CN114410701B - 高产l-异亮氨酸的基因工程菌及发酵法生产l-异亮氨酸的方法 - Google Patents

高产l-异亮氨酸的基因工程菌及发酵法生产l-异亮氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用发酵法以更高收率廉价制造L‑异亮氨酸的方法，采用基因工程的方法获得基因工程菌株，所述基因工程菌株包括实质上解除了L‑异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因和/或实质上解除了L‑异亮氨酸抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因；将所述基因工程菌株并进行发酵培养，培养过程中加入二酮丁酸或能转化为二酮丁酸的原料，培养结束后从培养物中分离出L‑异亮氨酸。本发明还公开了一种高产L‑异亮氨酸的基因工程菌株。

Description

高产L-异亮氨酸的基因工程菌及发酵法生产L-异亮氨酸的 方法
技术领域
本发明属于生化工程领域，涉及一种高产L-异亮氨酸的基因工程菌以及应用该菌种发酵生产L-异亮氨酸的方法。
背景技术
L-异亮氨酸又称“L-异白氨酸”，属于支链氨基酸(branched chain amino acid，BCAA)，是人与动物自身不能合成而必需以来外源供给的八大必需氨基酸之一，具有多种生理功能，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质生成和抑制其分解的效果，在人体生命活动中起着重要作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。
L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三种，而目前在工业生产上实施的只有发酵法。发酵法是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-异亮氨酸的的方法，包括添加前体发酵法和直接发酵法两类。其中添加前体发酵法又称微生物转化法，这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，在添加特异的前体物质以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效的转化为目的氨基酸。对于L-异亮氨酸，其前体物质主要有α-氨基丁酸、α-羟基丁酸、α-酮基丁酸和D-苏氨酸等，采用的微生物主要有芽孢杆菌、假单胞菌或粘质赛氏杆菌等。直接发酵法借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调解中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累某种氨基酸的目的。目前L-异亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌(黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等)诱变选育而来。
目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-异亮氨酸的生产，但仍存在菌株产酸水平低，发酵产物提取技术差等问题。因此，改进L-异亮氨酸的发酵菌株及技术工艺，提高产酸水平，进而降低提取难度，对提高国内L-异亮氨酸的产量及产品市场竞争力具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新型的基因工程菌株，通过添加苏氨酸的培养基培养该基因工程菌株以实现高产L-异亮氨酸的方法。
本发明所提供的具有L-异亮氨酸生产性的埃希氏杆菌属细菌的特征是保留含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的解除型ilvA基因或苏氨酸脱水酶tdcB基因和含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶的解除型(ilvIH、ilvBN，ilvGM，alsS)基因，以及异亮氨酸转运蛋白tdcC，以实现合成异亮氨酸所需的前体2-氧代丁酸的充分供应。
胞内的2-氧代丁酸与丙酮酸通过乙酰羟酸异构酶(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)/支链氨基酸脱氢酶(leuDH)的处理后，合成异亮氨酸。然后经过支链氨基酸转出蛋白ygaZH或brnEF运出细胞。其中ilvC可以为野生型的ilvC或突变版本的ilvCm，上述基因可以被保持在非染色体DNA或染色体DNA上。
本发明还提供了用发酵法制造L-异亮氨酸的方法，其特征是在培养基中添加苏氨酸，培养上述埃希氏杆菌属细菌，使L-异亮氨酸在该培养基中生成积累，而后从该培养基中提取出L-异亮氨酸。
具体实施方式
I.定义在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。如本文使用的和除非另作说明，术语“大约”指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±10％的变化，更优选±5％，甚至更优±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“核酸构建体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。核酸构建体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。核酸构建体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用，术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCRTM等等克隆核酸序列，和合成手段。
在各个说明性实施例中，本文所设想的多核苷酸包含但不限于包括表达载体、病毒载体、转移质粒、表达盒的多核苷酸和编码细胞因子抗体或抗体片段或抗原结合片段的多肽的多核苷酸。
如本文别处公开的或如本领域已知的，不管编码序列自身的长度如何，多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、未转译区域(UTR)、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点、终止密码子、转录终止信号、转录后应答元件以及编码自切割多肽的多核苷酸、表位标签，从而使得其整体长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受限于容易制备和用于预期重组DNA方案。
如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。转移的核酸通常连接到例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。很多载体在本领域中是已知的，包含但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体、细菌噬菌体以及动物病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。
递送特定实施例中设想的多核苷酸的说明性方法包含但不限于：电穿孔、声致穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪法、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体、DEAE-右旋糖酐介导的转移、基因枪和热休克等。
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区域——复制起点、选择盒、启动子、增强子、转译起始信号内含子、转录后调节元件、聚腺苷酸化序列、5′和3′未转译区域——其与宿主细胞蛋白交互以进行转录和转译。此类元件的长度和特异性可以变化。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。在特定实施例中，多核苷酸是包含但不限于表达载体和病毒载体的载体并且包含外源性、内源性或异源性控制序列，如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源性”控制序列是通过遗传操纵(即分子生物技术)置于与基因并置从而使得那个基因的转录由连接的增强子/启动子引导的序列。“异源性”控制序列是来自与倍遗传操纵的细胞不同的物种的外源性序列。“合成”控制序列可以包括一个或多个内源性和/或外源性序列的元件和/或提供最佳启动子和/或增强子活性以用于特定基因治疗的在体外或计算机模拟确定的序列。如本文所用，术语“启动子”指代RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶引发并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。
术语“增强子”指代含有能够提供增强的转录并且在一些情况下可以不依赖于其相对于另一个控制序列的取向而起作用的序列的、DNA的区段。增强子可以与启动子和/或另一个增强子元件合作地或添加性地起作用。术语“启动子/增强子”指代含有能够提供启动子和增强子两者的功能的序列的、DNA的片段。
术语“条件表达”可以指代任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。这个定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了感兴趣多核苷酸的条件表达，例如，表达通过使细胞、组织、生物体等经受使多核苷酸被表达或使感兴趣多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如编码糖皮质激素或雌性激素受体的基因的启动子、金属硫蛋白启动子；MX-1启动子、“基因开关”米非司酮可调系统、四环素依赖性调节系统等。
在一些实施例中，基因修饰细胞包括进一步包含实现属于体外阴性选择性表型的细胞的选择的阳性标记的多核苷酸。阳性选择性标记可以是基因，所述基因在被引入宿主细胞时表达允许阳性选择携带基因的细胞的显性表型。这一类型的基因在本领域中是已知。
在一个实施例中，阳性选择性标记和阴性选择性标记相连接，使得阴性选择性元件的丧失还伴随着阳性选择性标记的丧失。在特定实施例中，阳性和阴性选择性标记相融合，使得一个的丧失必定导致另一个的丧失。
如本文所用的，术语“转染”或“转化”或“转导”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入受体菌株。“转染的”或“转化的”或“转导的”菌株是已经由外源核酸转染、转化或转导的菌株。该菌株包括原代和它的子代。所述受体菌株可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。
在本申请说明书中，将编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的ilvA基因称为“解除型ilvA基因”，将含有编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的ilvIH基因称为“解除型ilvIH基因”。
II.具体实施方式
本发明的第一个方面，涉及一种多核苷酸分子，包括实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因可以是解除型ilvA基因。
或者，一种多核苷酸分子，包括实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因可以是解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种。
在一个具体实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因可以是解除型ilvIH基因。
在一个实施例中，本发明的一种多核苷酸分子，包括实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因和实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因。所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因、所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因如前所定义。
本发明所述的解除型ilvA基因与野生型ilvA基因不同，解除型ilvA基因相较于野生型ilvA基因发生变异，该变异是指解除了L-异亮氨酸对ilvA基因编码的反馈抑制的变异，例如L447F和/或L451A。
本发明所述的解除型ilvIH基因与野生型ilvIH基因不同。解除型ilvIH基因相较于野生型ilvIH基因发生变异，该变异是指解除了L-异亮氨酸对ilvH基因编码的反馈抑制的变异，例如G14D和/或S17F。
前述任一种多核苷酸分子，还可以包括苏氨酸脱水酶的基因(例如tdcB基因)、苏氨酸转运蛋白的基因(例如tdcC基因)、外运蛋白基因(例如大肠杆菌外运蛋白ygaZH基因、谷氨酸棒杆菌外运蛋白brnEF基因)、乙酰羟酸异构酶基因(例如ilvC基因)、二羟酸脱水酶(例如ilvD基因)、支链氨基酸氨基转移酶(例如ilvE基因)、支链氨基酸脱氢酶(例如leuDH基因)中的一种或多种。所述基因可以是野生型或突变型，例如在一个实施例中，所述ilvC基因可以为野生型的ilvC或突变型ilvGm，突变型ilvGm是指使用NADH作为辅酶的ilvC突变型基因，该突变型ilvC与使用NADPH为辅酶的野生型ilvC不同，突变型ilvC携带L67E、R68F和K75E的变异。
在一个实施例中，所述苏氨酸脱水酶(tdcB)、二羟酸脱水酶(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)及支链氨基酸转出蛋白ygaZH，可以来自大肠杆菌基因组。
在一个实施例中，所述支链氨基酸脱氢酶(leuDH)可以来自于枯草芽孢杆菌。在一个实施例中，所述支链氨基酸转出蛋白(brnEF)可以来自谷氨酸棒杆菌。
如本领域技术人员知晓，上述基因可以利用DNA引物通过PCR反应获得。其中，所述苏氨酸转运蛋白的基因(tdcC)基因直接影响苏氨酸进入细胞的通量，对其表达强度可进行细致调控以实现异亮氨酸的最优生产。而苏氨酸转运蛋白基因表达强度的控制可以通过使用不同强度的启动子(例如组成型启动子或诱导型启动子)、使用不同浓度的诱导剂(对于诱导型启动子)或使用不同类型质粒(游离于染色体外)，以及整合在基因组中的不同位置来实现。因此，本发明的第二个方面，涉及一种载体，包含前述任一项的多核苷酸分子，所述载体中还包含常用元件，包括但不限于复制起始位点(Origin of replication，ORI)、抗生素抗性基因、多克隆位点(multiple cloning site,MCS)、启动子、增强子、引物结合位点、选择标记中的一种或多种。
在一个实施例中，所述载体为质粒和/或病毒载体。在一个实施例中，所述质粒为pZAlac、pZElac中的一种或多种。在一个实施例中，所述病毒载体为腺病毒、腺联病毒(AAV)、反转录病毒、慢病毒中的一种或多种。本发明的第三个方面，涉及一种基因工程菌株，所述菌株包含实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因可以是解除型ilvA基因。
或者，一种基因工程菌株，包含实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因可以是解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种。
在一个具体实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因可以是解除型ilvIH基因。
在一个实施例中，本发明的一种基因工程菌株，包括实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因和实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因。
在一个实施例中，所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因、所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因如前所定义。
在一个实施例中，所述基因工程菌株选自来自于以下一种或多种菌属的菌株：大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒杆菌(Corynebacterium)、链霉菌(Streptomyces)、酵母(Yeast)等。
如上所述，可以将上述基因插入到能自体复制的载体DNA后，再导入宿主内，作为质粒类染色体外DNA保留在宿主内，也可以通过利用转导作用、易位子、Mu噬菌体或同源性重组的方法将上述基因编入宿主微生物的染色体内。为了有效地进行上述基因的表达，可以连接lac、trp、PL和tac等在微生物内起作用的其他启动子。在一个实施例中，所述基因工程菌株含有的乳酸脱氢酶ldhA及醇脱氢酶adhE活性分别或同时被减弱或消除。
在一个实施例中，所述基因工程菌株含有丙酮酸脱氢酶(pyruvate
dehydrogenase)活性被减弱或消除。
在一个实施例中，所述基因工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的乙酰化羟基酸合成酶的活性。
在一个实施例中，所述基因工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的苏氨酸脱氨酶的活性。在一个实施例中，所述基因工程菌株包含前述任一种多核苷酸分子和/或载体。本发明所述基因工程菌株具有高产L-异亮氨酸的能力。本发明的第四个方面，涉及一种高产L-异亮氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述方法包括质粒的构建和表达、基因组整合(例如CRISPR，lambda red等介导的同源重组)等。本发明的第五个方面，涉及一种组合物，所述组合物包含前述任一种多核苷酸分子和/或载体、前述任一种基因工程菌株。本发明的第六个方面，涉及前述任一种多核苷酸分子和/或载体、前述任一种基因工程菌株在生产L-异亮氨酸中或制备含有L-异亮氨酸的药物或食品保健品中的应用。
本发明的第七个方面，涉及一种生产L-异亮氨酸的方法，所述方法使用前述任一种多核苷酸分子和/或载体、前述任一种基因工程菌株。
在一个实施例中，所述方法为发酵法培养前述任一种基因工程菌株或含有前述任一种多核苷酸分子和/或载体的菌株。
在一个实施例中，所述方法为了增加前体2-氧代丁酸的供应，在发酵培养基中添加了0.1％-5％的苏氨酸。
在一个实施例中，所述苏氨酸的添加也可以通过流加的方式供应，在流加培养基中苏氨酸的浓度范围为10％-14％。
在一个实施例中，所述方法包括步骤：
(i)在氧气不充分的培养条件下，培养前述任一种基因工程菌株；加入2-氧代丁酸或者苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸等可以转化为2-氧代丁酸的原料。(ii)从(i)的培养物中分离出所述的L-异亮氨酸。在一个实施例中，所述方法的发酵培养基包括葡萄糖20g/L，硫酸铵8g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，五水硫酸锰0.02g/L，苏氨酸15g/L，甜菜碱1g/L，丝氨酸1g/L，尼古丁酸0.01g/L，VB1 0.005g/L。
在一个实施例中，所述方法的发酵培养基包括葡萄糖4％、苏氨酸1.5％、丝氨酸0.1％、酵母提取物0.5％、MgSO4 0.12％、CaCl2 0.01％、NH4Cl 0.26％、NaCl 0.05％、Na2HPO4 0.6％、KH2PO4 0.3％、VB1 0.0005％、甜菜碱0.1％、MnSO4·5H2O 0.002％、烟酸0.01％。
III.实施例
实施例1：重组质粒pZA-ilvAIH、pZA-tdcBC-ilvIH的构建
将解除型ilvA基因、解除型ilvIH基因片段通过PCR获取，然后经过限制性内切酶消化后，通过连接酶，连接在质粒pZAlac上，得到重组质粒pZA-ilvAIH。同理将tdcB基因，解除型ilvIH基因片段及编码苏氨酸转运蛋白的tdcC基因通过PCR获取，然后经过限制性内切酶消化后，通过连接酶，连接在质粒pZAlac上，得到重组质粒pZA-tdcBC-ilvIH。其中，tdcC的表达强度可以将上述两个重组质粒分别转化入缺失ilvD基因的BW25113背景菌株中，分别得到IL1与IL2。
实施例2：制备L-异亮氨酸前体二羟甲基戊酸
采用实例1中的菌株IL1与IL2，培养基为在现有普遍采用的发酵培养基：葡萄糖4％、苏氨酸1％、酵母提取物0.5％、MgSO4 0.12％、CaCl2 0.01％、NH4Cl 0.1％、NaCl0.05％、Na2HPO4 0.6％、KH2PO4 0.3％、VB1 0.0005％。用NaOH和盐酸调pH至7.0～7.2，115℃灭菌15min。
培养方法：将菌种接入LB培养基中，于37℃下培养10小时，转速240rpm。将LB培养物接种量为4％接入带有卡纳霉素的发酵培养基中；在30℃下于125mL的三角瓶中(装液量5mL，含有0.3克CaCO3)，240rpm，发酵至60h停止。IL1与IL2分别产出10.2g/L和9.5g/L异亮氨酸前体二羟甲基戊酸。
实施例3：产L-异亮氨酸菌基因工程菌的筛选
将ilvC/ilvCm、ilvD、ilvE/leuDH、ygaZH/brnEF基因通过PCR获取，然后经过限制性内切酶消化后，通过连接酶，连接在质粒pZElac上，得到下列组合的重组质粒pZE-ilvCD-ilvE-ygaZH、pZE-ilvCD-leuDH-ygaZH、pZE-ilvCD-leuDH-brnEF、pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH、pZE-ilvCmD-ilvE-brnEF、pZE-ilvCmD-leuDH-ygaZH和pZE-ilvCmD-leuDH-brnEF。
将上述质粒分别转化至缺失adhE与ldhA的IL1或IL2菌株中，得到系列发酵异亮氨酸的菌株。采用上述方法得到的14株菌株；摇瓶发酵培养基：葡萄糖4％、苏氨酸1.5％、丝氨酸0.1％、酵母提取物0.5％、MgSO4 0.12％、CaCl2 0.01％、NH4Cl 0.26％、NaCl 0.05％、Na2HPO4 0.6％、KH2PO4 0.3％、VB1 0.0005％、甜菜碱0.1％、MnSO4·5H20 0.002％、烟酸0.01％。用NaOH和盐酸调pH至7.0～7.2，115℃灭菌15min。
培养方法：将菌种接入LB培养基中，于37℃下培养10小时，转速240rpm。将LB培养物接种量为4％接入带有氨苄青霉素和卡那霉素的发酵培养基中；在30℃下于125mL的三角瓶中(装液量5mL，含有0.3克CaCO3)，240rpm，先培养8小时后，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续发酵48h-60h后停止。其中缬氨酸与异亮氨酸见表1。
表1：实例3摇瓶发酵结果
实施例4：基因工程菌发酵法生产L-异亮氨酸(受体菌DV10)
采用实例3中的最佳质粒组合pZA-ilvAIH与pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH，转化入受体菌DV10(ΔldhAΔptaΔpoxBΔadhEΔpflBΔmgsAΔfrdAΔdadAΔavtAΔilvE)进行发酵罐实验。
生产方法：将菌种接入LB培养基在37℃、中培养12h，按5％的接种量接入含有适量抗生素的发酵培养基(葡萄糖20g/L，硫酸铵8g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，五水硫酸锰0.02g/L，苏氨酸15g/L，甜菜碱1g/L，丝氨酸1g/L，尼古丁酸0.01g/L，VB1 0.005g/L)的1L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度采用分段控制模式：0～10h为37℃，10～40h为30℃，通入适当空气，调节适当搅拌转速，采用恒定转速800rpm控制溶氧，通过自动流加液氨控制pH在6.8～7.2，通过流加适量泡敌消泡，并通过流加浓度为500g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1％以内，同时流加浓度为90g/L的苏氨酸母液，发酵至40h停止。放罐时，L-异亮氨酸的产量为43.1g/L，转化率为84％。
实施例5：发酵法生产L-异亮氨酸(受体菌CCK19)
将实施例3中的质粒pZA-ilvAIH与pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH转化到菌株CCK19(ΔldhAΔpoxBΔadhEΔaceEΔfrdBC)中，得到的1株菌株。摇瓶发酵培养基：葡萄糖4％、苏氨酸1.5％、丝氨酸0.1％、酵母提取物0.5％、20MgSO4 0.12％、CaCl2 0.01％、NH4Cl 0.26％、NaCl 0.05％、Na2HPO4 0.6％、KH2PO4 0.3％、VB1 0.0005％、甜菜碱0.1％、MnSO4·5H2O0.002％、烟酸0.01％。用NaOH和盐酸调pH至7.0～7.2，115℃灭菌15min。
培养方法：将菌种接入LB培养基中，于37℃下培养10小时，转速240rpm。将LB培养物接种量为4％接入带有氨苄青霉素和卡那霉素的发酵培养基中；在30℃下于125mL的三角瓶中(装液量5mL，含有0.3克CaCO3)，240rpm，先培养8小时后，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续发酵27小时后停止。最终产生缬氨酸和异亮氨酸分别为1.26g/L和1.27g/L。
本发明提供的苏氨酸培养基生产异亮氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的培养基试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.发酵法生产L-异亮氨酸的方法，其特征在于，采用基因工程的方法获得基因工程菌株，所述基因工程菌株包括实质上解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱氨酶的基因和实质上解除了L-异亮氨酸抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因；将所述基因工程菌株并进行发酵培养，培养结束后从培养物中分离出L-异亮氨酸；发酵培养过程中，发酵培养基中添加0.1％-5％的苏氨酸，苏氨酸采用流加方式进行供应；
所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱氨酶的基因为解除型ilvA基因；
所述实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的乙酰化羟基酸合成酶III的基因为解除型ilvIH基因；
所述基因工程菌株还包括突变型乙酰羟酸异构酶基因(ilvCm)、二羟酸脱水酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶(ilvE)以及支链氨基酸转出蛋白ygaZH，突变型ilvCm是指使用NADH作为辅酶的ilvC突变型基因，突变型ilvCm携带L67E、R68F和K75E的变异；
所述基因工程菌通过如下方法构建：
1)选择敲除如下基因：ldhA、pta、poxB、adhE、pflB、mgsA、frdA、dadA、avtA、ilvE的大肠杆菌作为受体菌；
2)转入质粒组合pZA-ilvAIH与pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH；
其中重组质粒pZA-ilvAIH是将解除型ilvA基因与解除型ilvIH通过连接酶，连接在质粒pZAlac上得到；
其中重组质粒pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH是将ilvCm、ilvD、ilvE以及ygaZH基因通过连接酶，连接在质粒pZElac上得到。
2.根据权利要求1所述的发酵法生产L-异亮氨酸的方法，流加培养基中苏氨酸浓度为10％-14％。
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