CN117904191A - 一种荞麦开花基因flp1和flp2基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荞麦开花基因FLP1和FLP2基因的应用，属于基因工程技术领域，本发明通过采集早花型、中间型和晚花型荞麦始花期的花穗和叶片作为材料，进行转录组测序分析，通过对FLP类基因构建过表达载体和遗传转化验证，发现了荞麦开花基因FLP1、FLP2在花穗和叶片中具有高表达量。本发明具有促进荞麦开花时间提前，达到缩短生长期和增加产量的作用，有助于加快荞麦分子育种进程，加快优良广适品种的选育。

Description

一种荞麦开花基因FLP1和FLP2基因的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种荞麦开花基因FLP1和FLP2基因的应用。

背景技术

荞麦营养物质丰富，同时具有降血压、降血脂、降胆固醇、抗氧化等功效，有较高的药用价值，由荞麦加工制成的食品品类繁多，如荞麦面，苦荞茶等，深受人们喜爱。荞麦是一种短日照作物，喜冷凉气候，具有生育期短，耐贫瘠，经济效益高等优点，主要种植在高海拔地区，如四川、云南、贵州等山区。荞麦花期转换受到光周期、温度、养分等环境因素影响，开花时机往往会影响最终小花数，结实率和最终产量。由于荞麦品种开花和最终产量受当地气候环境影响较大，导致本地品种引种至其它种植区时，开花时间和产量容易出现波动，使得荞麦品种的种植范围有一定的地域限制性，严重制约了优良品种的大面积种植和推广。通过调控荞麦的开花时间，可以提高开花结实比例，有利于提高荞麦的区域适应性和产量。但目前关于荞麦开花基因的研究内容有限，发现新的控制荞麦开花的基因，将有利于荞麦开花结实和产量的提升。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种荞麦开花基因FLP1和FLP2基因的应用，以解决荞麦开花时间晚、影响产量的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种基因FLP1和FLP2在促进植物提前开花、缩短植物生长周期和增加植物产量方面的应用；基因FLP1和FLP2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，通过过表达基因FLP1和FLP2以促进植物提前开花、缩短植物生长周期和增加植物产量。

进一步，植物为荞麦。

本发明还公开了一种包含基因FLP1和FLP2的过表达载体。

本发明还公开了一种获得提前开花荞麦品种的方法，将基因FLP1和FLP2或过表达载体载入农杆菌，再侵染荞麦外植体，进行培育后，获得提前开花的荞麦品种。

本发明的有益效果为：本发明公开的荞麦开花基因FLP1、FLP2基因在具有不同开花时间的荞麦花穗和叶片中存在特异性表达，通过荞麦开花基因FLP1、FLP2基因的高表达量，具有促进荞麦开花时间提前，果荚数增加，达到缩短生长期和增加产量的作用，为荞麦分子育种及品种改良提供了方向。

附图说明

图1为FLP1、FLP2基因电泳图；

图2为FLP1、FLP2基因在不同开花时间荞麦花穗中的表达量图；

图3为FLP1、FLP2基因在不同开花时间荞麦叶片中的表达量图；

图4为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株PCR检测结果；

图5为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株基因表达量；

图6为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株同一时期的开花实物图；

图7为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株开花时间对比图；

图8为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株第一朵花开时间莲座叶数量对比图；

图9为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株收获时分枝数对比图；

图10为拟南芥转基因FLP1、FLP2植株与拟南芥野生型(WT)植株收获时果荚数对比图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1筛选目的基因

通过田间分期播种不同开花时间的荞麦进行实验，早花型XQ1开花早(28d左右)、生育期短(75d左右)；晚花型MQ开花晚(37d左右)、生育期长(105d左右)；而中间型KQ178的开花时间在32d左右，生育期在90d左右。发现不论是在春季播种还是秋季播种，早花型XQ1、中间型KQ178、晚花型MQ1荞麦的株高、一级分枝数、小花穗数都随着播种时间的推迟而逐渐减少，因此在荞麦的始花期，收集上述三个开花类型荞麦的花穗和顶端完全展开的两片真叶，以此为材料提取RNA进行通过illumina高通量测序。基于基因在各个样本中的Count值进行差异分析，以FPKM≥1，Fold change(差异倍数)≥4且FDR(错误发现率)<0.01作为差异基因的筛选的标准；通过基因共表达聚类分析和GO差及分析(GO q-value<0.05)进一步筛选差异基因，然后通过表达网络分析，最后发现FLP1和FLP2基因与荞麦开花时间有紧密关联。

从荞麦中分离的FLP类基因的CDS序列及其氨基酸序列如下所示。

(1)核苷酸序列

①FLP1基因CDS序列(SEQ ID NO：1)：

ATGCATTCACTGAAATCCCACAAAACAAAACAAAACAAAACACTTTTATTCCTAAGAATGCCGAGAGAGATCAGAGACCCTCTAACTGTAGGGAGAGTTGTAGGAGAAGTGTTGGATCCTTTCAATAGAACTATCCCTTTTCGCGTTATCTACACGGCTAGAGACATCGTCAATGGATGTGAGCTTAGGCCTTCTCAGGTCGTCACCCAACCTAGAGTCGAGGTCGGTGGCGATGATCTTCGCACTTTCTATACTCTCATAATGGTAGATCCTGATGCTCCTAGTCCAAGTGATCCACACCTAAGAGAATACTTGCACTGGTTGGTTACTGATATTCCAGCAACAACCGGAGCCACCTTTGGGCAAGAGGTGGTATGCTACGAGTGCCCACGACCGACGGTGGGGATCCACCGCTTTATATTCGTGCTATTCAGGCAACTTGGTCGCCAAACGGTATACGCTCCTGGTTGGCGCCAAAACTTCTGCACTCGAGATTTCGCCGAGCTGTACAATCTGGGTCTTCCCGCCGCCGCCGTCTACTTCAACTGCCAGAGGGAGGGTGGCTCAGGAGGCCGCCGCCGCTAG；

②FLP2基因CDS序列(SEQ ID NO：2)：

ATGGCAAGATCGAGAGATCCGCTGTTCGTAGGGAGAGTGGTTGGTGATGTGTTGGATCCTTTCACCAACACTATCCCCTTGAGGGTTTCTTACACCTCCCGTCATATCGTTAATGGTTCCGAGCTCAGGCCTTCTCAAGTGGTCACCCAACCTAGGGTTGAGATCGGTGGCGATGATCTTCGCACCTTTTACACTCTCGTGATGGTGGATCCTGATGCTCCTAGCCCAAGTAATCCAACCTTGAGAGAATACTTACACTGGTTGGTTACTGATATACCAGCAACTACAGGAACAACCTTTGGAAATGAGGTGTTGTGTTATGAGAGCCCAAGGCCAACCATGGGGATCCACCGCTTGGTGTTTGTGTTGTTCAGGCAGCTAGGGAGGCAAACGGTGTTCGCACCTGGGTGGCGTCAAAACTTCAACACCAGAGACTTCGCCGAGCTCTACAACCTCGGTTTGCCTGTTGCCGCCGTTTACTTCAACTGTCAGAGGGAAGGAGGTTGCGGTGGACGACGCCGTTATCCAGATCCATCTGTGTAA。

(2)蛋白序列

①FLP1蛋白序列(SEQ ID NO：3)：

MHSLKSHKTKQNKTLLFLRMPREIRDPLTVGRVVGEVLDPFNRTIPFRVIYTARDIVNGCELRPSQVVTQPRVEVGGDDLRTFYTLIMVDPDAPSPSDPHLREYLHWLVTDIPATTGATFGQEVVCYECPRPTVGIHRFIFVLFRQLGRQTVYAPGWRQNFCTRDFAELYNLGLPAAAVYFNCQREGGSGGRRR；

②FLP2蛋白序列(SEQ ID NO：4)：

MARSRDPLFVGRVVGDVLDPFTNTIPLRVSYTSRHIVNGSELRPSQVVTQPRVEIGGD DLRTFYTLVMVDPDAPSPSNPTLREYLHWLVTDIPATTGTTFGNEVLCYESPRPTMGIHRLV FVLFRQLGRQTVFAPGWRQNFNTRDFAELYNLGLPVAAVYFNCQREGGCGGRRRYPDPSV。

实施例2克隆荞麦开花基因FLP1和FLP2基因

取含有荞麦开花基因FLP1和FLP2基因的荞麦花序和叶片，用液氮快速研磨，按照TAKARA公司的Takara kit试剂盒说明书提取总RNA；以总RNA为模板参照Trans GeneBiotech公司的Prime Script RT reagent kit试剂盒说明书进行操作，反转成全长cDNA；以全长cDNA为模板，分别利用引物FLP1-F、FLP1-R、FLP2-F和FLP2-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得的目的片段长度分别为585bp和543bp。

