CN117647644A - 一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 - Google Patents
一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117647644A CN117647644A CN202410116753.2A CN202410116753A CN117647644A CN 117647644 A CN117647644 A CN 117647644A CN 202410116753 A CN202410116753 A CN 202410116753A CN 117647644 A CN117647644 A CN 117647644A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- buffer solution
- blocking
- latex
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 323
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 168
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims abstract description 168
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 128
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 120
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 118
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 52
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 8
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 claims description 85
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 claims description 85
- 108091000053 retinol binding Proteins 0.000 claims description 80
- 102000029752 retinol binding Human genes 0.000 claims description 80
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 66
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 55
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 55
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 49
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 47
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 46
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 42
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 36
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 30
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 28
- WCGGWVOVFQNRRS-UHFFFAOYSA-N dichloroacetamide Chemical compound NC(=O)C(Cl)Cl WCGGWVOVFQNRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 26
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 24
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 22
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 22
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 22
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 20
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 19
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 19
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 19
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 16
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 16
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 12
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 12
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 9
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 8
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 claims description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 abstract 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 20
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010004103 Chylomicrons Proteins 0.000 description 2
- -1 HCl or TFA Chemical class 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000001268 chyle Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229960003471 retinol Drugs 0.000 description 2
- 235000020944 retinol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011607 retinol Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000665882 Homo sapiens Retinol-binding protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000008763 Mercury poisoning Diseases 0.000 description 1
- 206010027439 Metal poisoning Diseases 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 238000011094 buffer selection Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- JFUIHGAGFMFNRD-UHFFFAOYSA-N fica Chemical compound FC1=CC=C2NC(C(=O)NCCS)=CC2=C1 JFUIHGAGFMFNRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种封闭剂及其在免疫检测中的应用,封闭剂OH‑PEG‑NH2及由该封闭剂制备的封闭液、组分简单、性能稳定。本发明通过优化封闭剂和封闭缓冲液的使用浓度及其封闭条件,并将该封闭过程应用在2种胶乳试剂的制备过程中,配合2种胶乳试剂中试剂1和试剂2主要组分和制备过程的层层优化筛选,验证了该封闭剂OH‑PEG‑NH2不仅能够提高了封闭后胶乳颗粒上目标抗体的特异性免疫识别和结合能力,提升了所制备的胶乳试剂的检测准确度、稳定性和检测线性范围,而且该封闭剂有望推广应用在所有免疫检测中固相载体的封闭制备过程中,扩大现有封闭剂的使用范围及提升免疫检测试剂的综合性能水平。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域,具体涉及一种封闭剂及其在免疫检测中的应用,尤其是用于制备胶乳免疫比浊检测试剂,比如该封闭剂用于制备RBP或者BMG这2种胶乳免疫比浊快速检测试剂盒。
背景技术
在涉及固相介质的免疫反应中,无论是免疫层析或是板式ELISA,胶乳免疫比浊或是磁微粒化学发光,或是更新的微流控技术,待测临床样本成分的复杂性可能会影响整个免疫检测反应发生非特异性反应,从而产生假阳性或假阴性的检测结果。为了阻止待测样本中非代表性的蛋白质或生物分子与固相介质之间发生非特异性结合,一般使用不会参与反应的物质对固相介质表面进行封闭,这种物质被称为封闭剂。常用BSA、酪蛋白等动物来源的封闭剂,属于氨基酸、多肽或蛋白质类物质,由于成分复杂、批间差难以控制、且临床样本与封闭剂存在或多或少非特异结合反应从而导致假阳性,这类封闭剂存在信噪比低、交叉反应及不稳定等问题,比如不同厂家和不同批次的BSA差异巨大,使用前需要通过检测筛选到合适批次BSA,该类检测筛选工作不仅操作繁琐而且耗费时间较长。已知胶乳偶联封闭中,主要封闭剂包括蛋白封闭、荧光有机物封闭(FICA)等。常见封闭剂的这些问题给所应用的免疫反应尤其是本申请验证的胶乳免疫比浊中胶乳颗粒偶联的制备中带来了很多不便,导致胶乳试剂灵敏度低、重复性差、稳定性低等问题,从而不能满足急诊和临床病人对胶乳免疫比浊用于POCT及时诊断的需要。因此,急需一种组分简单、结构稳定、通用性强的封闭剂,既能够对抗体特异性反应具有保护性,又能够满足不干扰抗体与抗原结合、且使用操作简便。
胶乳免疫比浊检测方法是非常主流的一种快速检测样本的免疫检测方法,采用胶乳免疫比浊检测方法制备的试剂盒简称胶乳试剂,基本检测原理是:抗原抗体在缓冲液中快速形成抗原抗体复合物,使反应液出现浊度,透光率下降。在一定的比例范围内,反应液的浊度和抗原抗体的量呈线性相关关系。然而该方法的灵敏度和准确度不如化学发光法,提高胶乳试剂灵敏度、特异性和准确度等性能的关键在于抗原抗体、胶乳颗粒的选择,以及反应流程和反应条件的优化等。
视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protcin,RBP)为血液中视黄醇(维生素A)的转运蛋白,RBP可辅助用于高血压及糖尿病早期肾病进行临床检测的参考指标。β2微球蛋白(β2-microglobulin,BMG)是一种内源性低分子量血清蛋白质,BMG可辅助用于肾功能、肾移植成活、糖尿病肾病、重金属镉、汞中毒以及某些恶性肿瘤进行早期临床检测的参考指标。RBP和BMG常用胶乳免疫比浊法进行检测,然而目前对RBP和BMG胶乳免疫比浊检测都存在由于非特异性反应带来的检测线性范围窄、灵敏度低等问题。
发明内容
本发明为了克服上述问题,提供一种组分简单、性能稳定的通用封闭剂及由该封闭剂制备的封闭液,可以用于胶乳免疫比浊检测方法,尤其是应用于制备胶乳试剂中试剂R2的制备。
为实现上述发明目的,本发明通过以下技术方案实现:
第一方面,本发明提供了一种封闭剂,该封闭剂的化学名称为羟基-聚乙二醇-氨基OH-PEG-NH2,是一种高分子聚合物,分子量为4000~6000,该封闭剂OH-PEG-NH2可以应用在免疫检测中固相介质表面的封闭,该封闭剂OH-PEG-NH2用于封闭时的使用浓度为0.05%~1%。
第二方面,本发明提供了一种封闭液,包括封闭剂OH-PEG-NH2和封闭缓冲液,将封闭剂OH-PEG-NH2溶解于封闭缓冲液中制备而成,该封闭缓冲液为5~45mmol/L PB缓冲液、5~45mmol/LPBS缓冲液、5~45mmol/L MES缓冲液;可以应用的免疫检测为胶乳免疫比浊检测,该固相介质为胶乳颗粒;该封闭液的pH值为6.0~9.0;当目标抗体和胶乳颗粒偶联完成后使用该封闭液进行封闭反应,该封闭反应的条件为置于25~30℃反应1h~3h。
第三方面,本发明提供了一种试剂R2的制备方法,应用于胶乳免疫比浊检测方法,试剂R2的制备步骤如下:S1:活化缓冲液中,用活化剂使10~100g/L胶乳颗粒的表面羧基被修饰,得到羧基被活化剂修饰的胶乳颗粒溶液;S2:加入50~100mg/L目标抗体,反应1~3h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;S3:加入封闭液完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀;S4:加入PBS缓冲液后超声1~5min,均匀分散抗体-胶乳颗粒混合体系;S5:取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,混合均匀后制备得到保存剂;S6:将S4超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于S5制备得到的保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,即为胶乳免疫比浊检测中的试剂R2,分装后4℃保存待用。
根据本发明的一个优选实施例,所述制备方法中,步骤S1中,该活化剂为5% EDC和/或0.2%~1.0%NHS,将该活化剂和胶乳颗粒共同置于活化缓冲液中完成活化,活化缓冲液为5~15mmol/L缓冲液;步骤S2中,目标抗体的浓度为50~100mg/L;步骤S5中,保存缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、或者90~150mmol/L HEPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.1~0.6%酪蛋白、50~120mmol/L NaCl、30~50%甘油和10%~15%乳糖;防腐剂为0.05~0.1%的二氯乙酰胺溶液。
根据本发明的一个优选实施例,所述制备方法中,步骤S1中,该胶乳颗粒的粒径为100~200nm;该活化缓冲液为PB缓冲液、或者PBS缓冲液、或者MES缓冲液。
第四方面,本发明提供了一种试剂R2,根据试剂R2的制备方法制备而成。
第五方面,本发明提供了一种试剂盒,采用胶乳免疫比浊检测方法,该试剂盒包括试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比可以为2:1~4:1;其中试剂R1包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂,该试剂R1的pH值被PH调节剂调至7.0~7.8;试剂R2包含目标抗体偶联的胶乳颗粒、封闭液和保存剂,该试剂R2的pH值被PH调节剂调至7.2~8.0,其中,保存剂包括保存缓冲液、稳定剂、防腐剂;稳定剂包括酪蛋白、NaCl、甘油和乳糖,甘油和乳糖作为悬浮剂。
根据本发明的一个优选实施例,所述试剂盒,在试剂R1中,缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、或者100~150 HEPES-NaOH缓冲液,表面活性剂为0.01~0.05% EMULGEN A90,稳定剂包含0.1~0.6% BSA和100~120mmol/L NaCl,防腐剂为0.01~0.05% PC300溶液;在试剂R2中,在目标抗体偶联的胶乳颗粒中,目标抗体为视黄醇结合蛋白RBP或者β2微球蛋白BMG。
根据本发明的一个优选实施例,所述试剂盒,目标抗体为视黄醇结合蛋白RBP时,在试剂R1中,该缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液;在试剂R2中,该保存缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液;目标抗体为β2微球蛋白BMG时,在试剂R1中,该缓冲液为100~150mmol/L HEPES-NaOH缓冲液;在试剂R2中,该保存缓冲液为100~150mmol/LHEPES-NaOH缓冲液。
第六方面,本发明提供了一种应用,为封闭剂,封闭液,试剂R2的制备方法,试剂R2,试剂盒,在制备胶乳试剂相关产品中的应用。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种封闭剂OH-PEG-NH2及由封闭剂OH-PEG-NH2制备的封闭液,其组分简单、结构稳定,将含有封闭剂OH-PEG-NH2的封闭液应用在胶乳免疫比浊检测方法中,进一步验证并优化了试剂R2制备步骤所涉及的缓冲液、保护剂组分等,使得由试剂R1、试剂R2制备而成的胶乳试剂,相对于传统的胶乳免疫比浊法,明显改善试剂的检测精密度、稳定性、灵敏度和特异性。
本领域技术人员公知OH-PEG-NH2的化学名称为羟基-聚乙二醇-氨基(hydroxyl-PEG-Amine),是由PEG衍生的带有一个羟基和一个胺基的线性的杂双功能化合物,分子量为2000~20000,根据分子量、纯度、温度、pH值等不同,呈现出不同的物理和化学性质,其中,羟基可以被很多化学反应激活,胺基也可以与许多胺反应基团(如NHS、羧酸、环氧化物和醛)反应,羟基和胺基这2个双活性官能团的化学活性强,使用中OH-PEG-NH2常以HCl或TFA等强烈刺激性和腐蚀性的盐的形式提供活性,存在对人体强伤害的潜在属性,且不同分子量的OH-PEG-NH2之间外观状态和物理性质差异显著,导致不同分子量的OH-PEG-NH2之间溶解性、粘性、化学反应活性、稳定性等物流和化学性质的差异巨大,也因为不同分子量的OH-PEG-NH2表现出不同的特定药效、且作用机制尚不清晰,因此,目前OH-PEG-NH2仅被批准用于科研试验和制造用途,尚未能获批用于人类治疗或诊断用途。
本发明意外筛选到了OH-PEG-NH2用作封闭剂的最佳分子量为4000~6000,并验证了与不同封闭缓冲液组合的封闭作用效果,并进一步优化获得该封闭剂OH-PEG-NH2用于封闭时的使用浓度为0.1%~0.6%,封闭剂OH-PEG-NH2配合5~45mmol/L PB缓冲液制备得到一种封闭液。首先,本发明筛选出通用的封闭剂OH-PEG-NH2,分子量为4000~6000及其封闭缓冲液,一方面4000~6000分子量条件下为液体或半液体状态,该状态条件下的溶解性、粘性、化学反应活性、稳定性都比较合适。另一方面封闭缓冲液限定为PB缓冲液能够保证封闭剂OH-PEG-NH2的分子活性,使封闭剂OH-PEG-NH2处于pH值接近生理条件、弱化了OH-PEG-NH2常规科研应用在酸性条件中的刺激性和腐蚀性,而且本发明优选的分子量,和在非常规的、非酸性的PB缓冲液条件下,封闭剂OH-PEG-NH2自身结构稳定。第二,封闭剂OH-PEG-NH2上包含两种有活性的官能团分子结构:羟基和胺基,可以使被包被的蛋白质、目标抗体或者其他活性物质能够快速、有效地聚乙二醇化,聚乙二醇化后的生物分子稳定性进一步提高。第三,OH-PEG-NH2作为封闭剂,自身不具有免疫原性,可以避免后续免疫反应过程中的非特异性干扰。第四,由封闭剂OH-PEG-NH2制备的封闭液组成成分简单,OH-PEG-NH2作为一种高分子聚合物,制备成的封闭液中可以不包含氨基酸、蛋白质类复杂的组成物质。第五,封闭剂OH-PEG-NH2中位于羟基和胺基之间的PEG不仅能够提供良好的水溶性,还能够抑制带电分子与封闭后羧基化修饰的胶乳颗粒表面产生非特异性结合。第六,封闭剂OH-PEG-NH2为高分子聚合物,本身具有柔性连接长度,当待测样品中检测的目标蛋白(比如RBP、BMG)的浓度较高时,即便未实现完全的特异性结合也容易发生蛋白聚集交联等现象(胶乳免疫比浊检测中浊度变化与目标蛋白的浓度成正比,因此,封闭剂OH-PEG-NH2的柔性长度,降低了非特异性的聚集交联反应,提高了所应用的胶乳试剂的最高检出限,从而提高了胶乳试剂的高值灵敏度。因此,本发明封闭液中创造性选择分子量4000~6000的封闭剂OH-PEG-NH2并制备为封闭液用于封闭固相介质胶乳颗粒,不仅可以阻止包被的目标抗体与反应体系之间的非特异性反应,还能够提高所封闭的目标抗体的特异性免疫识别和结合能力,从而提高免疫反应的灵敏度和特异性。
本发明在目标抗体包被胶乳颗粒的制备中,使用含有封闭剂OH-PEG-NH2的封闭液,实验验证经OH-PEG-NH2封闭后不会影响胶乳颗粒上包被的目标抗体的特异性识别和结合能力。此外,在将封闭剂OH-PEG-NH2应用在胶乳试剂的制备中,同时优化了试剂R1和试剂R2的组分,包括目标抗体、胶乳颗粒、制备步骤和反应条件等,还优化筛选了一系列缓冲液,比如活化、交联过程中都使用到活化缓冲液,活化缓冲液和封闭缓冲液都可以为PB缓冲液、或者PBS缓冲液、或者MES缓冲液,只是使用浓度不同,保存缓冲液优选PIPES-NaOH缓冲液或HEPES-NaOH缓冲液,在上述缓冲液选择优化基础上进一步优化了缓冲液的使用浓度,使各制备步骤均能够发挥最优的活化、交联、封闭和保存等作用。保存剂中保存缓冲液优选PIPES-NaOH缓冲液或者HEPES-NaOH缓冲液,二者都是由两性离子缓冲剂和NaOH组成的缓冲液,一般不干扰抗体抗原的特异性反应过程、干扰反应小,还能够使得保存液在长期储存和使用过程中长时间控制恒定的pH范围和稳定性,化学稳定性高,能保证该缓冲液中的磺酸基离子还能够促进检测过程中抗体抗原的特异性反应,增强灵敏度和特异性。
目标抗体包被胶乳颗粒的制备中,以目前采用胶乳免疫比浊检测尚存在性能提升空间的RBP和BMG为目标蛋白,本发明优化了目标抗体包被胶乳颗粒中的微球活化、封闭和保存的过程,其中,与保存缓冲液相对应,用于检测RBP的试剂R1的缓冲液和保存缓冲液的最优选择均为PIPES-NaOH缓冲液,用于检测BMG的试剂R1的缓冲液和保存缓冲液的最优选择均为HEPES-NaOH缓冲液,且缓冲液的最优使用浓度也存在区别。RBP和BMG虽然都属于低分子量蛋白质,但是视黄醇结合蛋白(RBP)和β2微球蛋白(BMG)的分子量和结构存在本质区别,对应2种不同的目标抗体在与被修饰的微球表面进行化学交联时的试剂组分和反应条件也存在区别,需要进行具体实验筛选和验证。此外,胶乳微球表面羧基活化中,所用活化剂优选4~6%EDC,能够有效地保证目标抗体(比如RBP和BMG抗体)与胶乳微球的化学偶联,并且在本发明筛选的最优封闭条件下,一方面封闭剂OH-PEG-NH2能够与胶乳微球剩余被修饰的羧基有效的结合,实现有效封闭,另一方面OH-PEG-NH2的亲水性能够正向影响并提高试剂R2的稳定性,最终用改善目标抗体包被胶乳颗粒的稳定性和室温保存便利性。
胶乳免疫比浊中,关于表面活性剂,本发明所述试剂R1中,优选EMULGEN A90并降低了表面活性剂的使用量,0.1-0.5% EMULGEN A90不仅降低了乳糜干扰,改善了试剂R1的稳定性,还提升了试剂R1的抗干扰能力。关于稳定剂,试剂R1中优选BSA和NaCl,而在试剂R2中,稳定剂除了0.1~0.6%酪蛋白和50~120mmol/L NaCl,还添加了30~50%甘油和10%~15%乳糖作为悬浮剂,尤其是试剂R2的保存剂中包含了蛋白质、糖类组分,在维持目标抗体在溶液中悬浮稳定状态的同时,还能够保护目标抗体的活性和构象的稳定,有利于减缓由于胶乳颗粒等潜在的分层或沉淀影响特异性免疫反应信号衰减的趋势。试剂R1和试剂R2分别使用0.01~0.05% PC300溶液和0.05~0.1%的二氯乙酰胺溶液作为防腐剂,保存剂进一步优化,筛选了最佳的稳定剂、防腐剂及最优浓度范围。稳定剂中酪蛋白最优浓度为0.2~0.4%、甘油和乳糖最优浓度分别为20~50%和7.0%~12.0%、二氯乙酰胺作为防腐剂的最优浓度为0.08%,尤其是0.08%的防腐剂能够在最低使用剂量的前提下,使得该试剂盒在常温条件下获得了良好的热稳定性和保存稳定性。此外,本试剂能够常温保存,从而提高了本发明相关产品在辅助临床应用中的实用性。
本发明胶乳免疫比浊试剂中,抗干扰性能方面主要表现在:试剂R1优选的表面活性剂EMULGEN A90,能够降低乳糜干扰;试剂R2优选的封闭剂和系列缓冲液,组分简单,自身均不具有免疫原性,不存在背景干扰,有利于进一步避免非特异性免疫反应,从而降低了试剂盒的最低检出限,提高了胶乳免疫比浊试剂检测中的低值灵敏度;此处的低值灵敏度结合上述封闭剂能够提高检测中的高值灵敏度,使得本发明胶乳免疫比浊试剂整体检出限进一步提高,最终扩大了检测的线性范围,同时检测特异性也较高。
综上可知,本发明提供了一种由封闭剂OH-PEG-NH2制备的封闭液,并通过缓冲液、表面活性剂等制备条件的层层优化验证了封闭剂OH-PEG-NH2可以成功应用在胶乳免疫比浊检测BMG和RBP这2种试剂上,由封闭剂OH-PEG-NH2制备的封闭液组分简单、结构稳定、通用性强,在充分实现对固相载体封闭效果的基础上,不仅不干扰抗体与抗原特异性结合反应、使用操作简便,而且还能降低了最低检出限、提高最高检出限,从而扩大了检测的线性范围和检测灵敏度。该封闭剂OH-PEG-NH2应用在胶乳免疫比浊检测试剂盒中,通过层层条件优化,获得了试剂R1及试剂R2的优选配方,使得试剂盒在常温条件下获得了良好的热稳定性和保存稳定性,有效降低了生产成本、制备使用简单,可以在全自动生化分析仪上使用、自动化程度高,具有更好的灵敏度、特异性、检测范围、准确度和稳定性等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的RBP试剂1检测临床样本准确度的相关性图;
图2为本发明实施例2所述的RBP试剂2检测临床样本准确度的相关性图;
图3为本发明实施例3所述的RBP试剂3检测临床样本准确度的相关性图;
图4为本发明实施例4所述的RBP试剂4检测临床样本准确度的相关性图;
图5为本发明实施例5所述的BMG试剂1检测临床样本准确度的相关性;
图6为本发明实施例6所述的BMG试剂2检测临床样本准确度的相关性;
图7为本发明实施例7所述的BMG试剂3检测临床样本准确度的相关性;
图8为本发明实施例8所述的BMG试剂4检测临床样本准确度的相关性;
其中,横坐标为实施例对临床样本的测试值,纵坐标为对照试剂检测同一待测样本的对照值。
具体实施方式
下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例,其中相同或相似的表示相同的概念。在下面的详细描述中,为便于解释,阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。在下面的详细描述中,为便于解释,阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明均为常规方法,所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。其中,BMG和RBP抗体购自厦门英博迈生物技术有限公司;PIPES和HEPES购自百灵威科技公司;酪蛋白购自上海西宝生物科技有限公司;羟基-聚乙二醇-氨基(OH-PEG-NH2)(分子量4000~6000)购自上海西宝生物科技有限公司;甘油购自禾大化学品(上海)有限公司;二氯乙酰胺购自百灵威科技公司;羧基微球购自捷和泰(北京)生物科技有限公司;活化剂EDC、NHS购自上海品究化工有限公司;自动生化分析仪为日立自动生化分析仪7180。然而明显地,一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法,均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施本发明所述检测的应用对象是指采自于人体或动物体的体液类生物样本,样本采集工作完成后,该生物样本已经脱离了有生命的人体或动物体,比如血液样品(全血/血清/血浆)、体液、组织、排泄物、分离培养物(血培养物、痰培养物等)等,均属于离体的无生命的生物样本;所述检测过程在体外完成,所述检测的直接目的是检测样品中是否存在目标蛋白、氨基酸或核酸,所述检测的结果有助于辅助医生结合问诊信息作出全面判断,该检测属于在体外对无生命的生物样本中组分或含量的检测,检测中不存在直接获得疾病的诊断结果或健康状况的过程,因此,本发明不属于疾病的诊断方法,符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。
本发明提供了一种组分简单、稳定的封闭剂OH-PEG-NH2及由其制备的封闭液,由该封闭液应用在胶乳免疫比浊试剂的试剂R2的制备中,不仅能够提高所封闭的固相介质上目标抗体的特异性免疫识别和结合能力,还能够提高胶乳免疫比浊试剂后续检测的灵敏度。其中,由封闭剂OH-PEG-NH2制备的封闭液、胶乳颗粒及其用于胶乳免疫比浊检测BMG和RBP试剂的制备过程中,经过层层优化筛选得到缓冲液、表面活性剂、保护剂等组成的试剂R1、试剂R2最优组分,经验具体实验验证可见最终获得的BMG和RBP试剂的灵敏度、特异性、稳定性均很高,检测线性范围进一步提高。下面描述一下本发明的具体实施例:
实施例1:一种RBP试剂1的制备
RBP试剂1包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为2:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:100mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、100mmol/L NaCl、0.3%BSA、0.5% EMULGEN A90和0.005%PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.2。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为100nm的胶乳颗粒,10g/L胶乳颗粒与活化剂4% EDC共同置于由5mmol/L PB缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入50mg/L RBP抗体,反应1h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.2% OH-PEG-NH2的封闭液,置于25℃反应3h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为4000,封闭液pH值调至7.0、封闭缓冲液为5mmol/L PB缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声1min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为100mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.3%酪蛋白、60mmol/L NaCl和40%甘油和12.5%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.1% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.8即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例2:一种RBP试剂2的制备
RBP试剂2包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为3:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:110mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、110mmol/L NaCl、0.4%BSA、0.4% EMULGEN A90和0.04%PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.4。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为150nm的胶乳颗粒,50g/L胶乳颗粒与活化剂5% EDC共同置于由10mmol/L PBS缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基EDC修饰,得到羧基EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入75mg/L RBP抗体,反应2h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.6% OH-PEG-NH2的封闭液,置于27℃反应2h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为5000,封闭液pH值调至8.0、封闭缓冲液为15mmol/L PBS缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声2min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为120mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.4%酪蛋白、90mmol/L NaCl和30%甘油和15%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.08% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.6即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例3:一种RBP试剂3的制备
RBP试剂3包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为4:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:120mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、120mmol/L NaCl、0.5% BSA、0.3% EMULGEN A90和0.03% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.6。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为200nm的胶乳颗粒,100g/L胶乳颗粒与活化剂6% EDC共同置于由15mmol/L MES缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基被EDC修饰的胶乳颗粒溶液;加入100mg/L RBP抗体,反应3h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.05% OH-PEG-NH2的封闭液,置于29℃反应1h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为6000,封闭液pH值调至9.0、封闭缓冲液为45mmol/L MES缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声3min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为140mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.5%酪蛋白、120mmol/L NaCl和20%甘油和10%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.06% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.4即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例4:一种RBP试剂4的制备
RBP试剂4包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为5:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:120mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、100mmol/L NaCl、0.6% BSA、0.2% EMULGEN A90和0.02% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.8。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为150nm的胶乳颗粒,50g/L胶乳颗粒与活化剂1%NHS共同置于由10mmol/L PBS缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被NHS修饰,得到羧基被NHS修饰胶乳颗粒溶液;加入125mg/L RBP抗体,反应3h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.025% OH-PEG-NH2的封闭液,置于32℃反应4h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为3000,封闭液pH值调至9.0、封闭缓冲液为30mmol/L PBS缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声5min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为160mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.6%酪蛋白、120mmol/L NaCl和10%甘油和10%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.04% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.2即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
其中,由上述实施例1至实施例4应用本发明不同浓度封闭剂OH-PEG-NH2获得对应的所述RBP试剂1~RBP试剂4,采用胶乳免疫比浊法,可以用全自动生化分析仪进行自动生化结果分析,通用检测步骤如下:
RBP检测过程所用样本、试剂组合物及其用量设置如下:设置3种反应管,包括空白管、样品管和校准管,其中,空白管加2μL蒸馏水、样品管加2μL待测样品、校准管加2μL标准品;3种反应管先各加入试剂R1溶液180μL,于37℃孵育5分钟后;每个反应管再各加入试剂R2溶液60μL,混匀30秒后,用全自动生化分析仪读取3种反应管对应的吸光度(A1);再置于37℃孵育5分钟后,用全自动生化分析仪再次读取3种反应管对应的吸光度(A2);其中全自动生化分析仪的检测条件为:主波长设置为700nm,孵育温度为37℃,比色杯光径1cm,检测原理为吸光度差值ΔA(即终点上升法),计算公式如下:ΔA=A2-A1,。
实施例5:一种BMG试剂1的制备
BMG试剂1包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为2:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:150mmol/L HEPES-NaOH缓冲液、120mmol/L NaCl、0.1% BSA、0.4% EMULGEN A90和0.01% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.6。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为100nm的胶乳颗粒,10g/L胶乳颗粒与活化剂6% EDC共同置于由15mmol/L PB缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基被EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入100mg/L BMG抗体,反应3h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.25% OH-PEG-NH2的封闭液,置于26℃反应1h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为6000,封闭液pH值调至6.0、封闭缓冲液为10mmol/L PB缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声2min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.5%酪蛋白、110mmol/L NaCl和20%甘油和12.5%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.05% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.4即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例6:一种BMG试剂2的制备
BMG试剂2包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为3:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:140mmol/L HEPES-NaOH缓冲液、110mmol/L NaCl、0.2% BSA、0.3% EMULGEN A90和0.02% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.6。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为150nm的胶乳颗粒,50g/L胶乳颗粒与活化剂5% EDC共同置于由10mmol/L PBS缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基被EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入90mg/L BMG抗体,反应2h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.6% OH-PEG-NH2的封闭液,置于28℃反应2h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为5000,封闭液pH值调至7.0、封闭缓冲液为20mmol/L PBS缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声3min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为130mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.3%酪蛋白、90mmol/L NaCl和30%甘油和15%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.07% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.6即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例7:一种BMG试剂3的制备
BMG试剂3包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为4:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:130mmol/L HEPES-NaOH缓冲液、100mmol/L NaCl、0.3% BSA、0.2% EMULGEN A90和0.03% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.2。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为200nm的胶乳颗粒,100g/L胶乳颗粒与活化剂4% EDC共同置于由5mmol/L MES缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基被EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入80mg/L BMG抗体,反应1h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;加入含封闭剂0.1% OH-PEG-NH2的封闭液,置于30℃反应3h完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀,其中,OH-PEG-NH2分子量为4000,封闭液pH值调至8.0、封闭缓冲液为40mmol/L MES缓冲液;沉淀置于10mmol/L PBS缓冲液中超声4min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为110mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.1%酪蛋白、70mmol/L NaCl和40%甘油和10%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.09% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为7.8即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
实施例8:一种BMG试剂4的制备
BMG试剂4包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比为4:1。其中,试剂R1中主要组分及其使用浓度或终浓度为:120mmol/L HEPES-NaOH缓冲液、100mmol/L NaCl、0.4% BSA、0.1% EMULGEN A90和0.04% PC300,用PH调节剂将试剂R1溶液的PH调节至pH值为7.0。
其中,试剂R2的主要组分使用浓度或终浓度及其制备过程如下:取粒径为200nm的胶乳颗粒,10g/L胶乳颗粒与活化剂3% EDC共同置于由10mmol/L PBS缓冲液形成的活化缓冲液中完成活化,活化后胶乳颗粒表面羧基被EDC修饰,得到羧基被EDC修饰胶乳颗粒溶液;加入70mg/L BMG抗体,反应1h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;不使用任何封闭剂进行封闭反应,沉淀直接置于10mmol/L PBS缓冲液中超声3min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,其中,保存缓冲液为90mmol/L PIPES-NaOH缓冲液,稳定剂包括0.6%酪蛋白、50mmol/L NaCl和50%甘油和10%乳糖,此处甘油和乳糖作为悬浮剂,防腐剂为0.1% 二氯乙酰胺溶液,混合均匀后制备得到保存剂;将超声后的抗体-胶乳颗粒混合体系置于上述得到保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,用PH调节剂将该混合溶液的PH调节至pH值为8.0即为试剂R2,分装后4℃保存待检测使用。
其中,由上述实施例5至实施例8应用本发明不同浓度封闭剂OH-PEG-NH2获得对应的所述BMG试剂1~BMG试剂4,其中,BMG试剂4未使用封闭剂OH-PEG-NH2,采用胶乳免疫比浊法,可以用全自动生化分析仪进行自动生化结果分析,通用检测步骤如下:
BMG检测过程所用样本、试剂组合物及其用量设置如下:设置3种反应管,包括空白管、样品管和校准管,其中,空白管加3μL蒸馏水、样品管加3μL待测样品、校准管加3μL标准品;3种反应管先各加入试剂R1溶液160μL,于37℃孵育5分钟后;每个反应管再各加入试剂R2溶液40μL,混匀30秒后,用全自动生化分析仪读取3种反应管对应的吸光度(A1);再置于37℃孵育5分钟后,用全自动生化分析仪再次读取3种反应管对应的吸光度(A2);其中全自动生化分析仪的检测条件为:主波长设置为700nm,孵育温度为37℃,比色杯光径1cm,检测原理为吸光度差值ΔA(即终点上升法),计算公式如下:ΔA=A2-A1,。
取待测样本,使用上述实施例1~实施例8分别制备的RBP试剂1~RBP试剂4、BMG试剂1~BMG试剂4分别与对照试剂进行平行检测,评价上述实施例制备的2类检测试剂的稳定性和性能,性能包括抗干扰能力、线性范围、灵敏度及检测临床样本来验证检测结果的相关性,对照试剂分别购自日本生研生物上市销售的人RBP试剂和人BMG试剂,待测样本的测试值与对照试剂对同一待测样本的对照值的单位均为mg/L。
实施例9:稳定性评价
RBP试剂稳定性:待测样本为5个浓度水平的血清样本,将生理盐水替换为蒸馏水加入空白管,使用由实施例1~实施例4分别制备的RBP试剂1、RBP试剂2、RBP试剂3、RBP试剂4,使用倒序方法,平行检测热加速不同时间段(37℃放置1天、14天、28天)的RBP试剂和对照试剂,计算RBP试剂的日间均值、标准差SD与变异系数CV,稳定性检测结果如下表1所示。
表1 RBP试剂的稳定性
;/>
从表1可见本发明所述实施例1~实施例3制备的RBP试剂1~3对血清样本检测的日间精密度均不超过4%,实施例4制备的RBP试剂4对血清样本检测的日间精密度均超过6%,对照试剂对血清样本检测的日间精密度不超过7%。因此,RBP试剂1~3于37℃放置28天均保持96%以上的反应活性,与对照试剂相比稳定性更好。
RBP试剂空白吸光度稳定性:使用由实施例1~实施例4分别制备的RBP试剂1、RBP试剂2、RBP试剂3、RBP试剂4,分别在1天、7天、14天检测浓度0mg/L的空白样本,得到RBP试剂在不同天的空白吸光度,空白吸光度稳定性检测结果如下表2所示。
表2 RBP试剂空白吸光度的稳定性
;
从表2可见:所述实施例1~实施例3制备的RBP试剂1~3(含封闭剂0.025%-0.6%)检测0mg/L的空白样本的变异系数CV的绝对值小于0.15%,而实施例4制备的RBP试剂4(添加0.025%封闭剂)检测0mg/L的空白样本的变异系数CV的绝对值超过16%,并且对空白样本的检测变异系数先升后降低,由于添加的封闭剂与胶乳颗粒上的羧基结合,羧基就不能与其他蛋白结合,使得胶乳颗粒更好的悬浮在溶液中,而0.025% OH-PEG-NH2的使用浓度偏低导致封闭不完全,试剂中微球抗体复合物会不断凝集,凝集到一定大小,微球抗体复合物就会沉淀。因此,合适浓度的封闭剂能够显著的改善RBP试剂对空白样本的检测稳定性。
BMG试剂稳定性:待测样本为5个浓度水平的血清样本,将生理盐水替换为蒸馏水加入空白管,使用本实施例5~实施例8分别制备的BMG试剂1、BMG试剂2、BMG试剂3、BMG试剂4,使用倒序方法,平行检测热加速不同时间段(37℃放置1天、14天、28天)的BMG试剂和对照试剂,计算BMG试剂的日间均值、标准差SD与变异系数CV,稳定性检测结果如下表3所示。
表3 BMG试剂的稳定性
;
从表3可见本发明所述实施例5~实施例7制备的BMG试剂1~3对血清样本检测精密度的日间均值不超过3%,实施例8制备的BMG试剂4对血清样本检测的日间精密度均超过11%,对照试剂对血清样本检测的日间精密度不超过5%。因此,BMG试剂1~3于37℃放置28天均保持97%以上的反应活性,与对照试剂相比稳定性更好。
BMG试剂空白吸光度稳定性:使用由实施例5~实施例8分别制备的BMG试剂1、BMG试剂2、BMG试剂3、BMG试剂4,分别在1天、7天、14天检测浓度0mg/L的样本,得到BMG试剂在不同天的空白吸光度,空白吸光度稳定性检测结果如下表4所示。
表4 BMG试剂空白吸光度的稳定性
;
从表4可见:所述实施例5~实施例7制备的BMG试剂1~3(含封闭剂0.1%-1%)检测0mg/L的空白样本的变异系数CV的绝对值小于3%,而实施例8制备的BMG试剂4(没有添加封闭剂)检测0mg/L的空白样本的变异系数CV的绝对值超过33%,由于封闭剂还能够增加胶乳颗粒抗体复合物的亲水性,降低胶乳颗粒抗体复合物的疏水性,抗体和胶乳颗粒偶联的复合物更好的悬浮在溶剂中,因此,封闭剂能够显著的改善BMG试剂对空白样本的检测稳定性。
实施例10:性能评价
抗干扰能力:待测样本为10份诊断结果明确的临床血清样本,分别用上述实施例配制的RBP试剂1~RBP试剂4和BMG试剂1~BMG试剂4与对照试剂分别进行平行检测。其中,RBP试剂1~RBP试剂3和BMG试剂1~BMG试剂4的测试值与对应对照值的相对偏差不超过10%,其中RBP试剂的抗干扰能力检测结果如下表5所示。从表5可见,RBP试剂4测试值与对照值的相对偏差最高超过了20%,试剂的相关性低于0.975,且测试值普遍偏低,推测可能是血清样本中含有乳糜颗粒、蛋白质、一些高脂物质等,RBP试剂4由于制备过程中使用0.025%封闭剂OH-PEG-NH2进行封闭,浓度不合适,检测体系中还由于乳糜颗粒等干扰而出现非特异性结合,最终影响到RBP检测的特异性。
表5 RBP试剂的抗干扰能力
;
线性范围:待测样本同为10份诊断结果明确的临床血清样本,分别用上述实施例配制的RBP试剂1~RBP试剂3和BMG试剂1~BMG试剂4与对照试剂分别进行平行检测。其中,RBP试剂1~RBP试剂3的检测线性范围为:20~145mg/L,对照试剂的检测范围:20-140mg/L,BMG试剂1~BMG试剂3的检测线性范围为:0.7~45mg/L,对照试剂的检测范围:0.8-40mg/L,其中BMG试剂的检测线性范围结果如下表6所示。从表6可见,当人BMG试剂的对照值小于1mg/L时,BMG试剂4的测试值与对照值的相对偏差最大超过25%,低值临床样本(对照值<1mg/L)的测试值不稳定,推测可能因为BMG试剂4制备在封闭过程,封闭缓冲液浓度过高导致封闭剂在胶乳颗粒表面的覆盖不均匀,也可能是封闭剂不足,不能覆盖所有羧基,微球形成部分裸露的抗体结合位点,抑或是因为BMG试剂4中封闭剂OH-PEG-NH2的分子量为3000,作为封闭剂粘度较低、稳定性较低,无法更加坚固地覆盖在胶乳颗粒表面,这些原因降低了封闭剂的保护作用,进一步影响了抗体的特异性识别能力,最终影响到BMG检测4无法实现对低值临床样本的准确检测。
表6 BMG试剂的线性范围
;
灵敏度:待测样本为浓度分别为40mg/L和100mg/L的血清样本,分别用上述实施例配制的RBP试剂1~RBP试剂3与对照试剂分别进行平行检测。其中,RBP试剂1~RBP试剂3的灵敏度的吸光度检测结果如下表7所示。
表7 RBP试剂的灵敏度
;
待测样本为浓度分别为5mg/L和10mg/L的血清样本,分别用上述实施例配制的BMG试剂1~BMG试剂3与对照试剂分别进行平行检测。BMG试剂的灵敏度的检测结果如下表8所示。
表8 BMG试剂的灵敏度
;
从上述表格的检测结果可见,经上文验证抗干扰能力和线性范围都相对较好的RBP试剂1~RBP试剂3和BMG试剂1~BMG试剂3,检测的吸光度值(ABS)都明显高于各自的对照试剂。
临床样本检测相关性:待测样本为随机选取的40份临床样本,分别采用上述实施例1~实施例4配制的RBP试剂1~RBP试剂4和对照试剂进行平行检测,测试值与对照值的具体结果分别如下表9所示。
表9 RBP试剂对临床样本的检测结果
;
根据表9所示检测结果绘制得到实施例1~实施例4检测准确度的相关性分别如图1~图4所示,从图中可见由实施例1配制的RBP试剂1检测准确度的相关性为y=1.0152x-0.2584,关系数R2=0.9964;由实施例2配制的RBP试剂2检测准确度的相关性为y=1.0172x-0.9607,相关系数R2=0.9974;由实施例3配制的RBP试剂3检测准确度的相关性为y=1.0212x-0.9298,相关系数R2=0.9839;
因此,由实施例1~实施例3制备的RBP试剂1~RBP试剂3与对照试剂具有良好的相关性(R2=0.9964、0.9974、0.9839),可达到临床使用的标准。 实施例4的检测准确度相关曲线为y=1.0754x+10.246,相关系数R2=0.8125;说明实施例4制备的试剂与对照试剂相关性差,不能达到临床使用结果。
待测样本为随机选取的40份临床样本,分别采用上述实施例5~实施例8配制的BMG试剂1~BMG试剂4和对照试剂进行平行检测,测试值与对照值的具体结果分别如下表10所示。
表10 BMG试剂对临床样本的检测结果
;
根据表10所示检测结果绘制得到实施例5~8实施例检测准确度的相关性分别如图5~图8所示,从图中可见由实施例5配制的BMG试剂1检测准确度的相关性为y=1.0009x+0.0045,相关系数R2=1;实施例6配制的BMG试剂2检测准确度的相关性为y=1.0113x-0.0078,相关系数R2=0.9999;实施例7配制的BMG试剂3检测准确度的相关性为y=1.001x+0.0008,相关系数R2=0.9999;实施例8的线性相关曲线为y=0.9077x+2.8709,相关系数R2=0.7833;说明实施例1-3与对照试剂对照检测所得结果均具有相关性。实施例4与对照试剂检测所得结果相关性差,微球上羧基没有被封闭,与抗原可以结合,影性试剂的测值,使得试剂的特异性变差。
因此,由实施例5~实施例7制备的BMG试剂1~BMG试剂3与对照试剂具有良好的相关性(R2=1、0.9999、0.9999),可达到临床使用的标准。实施例8制备的BMG试剂与对照试剂具有较差的相关性(R2=0.7833),无法达到临床使用标准。
本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述,可以对那些细节进行不同的修饰或替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种封闭剂,其特征在于,化学名称为羟基-聚乙二醇-氨基OH-PEG-NH2,是一种高分子聚合物,分子量为4000~6000,所述封闭剂OH-PEG-NH2可以应用在免疫检测中固相介质表面的封闭,所述封闭剂OH-PEG-NH2用于封闭时的使用浓度为0.05%~1%。
2.一种封闭液,包括权利要求1所述的封闭剂和封闭缓冲液,将权利要求1所述的封闭剂溶解于封闭缓冲液中制备而成,所述封闭缓冲液为5~45mmol/L PB缓冲液、5~45mmol/LPBS缓冲液、5~45mmol/L MES缓冲液;可以应用的所述免疫检测为胶乳免疫比浊检测,所述固相介质为胶乳颗粒;
所述封闭液的pH值为6.0~9.0;
当目标抗体和胶乳颗粒偶联完成后使用所述封闭液进行封闭反应,封闭反应的条件为置于25~30℃反应1h~3h。
3.一种试剂R2的制备方法,应用于胶乳免疫比浊检测方法,试剂R2的制备步骤如下:
S1:活化缓冲液中,用活化剂使10~100g/L胶乳颗粒的表面羧基被修饰,得到羧基被活化剂修饰的胶乳颗粒溶液;
S2:加入50~100mg/L目标抗体,反应1~3h完成偶联,得抗体-胶乳颗粒偶联体系,离心弃上清,保留沉淀;
S3:加入权利要求2所述的封闭液完成封闭,得抗体-胶乳颗粒混合体系,离心弃上清,保留沉淀;
S4:加入PBS缓冲液后超声1~5min,均匀分散所述抗体-胶乳颗粒混合体系;
S5:取保存缓冲液,依次添加稳定剂、防腐剂,混合均匀后制备得到保存剂;
S6:将S4超声后的所述抗体-胶乳颗粒混合体系置于S5制备得到的所述保存剂中,得到含有目标抗体包被的胶乳颗粒的混合溶液,即为胶乳免疫比浊检测中的试剂R2,分装后4℃保存待用。
4.根据权利要求3所述的试剂R2的制备方法,其特征在于,
步骤S1中,所述活化剂为5% EDC和/或0.2%~1.0%NHS,将所述活化剂和所述胶乳颗粒共同置于活化缓冲液中完成活化,所述活化缓冲液为5~15mmol/L缓冲液;
步骤S2中,所述目标抗体的浓度为50~100mg/L;
步骤S5中,所述保存缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、或者90~150mmol/L HEPES-NaOH缓冲液,所述稳定剂包括0.1~0.6%酪蛋白、50~120mmol/L NaCl、30~50%甘油和10%~15%乳糖;所述防腐剂为0.05~0.1%的二氯乙酰胺溶液。
5.根据权利要求3所述的试剂R2的制备方法,其特征在于,
步骤S1中,所述胶乳颗粒的粒径为100~200nm;所述活化缓冲液为PB缓冲液、或者PBS缓冲液、或者MES缓冲液。
6.一种试剂R2,其特征在于,根据权利要求3-5任一项中所述的制备方法制备而成。
7.一种试剂盒,采用胶乳免疫比浊检测方法,所述试剂盒包括试剂R1和权利要求6所述的试剂R2,试剂R1和试剂R2的容积比可以为2:1~4:1;其中
试剂R1包含缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂,所述试剂R1的pH值被PH调节剂调至7.0~7.8;
试剂R2包含目标抗体偶联的胶乳颗粒、封闭液和保存剂,所述试剂R2的pH值被PH调节剂调至7.2~8.0,其中,所述保存剂包括保存缓冲液、稳定剂、防腐剂;稳定剂包括酪蛋白、NaCl、甘油和乳糖,甘油和乳糖作为悬浮剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,
在所述试剂R1中,所述缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液、或者100~150HEPES-NaOH缓冲液,所述表面活性剂为0.01~0.05% EMULGEN A90,所述稳定剂包含0.1~0.6% BSA和100~120mmol/L NaCl,所述防腐剂为0.01~0.05% PC300溶液;
在所述试剂R2中,在所述目标抗体偶联的胶乳颗粒中,所述目标抗体为视黄醇结合蛋白RBP或者β2微球蛋白BMG。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,
所述目标抗体为视黄醇结合蛋白RBP时,在所述试剂R1中,所述缓冲液为100~150mmol/L PIPES-NaOH缓冲液;在所述试剂R2中,所述保存缓冲液为100~150mmol/LPIPES-NaOH缓冲液;
所述目标抗体为β2微球蛋白BMG时,在所述试剂R1中,所述缓冲液为100~150mmol/LHEPES-NaOH缓冲液;在所述试剂R2中,所述保存缓冲液为100~150mmol/L HEPES-NaOH缓冲液。
10.权利要求1所述的封闭剂,权利要求2所述的封闭液,权利要求3-5任一项中所述的试剂R2的制备方法,权利要求6所述的试剂R2,权利要求7-8任一项中所述的试剂盒,在制备胶乳试剂相关产品中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410116753.2A CN117647644B (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410116753.2A CN117647644B (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117647644A true CN117647644A (zh) | 2024-03-05 |
CN117647644B CN117647644B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=90043610
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410116753.2A Active CN117647644B (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117647644B (zh) |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006226982A (ja) * | 2005-02-18 | 2006-08-31 | Trans Parent:Kk | ブロッキング剤 |
US20060240438A1 (en) * | 2003-07-28 | 2006-10-26 | Yukio Nagasaki | Surface of base material being inhibited in non-specific adsorption |
JP2006308307A (ja) * | 2005-04-26 | 2006-11-09 | Toyo Kohan Co Ltd | 生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法および生体関連分子検出用キット |
US20120164644A1 (en) * | 2010-10-22 | 2012-06-28 | T2 Biosystems, Inc. | Nmr systems and methods for the rapid detection of analytes |
CN106950363A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-07-14 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂 |
CN108014365A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-11 | 沈伟 | 一种封闭剂水凝胶及其试剂盒和制备方法 |
US20180149643A1 (en) * | 2015-06-30 | 2018-05-31 | Imec Vzw | Surface Immobilization of an Analyte-Recognizing Molecule |
US20190032104A1 (en) * | 2016-01-21 | 2019-01-31 | T2 Biosystems, Inc. | Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods |
JP2020016568A (ja) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | Jsr株式会社 | 蛍光標識体、組織染色方法、蛍光標識体の製造方法及び蛍光標識体の安定化方法 |
CN116008569A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-04-25 | 北京万泰德瑞诊断技术有限公司 | 一种检测胃泌素17的试剂盒及其制备方法 |
CN116008547A (zh) * | 2022-11-16 | 2023-04-25 | 安徽恩禾生物技术有限公司 | 一种用于肿瘤早期筛查的试剂盒及其制备方法 |
CN116376535A (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-04 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种发光组合物及其制备方法和应用 |
-
2024
- 2024-01-29 CN CN202410116753.2A patent/CN117647644B/zh active Active
Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060240438A1 (en) * | 2003-07-28 | 2006-10-26 | Yukio Nagasaki | Surface of base material being inhibited in non-specific adsorption |
JP2006226982A (ja) * | 2005-02-18 | 2006-08-31 | Trans Parent:Kk | ブロッキング剤 |
JP2006308307A (ja) * | 2005-04-26 | 2006-11-09 | Toyo Kohan Co Ltd | 生体関連分子の非特異的吸着を阻害する方法および生体関連分子検出用キット |
US20120164644A1 (en) * | 2010-10-22 | 2012-06-28 | T2 Biosystems, Inc. | Nmr systems and methods for the rapid detection of analytes |
US20180149643A1 (en) * | 2015-06-30 | 2018-05-31 | Imec Vzw | Surface Immobilization of an Analyte-Recognizing Molecule |
US20190032104A1 (en) * | 2016-01-21 | 2019-01-31 | T2 Biosystems, Inc. | Rapid antimicrobial susceptibility testing using high-sensitivity direct detection methods |
CN106950363A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-07-14 | 四川迈克生物科技股份有限公司 | 抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂 |
CN108014365A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-11 | 沈伟 | 一种封闭剂水凝胶及其试剂盒和制备方法 |
JP2020016568A (ja) * | 2018-07-26 | 2020-01-30 | Jsr株式会社 | 蛍光標識体、組織染色方法、蛍光標識体の製造方法及び蛍光標識体の安定化方法 |
CN116376535A (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-04 | 科美博阳诊断技术(上海)有限公司 | 一种发光组合物及其制备方法和应用 |
CN116008547A (zh) * | 2022-11-16 | 2023-04-25 | 安徽恩禾生物技术有限公司 | 一种用于肿瘤早期筛查的试剂盒及其制备方法 |
CN116008569A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-04-25 | 北京万泰德瑞诊断技术有限公司 | 一种检测胃泌素17的试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
张鹏飞;宋杰;陈佳;陆慧琦;韩焕兴;: "量子点与抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的偶联研究", 分析化学, no. 06, 15 June 2013 (2013-06-15), pages 846 - 850 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN117647644B (zh) | 2024-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112730839B (zh) | 一种磁微粒化学发光法测定细胞角蛋白19片段含量的试剂盒 | |
CN109596843B (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂盒 | |
CN104198723A (zh) | 一种基于氨基酸间臂的ngal快速检测试剂盒 | |
CN104034893B (zh) | 一种基于胶乳的三聚氰胺快速检测方法及试剂盒 | |
CN110736837B (zh) | 神经元特异性烯醇化酶的胶乳免疫比浊检测试剂盒 | |
CN113267635B (zh) | 一种脂联素抗体纳米胶乳颗粒及用于检测脂联素的试剂盒 | |
CN112526134A (zh) | 一种壳多糖酶3样蛋白1测定试剂盒 | |
CN111337691A (zh) | 一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
CN110907639A (zh) | 血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法 | |
CN102662064A (zh) | 检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的免疫比浊试剂盒及其制备方法 | |
CN110806487A (zh) | 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法 | |
WO2021088730A1 (zh) | 游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法 | |
CN111596072A (zh) | 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定pth的试剂盒及其制备使用方法 | |
CN113125753B (zh) | 一种用于检测尘螨组分特异性抗体的试剂盒 | |
CN114544934A (zh) | 一种曲霉半乳甘露聚糖检测试纸条及其应用 | |
CN111912990B (zh) | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 | |
CN107942068B (zh) | β2-微球蛋白测定试剂盒 | |
CN116008569B (zh) | 一种检测胃泌素17的试剂盒及其制备方法 | |
CN117647644B (zh) | 一种封闭剂及其在免疫检测中的应用 | |
CN111320696A (zh) | 基于链霉亲和素化胶乳的mmp-3抗体复合物及其试剂盒 | |
CN112014576A (zh) | 检测人血清淀粉样蛋白a的试剂及其制备方法 | |
US20190011451A1 (en) | Methods and compositions for assaying blood levels of legumain | |
CN114200129B (zh) | 组织金属蛋白酶抑制剂-2胶乳免疫比浊法血尿同检试剂盒 | |
CN115561450A (zh) | 用于检测触珠蛋白含量的试剂盒 | |
CN111308080B (zh) | 一种均相法肌酸激酶化学发光检测试剂及制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |