CN117538449A - 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法 - Google Patents

一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117538449A
CN117538449A CN202311540604.0A CN202311540604A CN117538449A CN 117538449 A CN117538449 A CN 117538449A CN 202311540604 A CN202311540604 A CN 202311540604A CN 117538449 A CN117538449 A CN 117538449A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pepper
peak
mobile phase
solution
characteristic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311540604.0A
Other languages
English (en)
Inventor
唐双燕
魏家保
张辉
谭沛
蔡素琴
黄凯伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Resources Sanjiu Modern Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
China Resources Sanjiu Modern Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Resources Sanjiu Modern Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Co ltd filed Critical China Resources Sanjiu Modern Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202311540604.0A priority Critical patent/CN117538449A/zh
Publication of CN117538449A publication Critical patent/CN117538449A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
    • G01N30/8686—Fingerprinting, e.g. without prior knowledge of the sample components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G01N30/94—Development
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography
    • G01N30/94—Development
    • G01N2030/945—Application of reagents to undeveloped plate

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Library & Information Science (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法。该方法包括供试品溶液的制备，采用了特定的梯度洗脱程序，测定；该方法为胡椒产品的质量稳定奠定了坚实的基础，能够建立可行的质量标准，实现了胡椒质量的有效控制，该构建方法得到的特征图谱中各个特征峰之间的分离度好，特征峰的响应值较好，且能够有效指认胡椒中的有效成分，方法更准确、可靠。本发明适用于白胡椒和黑胡椒。

Description

一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法。
背景技术
胡椒，胡椒科胡椒属的多年生木质藤本植物，2020版《中国药典》规定胡椒为胡椒科植物胡椒Piper nigrum L.的干燥近成熟或成熟果实。秋末至次春果实呈暗绿色时采收，晒干，为黑胡椒；果实变红时采收，用水浸渍数日，擦去果肉，晒干，为白胡椒。现有技术关于胡椒的研究较少，得到图谱的特征峰的分离度极差，难以对峰进行判断，无法达到判断药材质量的目的。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术难以判断胡椒药材质量，得到的胡椒特征图谱中特征峰分离度差等缺陷，从而提供一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
本发明第一方面提供了一种胡椒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取供试品制成供试品溶液；
测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件包括：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序：0-5min，20％→30％流动相A，80％→70％流动相B；5-6min，30％→40％流动相A，70％→60％流动相B；6-20min，40％流动相A，60％流动相B；20-30min，40％→45％流动相A，60％→55％流动相B。
