CN117487032A - 一种青砖茶多糖的提取纯化方法及获得的青砖茶多糖 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青砖茶多糖的提取纯化方法及获得的青砖茶多糖，青砖茶经过水提醇沉、脱蛋白、透析、DEAE‑Sepharose Fast Flow gel阴离子交换层析填料进一步纯化和冻干得到纯化青砖茶多糖。与现有技术相比，本发明整个操作过程反应条件较为温和，能很大限度上保留青砖茶多糖的活性以及最大程度上降低多糖成分的损失，具有提取率高、能耗低、溶剂用量少、操作简单和经济成本较低等优点，为研究青砖茶多糖的理化性质和生物活性奠定基础，对青砖茶多糖在食品、医疗保健和化妆品等领域的利用具有重要意义。

Description

一种青砖茶多糖的提取纯化方法及获得的青砖茶多糖

技术领域

本发明属于茶多糖的提取技术领域，尤其是涉及一种青砖茶多糖的提取纯化方法及获得的青砖茶多糖。

背景技术

黑茶(Dark tea)是六大茶类之一，主要包括普洱茶、青砖茶、六堡茶和茯砖茶等，因其具有独特的风味和有益的生理活性而受到国内外消费者和学者的广泛关注。黑茶属于后发酵茶，茶性温和，陈香浓郁，滋味醇厚，口感顺滑。其制作需要经过5道工序，包括杀青、揉捻、渥堆发酵、复揉和烘焙。黑茶的发酵也包含两个阶段，第一阶段为制作过程中渥堆发酵，再压成型前进入发酵间发酵，第二过程为储藏发酵。青砖茶属于黑茶，主要种植于湖北，长盛川牌青砖茶悠久历史，起源于唐朝，兴盛于明清，曾是中俄万里茶道的主要贸易商品，广受藏族、蒙古族和维吾尔族等边疆少数民族的喜爱。青砖茶属于砖形压制茶，由叶片和叶梗压制而成。青砖茶的生产工艺与黑茶一样，其中渥堆发酵是青砖茶感官品质形成的关键阶段，这是因为发酵过程中化学组分会发生变化，如茶氨酸、多酚和茶褐素等。青砖茶中含有丰富的生物活性化合物，包括茶氨酸、茶多糖、茶多酚、茶色素和黄酮类化合物等。近年来，大量研究表明，青砖茶具有抑菌、抗氧化、改善非酒精性脂肪肝、降血脂、调节胃肠道和改善脂质代谢等生理活性。

茶多糖是一组与蛋白质结合的具有生物活性的杂多糖，其含量会随着生茶叶成熟度的增加而增加。茶多糖的生物活性与化学组成和分子量及单糖组成等结构密切相关，而其化学组成和结构特征又受茶树品种、茶叶加工工艺和分离方法等因素的影响。目前，茶多糖的研究主要集中在提取分离、纯化、理化性质、药理作用等方面，而大分子杂多糖的整体复杂性阻碍了结构与生物活性之间关系的阐明，因此，迄今为止还没有理想的方法来评估TPS的完整结构，对其分子结构、功能机制和构效关系的研究尚处于初步探索阶段。已有研究证实，茶多糖具有丰富的生理活性，包括抗氧化、免疫调节、抗癌、抗肿瘤、降血糖和抗肥胖等生理活性。

热水浸提法是茶多糖提取的传统方法，具有操作简单和经济等优点，但也存在时间长和效率低等缺点。为提高提取效率缩短提取周期，酶法辅助提取、超声辅助提取和微波辅助提取等辅助提取法被应用于茶多糖的提取。粗茶多糖中含有蛋白质、茶多酚、茶色素和无机盐等物质，因此，需要通过一定的工艺手段对茶多糖进行分离纯化。粗茶多糖通常采用乙醇沉淀、Sevage试剂脱蛋白、树脂脱色和透析袋透析去除无机盐等小分子物质，通过这些步骤得到初步纯化的茶多糖。初步纯化得到的茶多糖可通过乙醇分级沉淀法得到纯度更高的茶多糖，此外，可以通过柱色谱法得到高纯度的茶多糖，但柱色谱法操作繁琐，以及实验周期较长。不同的提取方法和分离纯化方法将会影响茶多糖的化学组成和结构构象，进而影响茶多糖的生理活性，因此，选择合适的提取分离纯化方法至关重要。

公开号为CN115386015A的中国专利已申请公开了一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，通过将纤维素酶和果胶酶1:1混合，制得复合酶，然后利用复合酶降解青砖茶的细胞壁，使茶多糖溶出，然后通过一系列处理制备得到茶多糖成品。该提取方法结合多糖类物质提取关键因素如酶添加量、酶解时间、pH以及酶解时间，借助响应面法优化多糖类物质的提取工艺为：复合酶用量3.5％，酶解pH为7，酶解温度70℃，酶解时间2h，此时湖北青砖茶多糖的提取率为6.34％。优化后的提取工艺具有反应条件温和，提取率高，且不影响青砖茶多糖的抗氧化活性。其采用的是酶解的方法来提取青砖茶多糖，需要使用纤维素酶和果胶酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种青砖茶多糖的提取纯化方法及获得的青砖茶多糖，进而缩短提取周期和降低经济成本，获得纯度高且活性强的多糖，为青砖茶多糖的应用提供参考，拓展青砖茶深加工工艺，提高青砖茶产值，在食品、保健品、医药卫生和化妆品等领域有重要意义。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种青砖茶多糖的提取纯化方法，青砖茶经过水提醇沉、脱蛋白、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow gel阴离子交换层析填料进一步纯化和冻干得到纯化青砖茶多糖。

在本发明的一个实施方式中，青砖茶多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：将青砖茶干燥、粉碎、过筛得到青砖茶粉末；

(2)水提：将步骤(1)得到的青砖茶粉末加入超纯水得到青砖茶溶液，控制温度和转速，浸提，离心取上清液，收集下层滤渣，加入超纯水再次浸提，将滤液并入至上清液中；

(3)旋蒸浓缩：旋转蒸发浓缩步骤(2)所得的上清液；

(4)醇沉：向步骤(3)得到的浓缩液中加入95％乙醇溶液，静置过夜，离心，弃去上清液，向沉淀中加水复溶，得到多糖溶液；

(5)脱蛋白：向步骤(4)得到的多糖溶液中加入sevage试剂脱蛋白，剧烈振荡，离心，收集上清液，重复上述步骤三次，得到脱蛋白多糖；

(6)透析：将步骤(5)得到的脱蛋白多糖倒入透析袋中透析，将透析过的多糖冷冻保存；

(7)冷冻干燥：将步骤(6)得到的透析多糖冷冻干燥，得到青砖茶粗多糖；

(8)离子交换层析柱：将步骤(7)得到的青砖茶粗多糖缓慢且均匀加入以DEAE-Sepharose Fast Flow gel为填料的凝胶柱中，用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱，用自动收集器收集，收集0.2M NaCl洗脱的洗脱液；

(9)旋蒸浓缩：将步骤(8)得到的洗脱液旋转蒸发浓缩至一定体积，得到透析多糖溶液；

(10)透析：将步骤(9)得到的透析多糖溶液倒入截流相对分子质量为3500的透析袋中透析48h，期间每隔4h换一次水，将透析过的多糖冷冻保存；

(11)冷冻干燥：将步骤(10)得到的透析多糖冷冻干燥，得到青砖茶纯化多糖。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述青砖茶粉末与水的重量比为1：20，水提温度为95℃，浸提时间为2h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，加入超纯水再次浸提时，加入的超纯水的用量是下层滤渣重量的2倍。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中旋蒸浓缩的温度为60℃、转速为50r/min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，旋转蒸发浓缩至步骤(2)所得的上清液体积为初始体积的1/4。

在本发明的一个实施方式中，步骤(4)中，向步骤(3)得到的浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇溶液，在4℃冰箱中静置过夜。

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，sevage试剂与复溶得到的多糖溶液的体积比为1：10。

在本发明的一个实施方式中，步骤(5)中，剧烈振荡的时间为15min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(6)中，所用的透析袋为截流相对分子质量为3500Da的透析袋，脱蛋白多糖与流水的比例为1：50-100，先自然水透析24h，再去离子水透析24h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(7)中，冷冻干燥的温度为-50℃，真空度为0-1Pa，时间为48h。

在本发明的一个实施方式中，步骤(8)中，青砖茶粗多糖的上样浓度为50mg/mL，上样量为2mL，洗脱流速为2mL/min，5min/tube。

在本发明的一个实施方式中，步骤(8)中，将步骤(7)得到的青砖茶粗多糖缓慢且均匀加入以DEAE-Sepharose Fast Flow gel为填料的凝胶柱中(2.6cm×60cm)，用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱，用自动收集器收集，结束后用苯酚—硫酸法检测试管内的糖含量，绘制洗脱曲线。收集0.2M NaCl洗脱的19-34管，合并该管数的溶液。

在本发明的一个实施方式中，步骤(11)中，所得青砖茶纯化多糖的分子量为73734Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，其摩尔百分比含量分别为6.6％、21.0％、27.9％、24.2％、3.4％、2.5％和14.3％，记为pTPS。

本发明进一步提供基于上述方法制备得到的青砖茶纯化多糖，所得青砖茶纯化多糖的分子量为73734Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，其摩尔百分比含量分别为6.6％、21.0％、27.9％、24.2％、3.4％、2.5％和14.3％，记为pTPS。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明整个操作过程反应条件较为温和，能很大限度上保留青砖茶多糖的活性以及最大程度上降低多糖成分的损失，具有提取率高、能耗低、溶剂用量少、操作简单和经济成本较低等优点，为研究青砖茶多糖的理化性质和生物活性奠定基础，对青砖茶多糖在食品、医疗保健和化妆品等领域的利用具有重要意义。

附图说明

图1为青砖茶多糖的提取工艺流程。

图2为茶多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow gel离子交换层析柱的洗脱曲线。

图3为青砖茶多糖的HPGPC洗脱曲线。

图4为青砖茶多糖的单糖组成的离子色谱图。

图5为茶多糖的紫外光谱图。

图6为茶多糖的红外光谱图。

图7为高碘酸氧化标准曲线。

图8为茶多糖的高碘酸氧化反应结果。

图9为茶多糖的smith降解产物离子色谱图。

图10为茶多糖的三螺旋构象分析。

图11为茶多糖的SEM图。

图12为茶多糖的原子力显微镜图。

图13为茶多糖的原子力显微镜三维图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种青砖茶多糖的提取纯化方法，青砖茶多糖的提取工艺流程参考图1，具体步骤如下：

(1)原料粉碎：将青砖茶干燥、粉碎、过100目筛得到青砖茶粉末。

(2)水提：将步骤(1)得到的青砖茶粉末加入超纯水(料液比为1：20)得到青砖茶溶液，温度为95℃，转速为650r/min，浸提2h，5000r/min离心10min，取上清液，收集下层滤渣，加入20倍超纯水再次浸提1次，合并上清液。

(3)旋蒸浓缩：在60℃、50r/min条件下旋转蒸发浓缩至步骤(2)所得的上清液体积为初始体积的1/4。

(4)醇沉：向步骤(3)得到的浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇溶液，在4℃冰箱中静置过夜。5000r/min离心10min，弃去上清液，向沉淀中加水复溶。

(5)脱蛋白：向步骤(4)得到的复溶物中加入1/10倍体积的sevage试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4:1，V/V)脱蛋白，剧烈振荡15min，5000r/min离心10min，弃去中间层的变性蛋白和下层的有机层，收集上清液，重复上述步骤三次，合并上清液，60℃、50r/min条件下旋转蒸发浓缩至一定体积，得到脱蛋白多糖。

(6)透析：将步骤(5)得到的脱蛋白多糖倒入截流相对分子质量为3500Da的透析袋中，脱蛋白多糖与流水的比例为1：50-100，先流水透析24h，再去离子水透析24h，期间每隔4h换一次水，将透析过的多糖冷冻保存。

(7)冷冻干燥：将步骤(6)得到的透析多糖进行冷冻干燥，温度为-50℃，真空度为0-1Pa，时间为48h。得到青砖茶粗多糖。

(8)离子交换层析柱：将步骤(7)得到的青砖茶粗多糖配置成浓度为50mg/mL，上样量为3mL，缓慢且均匀加入以DEAE-Sepharose Fast Flow gel为填料的凝胶柱中(2.6cm×60cm)，用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱。流速为2mL/min，5min/tube，用自动收集器收集，每个溶剂梯度收集70管。结束后用苯酚—硫酸法检测试管内的糖含量，绘制洗脱曲线，茶多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow gel离子交换层析柱的洗脱曲线如图2所示。青砖茶多糖被分离成去离子水洗脱部分和0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液洗脱部分。在去离子水洗脱下，cTPS从第13管出峰，第16管达到最高峰，第19管结束；在0.1mol/LNaCl洗脱下，cTPS从第16管出峰，第19管达到最高峰，第31管结束；在0.2mol/LNaCl洗脱下，cTPS从第19管出峰，第22管达到最高峰，第70管结束；在0.3mol/LNaCl洗脱下，cTPS从第22管出峰，第24管达到最高峰，第25管结束。其中，0.1M和0.3M浓度下获得的量较少，不做后续处理，后续实验只选择0.2M NaCl洗脱后获得的处理液。收集0.2M NaCl洗脱较为对称的19-34管，合并该管数的溶液。

(9)旋蒸浓缩：在60℃、50r/min条件下将步骤(8)得到的洗脱液旋转蒸发浓缩至一定体积。

(10)透析：将步骤(10)得到的透析多糖倒入截流相对分子质量为3500的透析袋中先流水透析24h，再去离子水透析24h，期间每隔4h换一次水，将透析过的多糖冷冻保存。

(11)冷冻干燥：将步骤(10)得到的透析多糖冷冻干燥，温度为-50℃，真空度为0-1Pa，时间为48h，得到青砖茶纯化多糖。

(12)茶多糖的化学组成分析：采用苯酚硫酸法对多糖样品中中性糖含量进行测定，以标准葡萄糖溶液作为标准品，于490nm处测定吸光值；采用间羟基联苯法对多糖样品中糖醛酸含量进行测定，以半乳糖醛酸作为标准品，于525nm处测定吸光值；采用DNS法对多糖样品中还原糖含量进行测定，以标准葡萄糖溶液作为标准品，于540nm处测定吸光值；采用考马斯亮蓝法对多糖样品中蛋白质含量进行测定，以BSA作为标准品，于595nm处测定吸光值；采用福林酚法对多糖样品中多酚含量进行测定，以没食子酸工作液作为标准品，于765nm处测定吸光值。结果表如表1，茶多糖的中性糖含量为63.00±1.41％，糖醛酸含量为31.64±1.6％，还原糖含量为22.75±0.59％，蛋白质含量为1.55±0.52％，茶多酚含量为1.14±0.00％。

表1 pTPS的化学组成

(13)茶多糖的相对均一性的测定：通过高效凝胶渗透色谱法(high performancegel permeation chromatography,HPGPC)测定pTPS的分子量和纯度。精密称取pTPS样品和不同分子量的右旋糖酐标准品(相对分子量分别为：1152、5000、11600、23800、48600、80900、148000、273000、409800、667800)，样品和标准品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相为0.05M NaCl溶液；流速为0.6ml/min，柱温为40℃；样品进样量为20μL；检测器为示差检测器RI-10A，测定其出峰时间。

青砖茶多糖的HPGPC洗脱曲线如图3所示，表明茶多糖具有均一性，图3中45.5min为流动相的峰。

相对分子量和均一性结果如表2所示。

表2茶多糖的分子量结果

(14)茶多糖的单糖组成分析：精密称量5mg(精确到0.1mg)多糖样品置于20ml安瓿瓶中，加入3M TFA 2ml，120℃烘箱水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取50mL加入950mL去离子水，12000rpm离心5min，取上清液，即为多糖酸解液，进行离子色谱分析。

色谱柱：Dionex CarbopacTM PA20(3mm*150mm)；流动相：A:H2O；B:15mM NaOHC:；15mM NaOH&100mM NaOAC；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。取各单糖标准溶液精密配置浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。依据多糖样品的出峰时间判断青砖茶多糖的单糖组成，依据峰面积测定各单糖的摩尔浓度。

青砖茶多糖的单糖组成的离子色谱图如图4所示。青砖茶多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，其摩尔百分比含量分别为6.6％、21.0％、27.9％、24.2％、3.4％、2.5％和14.3％。图4中(A)为标准单糖，(B)为茶多糖的单糖组成的离子色谱图，2.0min为氢氧化钠的峰；41min乙酸钠的峰。

表3茶多糖单糖组成结果

(15)茶多糖的紫外扫描分析：利用紫外分光光度计对0.1mg/mLcTRS进行全波长扫描。波长范围设定为190-500nm，吸光度范围设定为0-1。结果如附图5所示，纯化后的茶多糖中核酸、蛋白质、多肽和其他杂质成分的含量非常低。

(16)茶多糖的傅里叶红外光谱扫描分析：精密称取pTPS干燥样品1mg，加入100mgKBr，混合研磨，压制成片，空白对照采用溴化钾粉末压片而成，分别置于傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650，于4000～400cm-1内进行光谱扫描。结果如附图6所示，茶多糖具有糖类、多糖结合水、糖醛酸基团、β-葡萄吡喃糖和α构型糖苷键的特征吸收峰。

(17)茶多糖的高碘酸氧化：精确配制30mmol/L高碘酸钠溶液，分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0mL于试管中，用去离子水添加至4mL，再从各管中用移液器准确移取100μL至容量瓶，用去离子水定容至25mL，在223nm处测定各吸光度值。以高碘酸钠浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标绘制标准曲线。取15mg多糖样品，先用5mL去离子水溶解，再加入15mL的30mmol/L高碘酸钠溶液，加蒸馏水定容到25mL，充分混匀后，置于4℃冰箱避光反应，间隙振荡。在反应0h，12h，24h，36h，48h，60h，72h……取样100μL，用去离子水定容至25mL，在223nm处测定其吸光度值。待吸光度达到稳定值时，加入1mL乙二醇破坏过量的高碘酸钠以终止反应。由此吸光度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量。取2mL反应液，加入一滴酚酞作为指示剂，用0.01mol/L NaOH溶液滴定，计算甲酸释放量。剩余的反应液用于Smith降解。结果如图7和图8所示，茶多糖在高碘酸钠溶液中发生氧化反应，在84h左右反应达到平衡，根据高碘酸钠的标准曲线可以得出高碘酸的消耗量为0.325mmol。甲酸生成量可根据NaOH溶液滴定的结果来计算甲酸生成量为0.230mmol。甲酸的生成表明pTPS存在含有连三轻基的糖残基，如1→或1→6键合的糖残基，而高碘酸钠的过量消耗证明pTPS中同时存在含有连二羟基的糖残基，由1→2；1→2,6；1→4,6或1→4糖残基连接。

(18)茶多糖的Smith降解：采用硼氢化钠(NaBH4)还原法制备多糖醇：经高碘酸氧化后的反应液，用蒸馏水流水透析72小时，在40℃下浓缩至大约10mL，加入70mg硼氢化钠，充分混匀，在暗处和室温条件下搅拌过夜，以还原多糖醛。用0.1mol/L乙酸中和反应液pH在5.0-6.0范围(5.5)，以除去反应中多余的NaBH4。反应液经减压浓缩，蒸馏水流水透析48小时，冷冻干燥，得到多糖醇。减压蒸干之后，再加入4mL三氟乙酸(2mol/L)，在110℃烘箱内酸解3h(6h)。待反应液冷却后，旋转蒸发除去三氟乙酸(45℃)，加入3mL甲醇，重复蒸干操作至固态，重复上述方法3次后以完全除去TFA。用2mL超纯水溶解水解物，离心(5000r/min，5min)后取水解产物的上清0.5mL置于洁净EP管内，再用超纯水稀释至总体积5mL，用于离子色谱上样测定。加入4.0mol/L三氟乙酸和上述2mL溶解残留物，用一次性滴管转入安瓿瓶后在110℃条件下水解6h。结束后用氮吹仪吹干反应液，先后四次各加入2mL的甲醇继续吹干。选用戴安DionexICS5000+系统进行检测，配备Chromeleon 6.5色谱工作站和CarboPacPA20阴离子交换分析柱(150mmx3mm)；进样量：25uL；淋洗程序：2mM的氢氧化钠淋洗液；流速:0.45mL/min；分析时间:40min。标准品包括当鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸(根据单糖组成结果选择)、赤藓糖醇以及甘油，制备成浓度梯度为4、8、12、16、20mg/mL的标准溶液后分别上样检测，得到各类标准品的浓度-峰面积的标准曲线以作为对照。根据样品的出峰时间判断其产物种类，根据峰面积测定各产物的摩尔浓度。结果如图9所示，茶多糖的衍生产物中含有大量的甘油和赤藓糖醇，说明茶多糖组分的糖残基中含有1→2、1→6和1→2,6键合的糖基或分支末端1→糖苷键，和1→4和1→4,6键合的糖基。此外，茶多糖的smith降解结果显示有单糖检出，说明pTPS含有以1→3键合的糖基。

(19)茶多糖的三股螺旋构象分析：多糖样品配成浓度为1mg/m L水溶液，取2mL的1mg/m L茶多糖溶液与2mL 80μmol/L刚果红溶液混合，再分别精确移取0、0.444、1、1.14、2.667和4mL的1mol/L NaOH溶液混合使NaOH在反应液中最终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mol/L，在室温下反应10min，用紫外分光光度计进行扫描，扫描范围为400-600nm，吸光度范围为0-3。测定混合液在不同浓度的NaOH溶液下最大吸收波长的变化。以NaOH浓度为横坐标，最大吸收波长为纵坐标作图。同时，用超纯水代替多糖做空白对照组。结果如图10所示，刚果红与茶多糖的最大吸收波长随NaOH溶液浓度的增加呈现相似的蓝移趋势，说明茶多糖在溶液中不存在三螺旋构象。

(20)茶多糖的SEM图：使用双面粘合碳带将干燥的粉末状样品固定到样品台上，然后置于高真空镀膜仪中30s，镀上一层铂金，使其具有导电性，后置于低真空超高分辨场发射扫描电子显微镜观察其形貌，以1.0kV的加速电位，200×的图像放大率拍摄图像。结果如图11所示，茶多糖在200x情况下，主要由大量的不规则片状物组成，表面粗糙。

(21)茶多糖的AMF图：取一块长方形玻璃板，用双面胶将单层云母片粘在长方形玻璃板上，使用一次性胶头滴管移取适量10mg/mL茶多糖水溶液滴在云母片上，放在红外灯下烤15min使样品烤干，以AC240为探针，使用原子力显微镜对茶多糖的微观形貌进行测试。结果如图12和图13所示，根据AFM平面图和三维图谱分析得出，茶多糖组分在溶液中并没有表现出链状分子的构象，表明茶多糖的多糖分子链溶解后会出现分子聚集形态，这可能是由于多糖大分子间通过交联形式形成聚合体形态。茶多糖呈现不规则的颗粒状和棒状物结构，大小不均一，宽度在1.8～10nm左右，高度在3.4～38nm左右，该多糖分子远高于多糖单链直径的理论值(0.1～1.0nm)，可能是由于多糖分子间范德华力以及糖链间氢键缔合所致。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，青砖茶经过水提醇沉、脱蛋白、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow gel阴离子交换层析填料进一步纯化和冻干得到纯化青砖茶多糖。

2.根据权利要求1所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)原料预处理：将青砖茶干燥、粉碎、过筛得到青砖茶粉末；

(2)水提：将步骤(1)得到的青砖茶粉末加入超纯水得到青砖茶溶液，浸提，离心取上清液，收集下层滤渣，加入超纯水再次浸提，将滤液并入至上清液中；

(3)旋蒸浓缩：旋转蒸发浓缩步骤(2)所得的上清液；

(4)醇沉：向步骤(3)得到的浓缩液中加入95％乙醇溶液，静置过夜，离心，弃去上清液，向沉淀中加水复溶，得到多糖溶液；

(5)脱蛋白：向步骤(4)得到的多糖溶液中加入sevage试剂脱蛋白，剧烈振荡，离心，收集上清液，重复上述步骤三次，得到脱蛋白多糖；

(6)透析：将步骤(5)得到的脱蛋白多糖倒入透析袋中透析，将透析过的多糖冷冻保存；

(7)冷冻干燥：将步骤(6)得到的透析多糖冷冻干燥，得到青砖茶粗多糖；

(8)离子交换层析柱：将步骤(7)得到的青砖茶粗多糖缓慢且均匀加入以DEAE-Sepharose Fast Flow gel为填料的凝胶柱中，用0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液依次进行梯度洗脱，用自动收集器收集，收集0.2M NaCl洗脱的洗脱液；

(9)旋蒸浓缩：将步骤(8)得到的洗脱液旋转蒸发浓缩至一定体积，得到透析多糖溶液；

(10)透析：将步骤(9)得到的透析多糖溶液倒入截流相对分子质量为3500的透析袋中透析48h，期间每隔4h换一次水，将透析过的多糖冷冻保存；

(11)冷冻干燥：将步骤(10)得到的透析多糖冷冻干燥，得到青砖茶纯化多糖。

3.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述青砖茶粉末与水的重量比为1：20，水提温度为95℃，浸提时间为2h。

4.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(3)中旋蒸浓缩的温度为60℃、转速为50r/min。

5.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(3)中，旋转蒸发浓缩至步骤(2)所得的上清液体积为初始体积的1/4。

6.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(5)中，sevage试剂与复溶得到的多糖溶液的体积比为1：10。

7.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(6)中，所用的透析袋为截流相对分子质量为3500Da的透析袋，脱蛋白多糖与流水的比例为1：50-100，先自然水透析24h，再去离子水透析24h。

8.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(7)中，冷冻干燥的温度为-50℃，真空度为0-1Pa，时间为48h。

9.根据权利要求2所述的一种青砖茶多糖的提取纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，步骤(8)中，青砖茶粗多糖的上样浓度为50mg/mL，上样量为2mL，洗脱流速为2mL/min，5min/tube。

10.基于权利要求1-9中任一项所述方法制备得到的青砖茶纯化多糖，其特征在于，所得青砖茶纯化多糖的分子量为73734Da，由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸组成，其摩尔百分比含量分别为6.6％、21.0％、27.9％、24.2％、3.4％、2.5％和14.3％。