aft的应用，可为如下b5)-b7)中的任一种：
b5)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b6)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b7)辅助筛选不具有花青素的番茄品种。
本发明还保护一种检测待测番茄中是否含有花青素的方法，可包括如下步骤：检测待测番茄的基因型为基因型I、基因型II还是基因型III，基因型I或基因型II的番茄含有花青素，基因型III的番茄不含有花青素；
所述基因型I为待测番茄含有所述等位基因AFT且不含有所述等位基因aft；所述基因型II为待测番茄含有所述等位基因aft和所述等位基因AFT；所述基因型III为待测番茄含有所述等位基因aft且不含有所述等位基因AFT。
上述方法中，所述“检测待测番茄的基因型为基因型I、基因型II还是基因型III”可为K1)或K2)：
K1)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、待测番茄的基因型为基因型I，如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段、待测番茄的基因型为基因型III；如果酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段、待测番茄的基因型为基因型II；
K2)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行测序；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列、待测番茄的基因型为基因型I，如果PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列、待测番茄的基因型为基因型III，如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列、待测番茄的基因型为基因型II。
本发明还保护一种检测待测番茄携带所述等位基因AFT和/或所述等位基因aft的方法，可为G1)或G2)：
G1)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、待测番茄携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft，如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段、待测番茄携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT，如果酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段、待测番茄携带所述等位基因aft和所述等位基因AFT；
G2)以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行测序；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列、待测番茄携带所述等位基因AFT且不携带所述等位基因aft，如果PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列、待测番茄携带所述等位基因aft且不携带所述等位基因AFT，如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列、待测番茄携带所述等位基因aft和所述等位基因AFT。
上述任一所述等位基因AFT可为如下c1)或c2)或c3)或c4)：
c1)序列表中序列1所示的DNA分子；
c2)序列表中序列5所示的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
c4)与c1)或c2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
上述任一所述等位基因aft可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)序列表中序列2所示的DNA分子；
d2)序列表中序列6所示的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
d4)与d1)或d2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
本发明公开了番茄的Aft基因及其等位变异形式：等位基因AFT和等位基因aft。在此基础上提供了鉴定等位基因AFT和等位基因aft的特异引物对以及等位变异序列与番茄是否含有花青素的相关关系。携带等位基因AFT的番茄品种含有花青素，不携带等位基因AFT的番茄品种不含有花青素。应用本发明提供的分子标记，能快速筛选出具有花青素的番茄材料，从而加速番茄新品种的育成步伐。本发明具有重要的理论意义和经济价值。
附图说明
图1为番茄10号染色体上R2R3-MYB基因簇结构示意图。
图2为R2R3-MYB基因簇中四个基因的表达水平分析。
图3为Solyc10g086290基因纯合打靶植株的测序结果。
图4为Solyc10g086290基因纯合打靶植株的绿熟期果实表型。
图5为Solyc10g086290基因纯合打靶植株的果皮中总花青素含量。
图6为实施例2中步骤二的实验结果。
图7为实施例3的实验结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
总花青素的测定方法记载于如下文献中：Zhang,B.，Hu,Z.，Zhang,Y.，Li,Y.，Zhou,S.，and Chen,G.(2012).A putative functional MYB transcription factorinduced by low temperature regulates anthocyanin biosynthesis in purple kale(Brassica Oleracea var.acephala f.tricolor).Plant Cell Rep 31，281-289.
番茄品种Indigo Rose为Johnn’s Selected Seeds公司的产品。在下文中，番茄品种Indigo Rose简称为Indigo Rose。
番茄品种LA1996和番茄品种Alisa Craig均为美国番茄遗传资源中心(网址为：http://tgrc.ucdavis.edu/)的产品。在下文中，番茄品种LA1996简称为LA1996，番茄品种Alisa Craig简称为Alisa Craig。
pKSE401载体为Addgene载体库(网址为：http://www.addgene.org/)的产品。SYBRPremix Ex Taq II定量PCR试剂盒为TaKaRa公司的产品。植物DNA快速提取试剂盒为北京博迈德基因技术有限公司的产品。限制性内切酶AvaII为NEB公司的产品。PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品。Premix Taq DNA聚合酶Mix为TaKaRa公司的产品。
实施例1、番茄Aft基因的克隆及其等位变异形式的发现
一、与Aft基因连锁的R2R3-MYB基因簇结构分析
现有研究表明，Aft基因与10号染色体的一个R2R3-MYB基因簇连锁。根据SGN数据库(网址为：http://solgenomics.net/)发布的番茄基因组数据SL2.50版本，对番茄10号染色体上与Aft基因连锁的R2R3-MYB基因簇进行分析。
分析结果见图1。结果表明，R2R3-MYB基因簇一共有4个R2R3-MYB基因，依次为Solyc10g086250基因、Solyc10g086260基因、Solyc10g086270基因和Solyc10g086290基因。其中Solyc10g086250基因为已报道的AN2基因(Meng X，Wang J-R，Wang G-D，Liang X-Q，LiX-D，Meng QW.(2015)An R2R3-MYB gene，LeAN2，positively regulated the thermo-tolerance in transgenic tomato.J Plant Physiol 175:1-8.)，Solyc10g086260基因为已报道的ANT1基因(Mathews H，Clendennen SK，Caldwell CG，Liu XL，Connors K，MatheisN，Schuster DK，Menasco DJ，Wagoner W，Lightner J，Wagner DR.(2003).Activationtagging in tomato identifies a transcriptional regulator of anthocyaninbiosynthesis，modification，and transport.Plant Cell15(8):1689-703.)。
二、R2R3-MYB基因簇中四个基因的表达水平分析
1、提取Indigo Rose的果皮的总RNA，然后反转录得到cDNA。
2、以步骤1得到的cDNA为模板，通过荧光定量PCR检测待测基因(Solyc10g086250基因、Solyc10g086260基因、Solyc10g086270基因或Solyc10g086290基因)的相对表达量(以Actin2基因为内参基因，Actin2基因即Solyc11g005330基因)。其中荧光定量PCR反应体系按照SYBR Premix Ex Taq II定量PCR试剂盒的说明书上样，反应条件也按照该试剂盒推荐的进行。
鉴定Solyc10g086250基因的引物为5’-CCAGGAAGGACAGCAAACGA-3’和
5’-CGAGGATGAGAACGAGGACG-3’。鉴定Solyc10g086260基因的引物为
5’-CGGAAGGACAGCTAACGATG-3’和5’-GCAATGTTCCTCCTCGTCCAA-3’。鉴定
Solyc10g086270基因的引物为5’-GAAGGAGCAGGAGGAGGTGTA-3’和
5’-ACCATCACTTTGTCCTTGTTGC-3’。鉴定Solyc10g086290基因的引物为
5’-TGCCAAGACATTGGGAGTGAG-3’和5’-CCAGAGCAAAGTCACCTCTCTT-3’。鉴定Actin2基因的引物为5’-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3’和5’-GGACAATGGATGGACCAGAC-3’。
实验结果见图2。结果表明，只有Solyc10g086290基因在Indigo Rose的果皮中表达，推测Solyc10g086290基因可能为Aft基因。
三、采用CRISPR/Cas9基因编辑技术确定番茄Aft基因
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对Indigo Rose的Solyc10g086290基因进行编辑。sgRNA靶点序列为5’-AGACATTGGGAGTGAGAAA-3’。出发载体为pKSE401载体。载体构建方法和纯合打靶植株的获得方法均记载于如下文献中：Xing,H.L.，Dong,L.，Wang,Z.P.，Zhang,H.Y.，Han,C.Y.，Liu,B.，Wang,X.C.，and Chen,Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants.BMC plant biology14:327.