所述色谱条件还包括：柱温为33-37℃；和/或，流速为0.28-0.32ml/min；和/或，检测波长：0-7min为285nm，7-30min为380nm；和/或，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；和/或，进样量为2-5μL。
所述色谱条件：柱温为35℃；和/或，流速为0.3ml/min；和/或，理论板数按胡椒碱峰计算应不低于5000；和/或，进样量为2μL。
所述胡椒为黑胡椒和/或白胡椒；
优选地，所述供试品为胡椒药材、胡椒饮片、胡椒汤剂、胡椒配方颗粒和胡椒标准汤剂冻干粉中的至少一种。
所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品，加溶剂，提取，滤过；
优选地，所述溶剂为有机溶剂；
优选地，所述提取的溶剂为30-70％的甲醇水溶液或者乙醇水溶液；
优选地，供试品的质量(g)与溶剂的体积(ml)的比值为(0.1-0.5):(10-50)。
所述构建方法还包括参照物溶液的制备；
优选地，所述参照物溶液的制备方法包括：取对照药材，加水提取，得到水提取物；在水提取物中加入溶剂，经二次提取、过滤；
优选地，在制备所述参照物溶液时，水提取物的质量(g)与提取溶剂的体积(ml)的比值为(0.4-1.0):(20-100)。
所述构建方法得到的特征图谱包括6个特征峰；
以3号峰为参照物峰，1号峰、2号峰、4号峰、5号峰、6号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.40、0.78、1.50、1.60、1.68；
其中，特征峰的相对保留时间在规定值的±10％。
本发明第二方面提供了一种胡椒的薄层鉴别方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备；
对照品溶液的制备；
取供试品溶液，点样，以三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的混合液作为展开剂，展开，取出，检视。
进一步地，所述三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的体积比为(5-10):(1-5):(1-3)。
所述三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的体积比为7:2:1。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的胡椒特征图谱的构建方法，该方法包括供试品溶液的制备，采用了特定的梯度洗脱程序，测定；该方法为胡椒产品的质量稳定奠定了坚实的基础，能够建立可行的质量标准，实现了胡椒质量的有效控制，该构建方法得到的特征图谱中各个特征峰之间的分离度好，特征峰的响应值较好，且能够有效指认胡椒中的有效成分，方法更准确、可靠。本发明适用于白胡椒和黑胡椒。
2.本发明提供的胡椒薄层鉴别方法，该鉴别方法以胡椒碱为阳性对照品进行鉴别，斑点Rf值适中，斑点清晰，分离度好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是对照药材参照物的色谱图；图2是黑胡椒标准汤剂冻干粉的图谱；图3是本发明实验例1中对比实验1-7得到的色谱图；图4是本发明实验例1不同波长得到的色谱图；图5是本发明实验例1中各个特征峰在不同紫外吸收光下的图谱；图6是本发明实验例2耐用性实验考查时，不同柱温得到的图谱；图7是本发明实验例2耐用性实验考查时，不同流速得到的图谱；图8是本发明实验例2耐用性实验考查时，不同色谱柱得到的图谱；图9是本发明实验例2耐用性实验考查时，不同色谱仪得到的图谱；图10是本发明实验例3黑胡椒药材、黑胡椒饮片和黑胡椒标准汤剂冻干粉得到的对照图谱；图11是本发明实施例3不同批次白胡椒标准汤剂冻干粉的图谱；图12是本发明实施例4黑胡椒标准汤剂冻干粉薄层鉴别图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
仪器：
色谱仪1：Waters超高效液相色谱仪；色谱仪2：Agilent超高效液相色谱仪；色谱仪3：赛默飞超高效液相色谱仪。色谱柱1：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100mm，1.8μm)；色谱柱2：Agilent Extend C18(2.1×100mm，1.8μm)；色谱柱3：Waters ACQUITY CSH C18(2.1×100mm，1.7μm)；色谱柱4：Agilent SB C18(2.1×100mm，1.8μm)。小熊煎药锅(机械型500W)-砂锅煎药壶JYH-C30A1，小熊电器股份有限公司。硅胶G预制板：青岛海洋化工厂分厂；硅胶G预制板：烟台德信生物科技有限公司。ZF-20D暗箱式紫外分析仪：上海宝山顾村电光仪器厂。TH-II型薄层加热器：上海科哲生化科技有限公司。定量毛细管：Hirschmann；1μL、3μL、5μL。
药剂：
胡椒碱对照品，纯度≥98.9％，批号：110775-201706，中国食品药品检定研究院；胡椒对照药材(黑胡椒)，批号：121440-200401，中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯，34860-4L-R，sigma公司)，甲醇(分析级，20211008，天津市风船化学试剂科技有限公司)，无水乙醇(AR，20211001420，天津市致远化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，34851-4，sigma公司)。
