CN117919294A - 一种菊花萃取物及其在制备用于抑制发炎反应和促进伤口愈合的医药组合物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种菊花萃取物及其在制备用于抑制发炎反应和促进伤口愈合的医药组合物中的用途，其中所述菊花萃取物是以亚临界水萃取法，在高温及高压下对菊花样品进行萃取而获得；其中所述伤口愈合包括慢性伤口愈合及糖尿病伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及一种菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat）萃取物及其在制备用于抑制发炎反应和促进伤口愈合的医药组合物中的用途，特别涉及一种以亚临界水萃取法，在高温及高压下对菊花样品进行萃取而获得的菊花萃取物及其在制备用于抑制发炎反应和促进伤口愈合的医药组合物中的用途。
背景技术
发炎反应（炎症反应）是健康宿主对有毒化学物质、死细胞、病原体、刺激物或过敏原引起的损伤或感染的反应，嗜中性粒细胞（又称为嗜中性白细胞、嗜中性白血球）在各种传染性和发炎性疾病中扮演的重要作用使它们成为具有吸引力的治疗介入的靶标。
嗜中性粒细胞被活化时会产生许多发炎反应，包括进行呼吸爆发产生超氧阴离子（O2 •−）和活性氧物质（Reactive oxygen species, ROS）、脱颗粒作用释放弹性酶（elastase）、趋化转移到发炎区域、释放细胞激素以及形成嗜中性粒细胞胞外陷阱（neutrophils extracellular traps, NETs），因此，抑制嗜中性粒细胞的发炎反应，是治疗嗜中性粒细胞发炎疾病的有效策略。
伤口愈合是皮肤经创伤后表皮组织再生的过程，其一般来说包含止血、炎症、增殖和组织重塑或消退（Gosain and DiPietro, 2004）四个阶段。然而，影响伤口愈合的因素很多，例如伤口的照顾、伤口的糖分等。糖尿病伤口愈合障碍与血管、神经病变、免疫和生化成分等多种因素有关。高血糖会使血管硬化，进而导致循环减慢和微血管功能障碍，并导致组织氧合减少；高血糖还会减少白细胞迁移到伤口，以致于患者更容易受到感染。而糖尿病（diabetes mellitus, DM）中的周围神经病变可能会导致该区域的麻木以及感觉疼痛的能力降低，这可能导致伤口未立即被注意到而采取适当的治疗（Spampinato SF, Caruso GI,De Pasquale R, Sortino MA, Merlo S. The Treatment of Impaired Wound Healingin Diabetes: Looking among Old Drugs. Pharmaceuticals (Basel). 2020;13(4):60.）。特别注意的是，糖尿病足溃疡（DFU）是DM的主要并发症，其发生在15%的糖尿病患者中。神经病变、血管疾病和感染被认为是与DFU有关的危险因素。过去的研究也发现，糖尿病患者下肢截肢的风险是非糖尿病患者的15至46倍。
天然化合物具备来源丰富与骨架多样化的优势，是药物开发的重要依据。从1981年到2019年，美国食品药品监督管理局新批准的药物中有近一半来自天然化合物或是其衍生物，如可卡因（cocaine）衍生的麻醉药品，由吗啡（morphine）衍生的止痛剂，长春新碱（vincristine）、阿霉素（doxorubicin）与紫杉醇（paclitaxel）用来治疗癌症，源自真菌的盘尼西林（penicillin）用来作为抗生素等，因此，本发明积极研究哪些天然化合物具有发展成抑制嗜中性粒细胞引起的发炎反应和促进伤口愈合的新型药物的潜力。
发明内容
本发明选用菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat）作为研究目标。
本发明涉及一种菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat）萃取物，所述菊花萃取物以亚临界水萃取法，在高温及高压下，对菊花样品进行萃取，以得到亚临界水萃取物。
在本发明中，其中所述菊花样品为新鲜或干燥的菊花。
在本发明中，优选地，其中所述高温是介于120~250℃。
在本发明中，优选地，其中所述高压是介于5~20 MPa。
在本发明中，优选地，其中所述亚临界水萃取法的萃取时间为5~60分钟。
更优选地，本发明进一步包括步骤c：将所述亚临界水萃取物再用纯水溶解后放置入管柱，并用纯水及不同比例的酒精水溶液作为移动相进行分层；以及步骤d：收集产量最大的酒精水溶液的分层，并进行冷冻干燥以获得本发明的菊花萃取物。
在本发明中，优选地，步骤c中所述不同比例的酒精水溶液选自20%酒精水溶液、40%酒精水溶液、60%酒精水溶液及95%酒精水溶液。
在本发明中，更优选地，步骤c中所述分层依次用纯水、20%酒精水溶液、40%酒精水溶液、60%酒精水溶液及95%酒精水溶液作为移动相进行分层。
本发明还涉及一种菊花萃取物在制备用于抑制嗜中性粒细胞引起的发炎反应的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体。
优选地，本发明还涉及一种菊花萃取物在制备用于清除个体内自由基的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体。
优选地，本发明还涉及一种菊花萃取物在制备用于促进个体伤口愈合的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体。
优选地，其中所述伤口愈合包括慢性伤口愈合。
更优选地，其中所述伤口愈合包括糖尿病伤口愈合或糖尿病足。
在本发明的各用途中，其中所述有效剂量为0.1 mg/kg体重至50 mg/kg体重。
在本发明中，本发明所述个体为人类或哺乳动物。
附图说明
图1为菊花样品BQ01不同萃取方式的示意图。
图2A至图2B显示索式萃取、水萃取、酒精萃取、乙酸乙酯萃取及亚临界水萃取条件下的菊花粗萃取物的自由基清除的效果。图2A显示在200℃亚临界水萃取条件下的菊花粗萃取物均有较好的DPPH及ABTS的清除率；图2B显示200℃亚临界水萃取条件下菊花粗萃取物的自由基清除率具有剂量依赖性。
图3所示为BQ01以不同萃取方式萃取的粗萃取物的UPLC成分分析。
图4显示BQ01-(200)_30各分层萃取物的DPPH及ABTS的清除率。
图5显示BQ01-(200)_30各分层萃取物对嗜中性粒细胞没有细胞毒性。
图6显示BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH有效刺激人类正常成纤维细胞株Hs68的细胞迁移。
图7A至图7E所示为BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH对糖尿病伤口愈合的功效。图7A为糖尿病伤口愈合动物模型的伤口愈合过程及照片；图7B及图7C为经低、高剂量BQ01-(200)_30处理后的糖尿病伤口愈合结果；图7D及图7E为经低、高剂量BQ01-(200)_30-60%EtOH处理后的糖尿病伤口愈合结果。*表示P<0.05、**表示P<0.01，其显示为与未处理组相比具有显著差异；而@表示P<0.05、@@表示P<0.01，其显示为与对照组（Pluronicacid 组）相比具有显著差异。
图8显示在本发明的糖尿病伤口愈合实验过程中，所有的糖尿病动物均处于糖尿病状态。
具体实施方式
应理解的是，实施例的详细描述是为了说明本发明的优选实施例，而非为了将本发明限制于某些实施例。应注意的是，本发明旨在涵盖所有在本发明相同精神和范围内的替代实施例。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
菊花粗萃取物制备
本发明取用新鲜或干燥的菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat）作为萃取样品，尤其以花作为萃取样品，并将菊花样品磨成粉末，命名为BQ01。
在本发明中，所述菊花样品BQ01分别以索氏萃取法（Soxhlet extraction）、水萃取法、酒精萃取法、乙酸乙酯（ethyl acetate; EA）萃取法以及亚临界水萃取法（subcritical water extraction）进行萃取，其流程示意图如图1所示。
其中，索氏萃取法是将5 g的BQ01与70 mL的水混合后，在100℃下进行索氏萃取60分钟，然后用滤纸过滤悬浮液，得到粗萃取物BQ01-S。
水萃取法、酒精萃取法及乙酸乙酯萃取法是在Dionex ASE 350系统（ThermoFisher Scientific, US）上进行加速溶剂萃取。将5 g的BQ01置于66 mL的不锈钢萃取槽中，其底部装有滤纸，将不锈钢萃取槽置于烘箱中，在槽中充满溶剂30秒，所述溶剂分别为水、50%乙醇、95%乙醇及乙酸乙酯，然后在高压（约1500 psi）下加热至所需的萃取时间（水萃取条件为100℃萃取15分钟；乙醇萃取及乙酸乙酯萃取的条件均为50℃萃取15分钟）。萃取结束后，将萃取液自萃取槽中注入收集瓶，并将残留物在约10 MPa的压力下吹扫1分钟（通常使用氮气），然后释放残余压力，将最终萃取液收集在收集瓶中，有机溶剂部分在35℃的旋转真空蒸发器中除去溶剂，再置入冷冻干燥机干燥；水萃取部分冷冻后用冷冻干燥机进行干燥，分别得到粗萃取物BQ01-H2O、BQ01-50%E、BQ01-95%E及BQ01-EA。
亚临界水萃取法是于Dionex ASE 350系统（ThermoFisher Scientific, US）上进行亚临界水萃取。将5 g的BQ01置于66 mL且底部装有滤纸的不锈钢萃取槽中用纯水进行萃取，将不锈钢萃取槽置于烘箱中，在槽中加水30秒，然后在高压（约1500 psi）下分别进行25种不同条件的萃取，其组合了5个不同萃取温度（120℃、140℃、160℃、180℃和200℃）和5个不同萃取时间（5、10、15、30和60分钟）。之后，将残留物在约10 MPa的压力下吹扫1分钟（通常使用氮气），然后释放残余压力，将最终萃取物收集在收集瓶中，萃取液冷冻后在冷冻干燥器中干燥24小时，最后得到25种粗萃取物BQ01-(120)_5、BQ01-(120)_10、BQ01-(120)_15、BQ01-(120)_30、BQ01-(120)_60、BQ01-(140)_5、BQ01-(140)_10、BQ01-(140)_15、BQ01-(140)_30、BQ01-(140)_60、BQ01-(160)_5、BQ01-(160)_10、BQ01-(160)_15、BQ01-(160)_30、BQ01-(160)_60、BQ01-(180)_5、BQ01-(180)_10、BQ01-(180)_15、BQ01-(180)_30、BQ01-(180)_60、BQ01-(200)_5、BQ01-(200)_10、BQ01-(200)_15、BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_60。
自由基清除能力测试
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（Diphenyl-p-picrylhydrazyl, DPPH）以及2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS）是与发炎有关的稳定自由基。在本发明中，进一步测试10 μg/mL的各菊花粗萃取物清除自由基的能力，其中以DMSO作为对照组，当各菊花粗萃取物具有自由基清除能力时，与乙醇配置的DPPH（100 μM）或是ABTS（7 mM）反应液混合30分钟后，其ΔA517或是ΔA734会明显下降，作为清除自由基的活性指标。
如图2A所示，结果显示在200℃亚临界水萃取条件下的菊花粗萃取物均有更好的DPPH及ABTS的清除率。
此外，如图2B所示，200℃亚临界水萃取条件下的菊花粗萃取物的自由基清除率具有剂量依赖性，且可达到与维生素E（Vit E）相当的自由基清除能力。
超氧阴离子与弹性酶抑制测试
本发明通过超氧阴离子与弹性酶的抑制测试，对上述各种菊花粗萃取物抗炎能力进行评估。
首先，进行嗜中性粒细胞的制备。
取自愿协助或对本计划有兴趣的健康捐血者（20-35岁；作息正常且禁服药物一周以上），以真空无菌采血管于手肘静脉采血约50 mL，将其加入等体积的3%右旋糖酐（Dextran）溶液中混合均匀，静置以沉降红细胞。取含有嗜中性粒细胞的上清液，覆盖于含有Ficoll-Paque溶液的离心管中离心，利用密度梯度将不同的血细胞分离，得到沉淀于底部的嗜中性粒细胞及少许红细胞。以不同浓度的NaCl溶液胀破残余的红细胞，利用二者渗透压耐受性的差异，保留所需的嗜中性粒细胞。
本发明上述各种菊花粗萃取物抗嗜中性粒细胞的发炎反应评估则以呼吸爆发实验及脱颗粒功能进行评估。
呼吸爆发主要会产生超氧阴离子（O2 •−）和活性氧物质（Reactive oxygenspecies, ROS），其中，超氧阴离子（O2 •−）的检测是用含有0.6 mg/mL亚铁细胞色素c（ferricytochrome c）的嗜中性粒细胞悬浮液（6×105 细胞/mL）在37℃下加入上述各种菊花粗萃取物作用2分钟，再用1 μg/mL的细胞松弛素B（cytochalasin B, CB）处理细胞约3分钟。接着用N-甲酰基-L-甲硫胺酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF）做为刺激剂，活化细胞约10-30分钟。再使用紫外光分光光度计，在波长550 nm下测量其吸光值。
在弹性酶（elastase）释放的实验中，将含有100 μM弹性酶受质甲氧琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-对-硝基苯胺（MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide）的嗜中性粒细胞悬浮液（6×105个细胞/毫升）预热5分钟使其达到37℃，接着加入上述各种菊花粗萃取物作用2分钟，用0.5 μg/mL的细胞松弛素B（cytochalasin B, CB）处理细胞约3分钟，再用0.1 μM的fMLF刺激嗜中性粒细胞活化约10-30分钟，最后，使用紫外光分光光度计，在波长405 nm下测量其吸光值。实验结果以弹性酶释出百分比来表示。
其结果如表1所示。
表1
IC50：半抑制浓度；统计结果以平均值±标准误差显示；统计结果是否具有显著差异是以各菊花粗萃取物的实验结果与对照组（DMSO）的实验结果进行比较，*P<0.05, **P< 0.01, ***P<0.005。
由图2A至图2B及表1的结果可以发现，BQ01-(200)_30具有最好的表现。
BQ01(200)_30浓缩馏分制备
本发明进一步将BQ01-(200)_30与其他萃取法所获得的菊花粗萃取物通过UPLC进行粗萃取物成分分析，其结果如图3所示，可以看出BQ01-(200)_30相较于其他粗萃取物似乎含有更多值得探究的成分，因此，本发明将BQ01-(200)_30进行浓缩馏分的制备。
BQ01-(200)_30累计共11.4498克，以多孔性苯乙烯的吸附树脂（Diaion HP-20，三菱化学股份有限公司，日本）为固定相填充管柱，管柱高度42厘米，直径为3.5厘米。将BQ01-(200)_30用纯水溶解后放置入管柱，使用纯水、20%酒精、40%酒精、60%酒精、95%酒精作为移动相进行洗涤分层，每个移动相洗涤体积为2000 mL，每个分层回收后，在38℃条件下，用减压浓缩机（Buchi Rotary Evaporator: Interface I-300, Vacuum pump V-300,Rotavapor R-210, Heating Bath B-491）将分层进行浓缩，再用冷冻干燥机进行干燥。
干燥后分别得到H2O层萃取物5.3721克（46.9%）、20%酒精层萃取物1.6554克（14.5%）、40%酒精层萃取物1.0693克（9.3%）、60%酒精层萃取物2.0332克（17.8%）及95%酒精层萃取物0.6617克（5.8%），总回收率为94.3%。分别命名为BQ01-(200)_30-H2O、BQ01-(200)_30-20%EtOH、BQ01-(200)_30-40%EtOH、BQ01-(200)_30-60%EtOH及、BQ01-(200)_30-95%EtOH。
各分层萃取物的抗发炎能力及细胞毒性测试
有关各分层萃取物的超氧阴离子与弹性酶抑制测试均与前述步骤相同，其结果如表2所示。
表2
IC50：半抑制浓度；统计结果以平均值±标准误差显示；统计结果是否具有显著差异是以各菊花粗萃取物的实验结果与对照组（DMSO）的实验结果进行比较，*P<0.05, **P< 0.01, ***P<0.005。
从表2显示的数据可以发现，BQ01-(200)_30-60%EtOH与BQ01-(200)_30-95%EtOH两组对于超氧阴离子与弹性酶抑制能力最好。
在自由基清除能力的试验中，其试验步骤与前述相同，其结果如图4所示，BQ01-(200)_30-40%EtOH、BQ01-(200)_30-60%EtOH与BQ01-(200)_30-95%EtOH三组的自由基清除率表现更好，其中BQ01-(200)_30-60%EtOH具有最好的自由基清除率表现。
进一步测试各分层对于嗜中性粒细胞的毒性。
由于乳酸脱氢酶（LDH）存在于各种细胞中，当细胞膜破裂时，LDH会释出到环境中，因此，可以通过测量细胞释出LDH的量作为评估药物是否对细胞产生毒性的依据。
将分离的嗜中性粒细胞悬浮液用BQ01-(200)_30各分层萃取物处理后，离心取得上清液，上清液LDH含量用CytoTox 96 non-radioactive cytotoxicity assay（Promega）来检测，其结果如图5所示，各分层萃取物对于细胞均没有毒性。
基于效益考虑，因BQ01-(200)_30-60%EtOH的产率高于BQ01-(200)_30-95%EtOH，后续将以BQ01-(200)_30-60%EtOH进行实验。
体外伤口愈合试验
本发明进一步测试BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH的伤口愈合能力。
取人类正常成纤维细胞株Hs68（购自Bioresource Collection and ResearchCenter）在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，培养于37℃、5% CO2的培养箱中。
将细胞培养于24孔板中，并分为四组，分别为对照组（Basal）、BQ01-(200)_30组（给予0.1 µg/mL的BQ01-(200)_30）、BQ01-(200)_30-60%EtOH组（给予0.1 µg/mL的BQ01-(200)_30-60%EtOH）及阳性对照组（给予20 ng/mL的PDGF-AA），接着用IBIDI Culture-Inserts（购自GmbH, Germany），根据制造商的说明书进行体外伤口愈合试验。
将IBIDI Culture-Inserts放入24孔细胞培养板的孔洞中，并在顶部轻轻按压以确保紧密贴附。IBIDI Culture-Inserts是由一个500 μm厚的壁隔开的两个池所组成，将等量的Hs68细胞（4.5×105 细胞/mL）分配到IBIDI Culture-Inserts的两个池中，培养24小时后，更换为没有胎牛血清的培养基（FBS-free medium），将IBIDI Culture-Inserts轻轻移除，以形成500 μm的间隙，并用PBS进行清洗。
细胞核用2 μg/mL的Hoechst 33342染色10分钟，并用PBS洗涤，然后依据组别分别用0.1 µg/mL的BQ01-(200)_30、0.1 µg/mL的BQ01-(200)_30-60%EtOH及20 ng/mL的PDGF-AA处理细胞，并在第0、6、9、12和24小时后，利用Citation 5成像系统（Biotek，England）观察细胞迁移并拍照。
如图6所示，BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH产生了显著的细胞迁移效果，证实BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH可以有效促进伤口愈合。
糖尿病伤口愈合试验
本发明的所有动物实验均经长庚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
首先建立糖尿病动物模型，本发明选用体重20-25 g的8周龄C57BL/6雄性小鼠，将小鼠禁食4小时后连续五天以腹膜内注射55 mg/kg体重的溶解在pH4.5柠檬酸盐缓冲液中的链脲佐菌素（STZ），并在前4天注射STZ后，给予正常食物和3%葡萄糖水，以诱导糖尿病，最后一天则不再给予葡萄糖水，改为给予一般的饮用水。
在上述过程中，STZ注射后72小时，将小鼠禁食4小时，用Contour Plus便携式血糖仪（Ascensia，英国）刺穿小鼠尾巴并放血以测量空腹血糖值。空腹血糖值为150-250 mg/dL的动物被认为是糖尿病前期，而>250 mg/dL则被认为是糖尿病并用于后续实验。所有的小鼠空腹血糖值均>250 mg/dL。
糖尿病动物模型建立后，接着建立糖尿病伤口愈合动物模型。
实验共使用48只C57BL/6雄性糖尿病小鼠，并随机分为5组：对照组13只（给予25%的Pluronic acid）、BQ01-(200)_30低剂量组8只（给予10 mg/kg的BQ01-(200)_30）、BQ01-(200)_30-60%EtOH低剂量组10只（给予10 mg/kg的BQ01-(200)_30-60%EtOH）、BQ01-(200)_30高剂量组7只（给予25 mg/kg的BQ01-(200)_30）及BQ01-(200)_30-60%EtOH高剂量组10只（给予25 mg/kg的BQ01-(200)_30-60%EtOH）。
每只糖尿病小鼠的毛发均在麻醉下通过剃刀和脱毛膏去除，用医用胶带固定背部皮肤防止皮肤拉伸，并使用无菌活检穿孔器造成一左一右的两个直径6 mm的全皮层伤口。
实验过程中，所有伤口均以开有圆形缺口的医用胶带固定，使伤口维持在缺口处，医用胶带则将伤口周围皮肤固定，以避免伤口愈合时的皮肤皱缩影响伤口面积计算，左侧伤口未进行任何处理，而右侧伤口则依据组别，分别给予25%的Pluronic acid、10 mg/kg的BQ01-(200)_30、10 mg/kg的BQ01-(200)_30-60%EtOH、25 mg/kg的BQ01-(200)_30及25 mg/kg的BQ01-(200)_30-60%EtOH进行每日局部治疗，持续2周，并每日对伤口进行拍照。
伤口面积使用Image J分析软件根据每天拍摄的照片进行计算，并表示为与第0天相比的伤口愈合百分比。
伤口愈合的结果如图7A至图7E所示，图7A显示未处理组、对照组、低剂量及高剂量组（包含BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH）的伤口愈合照片，图7B至图7E则将伤口面积量化后以折线图显示，从结果可以发现，相较于未处理组，用BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH低剂量及高剂量组处理的小鼠的伤口可以看到显著的伤口愈合。
上述剂量换算为人类使用剂量为0.8 mg/kg体重及2 mg/kg体重。
为了进一步确认BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH只促进糖尿病的伤口愈合，而并非是治疗糖尿病，因此对每只小鼠于第一周及第二周测量空腹血糖值，结果如图7所示，每只小鼠的空腹血糖值持续升高，证明BQ01-(200)_30及BQ01-(200)_30-60%EtOH只促进糖尿病的伤口愈合，而非治疗了糖尿病。
尽管本发明已经被足够详细地描述和示例，以供本领域技术人员制作和实施，但在不脱离本发明的精神和范围的情况下，各种替代、修改和改进应该是显而易见的。
本领域技术人员容易理解，本发明很好地适用于实现所述目的并获得所提及的目的和优点以及其中固有的那些目的和优点。细胞、动物以及产生它们的过程和方法仅代表优选的实施方式，是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员能想到其中的修改和其他用途，这些修改包含在本发明的精神内并且由权利要求的范围所限定。
Claims (15)
1.一种菊花萃取物的制备方法，其包括以下步骤：
a. 取菊花样品；以及
b. 将所述样品以亚临界水萃取法，在高温及高压下进行萃取，以得到亚临界水萃取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b的所述高温是介于120~250℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b的所述高压是介于5~20 MPa。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚临界水萃取法萃取5~60分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：
c. 将所述亚临界水萃取物用纯水溶解后放置入管柱，并用纯水及不同比例的酒精水溶液作为移动相进行分层；以及
d. 收集产量最大的酒精水溶液的分层，并进行冷冻干燥以获得菊花萃取物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤c的不同比例的酒精水溶液选自20%酒精水溶液、40%酒精水溶液、60%酒精水溶液及95%酒精水溶液。
7.根据权利要求5所述的方法，其中步骤c的分层依次用纯水、20%酒精水溶液、40%酒精水溶液、60%酒精水溶液及95%酒精水溶液作为移动相进行分层。
8.一种菊花萃取物，其通过如权利要求1至7中任一项所述的方法制备得到。
9.菊花萃取物在制备用于抑制个体内嗜中性粒细胞引起的发炎反应的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体，其中所述菊花萃取物通过权利要求1至7中任一项所述的方法制备得到。
10.菊花萃取物在制备用于清除个体内自由基的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体，其中所述菊花萃取物通过权利要求1至7中任一项所述的方法制备得到。
11.菊花萃取物在制备用于促进个体伤口愈合的医药组合物中的用途，所述医药组合物包括有效剂量的菊花萃取物及药学上可接受的载体，其中所述菊花萃取物通过权利要求1至7中任一项所述的方法制备得到。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述伤口愈合包括慢性伤口愈合。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述伤口愈合包括糖尿病伤口愈合或糖尿病足。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的用途，其中所述有效剂量为0.1 mg/kg体重至50 mg/kg体重。
15.根据权利要求9至13中任一项所述的用途，其中所述个体为人类或哺乳动物。
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