CN117919254A - 一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用 Download PDF

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CN117919254A CN202410050878.XA CN202410050878A CN117919254A CN 117919254 A CN117919254 A CN 117919254A CN 202410050878 A CN202410050878 A CN 202410050878A CN 117919254 A CN117919254 A CN 117919254A
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孙桂波
田瑜
叶景学
尚海
王敏
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Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
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Abstract

本发明提供了一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，属于生物医药领域；所述三唑类化合物如结构式(Ⅰ)所示，所述药物还包括药学上可接受的辅料；还提供了所述三唑类化合物的手性化合物、对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。相比于现有技术，所述三唑类化合物在制备具有防治缺血性脑卒中药物的应用中，表现出了更佳的药代动力学和药效学特性；具有更高的临床应用价值。

Description

一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。
背景技术
脑卒中(cerebral stroke)，又称“中风”，是由于血管阻塞导致血液不能流入大脑或脑部血管突然破裂而引起脑组织损伤的一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率及高复发率的特点。然而，目前脑卒中的治疗方法非常有限，对于超急性期缺血性脑梗死患者需要在时间窗内给予静脉溶栓及血管内治疗，但由于治疗时间窗的限制和治疗带来的出血风险的增加，实际只有5％的患者从重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)治疗中受益。因此，寻找和发现具有长效脑保护作用的药物是缺血性脑卒中防治领域的研究重点和目标。
丁苯酞(恩必普，NBP)是以“缺血性脑卒中治疗”为主要适应症的药物，NBP作用于脑缺血的多个病理环节，药效学研究表明其具有较强的抗脑缺血作用，明显改善脑缺血区的微循环和血流量，增加缺血区毛细血管数量；改善脑能量代谢，减少神经细胞凋亡此外，多项临床研究表明，NBP不仅能改善缺血性脑卒中患者的症状，而且其有助于长期恢复。但是由于其水溶性极差、肝毒性以及耐药等，单药的应用并不十分理想。
朱桃等人在其论文《川芎嗪-丁苯酞衍生物的设计、合成及抗血小板聚集活性研究》中以邻苯二甲酸酐和川芎嗪为原料,经自由基取代、正丁基锂亲核加成、对甲基苯磺酸催化脱水、Pd/C加氢还原、水解、酯化等反应合成了3个川芎嗪与丁苯酞拼合衍生物,其结构经1HNMR、13CNMR和HR-MS确证。其中(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲基-2-戊酰基苯甲酸酯对由腺苷二磷酸(ADP)诱导的血小板聚集活性抑制率IC50为0.26mmol/L,优于母体化合物川芎嗪和丁苯酞；然而丁苯酞作为一种具有抗脑缺血作用的化合物，现有技术中主要对其抗凝血作用进行研究，其抗脑缺血的优势作用并未被充分研究和开发。
陈宗胜等人在其论文《丹参川芎嗪联合丁苯酞注射液治疗急性缺血性脑卒中患者的疗效及对脑钠肽、Chemerin的影响》中对丁苯酞复配丹参川芎嗪的抗脑缺血的功效进行了研究，探讨丹参川芎嗪联合丁苯酞注射液治疗急性缺血性脑卒中患者的疗效及对脑钠肽、血清脂肪细胞因子(Chemerin)的影响。该论文中采取的方法为：选取诊断明确的急性缺血性脑卒中患者92例随机分为对照组(用丹参川芎嗪治疗)和联合治疗组(丹参川芎嗪+丁苯酞注射液治疗)各46例。持续治疗2w，美国国立卫生院脑卒中量表(NIHSS)评分观察患者的神经功能，酶联免疫吸附法检测患者血浆脑钠肽(BNP)、血管紧张素(Ang)Ⅱ、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、Chemerin水平，全血血流变仪分析患者的血流变指标。结果两组治疗后，患者的NIHSS评分、全血血流变学中低/高切黏度、血浆黏度、红细胞最大聚集指数及血浆BNP、AngⅡ、IL-8、TNF-α、MDA、Chemerin水平等结果较治疗前明显降低(P<0.05)，且联合治疗组明显低于对照组(P<0.05)。两组治疗后血清SOD水平较治疗前显著升高(P<0.05)，且联合治疗组显著高于对照组(P<0.05)。联合治疗组的预后效果显著优于对照组(P<0.05)。结论丹参川芎嗪联合丁苯酞注射液可明显提高急性缺血性脑卒中患者的神经功能，预后效果较好，作者认为这可能与降低患者血浆BNP、MDA及Chemerin水平，减轻炎症反应，提升机体抗氧化能力，加快血液流动有关。
