CN117757705A

CN117757705A - 可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株的构建及其应用

Info

Publication number: CN117757705A
Application number: CN202310501403.3A
Authority: CN
Inventors: 张科春; 黄浩; 倪梦寒; 王靖宇; 孙村民; 朱湘成
Original assignee: Element Driven Hangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Element Driven Hangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-03-26

Abstract

本发明涉及可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株的构建及其应用，可实现发酵法联合生产支链氨基酸(BCAA)如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。采用基因工程的方法获得基因工程菌株，所述基因工程菌株是通过在可生产异亮氨酸和/或缬氨酸的大肠杆菌宿主细胞中引入亮氨酸的合成途径，通过表达解除L‑亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuAm、异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD、芳香氨基酸转氨酶基因tyrB和亮氨酸外排蛋白基因leuE。最终实现两种或三种支链氨基酸的联产，而且联产工艺在总体葡萄糖的利用率上至少有30％以上的提高。本发明所述的基因工程菌株发酵周期短、产量高、转化率高，具有较高的生产应用价值。

Description

可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株的构建及其应用

技术领域

本发明属于生化工程领域，涉及用于联产支链氨基酸，如缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的基因工程菌及其应用。

背景技术

支链氨基酸(Branchedchainaminoacid，BCAA)是指α-碳上含有分支脂肪烃链的中性氨基酸，包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸，属于人和动物必需氨基酸。三种分支链氨基酸的生物合成途径，部分共享相同的前体物质和酶。支链氨基酸不能被高等动物自身合成，只能通过食物补充。支链氨基酸占必需氨基酸的40％，其足够的添加量及合理的比例对动物的正常发育十分重要。支链氨基酸的主要功能包括：细胞吸收能量增加，细胞活力提升，延缓细胞衰老，清除自由基，提升组织器官功能，抗疲劳，皮肤美容，提高心肺、心肌能力，提高心脑血管保护作用，降低脂肪，抗心力衰竭，骨骼肌合成以及提高免疫力。支链氨基酸在食品、医药、保健品、饲料、化妆品等领域均有着重要的应用。

L-缬氨酸(L-valine)可以补充营养，促进身体生长，提供能量。L-缬氨酸也可用于输液和注射液，促进外科创伤愈合。L-缬氨酸还是幼仔猪和肉鸡粗蛋白饲料中五种限制性氨基酸之一，其长期缺乏对动物生长性能会产生不利影响。近些年，作为一种重要的饲料日粮氨基酸品种，L-缬氨酸需求量持续增加。饲料级L-缬氨酸的出口量达到3万吨以上，年均增长率20％，市场前景非常良好。L-亮氨酸(L-leucine)在刺激肌肉蛋白合成和维持葡萄糖稳态中具有重要作用。L-亮氨酸也被用作一种调味剂和片剂生产的润滑剂。L-异亮氨酸(L-isoleucine)具有促进体内蛋白质、酶和肽类激素合成等功能，在具有各种生理功能的生命代谢过程中起重要作用，被广泛应用于饲料、医药、食品等行业。

支链氨基酸的生产方法有提取法、化学合成法、微生物发酵法等。提取法和化学合成法由于原料来源受限，生产成本高，难以实现工业化生产。与其他大部分L-氨基酸的生产相似，微生物发酵法是当前工业生产支链氨基酸的主要方法。微生物发酵法原料成本低，反应条件温和，容易实现大规模生产。但是，目前我国以微生物发酵法生产BCAA的技术尚不成熟，发酵水平不高，导致发酵周期长，产酸偏低，杂酸多，成为影响我国支链氨基酸产业化应用的首要因素。特别是由于L-亮氨酸及L-异亮氨酸的合成途径长、反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。

微生物发酵法生产支链氨基酸是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过菌株诱变选育出各种营养缺陷型或氨基酸结构类似物抗性突变株，如粘质赛氏杆菌、乳糖发酵短杆菌、谷氨酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、黄色短杆菌、大肠杆菌等，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累支链氨基酸的目的。

迄今为止，提高支链氨基酸生产菌株的L-支链氨基酸产量，一方面取决于所选突变菌株是否具备大量积累L-支链氨基酸的潜在能力；另一方面取决于发酵生产环境条件和技术工艺。因此，改造优良的L-支链氨基酸发酵菌株并优化技术工艺，提高菌种产酸能力、简化提取工艺，对提高国内L-支链氨基酸产品生产竞争力具有重要经济价值。