Solyc10g086290基因纯合打靶植株的测序结果见图3(WT为Indigo Rose，#1为缺失4bp的Solyc10g086290基因纯合打靶植株(以下称为纯合打靶植株#1)，#2为缺失2bp的Solyc10g086290基因纯合打靶植株(以下称为纯合打靶植株#2))。纯合打靶植株#1和纯合打靶植株#2缺失的碱基均不是3的倍数，导致移码突变，不能翻译出正常的Solyc10g086290蛋白。
观察Indigo Rose、纯合打靶植株#1和纯合打靶植株#2的果实表型。实验结果见图4：Indigo Rose的绿熟期果实呈紫黑色，纯合打靶植株#1和纯合打靶植株#2的绿熟期果实呈绿色。
检测Indigo Rose、纯合打靶植株#1和纯合打靶植株#2的总花青素含量。实验结果见图5(WT为Indigo Rose)：Indigo Rose的果皮中总花青素的含量为7.05mg/g鲜重，纯合打靶植株#1的果皮中总花青素的含量为0.06mg/g鲜重，纯合打靶植株#2的果皮中总花青素的含量为0.09mg/g鲜重。
上述结果表明，Indigo Rose的花青素积累表型依赖于Solyc10g086290基因。因此，Solyc10g086290基因确定为Aft基因。Indigo Rose中Aft基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
本发明的发明人在对大量番茄品种进行序列分析的基础上，发现在番茄中Aft基因存在两种等位变异形式：一种如序列表中序列1所示(命名为等位基因AFT)，一种如序列表中序列2所示(命名为等位基因aft)。与等位基因aft相比，等位基因AFT存在一个3bp缺失和一个6bp缺失。6bp缺失核苷酸序列为5’-AGGACC-3’，其包含1个限制性内切酶AvaII的识别位点(5’-GGWCC-3’)。
基于Aft基因的等位变异形式，将番茄分为三种基因型：基因型I(等位基因AFT纯合)、基因型II(等位基因AFT和等位基因aft杂合)和基因型III(等位基因aft纯合)。
实施例2、分子标记的开发和多态性检测
一、分子标记的开发
基于Aft基因的两种等位变异形式，开发分子标记。
扩增分子标记的核苷酸序列如下所示：
引物F：5’-GGTCACTTATTGCTGGGAGA-3’(序列表中的序列3)；
引物R：5’-CTCCATGTTGCATGGTTGTTG-3’(序列表中的序列4)。
二、多态性检测
A、多态性检测一
待测番茄为Indigo Rose、LA1996或Alisa Craig。
1、采用植物DNA快速提取试剂盒提取待测番茄的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，用步骤一中引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系(20μL)：Premix Taq DNA聚合酶Mix 10μL、引物F(5μmol/L)和引物R(5μmol/L)各0.8μL、待测番茄的基因组DNA(20ng/μL)1.5μL和ddH2O6.9μL。
PCR反应条件：95℃5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，35个循环；72℃10min。
3、取部分步骤2得到的PCR扩增产物，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测(目的为检测是否含有DNA条带)。
4、取部分步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶AvaII酶切，得到酶切产物；然后将酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果酶切产物带型A(显示一条带，为483bp)，则待测番茄的基因型为基因型I；如果酶切产物带型B(显示三条带，为483bp、315bp和177bp)，则待测番茄的基因型为基因型II；如果酶切产物带型C(显示两条带，为315bp和177bp)，则待测番茄的基因型为基因型III。
酶切体系(20μL)：PCR扩增产物10μL、限制性内切酶AvaII 1μL、BufferR 2μL和ddH2O 7μL。BufferR为限制性内切酶AvaII中的组件。
酶切反应条件：37℃5h。
实验结果见图6(M为DL2000DNA marker，AC为Alisa Craig，IR为Indigo Rose)。结果表明，Alisa Craig的基因型为基因型III，Indigo Rose和LA1996的基因型为基因型I。
B、多态性检测二
待测番茄为Indigo Rose、LA1996或Alisa Craig。
1、同步骤A中1。
2、同步骤A中2。
3、同步骤A中3。
4、取部分步骤2得到的PCR扩增产物，由北京睿博兴科公司进行测序，根据测序结果进行如下判断：如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列，则待测番茄的基因型为基因型I；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，则待测番茄的基因型为基因型II；如果PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列，则待测番茄的基因型为基因型III。
实验结果与多态性检测一中的实验结果完全一致。
上述结果表明，步骤一开发的分子标记具有较高的多态性。应用该分子标记可区分含有等位基因AFT纯合、和、等位基因AFT和等位基因aft杂合、和、等位基因aft纯合的番茄材料。
实施例3、分子标记的应用
一、应用一
待测番茄为Indigo Rose、LA1996或Alisa Craig。
1、按照实施例2中多态性检测一的方法对待测番茄进行基因分型。
2、将待测番茄种植于大田，常规田间管理，成熟后，观察绿熟期果实表型并检测待测番茄果皮中总花青素的含量。
结果表明，Indigo Rose的果皮有大量花青素积累，呈紫黑色，总花青素的含量为7.05mg/g鲜重；LA1996的果皮有少量花青素积累，呈紫色斑点，总花青素的含量为0.12mg/g鲜重；Alisa Craig的果皮无花青素积累，呈绿色，总花青素的含量为0mg/g鲜重。
二、应用二
以Indigo Rose为母本，Alisa Craig为父本进行杂交，得到杂交F1；然后杂交F1进行自交，得到F2子代。将14个F2子代命名为AC×IR F21至AC×IR F214。
待测番茄为Indigo Rose、Alisa Craig、杂交F1和14个F2子代。
1、按照实施例2中多态性检测一的方法对待测番茄进行基因分型。