18批黑胡椒饮片的批号：2103001Y、2103002Y、2103003Y、2103004Y、2103005Y、2103006Y、2103007Y、2103008Y、2103009Y、2103010Y、2103011Y、2103012Y、2103013Y、2103014Y、2103015Y、220701Y、220702Y、220703Y；分别记为Y1-Y18；其中，Y1-Y 3饮片产地为海南文昌市，Y4-Y6饮片产地为海南琼海市，Y7-Y9饮片产地为广东高州市，Y10-Y12饮片产地为云南腾冲县，Y13-Y15饮片产地为云南绿春县，Y16-Y18饮片产地为海南琼海市。S1-S18是对应批号为Y1-Y18批黑胡椒饮片制成的黑胡椒标准汤剂冻干粉的批号。
实施例1
本实施例提供了一种黑胡椒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取黑胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
参照物溶液的制备：取胡椒(黑胡椒)对照药材0.6g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
对照品溶液的制备：取胡椒碱对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml对照品溶液含30μg的溶液。
测定：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(规格：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长0～7min为285nm，7min～结束为380nm；理论板数按胡椒碱峰计算应不低于5000；梯度洗脱的程序：0-5min，20％→30％流动相A，80％→70％流动相B；5-6min，30％→40％流动相A，70％→60％流动相B；6-20min，40％流动相A，60％流动相B；20-30min，40％→45％流动相A，60％→55％流动相B。
分别精密吸取供试品溶液、参照物溶液和对照品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
特征峰的确认和指认
取18批黑胡椒标准汤剂冻干粉按照上述方法测定，得到18批黑胡椒标准汤剂冻干粉的保留时间和峰面积，见下表，采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征图谱。
18批黑胡椒标准汤剂冻干粉进行峰匹配，匹配18批次标准汤剂冻干粉供试品溶液特征图谱共有峰。根据对照药材特征峰、各峰分离及响应值情况筛选出6个特征峰，再与对照品进行比对，通过UPLC和LC/MS/MS对特征峰的识别和指认，3号峰为胡椒碱；18批标准汤剂冻干粉的图谱与对照药材参照物(图谱见图1)溶液相对应，以3号峰为参照物峰，特征图谱中6个特征峰相对于S峰的相对保留时间，相对峰面积进行统计，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，1号峰、2号峰、4号峰、5号峰、6号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.40、0.78、1.50、1.60、1.68，均在均值±10％范围内。其中，黑胡椒标准汤剂冻干粉的图谱见图2。
表1 18批黑胡椒饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间
表2 18批黑胡椒饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积
采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用方法(UPLC-Q-TOF/MS)对黑胡椒样品进行分析，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，对目标峰进行鉴定，并采用对照品定位和光谱研究，确认1号峰为N-反式阿魏酰酪胺，2号峰为胡椒林碱，3号峰为胡椒碱，4号峰为胡椒亭碱。LC/MS/MS分析结构具体定位图谱见下表。
表3黑胡椒质谱分析
实验例1色谱条件的考察
(1)本实验例考察了色谱条件，以色谱条件为变量提供了7组对比实验，各个对比实验的条件如下，结果见图3，其它同实施例1。
对比实验1：以Agilent SB C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为333nm，梯度洗脱，程序如下：
时间(min) 流动相A乙腈(％) 流动相B水(％)
0～5 23→30 77→70
5～7 30→39 70→61
7～10 39→40 61→60
10～20 40→42 60→58
20～35 42→43 58→57
对比实验2：以Agilent extend C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为30℃，流速为0.2ml/min，检测波长为333nm，梯度洗脱，程序如下：
时间(min) 流动相A乙腈(％) 流动相B水(％)
0～5 20→30 80→70
5～7 30→35 70→65
7～10 35→38 65→62
10～20 38→41 62→59
20～35 41→42 59→58
对比实验3：以Agilent extend C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃，流速为0.2ml/min，检测波长7min前为285nm，7min后为380nm，梯度洗脱，程序如下：