发明内容

本发明在可生产异亮氨酸和/或缬氨酸的大肠杆菌宿主细胞中引入亮氨酸的合成途径，通过表达解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuAm、异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD、芳香氨基酸转氨酶基因tyrB和亮氨酸外排蛋白基因leuE，得以实现三种支链氨基酸的联产。本发明的具体方面包括：

本发明第一方面提供：一种可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株，所述菌株表达：

1)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸合成；

2)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化α-异丙基苹果酸异构反应β-异丙基苹果酸；

3)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化β-异丙基苹果酸脱氢生成α-酮异己酸；

4)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化芳香氨基酸转氨至α-酮异己酸生成亮氨酸；

以及：

5)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸；优选地，所述DNA分子为实质上解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因；进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因；

和/或

6)至少一个编码多肽的DNA分子，该DNA分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种；

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

在本发明的具体实施方式中，所述1)的DNA分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA，优选地，为解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为G479C突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuAm。

在本发明的具体实施方式中，所述2)的DNA分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD。

在本发明的具体实施方式中，所述3)的DNA分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB。

在本发明的具体实施方式中，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB。

在本发明的具体实施方式中，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因(tdcB)、苏氨酸转运蛋白基因、支链氨基酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

本发明第二方面提供：联产缬氨酸与亮氨酸的工程菌株，所述菌株表达：

优选地，所述1)的DNA分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA，优选地，为解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为G479C突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuAm；

优选地，所述2)的DNA分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD；

优选地，所述3)的DNA分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB；

优选地，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB；

以及

6)至少一个编码多肽的DNA分子，该DNA分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种；

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

本发明第三方面提供：联产亮氨酸和异亮氨酸或联产三种支链氨基酸的基因工程菌株，所述菌株表达：

优选地，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB；

以及

5)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸；优选地，所述DNA分子为实质上解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因；和/或，所述DNA分子为苏氨酸脱水酶的基因(tdcB)；

和

6)至少一个编码多肽的DNA分子，该DNA分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种；

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因(tdcB)、苏氨酸转运蛋白基因、支链氨基酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，至少下列基因ldhA、adhE、pta、poxB的活性分别或同时被减弱或消除。

如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、酵母(Yeast)、棒杆菌(Corynebacterium)或链霉菌(Streptomyces)。

如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收BCAA的能力，和或具有所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌BCAA的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸ABC转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnQ基因或抑制brnQ基因的表达；进一步优选地敲除或突变livJKHMGF基因的一个或多个或抑制livJKHMGF基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygaZH、brnEF、yjeH或LeuE的表达被增强，进一步优选，增强ygaZH、brnEF或yjeH表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。

如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株，所述工程菌株构建的方法包括质粒表达，基因组整合如CRISPR、lambda-red、噬菌体等介导的同源重组。

本发明第四方面提供：如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株在联产支链氨基酸中的应用，或制备含支链氨基酸的食品、保健品或饲料中的用途。

本发明第五方面提供：联产支链氨基酸的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在培养基中培养如本发明第一至三方面任一所述的基因工程菌株；

(ii)从(i)的培养物中分离支链氨基酸。

在本发明具体的实施方式中，所述培养基中加入能转化为2-酮丁酸的原料；优选地，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、二氨基丁酸中的一种或几种。

有益效果：

本发明实现了两种或三种支链氨基酸的联产，而且联产工艺在总体葡萄糖的利用率上至少有30％以上的提高；本发明所述的基因工程菌株发酵周期短、产量高、转化率高，具有较高的生产应用价值。

附图说明

图1：支链氨基酸(L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸)的生物合成路径(斜体代表催化该步生化反应的酶；下划线代表可以外加的发酵底物/原料)

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的合成方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

I术语定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。

本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。

替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。

如本文使用的和除非另作说明，术语“大约”指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±10％的变化，更优选±5％，甚至更优±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。

如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。

“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。

如本文所用，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“核酸构建体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。核酸构建体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。核酸构建体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。

除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。

如本文所用，术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。

如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCRTM等等克隆核酸序列，和合成手段。

在各个说明性实施例中，本文所设想的多核苷酸包含但不限于包括表达载体、病毒载体、转移质粒、表达盒的多核苷酸和编码细胞因子抗体或抗体片段或抗原结合片段的多肽的多核苷酸。

如本文别处公开的或如本领域已知的，不管编码序列自身的长度如何，多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、未转译区域(UTR)、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点、终止密码子、转录终止信号、转录后应答元件以及编码自切割多肽的多核苷酸、表位标签，从而使得其整体长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受限于容易制备和用于预期重组DNA方案。

如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。转移的核酸通常连接到例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。很多载体在本领域中是已知的，包含但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体、细菌噬菌体以及动物病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。

递送特定实施例中设想的多核苷酸的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体、DEAE-右旋糖酐介导的转移、基因枪和热休克等。

表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区域——复制起点、选择盒、启动子、增强子、转译起始信号内含子、转录后调节元件、聚腺苷酸化序列、5′和3′未转译区域——其与宿主细胞蛋白交互以进行转录和转译。此类元件的长度和特异性可以变化。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。

在特定实施例中，多核苷酸是包含但不限于表达载体和病毒载体的载体并且包含外源性、内源性或异源性控制序列，如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源性”控制序列是通过遗传操纵(即分子生物技术)置于与基因并置从而使得那个基因的转录由连接的增强子/启动子引导的序列。“异源性”控制序列是来自与倍遗传操纵的细胞不同的物种的外源性序列。“合成”控制序列可以包括一个或多个内源性和/或外源性序列的元件和/或提供最佳启动子和/或增强子活性以用于特定基因治疗的在体外或计算机模拟确定的序列。

如本文所用，术语“基因敲除”是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。将同源片段导入生物中也可以DNA电转化或噬菌体转导(如大肠杆菌)的方式实现。

如本文所用，术语“启动子”指代RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶引发并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。

术语“增强子”指代含有能够提供增强的转录并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的取向而起作用的序列的、DNA的区段。增强子可以与启动子和/或另一个增强子元件合作地或添加性地起作用。术语“启动子/增强子”指代含有能够提供启动子和增强子两者的功能的序列的DNA的片段。

术语“条件表达”可以指代任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。这个定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了感兴趣多核苷酸的条件表达，例如，表达通过使细胞、组织、生物体等经受使多核苷酸被表达或使感兴趣多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制。

术语“增强表达”或“表达被增强”是指采用如下方式的至少一个增加相应基因的表达量，或者增强相应酶或蛋白质的表达量，或者提高相应酶或者蛋白质的活性：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强；

6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。

诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如编码糖皮质激素或雌性激素受体的基因的启动子、金属硫蛋白启动子；MX-1启动子、“基因开关”米非司酮可调系统、四环素依赖性调节系统等。

在一些实施例中，基因修饰细胞包括进一步包含实现属于体外阴性选择性表型的细胞的选择的阳性标记的多核苷酸。阳性选择性标记可以是基因，所述基因在被引入宿主细胞时表达允许阳性选择携带基因的细胞的显性表型。这一类型的基因在本领域中是已知。

在一个实施例中，阳性选择性标记和阴性选择性标记相连接，使得阴性选择性元件的丧失还伴随着阳性选择性标记的丧失。在特定实施例中，阳性和阴性选择性标记相融合，使得一个的丧失必定导致另一个的丧失。

如本文所用的，术语“转染”或“转化”或“转导”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入受体菌株。“转染的”或“转化的”或“转导的”菌株是已经由外源核酸转染、转化或转导的菌株。该菌株包括原代和它的子代。

所述受体菌株可以是大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等。

II.试剂和方法

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为普遍市售商品，或者可以通过已知方法制备。

LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％，用30％NaOH调节pH7.2，1×10⁵Pa灭菌20min。制成平板时另加琼脂1.5％。抗性筛选时根据抗性基因种类加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素和/或50mg/L的卡那霉素。

氨基酸浓度的测定：L-异亮氨酸，L-亮氨酸及L-缬氨酸标准品均购自Sigma-Aldrich公司(www.sigmaaldrich.cn)。取1mL发酵液，10000r/min离心5min去除菌体，经孔径0.22μm的滤膜过滤所得滤液，稀释合适倍数后，用高效液相色谱HPLC法(https://www.agilent.com/library/applications/5990-4547EN.pdf)测定样品中的支链氨基酸浓度。高效液相色谱仪为岛津NexeraLC-40，色谱柱为AgilentZORBAXEclipsePlusC18，4.6×250mm5μm。检测器为DAD二极管阵列检测器，检测波长338nm，参比波长390nm。流动相组成，比例变化，流速及色谱柱温度均按照上述方法设置。

如无特殊说明，各实施例中涉及亮氨酸合成的相关基因(酶)如表1所示，涉及缬氨酸及异亮氨酸合成的相关基因(酶)如表2所示。

表1：各实施例所涉及亮氨酸合成的相关基因(酶)

表2：各实施例所涉及缬氨酸或异亮氨酸合成的相关基因(酶)

本发明构建的生物材料如下表：

表3：各实施例构建的生物材料

实施例

实施例1：重组质粒pZE-ilvIHDCmEygaZH、pZE-alsS-ilvDCmEygaZH、pZS-ilvAIH和pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE的构建

通过PCR分别从质粒pZE-ilvDCmEygaZH及pZA-ilvAIH上扩增得到ilvDCmEygaZH及ilvIH片段，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接基因片段至pZElac载体PCR片段上，获得重组质粒pZE-ilvIHDCmEygaZH。

通过PCR从Bacillussubtilis168基因组中克隆乙酰乳酸合成酶基因alsS(Genbank GeneID：936852)，另通过PCR分别从质粒pZE-ilvDCmEygaZH上扩增得到ilvDCmEygaZH片段，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接基因片段至pZElac载体PCR片段上，获得重组质粒pZE-alsS-ilvDCmEygaZH。

通过PCR从质粒pZA-ilvAIH上扩增得到ilvAIH片段，另通过PCR从质粒pZS-Pcsc-cscBKA(中国专利申请号2022116667471)上扩增pZSlac载体(pSC101复制子，壮观霉素抗性)片段，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接ilvAIH基因片段至pZSlac载体上，获得重组质粒pZS-ilvAIH。

以E.coliBW25113基因组为模板，分别PCR克隆得到leuABCD基因簇片段、芳香氨基酸转氨酶tyrB基因片段及亮氨酸外排蛋白leuE基因片段，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接基因片段至PCR得到的pZAlac载体片段上，得到重组质粒pZA-leuABCD-tyrB-leuE。以pZA-leuABCD-tyrB-leuE为模板，设计突变引物进行环化PCR，将异丙基苹果酸合成酶LeuA的479位甘氨酸突变为半胱氨酸，解除L-亮氨酸对LeuA的反馈抑制，得到重组质粒pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE。

质粒pZE-ilvCmDE-ygaZH和pZA-ilvAIH已在中国专利(公开号：CN114410701A)中提到并使用。

将pZE-ilvIHDCmEygaZH和pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE共转化至基于大肠杆菌BW25113(DSM27469/CGSC7636)背景的菌株DV10(ΔldhAΔptaΔpoxBΔadhEΔpflBΔmgsAΔfrdAΔdadAΔavtAΔilvE)(中国专利公开号：CN114410701A)菌株中，得到的菌株命名为M-LV1；将pZE-alsS-ilvDCmEygaZH和pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE共转化至大肠杆菌DV10菌株中，得到的菌株命名为M-LV2。同时将质粒pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE、pZE-ilvIHDCmEygaZH和pZE-alsS-ilvDCmEygaZH分别单质粒转化DV10菌株中得到对照菌株M-LC、M-VC1和M-VC2。

将pZE-ilvCmDE-ygaZH、pZS-ilvAIH和pZA-leuAmBCD-tyrB-leuE共转化至大肠杆菌DV10菌株中，得到的菌株命名为M-LIV。将pZE-ilvCmDE-ygaZH和pZS-ilvAIH共转化至大肠杆菌DV10菌株中得到对照菌株M-LIVC。

实施例2：重组菌株发酵联产支链氨基酸(亮氨酸和缬氨酸)

使用发酵培养基(葡萄糖4％、酵母提取物0.5％、MgSO₄0.12％、CaCl₂0.01％、NH₄Cl1％、NaCl0.05％、Na₂HPO40.6％、KH₂PO₄0.3％、VB10.0005％。用NaOH和盐酸调pH7.0～7.2，115℃灭菌15min)进行发酵。发酵过程及方法如下：将菌株M-LV1和M-LV2分别接入含有适当浓度的氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将LB培养物按照10％(V/V)接种量接入含有适当浓度抗生素的上述30mL发酵培养基的150mL摇瓶中(含有40g/LCaCO₃作为pH稳定剂)中，透气膜封口；在37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀为2，加入IPTG诱导(终浓度为0.3mM)，继续在30℃，220rpm条件下培养至48h停止发酵。各支链氨基酸产量见表4。根据发酵结果我们可以看到，尽管缬氨酸与亮氨酸在合成路径的上游是部分重叠的，但二者联产后在碳源(葡萄糖)的总利用率上实现了大幅提升；相比单产缬氨酸，联产时碳源(葡萄糖)的利用率提高了35.2％－41.6％；此外实际工业生产中，当缬氨酸与亮氨酸以最终的混合物产品形式(如饲料添加剂等)进行生产时，我们的菌株及工艺在能耗、人工、运营和分离等环节中会带来成本上的优势。

表4：实施例2中各菌株的支链氨基酸发酵结果

实施例3：重组菌株发酵联产支链氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)

使用发酵培养基(葡萄糖4％、苏氨酸2％、酵母提取物0.5％、MgSO₄0.12％、CaCl₂0.01％、NH₄Cl1％、NaCl0.05％、Na₂HPO40.6％、KH₂PO₄0.3％、VB10.0005％。用NaOH和盐酸调pH7.0～7.2，115℃灭菌15min)进行发酵。发酵过程及方法如下：将菌株M-LIV接入含有适当浓度抗生素的LB培养基中，于37℃下培养10h，转速240rpm。将LB培养物按照10％(V/V)接种量接入含有适当浓度的抗生素的上述30mL发酵培养基的250mL摇瓶中(含有40g/LCaCO₃作为pH稳定剂)中，透气膜封口；在37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀为2，加入IPTG诱导(终浓度为0.3mM)，继续在30℃，220rpm条件下培养至48h停止发酵。各支链氨基酸产量见表5。同实施例2类似，三种支链氨基酸的联产在碳源(葡萄糖)的总利用率上实现了大幅提升；联产时碳源(葡萄糖)的利用率提高了37.5％；此外实际工业生产中，当三种支链氨基酸以最终的混合物产品形式(如饲料添加剂等)进行生产时，同样我们的菌株及工艺在能耗、人工、运营和分离等环节中会带来成本上的节省。

表5：实施例3中各菌株的支链氨基酸发酵结果

Claims

1.一种可实现支链氨基酸联产的基因工程菌株，所述菌株表达：

以及：

5)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸，优选地为实质上解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因

和/或

6)至少一个编码多肽的DNA分子，该DNA分子为乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种；

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

2.如权利要求1基因工程菌株，所述1)的DNA分子为异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA，优选地，为解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因，进一步优选的为G479C突变的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuAm。

3.如权利要求1所述的基因工程菌株，所述2)的DNA分子为异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD。

4.如权利要求1所述的基因工程菌株，所述3)的DNA分子为异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB。

5.如权利要求1所述的基因工程菌株，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB。

6.联产缬氨酸与亮氨酸的工程菌株，所述菌株表达：

优选地，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB；

以及

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

7.联产异亮氨酸和亮氨酸或联产三种支链氨基酸的工程菌株，所述菌株表达：

优选地，所述4)的DNA分子为芳香氨基酸转氨酶基因tyrB；

以及

5)至少一个编码多肽的DNA分子，该多肽催化从苏氨酸生成丁酮酸，优选地为实质上解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因；和/或，该DNA分子为苏氨酸脱水酶的基因(tdcB)；

和

所述DNA分子至少一个的表达被增强。

8.如权利要求1-7任一项所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株进一步包括苏氨酸脱水酶基因(tdcB)、苏氨酸转运蛋白基因、支链氨基酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。

9.如权利要求1-8任一项所述的基因工程菌株，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，至少下列基因ldhA、adhE、pta、poxB的活性分别或同时被减弱或消除。

10.如权利要求1-9任一项所述基因工程菌株，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、酵母(Yeast)、棒杆菌(Corynebacterium)或链霉菌(Streptomyces)。

11.如权利要求1-10任一项所述基因工程菌株，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收BCAA的能力，和或具有所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌BCAA的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸ABC转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnQ基因或抑制brnQ基因的表达；进一步优选地敲除或突变livJKHMGF基因的一个或多个或抑制livJKHMGF基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygaZH、brnEF、yjeH或LeuE的表达被增强，进一步优选，增强ygaZH、brnEF或yjeH表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。

12.如权利要求1-10任一项所述基因工程菌株，所述工程菌株构建的方法包括质粒表达，基因组整合如CRISPR、lambda-red、噬菌体等介导的同源重组。

13.如权利要求1-13任一项所述基因工程菌株在联产支链氨基酸中的应用，或制备含支链氨基酸的食品、保健品或饲料中的用途。

14.联产支链氨基酸的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在培养基中培养如权利要求1-12任一项所述基因工程菌株；

(ii)从(i)的培养物中分离支链氨基酸。

15.如权利要求14所述的方法，所述培养基中加入能转化为2-酮丁酸的原料；优选地，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、2-氨基丁酸中的一种或几种。