CN117821251A - 一种种子菌粉及其制备普洱熟茶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种种子菌粉及其制备普洱熟茶的方法，属于普洱茶发酵加工技术领域，该种子菌粉的制备方法为：普洱熟茶加水浸泡，收集浸泡液；将浸泡液与悬浮培养液混合培养，收集悬浮培养物。本发明经实验证实，将种子菌粉接入毛茶中，按照传统渥堆发酵方法制备的普洱熟茶，相较于接种有益菌种或者自然发酵的熟普产品，茶样的水浸出物、茶多酚总量、氨基酸总量、咖啡碱含量及没食子酸、可溶性糖含量和茶黄素、茶红素含量更高，茶褐素含量偏低，产品的品质更佳；并且，种子菌粉的制备工艺简单可行，成本较低，且能明显促进普洱熟茶的产品质量，为普洱熟茶的工业化生产提供新思路。

Description

一种种子菌粉及其制备普洱熟茶的方法

技术领域

本发明涉及普洱茶发酵加工技术领域，特别是涉及一种种子菌粉及其制备普洱熟茶的方法。

背景技术

普洱茶是以在云南省地理标志保护范围内的大叶种茶树鲜叶为原料，经过特殊加工工艺加工而成具有独特品质特征的植物性饮品。根据其制作工艺和品质特征的不同可分为普洱生茶和普洱熟茶。普洱生茶是没有经过发酵的晒青毛茶蒸压成型，可通过自然发酵转化为普洱陈茶，可以通过人工发酵变成熟茶。普洱熟茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料，在适宜的温度和湿度条件，由微生物作用进行渥堆发酵的黑茶类。加工工艺可概括为：晒青毛茶经潮水、固态发酵、风干、精制后得到普洱散茶，或经过蒸压制成饼状等样式，属于典型的后发酵茶。

在普洱熟茶的各个加工环节中，渥堆发酵是影响普洱熟茶品质特征形成的重要步骤。在渥堆发酵过程中微生物在高温高湿的条件下，以茶叶中的物质为反应基质，与各种酶协同作用发生一些系列的生物化学反应，使茶汤颜色由浅变深，口感由鲜爽变醇厚，香气由清香变陈香。普洱熟茶加工离不开微生物的参与，但由于各茶厂生产条件不一，加工技术不一，往往导致部分熟普产品风味欠佳，霉味明显，更为严重的是，这种熟普饮用后会对人体健康带来种种隐患。目前，有采用外源接入有益菌种辅助发酵生产品质更佳的普洱熟茶的研究报道，但是，优势菌种种类繁多，选择何种菌种或者组合菌种能在渥堆发酵中无多余不良菌种的生长，提高产品质量稳定性，这一过程并无标准化规程，且不同有益菌种，导致发酵程度不同，使公众对普洱茶的安全性持怀疑态度。同时有益菌种成本相对较高，不利于普洱熟茶大范围的推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种种子菌粉及其制备普洱熟茶的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的种子菌粉的制备工艺简单可行，成本较低，且能明显促进普洱熟茶的产品质量，为普洱熟茶的工业化生产提供新思路。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种发酵普洱熟茶的种子菌粉的制备方法，包括以下步骤：

普洱熟茶加水浸泡，收集浸泡液；

将浸泡液与悬浮培养液混合培养，收集悬浮培养物；

所述悬浮培养液是将马铃薯加水煮沸，过滤取滤液，将滤液与糖混匀，即得。

进一步地，所述普洱熟茶按照茶水质量比1：(40-60)加水浸泡，浸泡时间为4-6h。

进一步地，所述浸泡液与所述悬浮培养液的质量比为1：(50-70)，所述混合培养的时间为20-25h，温度为20-30℃。

进一步地，所述悬浮培养液的配制方法具体如下：

称取马铃薯250g，切块加水1000ml，加热至沸腾，维持25min，过滤取滤液，向滤液中补充水至1250ml，加入蔗糖25g，搅拌均匀，灭菌即可。

本发明还提供一种利用所述制备方法获得的种子菌粉。

本发明还提供一种利用所述种子菌粉制备普洱熟茶的方法，包括在毛茶中添加所述种子菌粉的步骤。

进一步地，所述种子菌粉和所述毛茶的质量比为1：(10000-100000)。

进一步地，在毛茶中添加所述种子菌粉之后，按照传统渥堆发酵方法制备普洱熟茶。

本发明还提供一种根据所述的方法制备的普洱熟茶。

本发明公开了以下技术效果：

本发明对符合国家标准且不会导致腹泻的普洱熟茶的浸泡液进行悬浮培养，获得的悬浮培养物经冻干后即为发酵生产普洱熟茶的种子菌粉，实验证实，将种子菌粉接入毛茶中，按照传统渥堆发酵方法制备的普洱熟茶，相较于接种有益菌种或者自然发酵的熟普产品，茶样的水浸出物、茶多酚总量、氨基酸总量、咖啡碱含量及没食子酸、可溶性糖含量、茶黄素和茶红素含量更高，茶褐素含量偏低，产品的品质更佳。并且，种子菌粉的制备工艺简单可行，成本较低，且能明显促进普洱熟茶的产品质量，为普洱熟茶的工业化生产提供新思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为熟普微生物分类学系统组成树状图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1一种利用种子菌粉发酵加工普洱熟茶的方法

S1.制备种子菌粉：选择按传统方法渥堆发酵加工工艺制备的，且符合国家标准并经过动物试验证实不会导致腹泻的普洱熟茶为茶样(由广州允和堂茶业有限公司提供)。将茶样按照茶水质量比1:50进行冷水浸泡5h，去茶渣，对浸泡液开展悬浮培养；

悬浮培养液配制方法如下：称取去皮马铃薯250g，切小块放入锅中，加蒸馏水1000ml，在电磁炉上加热至沸腾，维持25min，成泥状后，用2层纱布趁热过滤至量杯，补充蒸馏水至1250ml，加入蔗糖25g，搅拌均匀，导入三角瓶中，密封，放入高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌20min，稍放凉后装入培养瓶中备用。

将浸泡液和悬浮培养液以质量比为1:50混合进行悬浮培养，悬浮培养时间24h，温度为30℃。收集悬浮培养物，经冷冻干燥获得粉状物，即为种子菌粉。

S2.加工普洱熟茶：向杀菌处理后的晒青毛茶中添加种子菌粉，晒青毛茶与种子菌粉的质量比为100000：1，之后加水增湿至含水量为35％，将增湿的毛茶平铺于木质发酵槽中，在毛茶表面覆一层纱布，再在纱布上松散放置一层湿稻草，控制发酵温度为28℃，空气相对湿度为60％，毛茶发酵20h后进行初次翻堆，初次翻堆28h后进行第二次翻堆，二次翻堆38h后进行第三次翻堆，第三次翻堆每隔40h后进行一次翻堆，持续4次；最后将发酵后的普洱茶平摊于自然环境中自然干燥，干燥时间75h，即得普洱熟茶。

实施例2一种利用种子菌粉发酵加工普洱熟茶的方法

S1.制备种子菌粉：选择按传统方法渥堆发酵加工工艺制备的，且符合国家标准并经过动物试验证实不会导致腹泻的普洱熟茶为茶样(由广州允和堂茶业有限公司提供)。将茶样按照茶水质量比1:60进行冷水浸泡4h，去茶渣，对浸泡液开展悬浮培养；

悬浮培养液配制方法如下：称取去皮马铃薯250g，切小块放入锅中，加蒸馏水1000ml，在电磁炉上加热至沸腾，维持25min，成泥状后，用2层纱布趁热过滤至量杯，补充蒸馏水至1250ml，加入蔗糖25g，搅拌均匀，导入三角瓶中，密封，放入高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌20min，稍放凉后装入培养瓶中备用。

将浸泡液和悬浮培养液以质量比为1:70混合进行悬浮培养，悬浮培养时间20h，温度为20℃。收集悬浮培养物，经冷冻干燥获得粉状物，即为种子菌粉。

S2.加工普洱熟茶：向杀菌处理后的晒青毛茶中添加种子菌粉，晒青毛茶与种子菌粉的质量比为10000:1，之后加水增湿至含水量为30％，将增湿的毛茶平铺于木质发酵槽中，在毛茶表面覆一层纱布，再在纱布上松散放置一层湿稻草，控制发酵温度为28℃，空气相对湿度为70％，毛茶发酵24h后进行初次翻堆，初次翻堆25h后进行第二次翻堆，二次翻堆30h后进行第三次翻堆，第三次翻堆每隔42h后进行一次翻堆，持续2次；将发酵后的普洱茶平摊于自然环境中自然干燥，干燥时间85h，即得普洱熟茶。

实施例3一种利用种子菌粉发酵加工普洱熟茶的方法

S1.制备种子菌粉：选择按传统方法渥堆发酵加工工艺制备的，且符合国家标准并经过动物试验证实不会导致腹泻的普洱熟茶为茶样(由广州允和堂茶业有限公司提供)。将茶样按照茶水质量比1:40进行冷水浸泡6h，去茶渣，对浸泡液开展悬浮培养；

悬浮培养液配制方法如下：称取去皮马铃薯250g，切小块放入锅中，加蒸馏水1000ml，在电磁炉上加热至沸腾，维持25min，成泥状后，用2层纱布趁热过滤至量杯，补充蒸馏水至1250ml，加入蔗糖25g，搅拌均匀，导入三角瓶中，密封，放入高压蒸汽灭菌锅内，在121℃下灭菌20min，稍放凉后装入培养瓶中备用。

将浸泡液和悬浮培养液以质量比为1:50混合进行悬浮培养，悬浮培养时间25h，温度为25℃。收集悬浮培养物，经冷冻干燥获得粉状物，即为种子菌粉。

S2.加工普洱熟茶：向杀菌处理后的晒青毛茶中添加种子菌粉，晒青毛茶与种子菌粉的质量比为50000:1，之后加水增湿至含水量为40％，将增湿的毛茶平铺于木质发酵槽中，在毛茶表面覆一层纱布，再在纱布上松散放置一层湿稻草，控制发酵温度为28℃，空气相对湿度为60％，毛茶发酵22h后进行初次翻堆，初次翻堆27h后进行第二次翻堆，二次翻堆35h后进行第三次翻堆，第三次翻堆每隔40h后进行一次翻堆，持续3次；将发酵后的普洱茶平摊于自然环境中自然干燥，干燥时间80h，即得普洱熟茶。

对比例1

与实施例1相同，区别仅在于，省去S1步骤，在S2步骤中向杀菌处理后的晒青毛茶中添加青霉菌种。

对比例2

与实施例1相同，区别仅在于，省去S1步骤，在S2步骤中向杀菌处理后的晒青毛茶中添加酵母菌种。

对比例3

与实施例1相同，区别仅在于，省去S1步骤，在S2步骤中杀菌处理后的晒青毛茶未添加种子菌粉。

效果验证

一、对实施例1及对比例1-3制备的普洱熟茶进行品质检测

检测方法如下所示：

1茶叶含水量的测定

中华人民共和国国家标准GB/T 8304-2002:茶水分测定-----103℃恒重法。

2茶叶水浸出物测定

中华人民共和国国家标准GB/T 8305-2002:茶水浸出物测定-----全量法。

3茶多酚含量测定

中华人民共和国国家标准GB/T 8313-2008:茶叶中茶多酚的检测-----福林酚试剂法。

4茶叶游离氨基酸含量测定

中华人民共和国国家标准GB/T 8314-2002:茶游离氨基酸含量测定-----茚三酮显色法。

5茶叶可溶性糖测定

可溶性糖测定-----蒽酮硫酸比色法(汪东风等，1997)。

6茶叶茶黄素、茶红素、茶褐素含量的测定

茶黄素、茶红素、茶褐素的测定----系统分析法(黄意欢等，1995)

7茶叶生物碱的检测

参照中华人民共和国国家标准GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法，在此基础上采用实验室成熟的方法高效液相色谱HPLC(High PerformanceLiquid Chromatography)法同时检测咖啡碱和没食子酸含量。

8茶叶感官品质审评

参照中华人民共和国国家标准GB/T 23776-2018:黑茶(柱形杯审评法)。

9茶叶微生物分类测序方法

将普洱熟茶茶样分别称取20g，密封于塑料袋，送至生工生物(上海)股份有限公司进行高通量真菌ITS分类测序。

二、结果与分析

1感官审评结果

表1熟普样品感官审评

茶叶的感官审评可以从直观上判断茶叶的品质，是判断茶叶品质的常用方式。水浸出物含量的高低直接影响茶叶的品质，一般与茶叶品质成正相关；茶多酚是茶叶的主要呈味物质，决定茶汤滋味浓强或者醇和；茶色素包括茶黄素、茶红素和茶褐素，是茶汤的主要呈色物质，茶黄素是茶汤“亮”的主要成分；茶红素是茶汤“红”的主要成分；茶褐素是茶汤“褐”的主要成分。表1中，实施例1利用种子菌发酵制备的普洱熟茶汤色较对比例1-3茶样的深、浓且明亮，外形、响起及滋味均显著优于对比例1-3，且感官评分最高，证实本研究采用种子菌辅助发酵的普洱熟茶品质更佳。

2生化成分结果分析

对熟普样品生化成分(包括含水量、水浸出物、茶多酚总量、氨基酸总量、茶黄素、茶红素、茶褐素)进行测定，结果如表2、表3所示。

表2熟普样品的生化成分测定

表3普洱样品茶黄素、茶红素、茶褐素含量测定

水浸出物是茶叶中能被热水浸出并可以检测到的物质，是茶汤的主要呈味物质。主要包括茶多酚、氨基酸、咖啡碱、可溶性糖等物质，在一定程度上可以反映茶叶品质的优劣。茶多酚是茶叶中的一种活性物质，是茶叶中多酚类物质及其衍生物的总称，一般占茶叶干物质量的15％～30％，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等，对茶叶色、香、味的形成起着重要作用。游离氨基酸含量是评判茶叶品质的重要指标之一，其含量与茶叶的鲜爽度密切相关。氨基酸在渥堆发酵过程中在微生物的作用下或者其自身直接参与美拉德等生化反应影响发酵过程，对茶叶滋味和香气的形成起着推动作用。

表2和表3结果显示，4种普洱熟茶的各生化成分相差不大，但种子菌发酵样的水浸出物、茶多酚总量、氨基酸总量、咖啡碱含量及没食子酸、可溶性糖含量和茶黄素、茶红素含量高于对比例1-3，茶褐素含量较对比例3低。可以看出，种子菌发酵制备的普洱熟茶相较于青霉菌或酵母菌发酵制备的茶样品质更佳，也比未添加外源菌种的传统方法渥堆发酵制备的茶样品质更为优异。

普洱熟茶的品质除了与原料相关以外，与加工过程中微生物群落的状况关系更为密切。本研究制备的种子菌粉为符合标准的普洱熟茶的浸泡液悬浮培养物，其中含有形成一款优质、安全普洱熟茶的整个微生物群落。在熟茶发酵过程中通过添加种子菌粉，优质、安全普洱熟茶的整个微生物群落能够迅速生长扩繁，可最大限度抑制有害菌的生长，进而提高普洱熟茶的品质和安全性。

3微生物分类测序结果

将传统方法渥堆发酵制备的茶样(对比例3，命名为样品1)和种子菌发酵制备的普洱熟茶(实施例1，命名为样品2)送检，进行微生物分类测序，对比两者微生物差异。

为了了解两个样品中微生物信息，按照序列相似性对其进行聚类操作，从样品1中分析出26个物种，种子菌发酵茶样(样品2)分析出25个物种，分属于10个属，分别是曲霉属Aspergillus、酵母属Blastobotrys、根霉属Rhizomucor、念珠菌属Candida、Rasamsonia、青霉属Penicillium、Thermomyces、汉森德巴利Debaryomyces、Clavispora、unclassifiedEurotiales。在样本中通过DNA序列测出的菌株两个茶样共有15个，共有菌株中曲霉属的：浅蓝灰曲霉Aspergillus caesiellus、unclassified Aspergillaceae、黄曲霉Aspergillus flavus、杂色曲霉Aspergillus versicolor；酵母属：Blastobotryschiropterorum；根霉属：Rhizomucor pusillus；念珠菌属：布朗克假丝酵母Candidablankii；Rasamsonia：埃默森蓝状菌Rasamsonia emersonii；青霉属：橘青霉Pencillium citrinum；Thermomyces：疏棉状菌Thermomyces lanuginosus；汉森德巴利属：汉巴德利酵母菌Debaryomyces hansenii；Clavispora：unclassified Clavispora；unclassified Eurotiales：unclassified Eurotiales。样品1的独有菌株是曲霉属的烟曲霉Aspergilus fumigatus。

普洱熟茶微生物丰度分析结果见图1，其中“1”为样品1，“2”为样品2，颜色的扇形面积越大，说明在该分支上该样品的丰度越高。

由图1可知，从门的水平来说，两种普洱熟茶的优势微生物都属于毛霉门和子囊菌门；从目水平来说，两种普洱熟茶的优势微生物属于酵母目和散子囊目，其中酵母目微生物丰度更高。在散子囊目中，样品1的发菌科微生物丰度远远高于种子菌发酵样，其中Thermomyces属和Rasamesonia属微生物丰度高于种子菌发酵样，两者是耐高温的嗜热菌。种子菌发酵茶样曲霉科微生物丰度高于样品1。酵母目两者差异不大。微生物种的水平上，样品1中的黄曲霉含量是样品2的50倍，杂色曲霉含量是样品2的36倍，根小微毛霉含量是样品2的5倍，烟曲霉为样品1独有。

以上结果证实，外源接种种子菌粉可显著抑制普洱熟茶中有害菌生长，富集优势菌群，进而提高普洱熟茶的品质和安全性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种发酵普洱熟茶的种子菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

普洱熟茶加水浸泡，收集浸泡液；

将浸泡液与悬浮培养液混合培养，收集悬浮培养物；

所述悬浮培养液是将马铃薯加水煮沸，过滤取滤液，将滤液与糖混匀，即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述普洱熟茶按照茶水质量比1：(40-60)加水浸泡，浸泡时间为4-6h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述浸泡液与所述悬浮培养液的质量比为1：(50-70)，所述混合培养的时间为20-25h，温度为20-30℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述悬浮培养液的配制方法具体如下：

称取马铃薯250g，切块加水1000ml，加热至沸腾，维持25min，过滤取滤液，向滤液中补充水至1250ml，加入蔗糖25g，搅拌均匀，灭菌即可。

5.一种利用权利要求1-4任一项所述制备方法获得的种子菌粉。

6.一种利用权利要求5所述种子菌粉制备普洱熟茶的方法，其特征在于，包括在毛茶中添加所述种子菌粉的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子菌粉和所述毛茶的质量比为1：(10000-100000)。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在毛茶中添加所述种子菌粉之后，按照传统渥堆发酵方法制备普洱熟茶。

9.一种根据权利要求6-8任一项所述的方法制备的普洱熟茶。