时间(min) 流动相A乙腈(％) 流动相B水(％)
0～5 22→30 78→70
5～6 30→36 70→64
6～20 36→37 64→63
20～25 37→41 63→59
25～40 41→42 59→58
对比实验4：以Agilent extend C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃，流速为0.3ml/min，检测波长：7min前为285nm，7min后为380nm，梯度洗脱，程序如下：
时间(min) 流动相A乙腈(％) 流动相B水(％)
0～5 20→30 80→70
5～6 30→40 70→60
6～15 40 60
15～20 40→45 60→55
对比实验5：以Agilent extend C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃，流速为0.3ml/min，检测波长为7min前为285nm，7min后为380nm，梯度洗脱，程序如下：
时间(min) 流动相A乙腈(％) 流动相B水(％)
0～5 20→30 80→70
5～6 30→40 70→60
6～20 40 60
20～30 40→45 60→55
对比实验6：以Waters CSH C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为35℃，流速为0.3ml/min，检测波长为7min前为285nm，7min后为380nm，梯度洗脱，梯度洗脱程序同对比实验5。
对比实验7：以Eclipse plus C18为色谱柱，规格为2.1mm×100mm，1.8μm；柱温为35℃，流速为0.3ml/min，检测波长为7min前为285nm，7min后为380nm，梯度洗脱，梯度洗脱程序同对比实验5。
从上述结果可以看出，对比实验1得到的图谱中的色谱峰在30min后的分离效果不佳。对比实验2得到的色谱峰间的分离度有待进一步优化。对比实验3结果显示各峰在285nm和380nm下有较大的吸收，在此基础上进行优化，进行对比实验4和对比实验5，对这两组实验进行比较可以看出对比实验5得到的特征图谱较好。在对比实验5的基础上调整色谱柱，进行对比实验6和对比实验7，结果表明，对比实验7得到的图谱中各色谱峰的分离效果最优，因此，色谱条件最终确定为：优选对比实验5中的洗脱程序，吸收波长在7min之前选用285nm，7min之后选用380nm，流速为0.3ml/min，柱温为35℃。
(2)波长的考察
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉，以检测波长为变量，按照实施例1制备供试品溶液并测定，得到不同波长下的特征图谱，见图4；其中，波长分别为220nm、285nm、320nm、380nm。结合各特征峰在不同紫外吸收光的图谱(见图5)，结果表明前7min最大吸收为285nm,7min后为380nm。因此，检测波长优选：7min前选用285nm，7min后选用380nm。
实验例2方法学考察
2.1精密度实验
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉，按照实施例1制备供试品，并连续进样6次，记录色谱图，以3号峰胡椒碱为参照峰，计算其它峰的相对保留时间和峰面积，结果见下表。结果表明各色谱峰相对保留时间及相对峰面积RSD均小于1.0％，表明仪器精密度良好。
表4仪器精密度实验色谱峰相对保留时间结果
表5仪器精密度实验色谱峰相对峰面积结果
2.2中间精密度实验不同操作人员
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉，由3名不同检验员在不同时间按照实施例1制备供试品溶液，并采用同一台设备测定各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果表明，各特征峰相对保留时间RSD均较小，部分特征峰相对峰面积较接近，总体说明该方法中间精密度良好。
表6中间精密度相对保留时间实验结果
表7中间精密度相对峰面积实验结果
2.3重复性实验
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉，按照实施例1制备6份供试品溶液，测定，结果见下表。结果表明本发明方法重复性良好。
表8重复性实验-相对保留时间
表9重复性实验-相对峰面积
2.4稳定性实验
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉按照实施例1制备供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24小时进样，测定。结果表明各共有峰相对保留时间RSD值小于1.0％，各特征峰相对峰面积均值小于6.2％，说明供试品溶液在24h内稳定。
表10稳定性实验-相对保留时间
表11稳定性实验-相对峰面积
2.5耐用性实验
(1)不同柱温
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，以柱温为变量，柱温分别为33℃、35℃、37℃，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见下表和图6，结果表明不同柱温对色谱峰相对保留时间影响不大，说明方法耐用性良好。
表12不同柱温实验-相对保留时间
表13不同柱温实验-相对峰面积
(2)不同流速
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，以流速为变量，流速分别为0.28mL/min、0.30mL/min、0.32mL/min，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见下表和图7，结果表明不同流速对色谱峰相对保留时间及相对峰面积影响不大，说明本发明方法耐用性良好。