实验结果见图7(M为DL2000DNA marker，AC为Alisa Craig，IR为Indigo Rose，F1为杂交F1，1-14为AC×IR F21至AC×IR F214)。结果表明，Alisa Craig的基因型为基因型III，Indigo Rose的基因型为基因型I，杂交F1的基因型为基因型II，14个F2子代的基因型为基因型I、基因型II或基因型III。
2、将各个待测番茄种植于大田，常规田间管理，成熟后，观察绿熟期果实表型并检测待测番茄果皮中总花青素的含量。
实验结果见表1。
表1
上述结果表明，检测待测番茄的基因型，基因型I或基因型II的番茄含有总花青素，基因型III的番茄不含有总花青素。因此，采用实施例2开发的分子标记可以筛选具有花青素的番茄品种或不具有花青素的番茄品种。
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京市农林科学院
<120> 番茄花青素合成相关基因Aft的功能型分子标记及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum cv.Indigo Rose）
<400> 1
atgaatattg ccaagacatt gggagtgaga aaaggttcat ggactgaaga tgaagatatt 60
cttttgagga aatgtattga caagtatgga gaaggaaagt ggcatcttgt tccttttaga 120
gctggtaaag caaaattaag attttaattt tatgtatttt aaattttatg ataataatta 180
agttttaaat ttatgtagat tttaagtaaa atttgttaat gcaaaaatac tatttaggca 240
aaatctgtta gattatacta aatttccttt ttaagaaaag agaaacttac cttttgttgt 300
gatagtggcg tcccaaccta taactctagc atgaatagca tttcatgcct ccttttttat 360
tactgagtcg taaattaatt ttggtaggag tttacaagtt aatatatata tatatttgat 420
taattttttt agtttatata caatatctat gaaaaaatta ctaggttcgt tcaacccaca 480
aatccccact tactattatt tcacgtgatt atatgcaggt ctaaatagat gtcgaaagag 540
ttgtagactg aggtggttga attatctaag gccacatatc aagagaggtg actttgctat 600
ggatgaaata gatctcattt tgagacttca caagcttcta ggcaataggc aagtcagaaa 660
tttagttaaa agaaattcaa aaattattgt acatatatat tcacgaaaag aaacttttga 720
catacaaatt tgtgtacata ctagtcttcc gtatatatta tagtaagttg tctttgatgc 780
catattttta ttttcttttg gtttagatgg tcacttattg ctgggagact tccgggaaga 840
acagcaaacg atgtgaaaaa ctattggaac acacacctac acaagaagtt attaataact 900
cctcagatac aagagaataa gtacaataaa accctcaaga ttatcactga aagcactata 960
ctacgaccac gaccaagacc tcgacctcga acattctcaa gtgaaaataa tatttcttgg 1020
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<210> 2
<211> 1356
<212> DNA
<213> 番茄（Solanum lycopersicum cv.Alisa Craig）
<400> 2
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<213> 人工序列
<220>
<223>
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<212> DNA
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aaaccctcaa gattatcact gaaagcacta tactacgacc acgaccaaga cctcgacctc 180
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<210> 6
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<220>
<223>
<400> 6
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gtgagaagcc aacaaaaaaa acaccgtcat cgtctataga cgatgatgga gttcaatggt 360
ggacaaattt actggaaaat tggaaagaat ttgaggaaga agcaacagca gtattgaact 420
ttgaggaaga aaataagttg ttgccaaatt tgttgtatga ggaacataat tcaacaacca 480
tgcaacatgg ag 492
Claims (5)
1.由引物F和引物R组成的引物对的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：
b1)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b2)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b3)辅助筛选不具有花青素的番茄品种；
所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
应用所述引物对辅助鉴定待测番茄是否含有花青素的方法为：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行测序，然后进行如下判断：如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列、或PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，则待测番茄含有花青素；如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列，则待测番茄不含有花青素；
应用所述引物对辅助筛选具有花青素的番茄品种或辅助筛选不具有花青素的番茄品种的方法为：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行测序，然后进行如下判断：如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列、或PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，则待测番茄为具有花青素的番茄品种；如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列，则待测番茄为不具有花青素的番茄品种。
2.由引物F和引物R组成的引物对和限制性内切酶AvaII的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：
b1)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b2)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b3)辅助筛选不具有花青素的番茄品种；
所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
应用所述引物对和限制性内切酶AvaII辅助鉴定待测番茄是否含有花青素的方法为：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，得到酶切产物，进行如下判断：如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、或酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段，则待测番茄含有花青素；如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段，则待测番茄不含有花青素；
应用所述引物对和限制性内切酶AvaII辅助筛选具有花青素的番茄品种或辅助筛选不具有花青素的番茄品种的方法为：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，得到酶切产物，进行如下判断：如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、或酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段，则待测番茄为具有花青素的番茄品种；如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段，则待测番茄为不具有花青素的番茄品种。
3.以待测番茄的基因组DNA为模板，采用由引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段的应用，为如下b1)-b3)中的任一种：
b1)辅助鉴定待测番茄是否含有花青素；
b2)辅助筛选具有花青素的番茄品种；
b3)辅助筛选不具有花青素的番茄品种；
所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
应用所述DNA片段辅助鉴定待测番茄是否含有花青素的方法为：如果所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列5所示且不如序列表中的序列6所示、或所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列5所示和序列表中的序列6所示，则待测番茄含有花青素；如果所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列6所示且不如序列表中的序列5所示，则待测番茄不含有花青素；
应用所述DNA片段辅助筛选具有花青素的番茄品种或辅助筛选不具有花青素的番茄品种的方法为：如果所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列5所示且不如序列表中的序列6所示、或所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列5所示和序列表中的序列6所示，则待测番茄为具有花青素的番茄品种；如果所述DNA片段的核苷酸序列如序列表中的序列6所示且不如序列表中的序列5所示，则待测番茄为不具有花青素的番茄品种。
4.一种检测待测番茄中是否含有花青素的方法，包括如下步骤：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用由引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，然后用限制性内切酶AvaII酶切PCR扩增产物，得到酶切产物，进行如下判断：如果酶切产物中具有483bp的片段且不具有315bp和177bp的片段、或酶切产物中具有177bp、315bp和483bp的片段，则待测番茄含有花青素；如果酶切产物中具有177bp和315bp的片段且不具有483bp的片段，则待测番茄不含有花青素；
所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。
5.一种检测待测番茄中是否含有花青素的方法，包括如下步骤：以待测番茄的基因组DNA为模板，采用由引物F和引物R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将PCR扩增产物进行测序，然后进行如下判断：如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列、或PCR扩增产物含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，则待测番茄含有花青素；如果待测番茄的PCR扩增产物含有序列表中的序列6所示的核苷酸序列且不含有序列表中的序列5所示的核苷酸序列，则待测番茄不含有花青素；
所述引物F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物R为序列表的序列4所示的单链DNA分子。
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