反应体系的总体积为20μL，包括cDNA 1μL、上游引物和下游引物各0.5μL、2×EsTaq Master Mix 10μL，最后用ddH₂O 8μL，补足至20μL。

反应程序为：94℃下预变性4min，94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸30s，72℃下安全延伸5min，扩增37个循环。

所用引物序列如下：

FLP1-F：ATTCACTGAAATCCCACAAAACA(SEQ ID NO：5)；

FLP1-R：TCCCTCTGGCAGTTGAAGTAG(SEQ ID NO：6)；

FLP2-F：ATGGCAAGATCGAGAGATCC(SEQ ID NO：7)；

FLP2-R：CACAGATGGATCTGGATAACG(SEQ ID NO：8)；

FLP1、FLP2基因电泳图如图1所示。

实施例3荧光定量分析FLP基因的表达量

以全长cDNA为模板，利用qFLP1-F、qFLP1-R、qFLP2-F和qFLP2-R进行荧光定量，以FtH3作为内参基因。

反应体系的总体积为20μL，包括10μL qPCR Mix、2μL引物、2μL cDNA和6μL ddH₂O。

反应程序为：95℃下预变性30s，95℃下变性5s，60℃下延伸20s，扩增40个循环。

qFLP1-F：GGGCAAGAGGTGGTATGCTA(SEQ ID NO：9)；

qFLP1-R：ACCAGGAGCGTATACCGTTT(SEQ ID NO：10)；

qFLP2-F：TTATGAGAGCCCAAGGCCAA(SEQ ID NO：11)；

qFLP2-R：AGGCAAACCGAGGTTGTAGA(SEQ ID NO：12)；

结果如图2和图3所示，FLP1基因在早花型、中间型荞麦的花穗和叶片中表达量较高，而在晚花型品种中几乎不表达；FLP2基因在早花型、中间型荞麦的叶片中表达量较高，晚花型品种中叶片的表达量较低，在花穗中，FLP2基因在早花型和中间型的表达也高于在晚花型中的表达。说明FLP1和FLP2基因能促进荞麦开花。

实施例4重组质粒的构建

为了通过同源重组将目的片段连接到pEZR(K)-LN过表达载体上，对目的基因进行第二轮PCR操作，以上述回收的PCR产物为模板，利用引物LN-FLP1-F、LN-FLP1-R、LN-FLP2-F和LN-FLP2-R进行扩增，最终获得了有同源臂和含有HindⅢ和Kpn I酶切位点的目的片段。同时，用HindⅢ和Kpn I酶酶切过表达载体pEZR(K)-LN，回收载体片段，随后经同源重组连接、转化和测序后，获得可用于转化的过表达载体35S::FtFLP。

PCR反应体系的总体积为20μL，包括cDNA 1μL，上游引物和下游引物各0.5μL，2×FastPfu PCR SuperMaster Mix 10μL，最后用8μL ddH₂O补足至20μL。

PCR反应程序为：94℃下预变性4min，94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸35s，72℃下安全延伸5min，扩增30个循环。

酶切总体积为20μL，包括HindⅢ和Kpn I酶各0.5μL，空质粒pEZR(K)-LN 3μL，Buffer2μL，用14μL ddH₂O补足至20μL，在37℃下控温30min后，琼脂糖凝胶电泳并胶回收。

重组连接包括线性载体1.5μL，目的片段1μL，2×Easy Gene Assembly Mix 2.5μL；混匀后在50℃下保存15min，随后置于冰上2-3min，将连接产物转化进入大肠杆菌，采用菌液PCR的方法检测阳性克隆。

LN-FLP1-F：GGACACGCTCGAGCTCAAGCTTATGCATTCACTGAAATCCCAC(SEQ ID NO：13)；

LN-FLP1-R：CGGATCCCGGGCCCGCGGTACCAAGCGGCGGCGGCCTCCTGAGCCACCCTCCCTCTGGCAGTTGAAG(SEQ ID NO：14)；

LN-FLP2-F：GGACACGCTCGAGCTCAAGCTTATGGCAAGATCGAGAGAT(SEQ ID NO：15)；

LN-FLP2-R：CGGATCCCGGGCCCGCGGTACCAACACAGATGGATCTGGATA(SEQ ID NO：16)。

实施例5遗传功能验证

将FLP1和FLP2过表达载体导入拟南芥，观察拟南芥的开花时间，拟南芥遗传转化的方法步骤如下：

(1)将荞麦开花基因过表达载体35S::FtFLP1和35S::FtFLP2通过电击的方法转入至根癌农杆菌GV3101，获得转化物，取适量的转化物涂在含50mg/L Kan的YEB固体培养基上，倒置培养48h，长出单菌落；

(2)挑取培养基上的单菌落至含有50mg/L Kan的YEB液体培养基中，摇床震荡，在28℃、180rpm下培养，液体培养基浑浊后吸取1μL菌液为模板进行菌液PCR验证；将阳性克隆的菌液扩大培养至OD₆₀₀＝0.6，离心收集菌体，用等体积的渗透培养基进行重悬获得侵染液；渗透培养基成分包括：1/2MS，5％蔗糖，44nm L^-1 6-BA，0.005％ Silwet L-77，用KOH调至pH＝5.7；

(3)去除盛花期的拟南芥果荚，将拟南芥花序浸入侵染液中数秒，拿出来轻轻抖掉侵染液，随后将侵染后的植株进行避光保温保湿处理24h，再进行正常光照培养，待种子成熟后收获T0代种子；

(4)将收获的T0代种子消菌杀毒，然后种植在含有MS+50mg/L Kan的固体培养基内，并在4℃下黑暗春化3d，随即将培养皿置于长日照条件下(16h光照/8h黑暗，环境温度为光照22℃/黑暗18℃)的人工气候箱中，观察拟南芥的生长状况，阳性植株能在筛选培养基上正常生长，单株收获并种植T1代种子，同样条件下筛选获得阳性T2植株。

实施例6对转基因型拟南芥T2代植株和野生型植株PCR、qPCR鉴定

分别提取4周野生型和转基因拟南芥叶片中的DNA并进行PCR，引物为LN-test，将总RNA反转成cDNA，进行qPCR检测(以拟南芥UBQ10基因作为内参基因)。

PCR反应程序为：94℃下预变性4min，94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸35s，72℃下安全延伸5min，扩增30个循环。

如图4所示，转基因植株35S::FtFLP1和35S::FtFLP2检测结果为阳性，野生型植株WT检测结果为阴性。

如图5所示，FtFLP1和FtFLP2基因分别在转基因植株35S::FtFLP1和35S::FtFLP2中表现出高表达水平。

实施例7转基因型拟南芥T2代植株和野生型植株表型比对

(1)开花情况对比

如图6所示，荞麦开花基因FLP1、FLP2基因转化的拟南芥相比于野生型(WT)拟南芥提前开花。如图7和图8所示，野生型(WT)拟南芥在35天左右开第一朵花，且此时植株莲座叶的平均数量为12片；而转基因株系35S::FtFLP1在26天左右开第一朵花，此时植株莲座叶的平均数量为8片；转基因株系35S::FtFLP2在29天左右开第一朵花，此时植株莲座叶的平均数量为9片，说明荞麦开花基因FLP1、FLP2基因缩短了拟南芥的生育期，促进拟南芥提前开花。

(2)结果产量对比

如图9和图10所示，荞麦开花基因FLP1、FLP2基因转化的拟南芥相比于野生型(WT)拟南芥的分枝数和果荚数增加，野生型拟南芥的分枝数约为4个分枝，而转基因株系35S::FtFLP1和35S::FtFLP2的分枝数大约为6个；而相较于野生型拟南芥果荚数(113个左右)，转基因株系35S::FtFLP1株系的果荚数增加至157个左右，转基因株系35S::FtFLP1株系的果荚数增加至147个左右，说明荞麦开花基因FLP1、FLP2基因可以增加拟南芥分枝数及果荚数、提高产量。

Claims (5)

1.基因FLP1和FLP2在促进植物提前开花、缩短植物生长周期和增加植物产量方面的应用；所述基因FLP1和FLP2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过过表达基因FLP1和FLP2以促进植物提前开花、缩短植物生长周期和增加植物产量。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物为荞麦。

4.一种过表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的基因FLP1和FLP2。

5.一种获得提前开花荞麦品种的方法，其特征在于，将权利要求1所述的基因FLP1和FLP2或权利要求4所述的过表达载体载入农杆菌，再侵染荞麦外植体，进行培育后，获得提前开花、缩短生长周期和产量增加的荞麦品种。