表14不同流速实验-相对保留时间
表15不同流速实验-相对峰面积
(3)不同色谱柱
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，以色谱柱为变量，色谱柱1-3分别为Agilent Eclipse Plus C18、Agilent Extend C18、Waters CSH-C18，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见下表和图8，考虑到不同色谱柱对峰1的相对峰面积的影响，优选色谱柱1：Agilent Eclipse Plus。
表16不同色谱柱实验-相对保留时间
表17不同色谱柱实验-相对峰面积
(4)不同色谱仪
取同一批黑胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，以色谱仪为变量，色谱仪1-3分别为Waters、Agilent、赛默飞色谱仪，按照实施例1制备供试品溶液并测定，结果见下表和图9。结果表明不同色谱仪对色谱峰相对保留时间影响不大，综合评估该方法对不同仪器耐用性较好。
表18不同色谱仪实验-相对保留时间
表19不同色谱仪实验-相对峰面积
实验例3考察不同制剂得到的图谱
取18批黑胡椒药材、18批黑胡椒饮片和18批黑胡椒标准汤剂冻干粉，按照实施例1制备供试品溶液并测定，分别得到拟合后的特征图谱，见下表和图10，图10中的S1为黑胡椒药材得到的对照图谱，S2为黑胡椒饮片得到的对照图谱，S3为黑胡椒标准汤剂冻干粉得到的对照图谱。比较不同制剂得到的特征图谱，结果表明，不同制剂得到的特征图谱的特征峰数量差异小，黑胡椒药材经炮制加工为饮片，再经水煎煮过程制成冻干粉，该过程不会使不同剂型的黑胡椒的主要化学成分发生较大变化，量值传递性较好，本发明方法适用于不同剂型的黑胡椒，例如黑胡椒标准汤剂冻干粉、黑胡椒药材、黑胡椒饮片、黑胡椒配方颗粒等。
表20黑胡椒药材、黑胡椒饮片、黑胡椒标准汤剂冻干粉的对照图谱相对保留时间
表21黑胡椒药材、黑胡椒饮片、黑胡椒标准汤剂冻干粉的对照图谱的相对峰面积
实施例2
本实施例提供了一种黑胡椒标准汤剂冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
取黑胡椒药材，经除去杂质的炮制工艺作为黑胡椒饮片，取黑胡椒饮片约200g，破碎，破碎度不低于90％，置砂锅中，加入8倍水浸泡30min，先武火(500W)煮沸，再文火(300W)煎煮30min，200目滤布趁热过滤；药渣再加6倍水，武火(500W)煮沸后，再文火(300W)煎煮25分钟，200目滤布趁热过滤，合并滤液，滤液减压(65℃)浓缩至料液比接近1:4浓浸膏，置于冷冻干燥机中，冷冻干燥(-40℃，110kpa)至干，粉碎成粉末，即得黑胡椒标准汤剂冻干粉。
取18批黑胡椒饮片(Y1-Y18)按照上述方法制得18批黑胡椒标准汤剂冻干粉(批号S1-S18)，每批饮片平行制备两份标准汤剂冻干粉，计算出膏率的均值，并按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求，规定黑胡椒的出膏率范围。各批次饮片的出膏率以及规定出膏率范围如下表所示：
表22不同批号饮片得到的出膏率
上述结果说明：实测出膏率在10.4％-16.8％之间，平均出膏率为14.0％，SD为1.4％，均值±30％的波动范围9.8％-18.2％，规定胡椒饮片在制备标准汤剂时的出膏率范围为10％-17％，符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》要求。
采用上述方法制得的黑胡椒标准汤剂冻干粉的性状：本品为黄棕色至棕色的粉末；气微香，味辛辣；出率：胡椒饮片标准汤剂(冻干粉)出膏率范围为10％-17％；溶化性：照溶化性检查方法(中国药典2020年版通则0104)检查，加热水200ml，搅拌5分钟(必要时加热煮沸)，立即观察，应全部溶化或轻微浑浊，不得有焦屑；浸出物：取本品适量，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇100ml，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，不得少于6.0％；本品每1g含胡椒碱(C17H19NO3)应为12.0mg-30.0mg。
本实施例还提供了黑胡椒饮片中有效成分含量的测定方法，包括：
胡椒中含有多种成分，主要包括酰胺类生物碱、挥发油、有机酸、木脂素、酚类和微量元素等，其中，生物碱和挥发油是其最主要的活性成分，生物碱中胡椒碱含量最高、活性最广。《中国药典》将胡椒碱作为胡椒药材的含量指标成分，暂定以胡椒碱作为胡椒药材、标准汤剂冻干粉的含量指标成分。
取18批胡椒标准汤剂冻干粉样品(每个批号冻干粉对应两个平行样品)，按实施例1提供的方法和色谱条件测定各批次标准汤剂冻干粉中胡椒碱含量并计算转移率。按照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求，规定标准汤剂冻干粉中胡椒碱含量转移率范围。各批次标准汤剂冻干粉胡椒碱含量及转移率，以及规定范围见下表。
表23 18批次饮片标准汤剂冻干粉含量转移率及范围
/>
结论：由上表可知，各批次标准汤剂冻干粉中胡椒碱含量实测平均转移率范围为3.5％-7.9％，均值5.5％，SD为1.4％，均值±30％的波动范围为3.9-7.2％。规定胡椒标准汤剂冻干粉中胡椒碱含量转移率范围为4.0％-8.0％，符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求。胡椒饮片标准汤剂冻干粉胡椒碱含量均值17.8mg/g，最小值11mg/g，最大值30.2mg/g。
实施例3
本实施例提供了一种白胡椒特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取白胡椒标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液。
参照物溶液的制备：取胡椒(白胡椒)对照药材0.6g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇20ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
对照品溶液的制备：取胡椒碱对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml对照品溶液含30μg的溶液。
测定：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(规格：柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B；梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.3ml；检测波长0～7min为285nm，7min～结束为380nm；理论板数按胡椒碱峰计算应不低于5000；梯度洗脱的程序：0-5min，20％→30％流动相A，80％→70％流动相B；5-6min，30％→40％流动相A，70％→60％流动相B；6-20min，40％流动相A，60％流动相B；20-30min，40％→45％流动相A，60％→55％流动相B。
分别精密吸取供试品溶液、参照物溶液和对照品溶液各2μL，注入液相色谱仪，测定，即得。取15批白胡椒标准汤剂冻干粉按照上述方法测定，得到15批白胡椒标准汤剂冻干粉的图谱，见下表和图11，匹配15批次标准汤剂冻干粉供试品溶液特征图谱共有峰。15批标准汤剂冻干粉的图谱与对照药材参照物溶液相对应，以3号峰为参照物峰，特征图谱中6个特征峰相对于S峰的相对保留时间，相对峰面积进行统计，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。实验结果说明本发明方法适用于白胡椒。
表24 15批白胡椒饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对保留时间
表25 15批白胡椒饮片标准汤剂(冻干粉)特征图谱相对峰面积
实施例4
本实施例提供了黑胡椒标准汤剂冻干粉的薄层鉴别方法，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取18批黑胡椒冻干粉粉末(S1-S18)0.5g，分别加无水乙醇15ml，超声处理30min，滤过，得到滤液，即18批冻干粉对应的供试品溶液。
对照品溶液的制备：取胡椒碱对照品，加无水乙醇，制成每1ml含4mg对照品的溶液。
分别吸取供试品溶液5μL和对照品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板，以体积比为7:2:1的三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的混合液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置于紫外灯(365nm)下检视，结果见图12。图中自左至右依次对应D1-D18、胡椒碱对照品的色谱图，结果表明供试品色谱与胡椒碱对照品在相同的位置上显示相同的浅黄色荧光斑点。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种胡椒特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备：取供试品制成供试品溶液；
测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件包括：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序：0-5min，20％→30％流动相A，80％→70％流动相B；5-6min，30％→40％流动相A，70％→60％流动相B；6-20min，40％流动相A，60％流动相B；20-30min，40％→45％流动相A，60％→55％流动相B。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：柱温为33-37℃；和/或，流速为0.28-0.32ml/min；和/或，检测波长：0-7min为285nm，7-30min为380nm；和/或，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；和/或，进样量为2-5μL。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述色谱条件：柱温为35℃；和/或，流速为0.3ml/min；和/或，理论板数按胡椒碱峰计算应不低于5000；和/或，进样量为2μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述胡椒为黑胡椒和/或白胡椒；
优选地，所述供试品为胡椒药材、胡椒饮片、胡椒汤剂、胡椒配方颗粒和胡椒标准汤剂冻干粉中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法包括：取供试品，加溶剂，提取，滤过；
优选地，所述溶剂为有机溶剂；
优选地，所述提取的溶剂为30-70％的甲醇水溶液或者乙醇水溶液；
优选地，供试品的质量(g)与溶剂的体积(ml)的比值为(0.1-0.5):(10-50)。
6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，还包括参照物溶液的制备；
优选地，所述参照物溶液的制备方法包括：取对照药材，加水提取，得到水提取物；在水提取物中加入溶剂，经二次提取、过滤；
优选地，在制备所述参照物溶液时，水提取物的质量(g)与提取溶剂的体积(ml)的比值为(0.4-1.0):(20-100)。
7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法得到的特征图谱包括6个特征峰；
以3号峰为参照物峰，1号峰、2号峰、4号峰、5号峰、6号峰的相对保留时间的规定值分别为：0.40、0.78、1.50、1.60、1.68；
其中，特征峰的相对保留时间在规定值的±10％。
8.一种胡椒的薄层鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
供试品溶液的制备；
对照品溶液的制备；
取供试品溶液，点样，以三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的混合液作为展开剂，展开，取出，检视。
9.根据权利要求8所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的体积比为(5-10):(1-5):(1-3)。
10.根据权利要求8或9所述的薄层鉴别方法，其特征在于，所述三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮的体积比为7:2:1。
CN202311540604.0A 2023-11-17 2023-11-17 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法 Pending CN117538449A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311540604.0A CN117538449A (zh) 2023-11-17 2023-11-17 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311540604.0A CN117538449A (zh) 2023-11-17 2023-11-17 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117538449A true CN117538449A (zh) 2024-02-09

Family

ID=89795313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311540604.0A Pending CN117538449A (zh) 2023-11-17 2023-11-17 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117538449A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113791165A (zh) 一种炒蔓荆子标准汤剂质量检测方法
CN113917041B (zh) 一种牡丹皮标准汤剂质量检测方法
CN113552271A (zh) 一种刺五加标准汤剂质量控制方法
CN113933445A (zh) 一种石斛标准汤剂质量控制方法
CN114778739B (zh) 一种炒鸡内金标准汤剂质量检测方法
CN101091749A (zh) 头花蓼药材、提取物及其质量控制方法
CN104398580A (zh) 一种火麻仁对照提取物的制备方法与用途
CN117538449A (zh) 一种胡椒特征图谱的构建方法和薄层鉴别方法
CN110895265A (zh) 一种瓜蒌配方颗粒基源鉴定的方法
CN114441685B (zh) 一种重楼标准汤剂质量检测方法
CN113156010B (zh) 一种厚朴温中汤物质基准的质量控制方法
CN115541728A (zh) 一种红花药材及红花药物制剂的特征图谱构建方法及应用
CN110927274B (zh) 一种同时检测便通胶囊中六种成分含量的方法
CN112843124A (zh) 一种丹参配方颗粒的制备方法及其质量标准
CN113325095B (zh) 地榆药材的uplc指纹图谱构建方法和检测方法
CN114894920B (zh) 一种区分北苍术与茅苍术水提物的方法
CN115420827B (zh) 一种全面控制叶下珠质量的检测方法
CN114113348B (zh) 玫瑰花标准汤剂制法、特征图谱及含量测定方法
CN115452964B (zh) 锦灯笼的uplc特征图谱构建方法及质量控制方法
CN114577974B (zh) 一种刘寄奴标准汤剂质量检测方法
CN114965842B (zh) 口炎清整体质量检测方法及应用
CN117405804A (zh) 一种南瓜子及制剂的特征图谱、构建方法及质量检测方法
CN116879445A (zh) 地榆和长叶地榆配方颗粒特征图谱构建方法和鉴别方法
CN116165322A (zh) 甘草药材的质量控制方法
CN116165321A (zh) 鱼腥草药材的质量控制方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination