CN117821609A - 一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及疾病检测技术领域，具体公开了一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒及其检测方法。一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针。另外，本申请的检测方法包括以下步骤：S1、提取血浆样本中的总游离DNA；S2、以步骤S1中的总游离DNA为模板，使用预混PCR体系制备PCR扩增体系；S3、使用液滴生成仪制备油包水微滴体系；S4、微滴体系进行PCR扩增；S5、检测PCR扩增后液滴FAM通道和VIC通道的荧光强度，并进行数据分析，其具有准确度高，操作简便，敏感度高及成本低的优点。
Description
技术领域
本申请涉及疾病检测技术领域，更具体地说，它涉及一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒及其检测方法。
背景技术
棘球蚴病(Echinococcosis)又称包虫病(Hydatidosis)。该病不仅是传播最广泛的寄生虫病之一，也是公共卫生方面治疗和预防费用最高的疾病之一，呈地方性流行，是由棘球属的绦虫的幼虫寄生于人或动物机体组织所引发的传染病。采取早期诊断、早期治疗以及积极防治动物传染源的综合性防治措施，对控制包虫病对人类健康和畜牧业发展的影响十分重要。
包虫病的诊断目前主要依靠于B超、影像学检查和病理学检查等。因方法自身限制，易造成小病灶、非典型病灶的误诊和漏诊。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的包虫检测方法。随着分子生物学技术的发展，近年来出现了一系列检测包虫病的新方法，如多重PCR检测法、粪抗原ELISA法、粪DNA检测方法等。ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低。
目前在包虫病检测方面已开发了多种PCR检测方法，Trachsel,D.等开发了一种多重PCR来区分多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫和带绦虫的感染；Shang等开发了多重PCR检测方法，用于3种棘球绦虫的特异性和敏感性检测。“液体活检”作为体外诊断的一个分支，是指一种非侵入式的体液测试。目前针对于血液、尿液、唾液等样本的细胞外游离DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产前检测及肿瘤靶向药物指导等相关领域应用。但循环游离DNA的检测能否用于包虫病分型诊断仍是一个问题，2018年法国科学家检测了多房棘球蚴感染动物模型及泡型包虫病患者体内游离DNA的中Em的ND5和U1的表达情况，结果显示在沙鼠模型中ND5和U1广泛存在(8/9)，而在人体的研究中仅22.58％(7/31)的患者体内能够检出上述基因。发明人发现通过高通量测序技术能够有效检出病人血浆中的包虫游离DNA，灵敏度可达，特异性达。但是高通量测序存在成本高、技术难度大等问题，难以推广。
发明内容
本申请中U1snRNA基因在GenBank数据库中的基因编号为M73768.1；CYTB基因在GenBank数据库中的基因编号为AB461399.1。
为了提高检测结果的敏感度、准确度，降低成本，本申请提供一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒及其检测方法
本申请提供的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒及其检测方法采用如下的技术方案：
第一方面，本申请提供一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
U1snRNA基因上游引物U1snRNA-F：5′-ACCACGTGAGACAGATTGCAT-3′，
U1snRNA基因下游引物U1snRNA-R：5′-CGAAATGGCCAGAGGTGAGA-3′，
U1snRNA基因探针U1snRNA-P：5′-VIC-CTGCAGTGAACCACACAGTTGC-BHQ1-3′；
CYTB基因上游引物CYTB-F：5′-ACCTTGGCGTCAGATGTC-3′，
CYTB基因下游引物CYTB-R：5′-CCAACCAACGGCAAACTATC-3′，
CYTB基因探针CYTB-P：5′-FAM-TGGGCTGCCACTGTCCTTACTTCA-BHQ1-3′；
人内源基因上游引物RpolyA-F：5′-TGAAGCCGTGCGGAAGG-3′，
人内源基因下游引物RpolyA-R：5′-ACAAGAGAGCCAAGTGTCG-3′，
人内源基因探针RpolyA-P1：
5′-FAM-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′，
人内源基因探针RpolyA-P2：
5′-VIC-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′。
优选的，所述探针U1snRNA-P序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针CYTB序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
优选的，所述探针RpolyA-P1序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针RpolyA-P2序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
优选的，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲体系中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
优选的，所述试剂盒中引物终浓度为800nM，探针终浓度为100nM-400nM。
第二方面，本申请提供一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，采用如下的技术方案：
一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取血浆样本中的总游离DNA；
S2、以步骤S1中的总游离DNA为模板，使用预混PCR体系制备PCR扩增体系；
S3、使用液滴生成仪制备油包水微滴体系；
S4、微滴体系进行PCR扩增；
S5、使用液滴检测仪检测PCR扩增后液滴FAM通道和VIC通道的荧光强度，并使用机器自带软件进行数据分析，识别CYTB基因、U1snRNA基因和人内源基因阳性的液滴。
优选的，步骤S2中制备PCR扩增体系时反应引物终浓度为800nM，CYTB基因探针终浓度为333nM，U1snRNA基因探针终浓度为200nM，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nM，预混液体积20μL，模板DNA体积10μL。
优选的，步骤S4中进行PCR扩增时以U1snRNA-F、U1snRNA-R、CYTB-F、CYTB-R引物对为引物，以RpolyA-F、RpolyA-R对为质控引物，以U1snRNA-P、CYTB-P、RpolyA-P1、RpolyA-P2为探针进行PCR扩增反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火、延伸1min，共50个循环。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、准确度高，本发明根据多房棘球绦虫病原体DNA特异位点设计引物和探针，能够准确检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA。
2、操作简便，本发明将区分多房棘球蚴人源基因的引物探针进行预混，可以在一个反应中同时完成对细粒棘球绦虫的检测和对人源样本进行DNA提取质量评价，可以大批量快速筛查多房棘球蚴感染。
3、敏感度高，本发明从样品中提取DNA作为模板，采用目前检测灵敏度最高的数字PCR技术，可以对样本中微量虫源DNA进行不同靶点的扩增并达到检出的水平。
4.成本低，原先的检测试剂盒和设备价格昂贵，而本申请中的试剂盒价格相对便宜，能使大众普遍接受。
附图说明
图1是本申请中空白对照检测结果图；
图2是本申请中阴性对照检测结果图；
图3是本申请中阳性对照检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图1-3和实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
U1snRNA基因上游引物U1snRNA-F：5′-ACCACGTGAGACAGATTGCAT-3′，
U1snRNA基因下游引物U1snRNA-R：5′-CGAAATGGCCAGAGGTGAGA-3′，
U1snRNA基因探针U1snRNA-P：5′-VIC-CTGCAGTGAACCACACAGTTGC-BHQ1-3′；
CYTB基因上游引物CYTB-F：5′-ACCTTGGCGTCAGATGTC-3′，
CYTB基因下游引物CYTB-R：5′-CCAACCAACGGCAAACTATC-3′，
CYTB基因探针CYTB-P：5′-FAM-TGGGCTGCCACTGTCCTTACTTCA-BHQ1-3′；
人内源基因上游引物RpolyA-F：5′-TGAAGCCGTGCGGAAGG-3′，
人内源基因下游引物RpolyA-R：5′-ACAAGAGAGCCAAGTGTCG-3′，
人内源基因探针RpolyA-P1：
5′-FAM-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′，
人内源基因探针RpolyA-P2：
5′-VIC-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′。
所述探针U1snRNA-P序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针CYTB-P序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
所述探针RpolyA-P1序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针RpolyA-P2序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲体系中的一种或多种。
所述试剂盒还包括标准阳性模板。
所述试剂盒中引物终浓度为800nM，探针终浓度为150nM。
实施例2
一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
U1snRNA基因上游引物U1snRNA-F：5′-ACCACGTGAGACAGATTGCAT-3′，
U1snRNA基因下游引物U1snRNA-R：5′-CGAAATGGCCAGAGGTGAGA-3′，
U1snRNA基因探针U1snRNA-P：5′-VIC-CTGCAGTGAACCACACAGTTGC-BHQ1-3′；
CYTB基因上游引物CYTB-F：5′-ACCTTGGCGTCAGATGTC-3′，
CYTB基因下游引物CYTB-R：5′-CCAACCAACGGCAAACTATC-3′，
CYTB基因探针CYTB-P：5′-FAM-TGGGCTGCCACTGTCCTTACTTCA-BHQ1-3′；
人内源基因上游引物RpolyA-F：5′-TGAAGCCGTGCGGAAGG-3′，
人内源基因下游引物RpolyA-R：5′-ACAAGAGAGCCAAGTGTCG-3′，
人内源基因探针RpolyA-P1：
5′-FAM-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′，
人内源基因探针RpolyA-P2：
5′-VIC-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3′。
所述探针U1snRNA-P序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针CYTB-P序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
所述探针RpolyA-P1序列的5′标记为FAM报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针RpolyA-P2序列的5′标记为VIC报告荧光基团，3′端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲体系中的一种或多种。
所述试剂盒还包括标准阳性模板。
所述试剂盒中引物终浓度为800nM，探针终浓度为100nM-400nM。
实施例3
样本：泡型包虫病病人血浆
DNA提取：使用QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit(50)试剂盒
数字PCR仪：TD-1数字PCR平台
试剂耗材：微滴样本制备通用试剂盒、微滴检测通用试剂盒
一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，包括以下步骤：
S1、提取血浆样本中的总游离DNA；具体操作步骤如下：
S101、2mL离心管中加入1mL血浆样本、30μL Magnetic Bead Suspension、55μLProteinase K、150μL Bead Binding Buffer；室温缓慢颠倒混匀10min；200g离心30s后，将2mL离心管置于磁力架上至少1min至溶液澄清。
S102、吸弃上清，向离心管中加入200μL Bead Elution Buffer，涡旋混匀，将离心管置于振荡器上300r/min，震荡5min；将2mL离心管置于磁力架上至少1min至溶液澄清，转移上清至新的2mL离心管中。
S103、向上清中加入300μL Buffer ACB，并涡旋混匀。
S104、将上步得到的溶液加入到QIAamp UCP MinElute吸附柱中并6000g离心1min。
S105、更换新的收集管，向吸附柱中加入500μL buffer ACW2，6000g离心1min。
S106、更换新的收集管，20000g离心3min，将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，打开吸附柱盖子56℃干燥3min。
S107、加入30μL超纯水到吸附膜的中心，室温静置1min，20000g离心1分钟。短时间保存于4℃，长时间保存于-80℃。
S2、以步骤S1中的总游离DNA为模板，使用预混PCR体系制备PCR扩增体系。
其中，以反应引物终浓度为800nM，CYTB基因探针终浓度为333nM，U1snRNA基因探针终浓度为200nM，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nM，预混液体积20μL，模板DNA体积10μL。
S3、使用液滴生成仪制备油包水微滴体系。
S4、微滴体系进行PCR扩增；进行PCR扩增时以U1snRNA-F、U1snRNA-R、CYTB-F、CYTB-R引物对为引物，以RpolyA-F、RpolyA-R对为质控引物，以U1snRNA-P、CYTB-P、RpolyA-P1、RpolyA-P2为探针进行PCR扩增反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火、延伸1min，共50个循环。
S5、使用液滴检测仪检测PCR扩增后液滴FAM通道和VIC通道的荧光强度，并使用机器自带软件进行数据分析，识别CYTB基因、U1snRNA基因和人内源基因阳性的液滴。
检测方法
使用试剂盒中配置好的预混液，其中反应引物终浓度为800nM，CYTB基因探针终浓度为333nM，U1snRNA基因探针终浓度为200nM，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nM，预混液体积20μL，模板DNA体积10μL，其中以水为空白对照，以仅含有约300copies/μL的人内标基因片段为阴性对照，以含有约300copies/μL的人内标基因片段、30copies/μLU1snRNA基因片段和约100copies/μL CYTB片段的质控物为阳性对照，混匀后使用液滴生成仪制备油包水微滴体系；使用芯片阅读仪检测PCR扩增后液滴FAM通道和VIC通道的荧光强度，并使用机器自带软件进行数据分析，识别CYTB基因、U1snRNA基因和人内源基因阳性的液滴。
经数字PCR法检测的样本均经测序法检测，以对比数字PCR法的效果。结果见附表1，与高通量测序结果的符合率可达90％。
参照图1-3，由于在反应体系中不同探针的浓度不同，故而不同阳性组合的液滴具有不同的荧光强度，进而能在2D的荧光强度图中呈现出不同阳性组合的液滴群，从而区分液滴中所具有的靶序列的种类。
附表1.数字PCR法与测序法检测包虫cfDNA对比
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，包括用于检测多房棘球绦虫DNA的两组U1snRNA基因和CYTB基因的引物、探针及人内源基因的内质控引物、探针，所述引物、探针的序列如下：
U1snRNA基因上游引物U1snRNA-F：5´-ACCACGTGAGACAGATTGCAT-3´，
U1snRNA基因下游引物U1snRNA-R：5´-CGAAATGGCCAGAGGTGAGA-3´，
U1snRNA基因探针U1snRNA-P：5´-VIC-CTGCAGTGAACCACACAGTTGC-BHQ1-3´；
CYTB基因上游引物CYTB-F：5´-ACCTTGGCGTCAGATGTC-3´，
CYTB基因下游引物CYTB-R：5´-CCAACCAACGGCAAACTATC-3´，
CYTB基因探针CYTB-P：5´-FAM-TGGGCTGCCACTGTCCTTACTTCA-BHQ1-3´；
人内源基因上游引物RpolyA-F：5´-TGAAGCCGTGCGGAAGG-3´，
人内源基因下游引物RpolyA-R：5´-ACAAGAGAGCCAAGTGTCG-3´，
人内源基因探针RpolyA-P1：
5´-FAM-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3´，
人内源基因探针RpolyA-P2：
5´-VIC-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ1-3´。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述探针U1snRNA-P序列的5´标记为VIC报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针CYTB-P序列的5´标记为FAM报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述探针RpolyA-P1序列的5´标记为FAM报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团；所述探针RpolyA-P2序列的5´标记为VIC报告荧光基团，3´端标记物为BHQ1淬灭荧光基团。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR反应缓冲体系中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物终浓度为800nM，探针终浓度为100nM-400nM。
7.一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取血浆样本中的总游离DNA；
S2、以步骤S1中的总游离DNA为模板，使用预混PCR体系制备PCR扩增体系；
S3、使用液滴生成仪制备油包水微滴体系；
S4、微滴体系进行PCR扩增；
S5、使用液滴检测仪检测PCR扩增后液滴FAM通道和VIC通道的荧光强度，并使用机器自带软件进行数据分析，识别CYTB基因、U1snRNA基因和人内源基因阳性的液滴。
8.根据权利要求7所述的一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，步骤S2中制备PCR扩增体系时反应引物终浓度为800nM，CYTB基因探针终浓度为333nM，U1snRNA基因探针终浓度为200nM，人内源基因探针1和人内源基因探针2终浓度均为100nM，预混液体积20μL，模板DNA体积10μL。
9.根据权利要求7所述的一种血浆中多房棘球绦虫游离DNA的检测方法，其特征在于，步骤S4中进行PCR扩增时以U1snRNA-F、U1snRNA-R、CYTB-F、CYTB-R引物对为引物，以RpolyA-F、RpolyA-R对为质控引物，以U1snRNA-P、CYTB-P、RpolyA-P1、RpolyA-P2为探针进行PCR扩增反应，反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火、延伸1min，共50个循环。
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|---|---|---|---|
| CN202311851042.1A CN117821609A (zh) | 2023-12-28 | 2023-12-28 | 一种用于检测血浆中多房棘球绦虫游离dna的试剂盒及其检测方法 |
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2023
- 2023-12-28 CN CN202311851042.1A patent/CN117821609A/zh active Pending
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