CN116165322A

CN116165322A - 甘草药材的质量控制方法

Info

Publication number: CN116165322A
Application number: CN202111417405.1A
Authority: CN
Inventors: 吴相君; 果德安; 姚帅; 笪娟; 张创峰; 吴盼盼; 薛磊; 孙云波; 刘艺; 沈硕; 安堃; 王翠玲
Original assignee: Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2023-05-26

Abstract

本发明关于中药材质量控制技术领域，尤其涉及甘草药材的质量控制方法。该质量控制方法包括甘草的理化鉴别、指纹图谱、含量测定等检测项目，其中理化鉴别以甘草酸铵、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定和甘草酸为质量控制指标，并优化了薄层色谱鉴别方法，在操作简便的同时还能使上述化合物均能在薄层板上清楚地显示出来，专属性和耐用性均良好。本发明还优化了指纹图谱和含量测定方法中的供试品溶液制备方法以及色谱条件，使指纹图谱以及含量测定在精密度、专属性、稳定性、耐用性等方面均良好，从而有利于对甘草药材的质量进行检测。

Description

甘草药材的质量控制方法

技术领域

本发明关于中药材质量控制技术领域，尤其涉及甘草药材的质量控制方法。

背景技术

根据1977年版～2010年版《中国药典》规定，甘草药材为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。甘草Glycyrrhiza uralensis Fish通常被称为乌拉尔甘草，根据近代对本草的研究，我国历代本草记载甘草均为乌拉尔甘草，2015年版《中国药典》一部规定的甘草药材来源也是甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.，不包括胀果甘草和光果甘草.(即2015年版《中国药典》一部规定的))。虽然甘草、胀果甘草、光果甘草都曾被收录在药典中，但三者所含化学成分并不完全相同，故临床功效也有区别，在使用过程中应有针对性地选择，才能达到理想的临床效果。然而，三种来源的甘草药材外观性状并不容易区分，通过目前药典所记载的鉴别方法不易准确鉴别。

另一方面，甘草药材产地、采集时间、加工方式、储存条件对质量产生的影响，与甘草名称相近的其他药材(如苦甘草)被误购的可能性，均会影响到含甘草的成方制剂的用药安全性和有效性。

因此，对于中成药生产企业来说，提高甘草药材的质量控制标准，严格把控其购入甘草的来源、真伪和质量，对于保障用药人群安全性和有效性具有非常重要的意义。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供一种甘草药材的质量控制方法，该质量控制方法包括甘草的鉴别、指纹图谱、含量测定等检测项目，与现有技术相比，能够更准确地检测甘草药材的质量。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种甘草药材的质量控制方法，包括以甘草酸铵、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定和甘草酸作为理化鉴别的质量控制指标进行薄层色谱鉴别；

所述薄层色谱鉴别中供试品溶液的制备方法为：取待测样品粉末，以70％～100％v/v甲醇超声提取12～17min，固液分离，取液相部分，即得供试品溶液；

展开剂为体积比为15:1:1:2的乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水；

薄层板为GF254硅胶板；

检视方法：薄层板展开后，取出，喷以10％硫酸甲醇，晾干，102～108℃加热2～5min，置366nm下检视。

其中10％硫酸甲醇即浓硫酸体积百分浓度为10％的甲醇溶液。

目前《中国药典》中对于甘草的理化鉴别以甘草酸铵为质量控制指标，但检测甘草酸铵时，需要先用甲醇回流提取1h，蒸干后溶解，再用正丁醇提取3次，以水洗涤，蒸干后再以甲醇溶解，操作非常繁琐。另一方面，自然界中还存在含有甘草酸铵的其他植物，单以甘草酸铵作为理化鉴别的质量控制指标不足以准确鉴定甘草真伪。本发明筛选出的上述作为质量控制指标的化合物存在于甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.来源的合格甘草药材中，在胀果甘草中的含量与在乌拉尔甘草中的含量有明显不同，与苦甘草的含量差异则更为显著，故能够有效判断甘草来源、质量以及真伪。但若同时检测多种成分，则需要通过多次提取、多次鉴别的方式以使每种待测成分都能被准确鉴别出来，仍会需要繁琐操作。

为了简化操作流程并同时使甘草酸铵、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定和甘草酸被分离并显示出来，本发明对甘草理化鉴别的供试品溶液制备方法和薄层色谱条件进行了试验研究，并最终选择了上述供试品溶液的制备方法和薄层色谱条件，所得供试品溶液在上述薄层色谱条件下能够清楚地显示出甘草酸铵以及甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定、甘草酸的斑点，可有效鉴别甘草、胀果甘草及其伪品，专属性好，且耐用性良好。

优选地，以甲醇超声提取，每克所述样品粉末以8～12毫升甲醇超声提取。样品粉末和甲醇的比例进一步优选为1:10(g:mL)。以甲醇为溶剂制备供试品溶液，操作更便捷。

优选地，超声时间为15min。

优选地，固液分离方式为离心。

优选地，所述质量控制方法还包括指纹图谱质量控制方法，所述指纹图谱质量控制方法为高效液相色谱法，指标成分包括芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸；

供试品溶液的制备方法为：将待测样品粉末以50％v/v甲醇水溶液超声提取25～35min，固液分离后即得；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相A为乙腈，流动相B为0.035～0.065％磷酸溶液，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	7	93
2	20	80
			13	20	80
60	95	5

流速：0.4～0.6mL/min；

柱温：20～30℃；

检测波长为230nm。

上述线性梯度洗脱程序表示流动相比例在不同时间节点之间线性变化，如，流动相A的体积比在0～2min内由7％线性升至20％。

本发明对于供试品溶液的制备方法和色谱条件进行了考察，所得上述供试品溶液的制备方法能够提取获得较多的待测物，在上述色谱条件下，指标成分芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸的保留时间、峰面积、峰形、分离度等均较为理想。

优选地，所述色谱柱为Agilent Zorbax SB C18。使用该色谱柱时能够获得更佳的保留时间、峰面积、峰形、分离度。

优选地，磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；流速为0.5mL/min；柱温为25℃。

以甘草苷峰为标准峰(相对保留时间为1)，芹糖甘草苷的相对保留时间为0.87～0.92，甘草酸的相对保留时间为2.76～3.05。

优选地，所述质量控制方法还包括含量测定，用高效液相色谱法检测待测样品中的芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	21	79
8	21	79
			15	40	60
25	45	55

流速：0.8～1.2mL/min；

柱温：20～30℃；

检测波长为230nm。

本发明对于供试品溶液的制备方法和色谱条件进行了考察，所得上述供试品溶液的制备方法能够提取获得较多的待测物，在上述色谱条件下，指标成分保留时间、峰面积、峰形、分离度等均较为理想。

优选地，磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；流速为1.0ml/min；柱温为25℃。

优选地，所述测样品粉末与50％v/v甲醇水溶液的质量比体积为1:250(g：mL)。

甘草药材中的芹糖甘草苷在干燥品中的含量应不小于0.15％，甘草苷在干燥品中的含量应不小于0.20％，甘草酸在干燥品中的含量应不小于1.3％。

优选地，所述质量控制方法还包括性状鉴别和显微鉴别。

上述性状鉴别、显微鉴别应均符合《中国药典》2015年版中甘草项下的鉴别要求。

优选地，所述质量控制方法还包括水分检查、总灰分检查、酸不溶性灰分检查。按《中国药典》附录通则中的检测方法，水分应不超过12.0％，总灰分应不超过10.0％，酸不溶性灰分应不超过5.0％。

本发明的有益效果在于：本发明提供的甘草药材的质量控制方法能够准确鉴别甘草来源、真伪，并检测其质量，对于中成药生产企业把控其购入甘草的来源、真伪、质量，提高其含甘草的成方制剂产品的质量以及临床安全性和有效性具有积极作用。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1是本发明实施例3中用实施例1的展开剂得到的薄层色谱图；

图2是本发明实施例4中0h的薄层色谱图；

图3是本发明实施例4中24h的薄层色谱图；

图4是本发明实施例4中48h的薄层色谱图；

图5是本发明实施例4中在默克薄层板上展开得到的薄层色谱图1；

图6是本发明实施例4中在默克薄层板上展开得到的薄层色谱图2；

图7是本发明实施例4中在MN薄层板上展开得到的薄层色谱图；

图8是本发明实施例4中22.5℃，RH62％条件下得到的薄层色谱图；

图9是本发明实施例4中25.2℃，RH62％条件下得到的薄层色谱图；

图10是本发明实施例4中28.5℃，RH70％条件下得到的薄层色谱图；

图11是本发明实施例4中24.1℃，RH48％条件下得到的薄层色谱图；

图12是本发明实施例4中检测甘草酸铵时在ADC2-170409展开仪中得到的薄层色谱图；

图13是本发明实施例4中检测甘草酸铵时在ADC2-230010展开仪中得到的薄层色谱图；

图14是本发明实施例5中各批次甘草的薄层色谱图；

图15是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的连续进样精密度试验结果；

图16是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的重复性试验结果；

图17是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的中间精密度试验结果；

图18-1是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中空白溶剂的高效液相色谱图；

图18-2是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中芹糖甘草苷的高效液相色谱图；

图18-3是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中甘草苷的高效液相色谱图；

图18-4是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中异甘草苷的高效液相色谱图；

图18-5是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中芹糖异甘草苷的高效液相色谱图；

图18-6是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中甘草酸的高效液相色谱图；

图18-7是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的专属性试验结果中供试品溶液的高效液相色谱图；