发明人在实现背景技术给出的实施例中，发现背景技术中至少存在以下缺陷：丁苯酞的水溶性极差，并且具有肝毒性以及致耐药性；导致其单药的应用并不理想。
因此，如何提供一种对丁苯酞进行修饰的化合物在制备具有防治缺血性脑卒中作用药物中的应用，以克服丁苯酞单药的缺点，是本领域技术人员期望解决的技术问题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的单药药效较差及缺乏对丁苯酞进行结构修饰的化合物在制备具有防治缺血性脑卒中作用药物中的应用，提供了一种基于丁苯酞结构修饰和改造的三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，以更佳有效的改善在缺血性脑卒中中大脑的被影响面积，提高大脑的血液循环，降低缺血再灌注损伤。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明中文字或图片中记载的化合物B4或B4是指代三唑类化合物：分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
第一方面，本发明提供了一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。
优选地，所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，其通式如结构式(Ⅰ)所示：
优选地，所述的三唑类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用碱水解丁苯酞，调节pH，浓缩，加入氯乙酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺反应得到中间体1；
(2)将步骤(1)中得到的中间体1与炔丙胺溶解，加入O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和N,N-二异丙基乙胺反应得到中间体2；
(3)将川芎嗪采用过氧化苯甲酰引发，与N-溴代琥珀酸酐发生溴代反应得到中间体3；
(4)将步骤(3)中得到的中间体3溶解，再加入叠氮化钠反应得到中间体4；
(5)将步骤(2)中得到的中间体2和步骤(4)得到的中间体4溶解，加入催化剂反应得到中间体5；
(6)步骤(5)中得到的中间体5在催化剂作用下与取代化合物发生取代反应，得到所述三唑类化合物。
进一步优选地，步骤(1)中所采用的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中至少一种。
进一步优选地，步骤(1)中所述水解的条件为：在55-65℃保温1.5-3h，或在55-65℃微波30-45min。
进一步优选地，步骤(1)中所述调节pH的目标pH为3-4，采用的试剂选自为稀盐酸、稀硫酸和稀硝酸中的一种或几种。
进一步优选地，步骤(1)中所述浓缩的方法为加入萃取剂萃取；所述萃取剂选自乙酸乙酯和乙醚中的一种或两种。
进一步优选地，步骤(1)中所述氯乙酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺与丁苯酞的摩尔用量比依次为：1.4-1.6：0.08-0.12：1.4-1.6：1。
最优选地，步骤(1)中所述氯乙酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺与丁苯酞的摩尔用量比依次为：1.5：0.1：1.5：1。
进一步优选地，步骤(2)中所述溶解采用的溶剂包括二氯化碳。
进一步优选地，步骤(2)中所述炔丙胺与中间体1的摩尔用量比为1.1-1.3：1。
最优选地，步骤(2)中所述炔丙胺与中间体1的摩尔用量比为1.2：1。
进一步优选地，步骤(2)中所述O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、N,N-二异丙基乙胺与中间体1的摩尔用量比依次为：1.1-1.3：1.8-2.2：1。
最优选地，步骤(2)中所述O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、N,N-二异丙基乙胺与中间体1的摩尔用量比依次为：1.2：2：1。
进一步优选地，步骤(2)中所述反应的温度为20-30℃，时间为5.5-7h。
最优选地，步骤(2)中所述反应的温度为25℃，时间为6h。
进一步优选地，步骤(3)中所述过氧化苯甲酰与川芎嗪的摩尔用量比为0.08-0.12：1。
最优选地，步骤(3)中所述过氧化苯甲酰与川芎嗪的摩尔用量比为0.1：1。
进一步优选地，步骤(3)中所述N-溴代琥珀酸酐与川芎嗪的摩尔用量比为0.25-0.35：1。
最优选地，步骤(3)中所述N-溴代琥珀酸酐与川芎嗪的摩尔用量比为0.3：1。
进一步优选地，步骤(3)中所述溴代反应的方法为回流。
更进一步优选地，所述回流的温度为75-85℃，时间为3.5-5h。
进一步优选地，步骤(4)中所述溶解采用的溶剂包括乙腈。
进一步优选地，步骤(4)中所述叠氮化钠与中间体3的摩尔用量比为1.15-1.25：1。
最优选地，步骤(4)中所述叠氮化钠与中间体3的摩尔用量比为1.2：1。
进一步优选地，步骤(4)中所述反应的条件为在55-65℃微波55-70min。
最优选地，步骤(4)中所述反应的条件为在60℃微波60min。
进一步优选地，步骤(5)中所述中间体2与中间体4的摩尔用量比为1：0.9-1.1。
最优选地，步骤(5)中所述中间体2与中间体4的摩尔用量比为1：1。
进一步优选地，步骤(5)中所述溶解采用的溶剂包括二氯甲烷。
进一步优选地，步骤(5)中所述催化剂包括噻吩-2-甲酸亚铜(I)。
进一步优选地，步骤(5)中所述反应的温度为20-30℃。
进一步优选地，步骤(6)中所述催化剂包括碳酸铯；所述碳酸铯与中间体5的摩尔用量比为1.4-1.6：1。
进一步优选地，步骤(6)中所述取代化合物与中间体5的摩尔用量比为1.4-1.6：1。
更进一步优选地，步骤(6)中所述取代化合物选自吗啉。
进一步优选地，步骤(6)中所述取代反应的条件为在60-70℃反应100-140min；或在60-70℃微波50-65min。
最优选地，步骤(6)中所述取代反应的条件为在65℃反应120min；或在65℃微波60min。
优选地，所述药物的最小剂量单元所含B4的量为2-200mg。
所述药物的最小剂量单元是指一片，一颗胶囊，一袋颗粒或一支注射剂等。
优选地，所述防治缺血性脑卒中的药物包括预防缺血性脑卒中的药物和治疗缺血性脑卒中的药物。
优选地，所述药物的形式为固体、液体或气体。
进一步优选地，所述固体的形式为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、软胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体的形式为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂或酏剂；所述气体的形式为气雾剂或喷雾剂。
最优选地，所述药物的形式为片剂或注射剂。
优选地，所述药物的给药方式为口服、舌下、口腔粘膜、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、经皮、鼻腔、直肠途径中的至少一种。
第二方面，本发明提供了如式(Ⅰ)的三唑类化合物的手性化合物、对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步优选地，所述辅料包括粘合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、混悬剂、助悬剂、缓释剂、控释剂、冻干保护剂、包衣剂、肠溶材料、润滑剂、助流剂、抗粘剂、甜味剂、风味剂、增塑剂、遮光剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、渗透压调节剂、着色剂、色素、表面活性剂、乳化剂、水溶性基质、脂溶性基质、油脂性基质、致孔剂、凝胶剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂和抗氧剂中的至少一种。
优选地，所述药物的最小剂量单元所含如式(Ⅰ)的三唑类化合物的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物和酯中至少一种的量为2-200mg。
所述药物的最小剂量单元是指一片，一颗胶囊，一袋颗粒或一支注射剂等。
优选地，所述防治缺血性脑卒中的药物包括预防缺血性脑卒中的药物和治疗缺血性脑卒中的药物。
优选地，所述药物的形式为固体、液体或气体。
进一步优选地，所述固体的形式为粉末剂、片剂、颗粒剂、丸剂、硬胶囊、软胶囊、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、凝胶剂、糊剂、散剂或贴剂；所述液体的形式为溶液剂、混悬剂、注射剂、糖浆剂、搽剂、乳剂、酊剂或酏剂；所述气体的形式为气雾剂或喷雾剂。
优选地，所述药物的给药方式为口服、舌下、口腔粘膜、静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、经皮、鼻腔、直肠途径中的至少一种。
第三方面，本发明还提供了三唑类化合物或其对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯制备用于防治缺血再灌注损伤、及与缺血再灌注损伤具有类似机制及损伤介导的疾病的药物中的应用。
优选地，所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
优选地，所述疾病选自冠心病、高心病、肺心病、短暂性脑缺血发作、椎基底动脉供血不足、血管性痴呆、颅内动脉瘤、颅内血管畸形、颅内动脉及动脉窦血栓形成。
第四方面，本发明还提供了一种含有活性成分的药物组合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用；所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
优选地，所述活性成分包括三唑类化合物和三唑类化合物的手性化合物、对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物及酯中的至少一种；所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
进一步优选地，所述辅料选自下组：粘合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、混悬剂、助悬剂、缓释剂、控释剂、冻干保护剂、包衣剂、肠溶材料、润滑剂、助流剂、抗粘剂、甜味剂、风味剂、增塑剂、遮光剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、渗透压调节剂、着色剂、色素、表面活性剂、乳化剂、水溶性基质、脂溶性基质、油脂性基质、致孔剂、凝胶剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂和抗氧剂中的至少一种。
优选地，所述药物组合物还包含其他具有提高脑血流量或减少缺血再灌注损伤的作用的活性组分。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种三唑类化合物的新的应用，具体提供了三唑类化合物在制备具有防治缺血性脑卒中作用的药物中的应用。所述三唑类化合物可以有效改善脑卒中影响面积，具有增加脑血流量及改善大脑缺血再灌注损伤的作用。相比于现有技术，三唑类化合物在制备具有防治缺血性脑卒中药物的应用中，表现出了更佳的药代动力学和药效学特性；具有更高的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例一中化合物B4对体外缺氧复氧诱导的神经元细胞模型的保护作用结果对比图；
图1中A、B为化合物B4对SH-SY5Y细胞毒性和OGD/R细胞模型增殖活力的影响对比图；C为化合物B4对SH-SY5Y细胞OGD/R模型释放LDH的影响对比图；
图2为本发明实施例一中化合物B4、化合物A5对SH-SY5Y细胞毒性和OGD/R细胞模型增殖活力的影响对比图；
图3为本发明实施例一中化合物B4对SH-SY5Y细胞OGD/R模型凋亡和活性氧水平的影响结果图；
图3中A、B为细胞凋亡与坏死荧光结果；C、D为活性氧荧光结果；
图4为本发明实施例一中化合物B4对SH-SY5Y细胞OGD/R模型SOD、MDA水平以及Nrf2核转位情况的影响结果；
图4中，A、B为细胞内SOD和MDA含量结果；C为Nrf2核转位荧光结果；
图1-4中，与control组比较，###P<0.001；与模型组(OGD/R)比较*P＜0.05,***P＜0.001；与NBP组比较，&P＜0.05,&&&P＜0.001)；
图5为本发明实施例二中化合物B4对大鼠缺血性脑卒中模型的保护作用结果；
图5中，A为给药7d内各组体重的变化结果；B为给药7d内各组行为学评分的变化结果；C、D为给药7d后各组大鼠脑梗死面积结果；E、F为给药7d后各组大鼠脑血流量情况结果；
图5中，与Sham组比较，###P<0.001；与模型组(MCAO/R)比较**P＜0.01,***P＜0.001；与NBP组比较，&P＜0.05。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用仪器均为常规仪器，所用原料均为市售。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
合成例化合物B4的合成
中间体1的制备
中间体1的结构式如下：
取化合物NBP(10.0g,52.6mmol)，加入乙醇-水的混合溶液(体积比2:1)60mL，加入氢氧化钾(4.4.0g,78.4mmol)，60℃微波反应40min，反应结束后旋干溶剂，将浓缩液加水稀释，稀盐酸调节pH至3-4,析出白色固体，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后，将氯乙酰氯(6.3mL,78.9mmol)加入中间体1的乙酸乙酯溶液中,加入DMAP(642.3mg，5.26mmol)后滴加三乙胺(11mL,78.9mmol)，搅拌反应。反应结束后加水萃取,收集有机层,无水硫酸钠干燥后,过滤,蒸干溶剂得到粗品，以V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝10:1硅胶柱层析纯化得淡黄色固体7.6g，收率为51％。用于下一步反应。
中间体2的制备
中间体2的结构式如下：
取化合物中间体1(5g,17.6mmol)，溶于30ml二氯甲烷中，后加入TBTU(6.67g，29.6mmol)和DIPEA(5.8ml，44.2mmol)，反应结束后盐水萃取三次收集有机层，除水后，旋干溶剂，得到粗品，以V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝10:1硅胶柱层析纯化得淡黄色固体3.53g，收率为62.3％。用于下一步反应。
中间体2的1H NMR、13C NMR和HRMS数据如下所示：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.09(dd,J＝8.0Hz,1.1Hz,1H,H-3),7.61-7.58(td,J＝8.1Hz,1.4Hz,1H,H-5),7.58-7.56(dd,J＝8.1Hz,1.5Hz,1H,H-6),7.39(td,1H,J＝7.4Hz,1.5Hz,H-4),6.77(m,1H,C(CH)O),4.10(d,2H,CO(CH2)Cl),0.91(t,3H,CH3)；13C-NMR(150
MHz,CDCl3)δ:172.0,166.7,143.7,133.5,131.5,127.7,126.9,126.1,75..0,41.1,36.5,27.9,22.3,14.0；HRMS:Calcd.for C14H17ClO4(M+Na):307.0708.Found:307.0710
中间体3的制备
中间体3的结构式如下：
取化合物TMP(5g，36.7mmol)加入四氯化碳(50ml)溶解，后加入NBS(2.179g，12.2mmol)和BPO(890mg，3.6mmol)，微波加热65℃，1h。反应结束后抽滤，旋干溶剂，V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝20：1硅胶柱层析纯化得淡白色固体，1.83g，收率为69％。用于下一步反应。
中间体4的制备
中间体4的结构式如下：
取化合物中间体4(500mg，2.32mmol)加入乙腈(2ml)溶解，后加入NaN3，微波加热60℃，1h。反应结束后抽滤，旋干溶剂，无需处理直接用于下一步反应。
中间体5的制备
中间体5的结构式如下：
准确称取(2g，7mmol)中间体2，用5ml二氯甲烷稀释溶解，室温条件下依次加入中间体4(1.16g，7mmol)和Cutc(260mg，7mmol)，室温下搅拌2h。TLC检测反应完后，过滤浓缩得到粗品，以V(二氯甲烷):V(甲醇)＝15:1硅胶柱层析纯化得淡黄色固体1.8g，收率为56％。用于下一步反应。
中间体5的1H NMR、13C NMR和HRMS数据如下所示。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.72(s,1H,CCHN),7.45-7.42(m,1H,H-3),7.42-7.41(m,1H,H-5),7.41-7.40(m,1H,H-6),7.33-7.29(m,1H,H-4),7.20(m,1H,CONH),6.05(m,1H,C(CH)O),5.61(m,2H,NCH2C),4.74-4.66(m,2H,COCH2Cl),4.04(d,J＝14.8Hz,2H,NHCH 2),2.54(s,3H,CH3),2.51(s,3H,CH3),2.50(s,3H,CH3),0.86(t,J＝7.2Hz,3H,CH3)；13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:169.0,167.3,152.1,149.6,148.9,144.8,143.6,138.4,135.3,130.6,128.2,127.3,126.2,122.5,75.9,53.2,41.0,36.4,35.6,27.6,22.4,21.7,21.5,20.7,13.9.
HRMS:Calcd.for C25H31ClN6O3(M+Na):521.2038.Found:521.2038.
化合物B4的制备
按照前述方式制备中间体5；准确称取(1g，1.6mmol)中间体5置于微波管中，用3ml四氢呋喃稀释溶解，依次加入碳酸铯(0.9g，3.8mmol)和吗啉(0.24ml，3.8mmol)，微波反应，65℃1h。TLC检测反应完后，过滤浓缩得到粗品，以V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:4硅胶柱层析纯化得黄色粘稠液体0.43g，收率为39％。化合物B4的1H NMR、13C NMR和HRMS数据如下所示。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.65(s,1H,CCHN),7.54(m,1H,CONH),7.35-7.33(m,1H,H-3),7.33-7.31(m,1H,H-5),7.31-7.29(m,1H,H-6),7.25-7.21(m,1H,H-4),5.87(m,1H,C(CH)O),5.53(d,J＝14.6Hz,2H,NCH2C),4.62(m,2H,NHCH 2),3.62(t,J＝4.6Hz,4H,CH2OCH2),3.12(d,J＝16.6Hz,2H,COCH2N),2.47(s,3H,CH3),2.47-2.44,2.42-2.37(m,4H,CH2NCH2),2.44(s,3H,CH3),2.43(s,3H,CH3),0.77(t,J＝7.2Hz,3H,CH3)；13C-NMR(150MHz,CDCl3)δ:169.5,168.2,151.0,148.5,147.9,143.9,142.5,137.6,134.4,129.3,127.0,126.6,125.0,121.5,73.5,65.7(2C),58.6,52.2(2C),52.1,35.4,34.5,26.5,21.3,20.7,20.5,19.6,12.9.；HRMS:Calcd.for C29H39N7O4(M+H):550.3135.Found:550.3135.
实施例一：B4对体外缺氧复氧诱导的神经元细胞模型的保护作用
1.药物及试剂
本实验所用化合物B4及化合物A5由中国医学科学院药用植物研究所田瑜研究员按照上述合成方式提供，阳性药丁苯酞(NBP)购于MedChemExpress；cck-8试剂盒购于武汉三鹰生物技术有限公司。乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、蛋白定量(BCA)试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒和细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。活性氧检测试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。NRF2Rabbit mAb、Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。
2.细胞培养与缺氧复氧诱导的神经元细胞模型建立
人神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y)来自中国医学科学院基础医学研究所(中国北京)。SH-SY5Y细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Gibco，USA)、2mmol/L谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM培养基中培养，并置于37℃和5％CO2的潮湿环境中。用SH-SY5Y细胞进行缺氧复氧(OGD/R)，以模拟体外的脑损伤。当SH-SY5Y细胞融合度大于80％时，吸出原培养基，加入无FBS无糖培养基，然后放入含95％N2、5％H2，37℃的厌氧培养箱中培养3.5小时(OGD)，然后从厌氧培养箱中转移到正常环境中，用正常培养基代替无FBS的培养基进行复灌(R)，放入正常培养箱中继续培养12小时。Control组的处理方式为：当SH-SY5Y细胞融合度大于80％时，吸出原培养基，加入无FBS培养基，然后放入正常培养箱中培养。
3.细胞增殖活力和乳酸脱氢酶(LDH)检测
(1)细胞增殖活力检测(CCK-8)
取对数生长期的细胞以1.2×105个/孔的密度接种于96孔板中，在5％CO2、37℃条件培养长满至80％后，分别加入含化合物B4、A5、NBP和TMP(浓度均为6.25μM)的无FBS培养基孵育4h，然后进行OGD/R处理。处理结束后，每孔加入cck-8溶液10μL，37℃孵育1h后，微孔板震荡器震荡5s，酶标仪检测450nm处吸光度值(OD值)。将各测试孔的OD值减去本底OD值(无血清培养基加cck-8，无细胞)，根据各孔OD值计算平均值±SD。细胞存活率％＝(加药细胞OD值-本底OD值)/(对照细胞OD值-本底OD值)×100％。
在本检测中，加入了同样包含丁苯酞结构的化合物A5作为对比；所述A5的结构式如下：
/>
(2)乳酸脱氢酶(LDH)检测
细胞OGD/R处理结束后，吸取每孔细胞培养液上清，按照LDH试剂盒说明书操作，充分混匀，室温放置5分钟，用酶标仪在波长450nm下测定吸光度。
4.细胞凋亡与坏死检测
细胞OGD/R处理结束后，吸出原培养基，按照1:1:200的比例加入细胞染色缓冲液、Hoechst染色液和PI染色液。混匀，4℃孵育30mins。PBS清洗1次，置于荧光显微镜下观察并拍照。
5.细胞活性氧检测
细胞OGD/R处理结束后，吸出原培养基，每孔加入含10uM DCFH-DA的培养基，37℃孵育60mins，PBS清洗三次，置于荧光显微镜下进行拍照。
6.细胞SOD和MDA检测
细胞OGD/R处理结束后，吸出原培养基，加入0.25％的胰酶室温消化2分钟，加培养液终止消化，用移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入EP管，然后1000rpm/min，离心5min弃上清，留沉淀细胞，加入1mLPBS吹打均匀，再次1000rpm/min，离心5min弃上清，留沉淀细胞待用。在细胞沉淀中加入PBS，功率300W，冰水浴超声破碎细胞，每3-5s超声一次，间隔4次。蛋白定量(BCA)试剂盒检测蛋白浓度。按照试剂盒说明书依次加入试剂和样品，酶标仪检测。
7.细胞Nrf2核转位情况检测
细胞OGD/R处理结束后，吸出原培养基，每孔加入4％多聚甲醛固定15min，吸出，PBS清洗三次。加入0.3％TritonX-100进行细胞通透10min，吸出，PBS清洗三次。加入10％山羊血清37℃孵育30min。吸出，每孔加入Nrf2抗体(稀释比例为1:200)，4℃孵育过夜。吸出，PBS洗三次。加入Cy3 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(稀释比例为1:500)，室温孵育1h，吸出，PBS清洗三次，加入抗荧光淬灭剂(含DAPI)。置于荧光显微镜下进行拍照。
8.数据处理
数据处理采用SPSS16.0分析统计软件，实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，实验组之间采用t检验进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
9.实验结果
CCK8测定结果如图1中A、B所示，B4和NBP对于SH-SY5Y细胞OGD/R模型均具有明显的保护作用。细胞LDH释放如图1中C所示，B4和NBP均明显降低SH-SY5Y细胞OGD/R模型LDH的释放。
CCK8测定对比结果如图2所示，可见B4、A5、NBP及TMP对于SH-SY5Y细胞OGD/R模型均具有明显的保护作用。相比于A5、NBP及TMP，B4的细胞保护作用效果更佳。
细胞凋亡与坏死水平和细胞活性氧水平如图3所示，与Control组相比，OGD/R组细胞凋亡水平和活性氧水平明显升高，给予B4和NBP后降低。
细胞SOD、MDA水平如图4中A、B所示，与Control组相比，OGD/R组SOD水平显著降低、MDA水平明显增高，给予B4和NBP治疗后缓解。
细胞Nrf2核转位情况如图4中C、D所示，与Control组相比，OGD/R组Nrf2核转位增加，给予B4和NBP治疗后进一步增加了Nrf2核转位。
由此表明，化合物B4能够保护缺氧复氧诱导的神经元细胞模型。
结论：化合物B4对缺氧复氧诱导的神经元细胞模型具有明显的保护作用。
实施例二:B4对大鼠缺血性脑卒中模型的保护作用
1.实验动物和药物配制
SD大鼠购于北京维通利华实验技术有限公司，饲养于中国医学科学院药用植物研究所的动物屏障系统，环境为SPF级别，保证恒温(24±2℃)、恒湿(40％-60％)、12/12h昼夜照明，并保证充足的水和食物以及干燥的环境。
B4的配制：称取一定量的B4油性液体，用羧甲基纤维素钠(CMC)溶液配制，超声至充分混匀；NBP的配制：称取一定量的丁苯酞油性液体，用羧甲基纤维素钠(CMC)溶液配制，超声至充分混匀。
2.大鼠缺血性脑卒中模型(MCAO/R)的建立
采用大脑中动脉栓塞手术制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型。实验开始前，将尼龙栓线用75％酒精擦洗干净，在距球端18.5mm处做标记，置0.9％的无菌生理盐水中备用。将大鼠用氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉，仰卧于手术台上。颈正中切开皮肤，依次分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ECA的分支动脉，结扎ECA远端与总动脉(CCA)向心端。用动脉夹夹闭CCA和ICA，在ECA作个当于ECA直径2/3大小的切口，将制备好的栓线插入ICA，至阻断ICA血流处。并用手术线轻轻用力结扎。松开ICA的动脉夹,将尼龙栓线顺势插入ICA，插入18.5±0.5mm至大脑前(ACA)起始部，阻断大脑中动脉MCA)的血液供应。MCA阻断2h后，将尼龙丝线从ACA拔出，退至ECA内恢复，再灌注24h。
3.实验动物分组及给药
筛选健康合格的SPF级、体重280-330g的SD大鼠；随机分为5组，每组6只：假手术(Sham)组、MCAO/R模型组、B5给药低剂量组(5mg/kg)+MCAO/R、B5给药中剂量组(10mg/kg)+MCAO/R、B5给药高剂量组(20mg/kg)+MCAO/R、NBP对照组(60mg/kg)+MCAO/R。各组按剂量连续灌胃给药7d。假手术组(Sham)与模型组每天给予等体积的CMC溶液灌胃。
4.体重和行为学评分
在MCAO/R手术后1、3、5和7天，对MCAO/R和药物治疗的动物(n＝6/组/时间点)进行神经行为评估和体重称量。在本实验中，根据国际公认的MCAO/R术后大鼠神经功能缺损评分标准--改良神经功能严重程度评分(mNSS)，在不同时间点对大鼠的神经功能评分进行评估。总分是18分，分数越高代表神经系统损伤越严重。
5.激光多普勒检测脑血流量
将麻醉好的大鼠平放至托盘中，酒精消毒大鼠头顶部毛发及皮肤，手术剪剪开大鼠头顶部皮肤，用蘸有生理盐水的棉球清理头部剪开位置残留的毛发，将大鼠头顶正对于激光多普勒血流仪摄像头下进行拍照。
6.TTC染色
麻醉后20min内直接迅速取脑，保持大脑的完整性。-20℃冰箱中速冻10min左右便于切片。随后用专门的脑槽放置脑(准确计算梗死面积)，一般切成5-6片，每隔2mm切一片。将切片置于2％TTC溶液用锡箔纸盖住后放入37℃温箱15min不时翻动脑片使均匀接触到染色液。经染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。取出脑片放入4％多聚甲醛中固定24h，避光。固定好的脑片放在浅色手术台上用数码相机拍照。按公式计算缺血区体积比＝(各切片白色缺血区面积之和)/(各切片脑片面积之和)×100％。
7.数据处理
数据处理采用SPSS16.0分析统计软件，实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示。统计分析采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，实验组之间采用t检验进行两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。
8.实验结果
大鼠体重和行为学变化如图5中A、B所示，与MCAO/R组相比，B4高剂量组(20mg/kg)体重明显增加，行为学评分降低。
大鼠给药7d后大脑梗死面积如图5中C、D所示，与假手术(Sham)组相比，MCAO/R组脑梗死面积明显增加，给予B4和NBP治疗后大鼠脑梗死面积显著降低。
大鼠给药7d后大脑血流量如图5中E、F所示，与假手术(Sham)组相比，MCAO/R组脑血流量明显降低，给予B4和NBP治疗后大鼠脑血流量显著增加。
结论：化合物B4可以改善大鼠脑梗死面积、增加脑血流量，改善大鼠脑缺血再灌注损伤。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种三唑类化合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于：所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述三唑类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用碱水解丁苯酞，调节pH，浓缩，加入氯乙酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺反应得到中间体1；
(2)将步骤(1)中得到的中间体1与炔丙胺溶解，加入O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和N,N-二异丙基乙胺反应得到中间体2；
(3)将川芎嗪采用过氧化苯甲酰引发，与N-溴代琥珀酸酐发生溴代反应得到中间体3；
(4)将步骤(3)中得到的中间体3溶解，再加入叠氮化钠反应得到中间体4；
(5)将步骤(2)中得到的中间体2和步骤(4)得到的中间体4溶解，加入催化剂反应得到中间体5；
(6)步骤(5)中得到的中间体5在催化剂作用下与吗啉发生取代反应，得到所述三唑类化合物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(1)中所采用的碱选自氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙中至少一种；步骤(1)中所述水解的条件为：在55-65℃保温1.5-3h，或在55-65℃微波30-45min；步骤(1)中所述浓缩的方法为加入萃取剂萃取；所述萃取剂选自乙酸乙酯和乙醚中的一种或两种；步骤(1)中所述氯乙酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺与丁苯酞的摩尔用量比依次为：1.4-1.6：0..08-0.12：1.4-1.6：1；步骤(2)中所述溶解采用的溶剂包括二氯化碳；步骤(2)中所述炔丙胺与中间体1的摩尔用量比为1.1-1.3：1；步骤(2)中所述O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、N,N-二异丙基乙胺与中间体1的摩尔用量比依次为：1.1-1.3：1.8-2.2：1；步骤(2)中所述反应的温度为20-30℃，时间为5.5-7h。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(3)中所述过氧化苯甲酰与川芎嗪的摩尔用量比为0.08-0.12：1；步骤(3)中所述N-溴代琥珀酸酐与川芎嗪的摩尔用量比为0.25-0.35：1；步骤(3)中所述溴代反应的方法为回流；步骤(4)中所述溶解采用的溶剂包括乙腈；步骤(4)中所述叠氮化钠与中间体3的摩尔用量比为1.15-1.25：1；步骤(4)中所述反应的条件为在55-65℃微波55-70min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤(5)中所述中间体2与中间体4的摩尔用量比为1：0.9-1.1；步骤(5)中所述溶解采用的溶剂包括二氯甲烷；步骤(5)中所述催化剂包括噻吩-2-甲酸亚铜(I)；步骤(5)中所述反应的温度为20-30℃；步骤(6)中所述催化剂包括碳酸铯；所述碳酸铯与中间体5的摩尔用量比为1.4-1.6：1；步骤(6)中所述吗啉与中间体5的摩尔用量比为1.4-1.6：1；步骤(6)中所述取代反应的条件为在60-70℃反应100-140min；或在60-70℃微波50-65min。
6.一种三唑类化合物的手性化合物、对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用；其特征在于：所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
7.一种三唑类化合物或其手性化合物、对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物或酯在制备用于防治缺血再灌注损伤、及与缺血再灌注损伤具有类似机制及损伤介导的疾病的药物中的应用；
所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：：
所述疾病选自冠心病、高心病、肺心病、短暂性脑缺血发作、椎基底动脉供血不足、血管性痴呆、颅内动脉瘤、颅内血管畸形、颅内动脉及动脉窦血栓形成。
8.一种含有活性成分的药物组合物在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料；
所述活性成分包括三唑类化合物和三唑类化合物的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、游离形式和药用可接受的盐、水合物、溶剂化物及酯中的至少一种；所述三唑类化合物的分子式为C29H39N7O4，化学结构式如式(Ⅰ)所示：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述辅料选自下组：粘合剂、填充剂、稀释剂、崩解剂、混悬剂、助悬剂、缓释剂、控释剂、冻干保护剂、包衣剂、肠溶材料、润滑剂、助流剂、抗粘剂、甜味剂、风味剂、增塑剂、遮光剂、增溶剂、保湿剂、溶剂、渗透压调节剂、着色剂、色素、表面活性剂、乳化剂、水溶性基质、脂溶性基质、油脂性基质、致孔剂、凝胶剂、防腐剂、缓冲剂、螯合剂和抗氧剂中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的应用，所述药物组合物所述药物组合物还包含其他具有提高脑血流量或减少缺血再灌注损伤的作用的活性组分。
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