CN106279086B - 灵芝呋喃a及其药物组合物与其在制药和食品中的应用 - Google Patents

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Abstract

提供了灵芝呋喃A及其药物组合物与其制备方法和其在制药和食品中的应用。赤芝是中国药典收录的名贵特色菌类中药，从中分离得到一个新化合物灵芝呋喃A，活性研究表明该化合物体内外均可抗肾脏纤维化作用。同时其也可选择性抑制TGF‑β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化，鉴于Smad3磷酸化是介导多种器官纤维化的共同信号通路，提示灵芝呋喃A对于包括肾脏纤维化在内的器官纤维化的治疗作用。另外，本发明也提供了一种天然获取或化学合成制备灵芝呋喃A的方法。

Description

灵芝呋喃A及其药物组合物与其在制药和食品中的应用
技术领域：
本发明属于药物技术和食品领域，具体地涉及灵芝呋喃A及其制备方法，其在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的药物或保健食品中的应用，以灵芝呋喃A为活性成分的药物组合物。
背景技术：
慢性肾病在我国和全球的发病率已超过10％，慢性肾病可经肾脏纤维化过程进展至终末期肾衰竭，也可伴随严重的心血管病变，因此危害严重，遗憾的是对于慢性肾病目前仍无较好的方法阻止其进展。器官纤维化是器官受到不良因素侵害而后修复过程中产生的，是器官疤痕，器官纤维化将导致器官衰竭。众多研究表明TGF‐β1诱导的Smad3磷酸化是介导多种器官纤维化的主要病理机制之一，因此抑制尤其是选择性抑制Smad3活化是抗纤维化的关键，也是目前研究的热点，但相关分子药物仍比较缺乏，我们的发明即着眼于此。
灵芝在中国传统文化中被称为仙草，也是被世界称为可治疗百病的药材，足见其药理作用广泛。本发明的研发思路是肯定这一事实，并在中医“久病必虚”，“久病及肾”，“虚则补之”的理论指导下，近些年系统地开展了补益药灵芝抗肾病研究，有了诸多研究新发现和新发明。现有技术中未见有本发明涉及的化合物及其功能的相关报道。
发明内容：
本发明对赤芝(Ganoderma lucidum)的子实体进行了更深入研究，发现了灵芝呋喃A及其抗慢性肾病或抗器官纤维化作用，本发明的目的在于提供具有抗慢性肾病或抗肾脏纤维化或抗器官纤维化的化合物灵芝呋喃A(Lingzhifuran A)及其该发明的化合物在制备抗慢性肾病和/或抗肾脏纤维化和/或抗器官纤维化的药物中的应用，以及以该化合物为有效成分的药物组合物。本发明的另一目的还在于提供制备灵芝呋喃A的天然分离方法和化学合成工艺。
本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：
下述结构式所示的灵芝呋喃A(1)，
制备灵芝呋喃A的方法，取赤芝，粉碎，用95％乙醇回流提取，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，该萃取物经200‐300目硅胶柱层析，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50的氯仿‐甲醇系统梯度洗脱，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集得7个合并组份，其中组分2经MCI gel CHP20P柱层析，甲醇‐水35％-100％，梯度变化程序为5％，洗脱得组分2.1-2.11，其中组分2.5经Sephadex LH‐20甲醇洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，然后经RP‐18柱层析，甲醇－水,40％–60％得8个组份2.5.1-2.5.8，组份2.5.6经Sephadex LH‐20甲醇洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，再经半制备HPLC，甲醇‐水，65％纯化得灵芝呋喃A(1)。
制备灵芝呋喃A的方法，以对羟基苯甲醚和3‐氯‐2‐氟苯甲腈为原料，包括下述步骤：
原料对羟基苯甲醚与3-氯-2-氟苯甲腈经缩合反应生成化合物2，
化合物2经分子内与氯苯直接芳基化生成化合物3，
化合物3经脱去甲基保护基生成化合物4，
化合物4经叔丁基二甲基硅基保护生成化合物5，
化合物5经还原反应生成化合物6，
1-溴-3-甲基-2-丁烯与亚磷酸三甲酯经ARBUZOV反应生成异戊烯基膦酸二甲酯，异戊烯基膦酸二甲酯再经烯丙位氧化生成化合物7，
化合物6与化合物7经HWE反应生成化合物8，
化合物8经脱去保护基生成灵芝呋喃A(1)，
治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的药物组合物，含有治疗有效量的灵芝呋喃A(1)和药学上可接受的载体。
所述的灵芝呋喃A(1)在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的药物中的应用。
所述的灵芝呋喃A(1)在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的保健食品中的应用。
本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经不同给药途径给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。
附图说明：
图1表示化合物灵芝呋喃A抑制TGF‐β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化作用。A：灵芝呋喃A的mRNA水平抗肾脏纤维化作用，分组从左至右分别为：对照组(不加TGF‐β1和受试药物)，1(10μM)组(不加TGF‐β1，只加1的药物组，TGF‐β1+1(0μM)组，TGF‐β1+1(1μM)组，TGF‐β1+1(3μM)组，TGF‐β1+1(10μM)组；B：灵芝呋喃A的蛋白水平抗肾脏纤维化作用，分组从左至右分别为：对照组(不加TGF‐β1和受试药物)，1(10μM)组(不加TGF‐β1，只加1的药物组，TGF‐β1+1(0μM)组，TGF‐β1+1(1μM)组，TGF‐β1+1(3μM)组，TGF‐β1+1(10μM)组。
图2预防给药，二个剂量时(50mg/kg，100mg/kg)化合物灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化效果。A：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用，HE，Masson染色检测肾脏组织纤维化程度，图中左为假手术组(sham)，中为阳性对照组(vehicle)，右为用药组；B：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用(mRNA水平)；C和D：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用(蛋白水平)，图中左为假手术组(sham)，中为阳性对照组(vehicle)，右为用药组。
图3治疗性给药时，100mg/kg剂量时化合物灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化效果。A：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用，HE，Masson染色检测肾脏组织纤维化程度，图中左为假手术组(sham)，中为阳性对照组(vehicle)，右为用药组；B：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用(mRNA水平)；C和D：灵芝呋喃A在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型上的抗肾脏纤维化作用(蛋白水平)，图中左为假手术组(sham)，中为阳性对照组(vehicle)，右为用药组。
图4化合物灵芝呋喃A选择性抑制TGF‐β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化作用。图4a：灵芝呋喃A抑制Smad3而非Smad2的磷酸化；图4b：A：灵芝呋喃A不抑制Smad4，Smad7的表达；B：灵芝呋喃A对ERK，PI3K，p38蛋白的磷酸化水平无抑制作用。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1：
化合物1的分离纯化：
取赤芝(80kg)，粉碎，用95％乙醇回流提取(2x 360L x 2h)，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，该萃取物经硅胶(200‐300目)柱层析，氯仿－甲醇系统梯度(99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50)洗脱，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集得7个合并组份。其中组分2(55g)经MCI gelCHP 20P柱层析，甲醇－水(35％-100％，梯度变化程序为5％)洗脱得组分2.1-2.11。其中组分2.5(3.2g)经Sephadex LH‐20(甲醇)洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，然后经RP‐18柱层析(甲醇－水，40％–60％)得8个组份(2.5.1-2.5.8)。组份2.5.6(450mg)经Sephadex LH‐20(甲醇)洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，再经半制备HPLC(甲醇－水，65％)纯化得1(2.5mg)。
化合物1的结构确证：
化合物1的结构式如下所示：
化合物1的结构鉴定数据：
Table 1.1H(400MHz)and 13C(200MHz)NMR data of 1in acetone‐d6(δin ppm,Jin Hz).
灵芝呋喃A(Lingzhifuran A)(1).Yellow solid；UV(MeOH)λmax(logε)349(4.15),321(4.22)256(4.02),213(4.27)nm；ESI‐MS m/z 277[M–H]-；HRESI‐MSm/z 278.0942[M]+(calcd for C18H14O3,278.0943)；1H and 13C NMR data,see Table.ROESY图谱中H‐6’与H‐8’的相关及H‐5’与H‐9’的相关表明了化合物1的构型特征。
实施例2：
制备灵芝呋喃A的方法，以对羟基苯甲醚和3‐氯‐2‐氟苯甲腈为原料，包括下述步骤：
原料对羟基苯甲醚与3-氯-2-氟苯甲腈经缩合反应生成化合物2：
化合物2经分子内与氯苯直接芳基化生成化合物3：
化合物3经脱去甲基保护基生成化合物4：
化合物4经叔丁基二甲基硅基保护生成化合物5：
化合物5经还原反应生成化合物6：
1-溴-3-甲基-2-丁烯与亚磷酸三甲酯经ARBUZOV反应生成异戊烯基膦酸二甲酯，异戊烯基膦酸二甲酯再经烯丙位氧化生成化合物7：
化合物6与化合物7经HWE反应生成化合物8：
化合物8经脱去保护基生成灵芝呋喃A(1)：
具体步骤如下：
化合物2的合成：将对羟基苯甲醚(0.558g，4.5mmol)、3‐氯‐2‐氟苯甲腈(0.622g，4.0mmol)、碳酸钾(0.828g，6.0mmol)加入反应瓶中，加入25mL乙腈，加热回流8小时。经薄层析检测，反应基本完全，停止加热，使反应液降至室温。减压旋蒸除去乙腈，用乙酸乙酯萃取2次，每次20mL，合并2次乙酸乙酯萃取液，先用3M的氢氧化钠水溶液(15mL)洗，再用饱和食盐水(15mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩乙酸乙酯萃取液，得淡黄色油状物，经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯，20:1洗脱)纯化，得0.820g白色粉末2，产率79％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ:7.69(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),7.60(dd,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.26(dd,J＝8.1,7.8Hz，1H),6.83(m,4H),3.78(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:155.6,153.7,151.1,135.6,132.4,129.5,126.0,116.9,114.8,114.7,109.7,55.7.
化合物3的合成：将化合物2(0.800g，3.1mmol)、碳酸钾(0.650g，4.7mmol)、醋酸钯(0.028g，0.13mmol，4mol％)、三环己基膦四氟硼酸盐(0.100g，0.27mmol，8mol％)加入双口反应瓶中，用氩气置换反应体系中的空气，加入预先脱气的N,N‐二甲基乙酰胺(20mL)，加热至140℃，反应15小时。经薄层析检测，反应基本完全，停止加热，使反应液自然冷却至室温。将反应液倒入50mL去离子水中，乙酸乙酯萃取2次，每次30mL,合并2次乙酸乙酯萃取液，先用去离子水洗2次，每次15mL，然后用饱和食盐水(20mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得黄色固体，经硅胶柱层析(石油醚：二氯甲烷，2:1洗脱)纯化，得0.590g白色粉末3，产率86％。1H NMR(400MHz,DMSO‐d6)δ:8.51(d,J＝7.7Hz,1H),8.00(d,J＝7.6Hz,1H),7.83(d,J＝2.6Hz,1H),7.77(d,J＝9.0Hz,1H),7.56(dd,J＝7.7,7.6Hz,1H),7.20(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),3.89(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO‐d6)δ:156.4,156.0,150.2,131.0,126.9,125.3,123.6,123.1,116.9,115.1,112.8,104.8,95.4,55.9.EIMS m/z 223[M]+.
化合物4的合成：将化合物3(0.580g，2.6mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，冰浴降温至0℃，滴加2M三溴化硼的二氯甲烷溶液(2.5mL，5.0mmol)，滴加完30分钟后，让反应液自然升至室温，反应12小时。经薄层析检测，反应完全，冰浴降温至0℃，滴加去离子水淬灭反应。减压旋蒸除去二氯甲烷，乙酸乙酯萃取3次，每次50mL，合并3次乙酸乙酯萃取液，先用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)洗，饱和食盐水(30mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得黄白色固体4(0.540g)。所得粗产物不经纯化直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,acetone‐d6)δ:8.68(s,1H),8.37(d,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.88(dd,J＝7.7,1.2Hz,1H),7.60(d,J＝8.9Hz,1H),7.57(d,J＝2.6,1H),7.53(dd,J＝7.8,7.7Hz,1H),7.14(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H)；13CNMR(100MHz,acetone‐d6)δ:157.4,155.3,151.2,131.4,126.9,126.6,124.5,124.0,117.9,115.5,113.2,107.2,97.0；HREIMS m/z 209.0484[M]+(calcd.for C13H7NO2,209.0477).
化合物5的合成：将化合物4(0.520g，2.5mmol)溶于无水N,N‐二甲基甲酰胺(10mL)，室温下，加入叔丁基二甲基氯硅烷(0.450g，3mmol)，咪唑(0.340g，5mmol)。反应过夜，经薄层析检测，反应完全。将反应液倒入30mL去离子水中，乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并2次乙酸乙酯萃取液，用去离子水洗2次，每次15mL，然后用饱和食盐水(15mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得黄色油状物，经硅胶柱层析分离(石油醚：丙酮，15:1洗脱)纯化，得0.650g白色粉末5，产率81％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.11(dd,J＝7.8,1.2Hz,1H),7.70(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.52(d,J＝8.8Hz,1H),7.39(dd,J＝7.8,7.6Hz,1H),7.37(d,J＝2.6Hz,1H),7.04(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),1.03(s,9H),0.24(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:156.9,152.3,151.5,130.4,125.8,125.5,123.6,122.7,121.4,115.1,112.6,111.2,96.6,25.7,18.2,‐4.4；HREIMS m/z 323.1337[M]+(calcd.for C19H21NO2Si,323.1342).
化合物6的合成：将化合物5(0.323g，1.0mmol)溶于无水甲苯(20mL)中，冰浴降至0℃，氩气保护下滴加1.1M二异丁基氢化铝的环己烷溶液(1.2mL，1.3mmol)，0℃下反应15分钟。薄层析检测，体系中有少量的原料剩余，加入饱和酒石酸钾钠水溶液20mL淬灭反应，继续搅拌反应液3小时。乙酸乙酯萃取2次，每次20mL，合并2次乙酸乙酯萃取液，用饱和食盐水(15mL)洗，无水硫酸钠干燥。减压浓缩得淡黄色固体，经硅胶柱层析(石油醚：二氯甲烷，3:1洗脱)纯化，得0.252g白色粉末6，产率77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.58(s,1H),8.15(d,J＝7.6Hz,1H),7.94(d,J＝7.7Hz,1H),7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.45(dd,J＝7.7,7.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.6Hz,1H),7.03(dd,J＝8.8,2.6Hz,1H),1.03(s,9H),0.25(s,6H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:188.5,156.7,152.0,151.7,127.5,126.7,126.3,123.5,122.6,121.3,120.9,112.4,111.0,25.7,18.2,‐4.4；HREIMS m/z 326.1325[M]+(calcd.forC19H22O3Si,326.1338).
化合物7的合成：将1‐溴‐3‐甲基‐2‐丁烯(21g，140.9mmol)、亚磷酸三甲酯(25g，176mmol)加入反应瓶中，先在30℃下反应2小时，再在70℃反应2小时，然后在110℃下反应过夜。停止反应，减压旋蒸除去反应液中过量的亚磷酸三甲酯，减压蒸馏得异戊烯基膦酸二甲酯19g。将所得的异戊烯基膦酸二甲酯(8g，44.9mmol)溶于二氯甲烷中，加入二氧化硒(4.94g，44.9mmol)，70％过氧叔丁醇(20mL)，加热回流80小时，停止加热，冷却至室温后加入饱和硫代硫酸钠水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取4次，每次150mL，合并乙酸乙酯萃取液，无水硫酸钠干燥。浓缩得暗红色油状物，经硅胶柱层析(乙酸乙酯洗脱)，得无色油状化合物7(2.85g)，产率63％。1H NMRδ:9.46(s,1H),6.53‐6.47(m,1H),3.80(s,3H),3.77(s,3H),2.96(d,J＝8.0Hz,1H),2.90(d,J＝8.0,1H),1.81(d,J＝3.0,3H)。
化合物8的合成：将上述所得的化合物6(0.240g0.74mmol)，化合物7(0.170g，0.89mmol)加入反应瓶中，氩气保护下，加入无水四氢呋喃，冰浴降温至0℃，加入60％氢化钠(0.036g，0.89mmol)，0℃下反应30分钟。经薄层析检测，反应基本完全，加入饱和氯化铵水溶液淬灭反应。用乙酸乙酯萃取2次，每次15mL，合并2次乙酸乙酯萃取液，用饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸钠干燥。浓缩得黄色固体，经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷，20:1:2洗脱)纯化得0.260g黄色粉末8，产率90％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.56(s,1H),7.86(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.77(dd,J＝15.6,11.3Hz,1H)7.55(d,J＝7.5Hz,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.37(d,J＝2.5Hz,1H),7.33(dd,J＝7.6,7.5Hz,1H),7.31(d,J＝15.6Hz,1H),7.11(d,J＝11.3Hz,1H),7.00(dd,J＝8.8,2.5Hz,1H),2.04(s,3H),1.04(s,9H),0.25(s,6H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:194.8,154.7,151.8,151.2,149.1,138.2,135.5,126.7,126.6,125.2,124.4,122.8,121.4,121.4,120.3,112.1,111.1,25.7,18.3,9.9,‐4.4；HREIMS m/z 392.1805[M]+(calcd.for C24H28O3Si,392.1808).
灵芝呋喃A(1)的合成：将化合物7(0.250g，0.64mmol)溶于8mL无水四氢呋喃中，滴加1M四丁基氟化铵四氢呋喃溶液(0.8mL)，室温下反应2小时。经薄层析检测，反应完全，滴加3M盐酸淬灭反应。调节反应液的pH值至4左右，乙酸乙酯萃取2次，每次20mL,合并乙酸乙酯萃取液，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。浓缩得深黄色固体，重结晶得灵芝呋喃A，深黄色粉末0.150g，产率85％。1H NMR(400MHz,acetone‐d6)δ:9.59(s,1H),8.46(br,1H),8.02(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.93(dd,J＝15.6,11.3Hz,1H),7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.58(d,J＝8.8Hz,1H),7.52(d,J＝2.6Hz,1H),7.47(d,J＝15.6Hz,1H),7.39(dd,J＝7.6,7.6Hz,1H),7.32(d,J＝11.3Hz,1H),7.08(dd,J＝8.8,2.6Hz),2.00(d,J＝1.2Hz,3H)；13C NMR(150MHz,acetone‐d6)δ:194.9,155.3,154.8,151.0,149.3,139.1,135.7,127.7,127.6,126.0,125.2,123.9,122.3,122.3,116.8,112.9,106.8,9.7.HRESIMS m/z 277.0872[M-H]-(calcd.for C18H13O3,277.0865).
实施例3：
实施例1或2所得化合物灵芝呋喃A(1)，按常规法加注射用溶媒，精滤，灌封灭菌后制成注射液。
实施例4：
实施例1或2所得化合物灵芝呋喃A(1)，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例5：
实施例1或2所得化合物灵芝呋喃A(1)，按常规法配以各种药用辅料制成片剂或胶囊剂。
使用灵芝呋喃A(1)，作为药物活性成分，使用几种常规赋形剂作为制备组合药物片剂或胶囊剂的辅料成分，按照常规方法制成每片或每粒胶囊含有药物成分10‐300mg的样品。
实施例6：
取实施例1或2的方法制得的化合物灵芝呋喃A(1)1份，10份植脂末，混匀，按照常规方法制成固体饮料。
实施例7：
本发明化合物灵芝呋喃A(1)的体外抗肾脏纤维化作用。
实验方法：参照文献(Journal of the American Society of Nephrology 2015,26,1827–1838)报道的方法进行。采用的细胞类型为大鼠肾小管上皮细胞(NRK‐52E)，培养基为含10％胎牛血清的DMEM(Gibco,Life Technologies)，灵芝呋喃A用DMSO溶解。NRK‐52E细胞采用图1中标识的浓度，TGF‐β1刺激的浓度为10ng/mL，常规培养，分组。灵芝呋喃A与细胞共孵育1小时(预防性给药)，然后用TGF‐β1刺激36或48小时，刺激完毕后(48小时)，提取细胞总蛋白，采用免疫印迹法(Western Blot)检测纤维化指标α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)蛋白水平；或刺激完毕后(36小时)采用实时荧光定量PCR(real‐time PCR)检测纤维化指标α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的mRNA表达水平变化。统计方法为ANOVA.
实验结果：图1A显示，与阳性对照组相比，灵芝呋喃A可浓度依赖性地降低TGF‐β1介导的NRK‐52E细胞α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的mRNA表达水平。图1B表明，与阳性对照组相比，灵芝呋喃A可浓度依赖性地降低TGF‐β1介导的NRK‐52E细胞α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的蛋白表达水平。
实施例8：
本发明化合物灵芝呋喃A(1)的体内抗肾脏纤维化作用(预防性给药)。
实验方法：参照文献(Journal of the American Society of Nephrology 2015,26,1827–1838；CN 201210111642.X)报道的方法进行。采用的大鼠体重为200‐250g，随机分组，共4组，每组6只，sham为假手术组，vehicle为阳性对照组，其它为不同剂量给药组。UUO(单侧输尿管梗阻)模型按照文献(Journal of the American Society of Nephrology2015,26,1827；CN 201210111642.X；Journal of the American Society of Nephrology2002,13,2464)成熟的方法常规制备。灵芝呋喃A用PBS作为溶媒制成均匀的混悬液，灌胃给药，每日一次，剂量如图2所示，制备UUO模型时即行给药，饲养14天后处死动物。取各组肾脏组织，分别进行HE，Masson染色，α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)免疫组化染色、mRNA及蛋白表达水平分析。
实验结果：图2A显示，二个灵芝呋喃A用药组的大鼠肾间质炎症细胞浸润明显低于阳性对照组；用药组的大鼠肾间质的胶原沉积也明显低于阳性对照组。图2B显示，与阳性对照组相比，灵芝呋喃A可剂量依赖性地降低梗阻肾α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的mRNA表达水平。图2C和2D的免疫组化染色及免疫印迹法(Western Blot)表明，灵芝呋喃A可降低梗阻肾肾小管的α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的蛋白表达水平。
实施例9：
本发明化合物灵芝呋喃A(1)体内抗肾脏纤维化作用(治疗性给药)。
实验方法：参照文献(Journal of the American Society of Nephrology 2015,26,1827–1838；CN 201210111642.X)报道的方法进行。采用的大鼠体重为200‐250g，随机分组，共3组，每组6只，sham为假手术组，vehicle为阳性对照组，其它为100mg/kg剂量给药组。UUO(单侧输尿管梗阻)模型按照文献(Journal of the American Society of Nephrology2015,26,1827；CN 201210111642.X；Journal of the American Society of Nephrology2002,13,2464)成熟的方法常规制备。灵芝呋喃A用PBS作为溶媒制成均匀的混悬液，灌胃给药，每日一次，剂量如图3所示，制备UUO模型后的第七天开始给药，饲养14天后处死动物。取各组肾脏组织，分别进行HE，Masson染色，α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)免疫组化染色、mRNA及蛋白表达水平分析。
实验结果：图3A显示，灵芝呋喃A用药组的大鼠肾间质炎症细胞浸润明显低于阳性对照组；用药组的大鼠肾间质的胶原沉积也明显低于阳性对照组。图3B显示，与阳性对照组相比，灵芝呋喃A可降低梗阻肾α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的mRNA表达水平。图3C和3D的免疫组化染色及免疫印迹法(Western Blot)表明，灵芝呋喃A可降低梗阻肾肾小管的α‐SMA，纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原(collagen I)的蛋白表达水平。
实施例10：
本发明化合物灵芝呋喃A(1)对TGF‐β1介导的NRK‐52E细胞Smad3磷酸化水平的抑制作用。
实验方法：参照文献(Journal of the American Society of Nephrology 2015,26,1827–1838；CN 201310577167.X)报道的方法进行。采用的细胞类型为大鼠肾小管上皮细胞(NRK‐52E)，培养基为含10％胎牛血清的DMEM(Gibco,LifeTechnologies)，灵芝呋喃A用DMSO溶解。NRK‐52E细胞采用图4中标识的浓度，TGF‐β1刺激的浓度为10ng/mL，常规培养，分组。灵芝呋喃A与细胞共孵育1小时(预防性给药)，然后用TGF‐β1刺激1小时，刺激完毕后，提取细胞总蛋白，采用免疫印迹法(Western Blot)检测Smad2，Smad3磷酸化水平，Smad4，Smad7蛋白表达水平及p38，PI3K，ERK的磷酸化水平。统计方法为ANOVA。
实验结果：图4a显示，与阳性对照组相比，灵芝呋喃A可浓度依赖性地降低TGF‐β1介导的NRK‐52E细胞Smad3磷酸化，而对Smad2磷酸化水平无影响。图4b的A图显示，灵芝呋喃A对TGF‐β1介导的NRK‐52E细胞Smad4，Smad7表达无影响，图4b的B图显示，灵芝呋喃A对p38，PI3K，ERK的磷酸化水平也无明显影响。
综上所述，灵芝呋喃A无论体内外均可明显抑制肾脏组织纤维化；NRK‐52E细胞上灵芝呋喃A还可选择性抑制Smad3磷酸化水平，提示其对于包括肾脏纤维化在内的器官纤维化的治疗作用。

Claims (6)

1.下述结构式所示的灵芝呋喃A(1)，
2.制备权利要求1所述的灵芝呋喃A的方法，取赤芝，粉碎，用95％乙醇回流提取，合并提取液并减压回收溶剂得粗提取物，将粗提取物混悬于水中，然后用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物，该萃取物经200‐300目硅胶柱层析，99:1，98:2，97:3，96:4，95:5，94:6，93:7，92:8，90:10，85:15，80:20，50:50的氯仿‐甲醇系统梯度洗脱，每种溶剂梯度为1.5倍柱体积，按照每份500mL收集得7个合并组份，其中组分2经MCIgel CHP 20P柱层析，甲醇‐水35％‐100％，梯度变化程序为5％，洗脱得组分2.1‐2.11，其中组分2.5经Sephadex LH‐20甲醇洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，然后经RP‐18柱层析，甲醇‐水,40％‐60％得8个组份2.5.1‐2.5.8，组份2.5.6经Sephadex LH‐20甲醇洗脱，TLC跟踪，合并相同斑点，再经半制备HPLC，甲醇‐水，65％纯化得灵芝呋喃A(1)。
3.制备权利要求1所述的灵芝呋喃A的方法，其特征在于，以对羟基苯甲醚和3‐氯‐2‐氟苯甲腈为原料，包括下述步骤：
原料对羟基苯甲醚与3-氯-2-氟苯甲腈经缩合反应生成化合物2，
化合物2经分子内与氯苯直接芳基化生成化合物3，
化合物3经脱去甲基保护基生成化合物4，
化合物4经叔丁基二甲基硅基保护生成化合物5，
化合物5经还原反应生成化合物6，
1-溴-3-甲基-2-丁烯与亚磷酸三甲酯经ARBUZOV反应生成异戊烯基膦酸二甲酯，异戊烯基膦酸二甲酯再经烯丙位氧化生成化合物7，
化合物6与化合物7经HWE反应生成化合物8，
化合物8经脱去保护基生成灵芝呋喃A(1)，
4.治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的灵芝呋喃A(1)和药学上可接受的载体。
5.权利要求1所述的灵芝呋喃A(1)在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的药物中的应用。
6.权利要求1所述的灵芝呋喃A(1)在制备治疗肾脏纤维化或慢性肾病或器官纤维化的保健食品中的应用。
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