图19是本发明实施例6中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的稳定性试验结果；

图20是本发明实施例7中甘草对照指纹图谱；

图21是本发明实施例7中15批甘草药材指纹图谱测定结果；

图22-1是本发明实施例8中专属性试验结果中空白溶剂的高效液相色谱图；

图22-2是本发明实施例8中专属性试验结果中芹糖甘草苷的高效液相色谱图；

图22-3是本发明实施例8中专属性试验结果中甘草苷的高效液相色谱图；

图22-4是本发明实施例8中专属性试验结果中甘草酸的高效液相色谱图；

图22-5是本发明实施例8中专属性试验结果中供试品溶液的高效液相色谱图；

图23是本发明实施例8中线性考察试验结果；

图24是本发明对比例1中不同制备方法得到的供试品溶液进行甘草酸铵薄层色谱鉴别的薄层色谱图；

图25是本发明对比例2中用展开剂1得到的薄层色谱图；

图26是本发明对比例3中用展开剂2得到的薄层色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前《中国药典》对于甘草的理化鉴别以甘草酸铵为质量控制指标，但检测甘草酸铵时，供试品溶液的制备过程非常繁琐。并且，单以甘草酸铵作为理化鉴别的质量控制指标不足以准确鉴定甘草真伪。为了提高鉴定的准确度，本发明以甘草酸铵、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定和甘草酸作为理化鉴别的质量控制指标，并对甘草理化鉴别的供试品溶液制备方法和薄层色谱条件进行了试验研究，最终选择了供试品溶液的制备方法为：取待测样品粉末，以70％～100％v/v甲醇超声提取12～17min，固液分离，取液相部分，即得供试品溶液；薄层色谱条件中的展开剂为乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水(15:1:1:2)，薄层板为GF254硅胶板，检视方法为喷以10％硫酸甲醇，102～108℃加热2～5min，置366nm下检视。所得供试品溶液在上述薄层色谱条件下能够清楚地显示出甘草酸铵以及甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定、甘草酸的斑点，可有效鉴别甘草、胀果甘草及其伪品，专属性好，且耐用性良好。

本发明还增加了药材指纹图谱和含量测定方法，并对供试品溶液的制备方法进行了实验研究，考察了不同的提取溶剂和提取方法，提取试剂例如①中性溶剂：50％v/v甲醇水溶液，70％v/v甲醇水溶液，甲醇，50％v/v乙醇水溶液，70％v/v乙醇水溶液，乙醇，水；②碱性溶剂：8g/L氨水；③以8g/L氨水提取后再以磷酸调节pH；④以50％v/v甲醇水溶液与氨水的混合液为提取液提取后再以磷酸调节pH；等。结合上述不同提取试剂，本发明考察的提取方法包括超声、回流等，对不同溶剂在不同提取方式、提取时间、提取体积及提取次数下的提取效果进行了实验设计和验证。实验发现，中性溶剂中甲醇体系所提总含量高于乙醇体系，50％v/v甲醇水溶液提取效率在此系列中最高；碱性溶剂提取总含量较高但峰形较差；加碱提取后加酸调节，提取效率高但操作繁琐。最优提取溶剂为50％v/v甲醇水溶液。结合提取方法对提取效果的影响，最终确定的供试品溶液制备方法为：将待测样品粉末以50％v/v甲醇水溶液超声提取25～35min，固液分离后即得。

本发明还对指纹图谱测定以及含量测定的液相色谱条件进行了实验研究，考察了不同色谱柱、流动相系统、水相酸度、流动相程序、流速、进样量等色谱条件对于指标成分保留时间、峰面积、峰形、分离度等的影响。例如，在含量测定的液相色谱条件中考察了不同色谱柱(Waters XBridge C18，Agilent Eclipse Plus C18，Agilent ZORBAX SB C18等)、流动相系统(乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.05％磷酸等)、水相酸度(0.01％磷酸，0.05％磷酸，0.1％磷酸等)，流动相程序，流速(0.8mL/min，1.0mL/min，1.2mL/min等)，柱温(20℃，25℃和30℃)以及进样量(5μl，10μl和20μl)，确定了本发明中指纹图谱测定和含量测定的最佳色谱条件。经方法学验证，本发明中指纹图谱测定和含量测定方法专属性、精密度、稳定性、耐用性等均良好，可满足甘草药材指纹图谱测定和含量测定的要求。

上述鉴别、药材指纹图谱以及含量测定方法提高了甘草的质量标准，能够准确考察甘草药材的来源、质量和真伪，对于中成药生产企业把控其购入的甘草的来源、质量和真伪，提高其含甘草的成方制剂产品的质量以及临床安全性和有效性具有积极作用。

以下实施例中所采用的甘草药材匀来自甘肃，批号和具体产地如表1所示。

表1甘草药材产品信息

以下实施例中薄层色谱鉴别所采用的对照品：

甘草酸铵(中国食品药品检定研究院，批号110731-201720)，甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120904-201620)，胀果甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号121303-201704)。

以下实施例中薄层色谱鉴别所采用的仪器与试剂：

自动点样仪ATS4(瑞士卡玛公司)，成像仪VISUALIZER(瑞士卡玛公司)，自动展开仪ADC2(瑞士卡玛公司)，薄层自动浸渍器III(瑞士卡玛公司)，薄层加热器III,230V(瑞士卡玛公司)，电子天平CPA224S(赛多利斯北京有限公司)，超声仪(上海科导超声仪器有限公司)；

高效硅胶G60 F254玻璃板20×10cm(默克)，高效硅胶G60 F254玻璃板20×10cm(德国MN)；

甲醇(国药集团，分析纯，批号20180601)，乙酸乙酯(国药集团，分析纯，批号20160902)，甲酸(国药集团，分析纯，批号20150518)，冰醋酸(国药集团，分析纯，批号20141022)，乙醚(国药集团，分析纯，批号20170104),甲苯(国药集团，分析纯，批号20180209)，正丁醇(国药集团，分析纯，批号20161215)，硫酸(国药集团，分析纯，批号20171222)。

以下实施例中指纹图谱和含量测定所采用的仪器与试剂：

Milli-Q Synthesis A10超纯水仪(MILLIPORE，Bedford，MA，USA)；Elma超声仪(Elma p180H，Germany，Serial 101561035)；安捷伦1260液相色谱系统(AgilentTechnologies，Agilent Technologies 1260Infinity，USA)：四元溶剂输送系统、在线脱气机，自动进样器，控温模块，柱温箱，二极管阵列检测器和色谱工作站(Chem Station ForLC 3D Systems A10.02(1757))，各模块详细信息见表2。

表2仪器信息

甲醇(分析纯，国药集团(上海)化学试剂有限公司，批号20180119)；磷酸(色谱纯，Tedia，USA，批号911254)；乙腈(色谱纯，Adamas，批号P1855094)。

以下实施例中指纹图谱和含量测定所采用的对照品：

芹糖甘草苷(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号ST04390120MG)，甘草苷(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号ST07010120MG)，甘草酸(上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号ST00660120MG)。

实施例1

本发明实施例提供了甘草药材的质量控制方法。

1、鉴别

1.1性状鉴别

待测样品呈圆柱形，表面红棕色或灰棕色，具显著的纵皱纹、沟纹、皮孔及稀疏的细根痕。质坚实，断面略显纤维性，黄白色，粉性，形成层环明显，射线放射状。根茎呈圆柱形，表面有芽痕，断面中部有髓。气微，味甜而特殊。

1.2显微鉴别

待测样品横切面在NIKON NI-U正置偏光显微镜下具有如下特征：木栓层为数列棕色细胞。栓内层较窄。韧皮部射线多弯曲；纤维多成束，周围薄壁细胞常含草酸钙方晶，形成晶纤维；筛管群常因压缩而变形。束内形成层明显。导管较多，多为具缘纹孔导管。根中心无髓；根茎中心有髓。

1.3理化鉴别

供试品溶液：取待测样品粉末0.2g，以2ml甲醇超声提取15min，离心，取上清液，即得供试品溶液；

对照品溶液：取甘草酸铵对照品加甲醇溶液制成每1ml含0.5mg的对照品溶液。

展开剂：乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水(15:1:1:2)；

薄层板：高效硅胶G 60F254玻璃板20×10cm(默克)；

展距：6cm；

点样量：5μl；

显色剂：10％硫酸甲醇；

检视方法：薄层板展开后，取出，喷以10％硫酸甲醇，晾干，105℃加热3min，置366nm下检视。

2、指纹图谱

供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％v/v甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率565W，频率37kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％v/v甲醇水溶液混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸对照品适量，精密称定，加50％v/v甲醇水溶液制成每1ml含芹糖甘草苷25μg、甘草苷80μg和甘草酸0.1mg的溶液，即得。

指纹图谱质量控制方法为高效液相色谱法，色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(规格：4.6mm×25cm；5μm)；

进样量：10μl；

流速：0.5ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：230nm；

流动相：流动相A：乙腈，流动相B：0.05％磷酸溶液，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的程序如下：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	7	93
2	20	80
			13	20	80
60	95	5

理论板数按甘草苷峰计算应不低于10000。

精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

3、含量测定

用高效液相色谱法检测待测样品中的芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸：

供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％v/v甲醇水溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率565W，频率37kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％v/v甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：取芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸对照品适量，精密称定，加50％v/v甲醇水溶液分别制成每1ml含芹糖甘草苷25μg、甘草苷80μg、甘草酸0.1mg的溶液，即得。

高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(4.6×250mm，5μm)；

进样量：10μl；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：230nm；

流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸溶液，进行线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的程序如下：

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	21	79
8	21	79
			15	40	60
25	45	55

理论板数按甘草苷峰计算应不低于5000。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4、水分检查：按《中国药典》2015版通则通则0832第二法，水分应不超过12.0％。

5、总灰分检查：按《中国药典》2015版通则通则2302，总灰分应不超过10.0％。

6、酸不溶性灰分：按《中国药典》2015版通则通则2302，酸不溶性灰分应不超过5.0％。

实施例2

本发明实施例提供了甘草药材的质量控制方法中的另一种对甘草酸铵的理化鉴别方法。

供试品溶液：取待测样品粉末0.2g，以70％v/v甲醇2ml超声提取15min，离心，取上清液，即得供试品溶液；

展开剂：乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水(15:1:1:2)；

薄层板：高效硅胶G60 F254玻璃板20×10cm(默克)；

展距：6cm；

点样量：5μl；

显色剂：10％硫酸甲醇；

实施例3

本实施例提供了上述质量控制方法中甘草酸铵的理化鉴定方法的专属性考察。

供试品溶液1：取批号FB-CG-04粉末1.0g，加乙醚40ml，加热回流1小时，过滤，弃去乙醚液，残渣加30ml甲醇，加热回流1小时，减压回收甲醇，后加水40ml溶解，正丁醇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇溶液，加水洗3次，减压回收正丁醇，5ml甲醇溶解，离心，取上清液，即得供试品溶液1；

供试品溶液2：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加甲醇2ml，超声处理15min，离心，取上清液，即得甘草的供试品溶液2。

供试品溶液3：取批号FB-GC-17粉末0.2g，加甲醇2ml，超声处理15min，离心，取上清液，即得甘草的供试品溶液3。

供试品溶液4：取批号ZS-GC-03粉末0.2g，加甲醇2ml，超声处理15min，离心，取上清液，即得甘草的供试品溶液4。

供试品溶液5：取批号ZS-GC-08粉末0.2g，加甲醇2ml，超声处理15min，离心，取上清液，即得甘草的供试品溶液5。

供试品溶液6：取苦甘草(市售药材)粉末0.2g，加甲醇2ml，超声处理15min，离心，取上清液，即得甘草的供试品溶液。取甘草对照药材、胀果干草对照药材0.1g，分别加甲醇2ml，离心，取上清液，分别得到对应的供试品溶液6。

甘草苷对照品、异甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芹糖异甘草苷对照品、光甘草定对照品、甘草酸对照品、甘草酸铵对照品以甲醇溶解，得各对照品溶液，浓度分别为甘草苷对照品0.5mg/ml、异甘草苷对照品0.199mg/ml、芹糖甘草苷对照品0.203mg/ml、芹糖异甘草苷对照品0.2mg/ml、光甘草定对照品0.1886mg/ml、甘草酸对照品0.505mg/ml、甘草酸铵对照品0.477mg/ml。

按实施例1的展开剂、薄层板、显色剂、检视方法得到的薄层色谱结果如图1所示。

根据图1的彩色薄层色谱图显示，甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷对照品分别在RF0.41，0.48，0.24，0.29呈现亮绿色荧光斑点，光甘草定在RF0.92呈现一蓝黑色斑点，甘草酸和甘草酸铵在RF0.16相同位置显示相同颜色暗绿色斑点；

甘草对照药材显示与甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷对照品相同RF值和颜色的亮绿色斑点，在RF0.92位置不显示光甘草定对照品颜色斑点，在RF0.16位置显示与甘草酸和甘草酸铵对照品颜色一致的暗绿色斑点，在甘草苷和芹糖异甘草苷斑点之间显示两个亮蓝色荧光斑点，在RF0.8-0.9位置显示两个蓝色荧光斑点；胀果甘草对照药材在RF0.7-095位置显示5-6个不同强度亮蓝色斑点，可以与甘草区别；

甘草FB-GC-04显示与甘草对照药材薄层色谱轮廓一致的色谱图，FC-GC-17，ZS-GC-03和ZS-GC-08显示相对亮度较弱的甘草苷和异甘草苷斑点，在甘草苷和芹糖异甘草苷斑点之间不显示两个亮蓝色荧光斑点；苦甘草显示与甘草和胀果甘草完全不同的色谱图。

结果显示，该方法具有较好的专属性，可以区别不同来源甘草药材和伪品。

实施例4

本实施例提供了上述质量控制方法中理化鉴定方法的耐用性考察。

1、稳定性试验

按实施例1中供试品溶液的制备方法配制供试品溶液和对照药材溶液，以甲醇为溶剂配制甘草酸铵对照品溶液(0.5mg/mL)。取药材供试品溶液和对照品溶液、对照药材溶液分别在0h，24h和48h用实施例1的薄层色谱条件展开剂展开，按照上述薄层色谱方法进行检视。0h、24h、48h得到的薄层色谱图分别如图2、3、4所示。

图2～图4的彩色图显示，供试品溶液和对照品溶液、对照药材溶液在放置48h内色谱轮廓和斑点强度均无明显差异，显示该理化鉴定方法稳定性较好。

2、不同薄层板

按实施例1中供试品溶液的制备方法配制供试品溶液和对照药材溶液，以甲醇为溶剂配制甘草酸铵对照品溶液(0.5mg/mL)。取药材供试品溶液和对照品溶液、对照药材溶液分别在默克和MN两种高效薄层板展开，考察不同品牌薄层板对薄层分离效果的影响。展开剂同实施例1。在两块默克薄层板上展开得到的薄层色谱图分别如图5和图6所示，在MN薄层板上展开得到的薄层色谱图如图7所示。

结果显示，不同薄层板显示相似薄层色谱轮廓斑点，具有较好的重现性，且默克薄层板分离效果略优于MN薄层板。

1.3温湿度影响

按实施例1中供试品溶液的制备方法配制供试品溶液和对照药材溶液，以甲醇为溶剂配制甘草酸铵对照品溶液(0.5mg/mL)。取药材供试品溶液和对照品溶液、对照药材溶液分别在不同实验室温湿度进行薄层色谱系统考察。薄层色谱条件同实施例1。22.5℃，RH62％条件下得到的薄层色谱图如图8所示，25.2℃，RH62％条件下得到的薄层色谱图如图9所示，28.5℃，RH70％条件下得到的薄层色谱图如图10所示，24.1℃，RH48％条件下得到的薄层色谱图如图11所示。

结果显示，对照品溶液和供试品溶液在不同实验室温湿度条件下展开，薄层色谱图轮廓无明显差异。显示该理化鉴定方法在实验室条件下基本不受温湿度影响。

4、不同展开仪

按实施例1中供试品溶液的制备方法配制供试品溶液和对照药材溶液，以甲醇为溶剂配制甘草酸铵对照品溶液(0.5mg/mL)。取药材供试品溶液和对照品溶液、对照药材溶液分别在不同展开仪中展开，考察不同展开仪对薄层分离效果的影响。在ADC2-170409展开仪中得到的薄层色谱图如图12所示，在ADC2-230010展开仪中得到的薄层色谱图如图13所示。

图12和图13的彩色图显示，对照品溶液和供试品溶液在不同展开仪展开，薄层色谱图轮廓无明显差异。显示展开仪对该理化鉴定方法的鉴别结果无明显影响。

实施例5

本实施例提供了不同批次甘草药材的理化鉴定结果。

取待测样品粉末0.2g，加甲醇2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液；

对照药材溶液：取甘草对照药材、胀果甘草对照药材，同法制成对照药材溶液；

对照品溶液的制备：取甘草酸铵对照品加甲醇溶液制成每1ml含0.5mg的对照品溶液；

展开剂：乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水(15:1:1:2)；

薄层板：高效硅胶G 60F254玻璃板20×10cm(默克)；

展距：6cm；

点样量：5μl；

显色剂：10％硫酸甲醇；

各批次甘草所得高效薄层色谱图如图14所示。

由图14的彩色图显示，在紫外灯366nm下，供试品溶液薄层色谱图均呈现与甘草对照药材颜色和位置一致的薄层轮廓图

实施例6

本实施例提供了实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的方法学验证结果。以下供试品溶液的制备方法同实施例1。

1、精密度

1.1连续进样精密度考察

取同一批次待测的甘草药材，按实施例1中供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件连续测定六次，并将结果导入指纹图谱相似度评价系统进行比较。结果见图15。

结果表明，一个样品连续进样六次所得相似度为1.000，符合中国药典和国家药品标准的规定。

1.2重复性考察

取六个样品，用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件各测定一次，并将结果导入指纹图谱相似度评价系统进行比较。结果见图16。

结果表明，重复性样品的相似度为0.999-1.000。该方法的重复性结果符合中国药典和国家药品标准的要求。

1.3中间精密度考察

在不同日期，由不同人员分别制备供试品溶液，以不同色谱仪器用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件进行测定，并将结果导入指纹图谱相似度评价系统进行比较。结果见图17。

结果表明，中间精密度样品的相似度为0.973-1.000。该方法的精密度结果符合中国药典和国家药品标准的规定。

2、专属性

用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件分别测定空白溶剂，对照品溶液和供试品溶液。结果见图18-1～18-7。

结果表明，样品中各指标成分保留时间与对照品溶液对应，空白溶剂无干扰。方法专属性符合中国药典和国家药品标准的要求。

3、稳定性

用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件测定对照品溶液及供试品溶液在室温下测定24h的稳定性。结果见图19。

结果表明，供试品室温放置24h所得指纹图谱的相似度为1.000。稳定性符合中国药典和国家药品标准的要求。

4、耐用性

对实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件的检测波长，有机相比例进行微小变动，并更改色谱柱类型，对供试品溶液剂型测定，稳定性测定结果见表3。

表3耐用性测定结果

结果表明，改变以上参数，相似度为0.981-1.000。方法耐用性符合中国药典和国家药品标准的要求。

实施例7

本实施例提供了15批合格甘草药材的指纹图谱测定。

1、选择符合中国药典标准的6批合格样品，按实施例1中的制备方法制备指纹图谱测定的供试品溶液，用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件生成对照指纹图谱。对照指纹图谱见图20。图20中有6个共有峰：峰2为芹糖甘草苷，峰3(S)为甘草苷，峰4为芹糖异甘草苷，峰5为异甘草苷，峰6为甘草酸。

取对照药材和15批待测的甘草药材，按实施例1中的制备方法制备指纹图谱测定的供试品溶液和对照品溶液，用实施例1中考察指纹图谱的高效液相色谱条件测定对照品溶液、对照药材溶液及15批药材对上述对照指纹图谱的相似度，对照药材溶液和供试品溶液的结果见表4和图21。

表4各批药材相似度

各批供试品指纹图谱中呈现与参照物色谱峰(即对照品的色谱峰)保留时间相同的色谱峰。对照药材指纹图谱与对照指纹图谱比对，相似度为0.976。将15批供试品与对照指纹图谱进行相似度计算，相似度0.670～0.996。

实施例8

本实施例提供了实施例1中含量测定的高效液相色谱条件的方法学考察结果。

1、准确度

称取0.5g甘草粉末，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，分别精密加入相当于供试品溶液中芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸含量50％，100％和150％相应的混合对照品溶液50ml，按实施例1中供试品溶液制备方法制备供试品溶液，每个浓度制备三份，共九份供试品溶液。测定结果见表5。

表5准确度考察结果

结果表明，该方法准确度符合要求。

2、重复性：

按实施例1中含量测定项下供试品溶液制备方法制备六份供试品溶液。用实施例1中含量测定的高效液相色谱条件进行测定，测定结果见表6。

表6重复性考察结果(％)

结果表明，该方法重复性符合要求。

3、中间精密度：

在两个不同日期，两个人员分别按实施例1中含量测定项下供试品溶液制备方法制备三份供试品溶液，以两台用不同色谱仪器用实施例1中含量测定的高效液相色谱条件进行测定，共九份供试品溶液。测定结果见表7。

表7中间精密度结果

结果表明，该方法的中间精密度结果符合规定。

4、专属性

按实施例1中含量测定项下对照品溶液和供试品溶液制备方法制备对照品溶液和供试品溶液，用实施例1中含量测定的高效液相色谱条件分别测定空白溶剂，对照品溶液和供试品溶液。结果见图22。

结果表明，供试品溶液中各指标成分保留时间与对照品溶液对应，空白溶剂无干扰。说明该方法专属性符合要求。

5、线性和范围

配制单标及混标母液，混标母液含芹糖甘草苷0.132mg/ml，甘草苷0.401mg/ml，甘草酸0.633mg/ml。分别精密量取0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml及2.0ml的混标母液，置5ml的容量瓶中，加溶剂定容，得标准曲线溶液并用实施例1中含量测定的高效液相色谱条件进行测定。以峰面积对浓度建立标准曲线。结果见表8及图23。

表8标准曲线

结果表明，线性符合要求。

6、稳定性

用实施例1中含量测定的高效液相色谱条件测定对照品溶液及供试品溶液在室温下的24h稳定性。结果表明，芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸对照品峰面积的RSD分别为0.18％，0.13％，0.19％，供试品溶液峰面积的RSD分别为1.29％，1.20％，0.20％。该方法稳定性符合规定。

7、耐用性

对实施例1中含量测定的高效液相色谱条件的检测波长，有机相比例进行微小变动，并更改色谱柱类型。含量测定结果见表9。

表9耐用性考察结果

梯度1：0/8/15/25min,20/20/39/44乙腈(％)

梯度2：0/8/15/25min,21/21/40/45乙腈(％)

梯度3：0/8/15/25min,22/22/41/46乙腈(％)

结果表明，芹糖甘草苷在不同类型柱上的含量差异>3％，但小于5％，总含量未出现显著差异，提示最好固定色谱柱的填料。其余条件的微小变动不会影响甘草药材含量的测定。

实施例9

本实施例提供了不同批次甘草药材的含量测定结果。

按实施例1中含量测定的方法对25批甘草中的芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸进行含量测定。

测定结果如下：

表10各批含量测定(％)

结果表明，以上25批甘草中芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸的含量均符合要求。

对比例1

本对比例提供了以不同提取溶剂制备的供试品溶液进行甘草酸铵薄层色谱鉴别的结果。

待测样品粉末均为FB-CG-04批样品。

供试品溶液2：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加甲醇2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液2；(即实施例1)

供试品溶液3：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加70％v/v甲醇2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液3；(即实施例2)

供试品溶液4：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加乙醇2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液4；

供试品溶液5：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加甲苯2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液5；

供试品溶液6：取批号FB-CG-04粉末0.2g，加乙酸乙酯2mL，超声处理15min，离心，取上清液，即得供试品溶液6；

甘草酸铵对照品以甲醇溶解，得甘草酸铵对照品溶液。

展开剂、薄层板、显色剂、检视方法均同实施例1。

各样品展开后紫外灯366nm下检视的薄层色谱图如图24所示。在图24的彩色图中，甘草酸铵对照品在RF0.19位置呈深绿色斑点。供试品溶液1在相应位置RF处均呈现与甘草酸铵对照品相同颜色的斑点，70％v/v甲醇、甲醇提取方法与现有中国药典提取方法薄层色谱图相似，均呈现与对照品位置和颜色一致的斑点，乙醇、乙酸乙酯提取方法薄层图显示提取效率低于甲醇和70％v/v甲醇，甲苯提取薄层图斑点均不显示相同斑点。

对比例2

本对比例提供了用不同展开剂进行甘草酸铵薄层色谱鉴别的结果。

取实施例3中的供试品溶液1～供试品溶液6，甘草对照药材、胀果干草对照药材的供试品溶液，以及甘草苷对照品、异甘草苷对照品、芹糖甘草苷对照品、芹糖异甘草苷对照品、光甘草定对照品、甘草酸对照品、甘草酸铵对照品的对照品溶液。

展开剂1为正丁醇：冰醋酸：水(7:1:2)；

展开剂2为正丁醇：冰醋酸：水(7:1:12)。

薄层板、显色剂、检视方法均同实施例1。

各样品在不同展开剂下得到的薄层色谱图如图25、26所示。以展开剂1展开的色谱图如图25所示，以展开剂2展开的色谱图如图26所示，结果显示，图25和图26中甘草苷和异甘草苷分离不开，芹糖甘草苷和芹糖异甘草苷分离不开。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种甘草药材的质量控制方法，其特征在于，包括以甘草酸铵、甘草苷、异甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、光甘草定和甘草酸作为理化鉴别的质量控制指标进行薄层色谱鉴别；

展开剂为体积比为15:1:1:2的乙酸乙酯：甲酸：冰醋酸：水；

薄层板为GF254硅胶板；

检视方法：薄层板展开后，取出，喷以10％硫酸甲醇，晾干，102-108℃加热2～5min，置366nm下检视。

2.根据权利要求1所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，以甲醇超声提取，每克所述样品粉末以8～12毫升甲醇超声提取。

3.根据权利要求2所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，超声时间为15min。

4.根据权利要求1所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括指纹图谱质量控制方法，所述指纹图谱质量控制方法为高效液相色谱法，指标成分包括芹糖甘草苷、甘草苷和甘草酸；所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流速：0.4～0.6mL/min；

柱温：20～30℃；

检测波长为230nm。

5.根据权利要求4所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；和/或

流速为0.5mL/min；和/或

柱温为25℃。

6.根据权利要求1所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括含量测定，用高效液相色谱法检测待测样品中的芹糖甘草苷、甘草苷、甘草酸；供试品溶液的制备方法为：将待测样品粉末以50％v/v甲醇水溶液超声提取25～35min，固液分离后即得；

所述高效液相色谱的色谱条件为：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 21 79 8 21 79 15 40 60 25 45 55

流速：0.8～1.2mL/min；

柱温：20～30℃；

检测波长为230nm。

7.根据权利要求6所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，磷酸溶液为0.05％磷酸溶液；和/或

流速为1.0mL/min；和/或

柱温为25℃。

8.根据权利要求6所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，甘草药材中的芹糖甘草苷在干燥品中的含量应不小于0.15％，甘草苷在干燥品中的含量应不小于0.20％，甘草酸在干燥品中的含量应不小于1.3％。

9.根据权利要求1～8任一项所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括性状鉴别和显微鉴别。

10.根据权利要求1～8任一项所述的甘草药材的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法还包括水分检查、总灰分检查和酸不溶性灰分检查。