CN117467632A - 一种肝素n-磺基转移酶突变体构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素N‑磺基转移酶突变体构建方法，属于生物工程技术领域。本发明对人源的双功能酶(NCBI Reference Sequence:NP_001534.1)中的硫酸乙酰肝素N‑磺基转移酶1进行了改造，通过截短、单点突变、多点组合突变等生物技术手段，获得了能够使得稳定性和催化效率显著提升的肝素N‑磺基转移酶突变体。本发明提供的人源肝素N‑磺基转移酶突变体催化效率比人源肝素N‑磺基转移酶原始菌株提高了1.3倍，且在37℃下的稳定性也较野生型有显著提升，更有利于长时间催化获得高转化率的N‑磺酸化肝素前体。
Description
技术领域
本发明涉及一种肝素N-磺基转移酶突变体构建方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
肝素作为一种磺酸化水平较高的糖胺聚糖，除了被应用于抗血栓的形成外，还被作为肿瘤、小儿生长受限等多种疾病。目前肝素主要通过动物组织的提取、化学法合成等方式获得，容易存在动物病毒的交叉感染、产物结构不均一、磺酸化水平低、功能基团的丢失、化学废液的环境污染等问题。
为了尽可能实现绿色合成高磺酸化水平的肝素产物，许多研究者使用哺乳动物或微生物进行肝素的合成。合成过程从肝素前体(Heparonsan，β-D-1,4-GlcA-α-D-GlcNAc)开始，这是肝素和硫酸乙酰肝素共同的前体，也是它们合成过程中最重要的模板，肝素前体需要通过N-脱乙酰、N-磺酸化、葡萄糖醛酸异构化、2-O-磺酸化、6-O-磺酸化和3-O磺酸化等六步顺序修饰反应才能够获得肝素或硫酸乙酰肝素。磺酸基团是肝素或硫酸乙酰肝素的重要功能基团，决定了它们在生物体中的不同生理功能，N-磺酸化是第一步也是关键的一步，由N-磺基转移酶催化获得的N-磺酸化产物，不仅是后续多种磺基转移酶的催化必需底物，同时也决定了肝素或硫酸乙酰肝素的整体磺酸化水平。因此，为了提高整体磺酸化修饰水平，需要获得高转化的N-磺酸化肝素前体。由于天然肝素N-磺基转移酶主要在哺乳动物中存在，需要繁琐的提取纯化步骤，因而微生物异源重组表达能够有效简化肝素N-磺基转移酶的提取和纯化。N-磺酸化需要经过长时间催化，但现有的肝素N-磺基转移酶存在稳定性低的问题，限制了其在获得高转化N-磺酸化肝素前体的应用。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是：提高肝素N-磺基转移酶的稳定性及催化效率。
[技术方案]
本发明提供一种肝素N-磺基转移酶突变体，是将人源肝素N-磺基转移酶进行突变后得到的。所述人源肝素N-磺基转移酶是NCBI Reference Sequence:NP_001534.1所示的双功能酶的第599位的赖氨酸至第882的精氨酸区域，人源肝素N-磺基转移酶对应的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述肝素N-磺基转移酶突变体是对原始序列进行分析，对特定位点进行突变后获得的突变体，所述肝素N-磺基转移酶突变体的稳定性得到了提高。
本发明的第一个目的是提供肝素N-磺基转移酶突变体，所述突变体包括如下任一：
(a)将人源肝素N-磺基转移酶的N端前3个或4个氨基酸(NΔ3或NΔ4,D603-R882)敲除，得到突变体NΔ3或NΔ4；
(b)将人源肝素N-磺基转移酶的第637位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E637P；
(c)将人源肝素N-磺基转移酶的第741位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E741P；
(d)将人源肝素N-磺基转移酶的第839位的谷氨酸(E)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E839P；
(e)将人源肝素N-磺基转移酶的第842位的亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)，得到突变体L842P；
(f)将人源肝素N-磺基转移酶的第779位的赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)并将第782位的精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)，得到突变体K779N/R782V；
(g)将人源肝素N-磺基转移酶的N端前4个氨基酸(D603-R882)敲除、将第637位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)、将第741位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)、将第839位的谷氨酸(E)突变为脯氨酸(P)、将第842位的亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)、将第779位的赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)并将第782位的精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)，得到突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V。
在一种实施方式中，所述人源肝素N-磺基转移酶的氨基酸序列如NCBI ReferenceSequence:NP_001534.1的双功能酶的第599位的赖氨酸至第882的精氨酸所示。
在一种实施方式中，人源肝素N-磺基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述肝素N-磺基转移酶突变体的基因。
在一种实施方式中，所述突变体的NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供含有所述编码肝素N-磺基转移酶突变体的基因的重组质粒。
在一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
本发明的第四个目的是提供表达所述肝素N-磺基转移酶突变体或含有所述基因的微生物细胞。
在一种实施方式中，以大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母为宿主，表达所述肝素N-磺基转移酶突变体。
本发明的第五个目的是提供表达所述肝素N-磺基转移酶突变体的方法，包含如下步骤：
(1)将编码所述肝素N-磺基转移酶突变体的基因连接至表达载体上，得到重组载体；
(2)将所述重组载体转化至大肠杆菌中进行表达，获得重组菌株；
(3)培养所述转化体，并将培养液进行物理破碎处理，得到含有所述肝素N-磺基转移酶的粗酶液。
在一种实施方式中，将肝素N-磺基转移酶突变体与促溶标签融合，得到融合蛋白，并将融合蛋白在微生物宿主中进行表达。
在一种实施方式中，使用蛋白纯化系统和蛋白纯化柱对所述肝素N-磺基转移酶进行纯化处理，获得纯度较高的肝素N-磺基转移酶。
在一种实施方式中，所述微生物宿主为大肠杆菌，所述重组菌株的培养方法是：采用LB培养基在37℃培养所述转化体1-3h，加入终浓度为0.2-1mM的IPTG诱导，转移至25℃培养16-20h。
本发明的第六个目的是提供一种提升人源肝素N-磺基转移酶性能的方法，所述方法是将人源肝素N-磺基转移酶的N端前3个或4个氨基酸敲除、将其第637位、741位、839位、842位、779位或782位中一位或多位发生突变；所述性能包括催化效率、稳定性。
在一种实施方式中，所述人源肝素N-磺基转移酶的氨基酸序列如NCBI ReferenceSequence:NP_001534.1的双功能酶的第599位的赖氨酸至第882的精氨酸所示。
在一种实施方式中，所述方法对人源肝素N-磺基转移酶做的改造如(a)～(g)任一所示：
(a)将N端前3个或4个氨基酸(NΔ3或NΔ4,D603-R882)敲除，得到突变体NΔ3或NΔ4；
(b)将第637位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E637P；
(c)将第741位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E741P；
(d)将第839位的谷氨酸(E)突变为脯氨酸(P)，得到突变体E839P；
(e)将第842位的亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)，得到突变体L842P；
(f)将第779位的赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)并将第782位的精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)，得到突变体K779N/R782V；
(g)将N端前4个氨基酸(D603-R882)敲除、将第637位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)、将第741位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)、将第839位的谷氨酸(E)突变为脯氨酸(P)、将第842位的亮氨酸(L)突变为脯氨酸(P)、将第779位的赖氨酸(K)突变为天冬酰胺(N)并将第782位的精氨酸(R)突变为缬氨酸(V)，得到突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V。
本发明的第七个目的是提供所述的肝素N-磺基转移酶突变体、所述的基因或所述的微生物细胞在催化获得N-磺酸化肝素前体、制备肝素及硫酸乙酰肝素中的应用。
[有益效果]
本发明对人源的双功能酶(bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 1isoform 1，NCBI Reference Sequence:NP_001534.1)中的硫酸乙酰肝素N-磺基转移酶1进行了改造，通过截短、单点突变、多点组合突变等生物技术手段，获得了能够使得稳定性和催化效率显著提升的肝素N-磺基转移酶突变体，突变体的催化效率可比原始菌株提高了1.3倍，在37℃下的稳定性也较野生型有显著提升，更有利于长时间催化获得高磺酸化的肝素N-磺酸化肝素前体。
附图说明
图1是肝素N-磺基转移酶在不同诱导浓度和诱导温度下的酶活差异。
图2是肝素N-磺基转移酶的纯蛋白电泳图。泳道1：破壁后上清液；泳道2：经过镍柱纯化后的酶液。
图3是肝素N-磺基转移酶突变体与野生型酶的残余酶活比较。
图4是肝素N-磺基转移酶突变体与野生型酶的比酶活比较。
图5是肝素N-磺基转移酶突变体与野生型酶的活性(a)和稳定性(b)差异。
图6是肝素N-磺基转移酶突变体与野生型酶的最适温度(a)和最适pH(b)。
具体实施方式
实施例涉及的核苷酸序列信息：
SEQ ID NO.1序列信息为人源的肝素N-磺基转移酶(NP_001534.1，K599-R882)的编码基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2序列信息为肝素N-磺基转移酶突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V的编码基因的核苷酸序列。
肝素N-磺基转移酶酶活测定方法：在37℃条件下，反应体系中加入50mM PNPS，0.5mM PAP，2mg AST IV，10％(v/v)甘油，1mg N-脱乙酰肝素前体和10μg肝素N-磺基转移酶纯化酶液，用20mM Tris-HCl缓冲体系(pH 8.0)将反应体系定容1.0mL，置于37℃恒温孵育15min后，检测实验组与对照组A400吸光值的差值。对照组中将肝素N-磺基转移酶酶液置于沸水中加热失活10分钟，其余操作同实验组。酶活定义单位：每分钟转化1μM PNP所需要的酶量。
表1
实施例1：重组大肠杆菌的构建
使用标准的PCR扩增体系和程序，扩增SEQ ID NO.1所示的编码肝素N-磺基转移酶的基因，使用Gibson组装技术将所得基因连接至pET32a质粒BamHI和HindIII酶切位点上，并在基因的N端融合促溶标签MBP tag，获得重组质粒，将重组质粒转入Escherichia coliRosetta(DE3)中，培养后得到转化子，转化子经验证正确的即为阳性转化子，为表达野生型肝素N-磺基转移酶的重组大肠杆菌菌株。
实施例2：重组大肠杆菌的发酵产酶
(1)摇瓶培养
将上述实施例1构建的重组大肠杆菌接种于LB培养基中，经过37℃过夜培养后，将重组大肠杆菌转接于装有TB培养基的250ml三角摇瓶中，37℃培养2h，分别加入终浓度为0.1、0.2、0.5、1mM的IPTG诱导后，并分别置于25℃、30℃培养16-20h。将发酵液于4℃进行离心(6000rpm、10min)，弃掉上清，使用20mM Tris-HCl缓冲液重悬菌体2-3次，使用超声细胞破碎仪破碎后于12000rpm高速离心20min，获得粗酶液。
(2)蛋白的纯化
将上述实施例2获得的粗酶液使用0.22μm滤膜进行过滤，并将过滤后上清液通过AKTA纯化系统加载至镍柱上，使用含有20mM Tris-HCl缓冲液、500mM咪唑、500mM NaCl的洗脱液进行洗脱，获得纯化的酶液。
结果：
如图1所示，比较了诱导浓度和诱导温度对酶活性的差异，在25℃条件下以终浓度0.2mM IPTG诱导时活性达到最高。
如图2所示，经过培养和纯化处理，获得了条带单一的重组酶。
实施例3：稳定性提高突变体的获得
为了提高肝素N-磺基转移酶的稳定性，对N端前3-5个氨基酸和C端末尾6个氨基酸进行截短突变，对S625、S637、R688、D721、S741、E784、T807、E839、L842、T869位点进行定点突变，对N679、S832位点使用密码子NNK进行单点随机突变和组合突变，对K779/R782位点使用简并密码子NDT进行随机突变。
以实施例1构建的携带编码未经突变的肝素N-磺基转移酶的基因的重组质粒为模板，使用标准的PCR程序进行扩增，所用引物如表1所示。将截短突变的PCR产物使用限制酶DpnI消化模板后，使用Blunting Kination Ligation试剂盒将线性PCR产物连接环化，并转入Escherichia coli JM109中。将定点突变和随机突变的PCR扩增产物转Escherichiacoli JM109中。挑选单菌落测序验证获得正确的转化子。转化子的培养及产酶诱导方法如实施例2所示(IPTG浓度为0.2mM、诱导温度为25℃)，获得突变体纯酶的方法如实施例2所示。
将得到的野生型与突变体纯酶分别置于20mM Tris-HCl缓冲液中，在37℃处理20min后，置于冰上冷却10min，测定其酶活，筛选到稳定性提高的突变体NΔ4、S637P、S741P、E839P、L842P、K779N/R782V。
结果如图3、图4所示，使用截短突变、定点突变和随机突变进行筛选获得了稳定性明显高于原始菌株的突变体，同时，与野生型相比较，比酶活水平接近。
实施例4：稳定性提高突变体的组合
将上述实施例3获得的稳定性高于原始菌株的突变体进行组合，以实施例3构建的携带编码的经过突变的肝素N-磺基转移酶的基因的重组质粒K779N/R782V为模板，利用表1所示的引物，使用标准的PCR程序进行扩增。转化子的培养方法如实施例2所示，获得突变体纯酶的方法如实施例2所示。将得到的突变体纯酶置于20mM Tris-HCl缓冲液中，在37℃处理不同时间后，置于冰上冷却10min，测定其酶活，最终获得稳定性明显提高的突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V。
具体如图5所示，突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V在24h后仍保留有78％的残余酶活，且突变体的催化效率比原始菌株提高了1.3倍。
对组合突变体与野生型同时进行酶学性质的表征：
酶的最适温度检测方法为：将得到的纯酶加入酶活检测体系中，分别在30、35、37、42、45、50、55℃测定其酶活。酶的最适pH检测方法为：将得到的纯酶置于不同pH的缓冲液中(pH6.0、6.5的20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH7.0、7.5、8.0的20mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0、10.0、10.6的20mM甘氨酸-NaOH缓冲液)，于37℃检测其酶活。
具体如图6所示，突变体NΔ4/S637P/S741P/E839P/L842P/K779N/R782V和野生型的最适温度和最适pH值相似，性能保持稳定。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种肝素N-磺基转移酶突变体，其特征在于，所述肝素N-磺基转移酶突变体包括如下任一：
(a)人源肝素N-磺基转移酶的N端前3个或4个氨基酸敲除；
(b)将人源肝素N-磺基转移酶的第637位的丝氨酸突变为脯氨酸；
(c)将人源肝素N-磺基转移酶的第741位的丝氨酸突变为脯氨酸；
(d)将人源肝素N-磺基转移酶的第839位的谷氨酸突变为脯氨酸；
(e)将人源肝素N-磺基转移酶的第842位的亮氨酸突变为脯氨酸；
(f)将人源肝素N-磺基转移酶的第779位的赖氨酸突变为天冬酰胺并将第782位的精氨酸突变为缬氨酸；
(g)将人源肝素N-磺基转移酶的N端敲除前4个氨基酸、第637位的丝氨酸突变为脯氨酸、第741位的丝氨酸突变为脯氨酸、第839位的谷氨酸突变为脯氨酸、第842位的亮氨酸突变为脯氨酸、第779位的赖氨酸突变为天冬酰胺和第782位的精氨酸突变为缬氨酸；
所述人源肝素N-磺基转移酶的氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_001534.1的双功能酶的第599位的赖氨酸至第882的精氨酸所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
5.表达权利要求1所述的肝素N-磺基转移酶突变体或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。
6.根据权利要求3所述的微生物细胞，其特征在于，所述以大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母为宿主，表达权利要求1所述的肝素N-磺基转移酶突变体。
7.一种提升人源肝素N-磺基转移酶性能的方法，其特征在于，所述方法是将人源肝素N-磺基转移酶的N端前3个或4个氨基酸敲除、将其第637位、741位、839位、842位、779位或782位中一位或多位发生突变；所述性能包括催化效率、稳定性。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人源肝素N-磺基转移酶的氨基酸序列如NCBI Reference Sequence:NP_001534.1的双功能酶的第599位的赖氨酸至第882的精氨酸所示。
9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法对人源肝素N-磺基转移酶做的改造如(a)～(g)任一所示：
(a)将N端前3个或4个氨基酸(NΔ3或NΔ4,D603-R882)敲除；
(b)将第637位的丝氨酸突变为脯氨酸；
(c)将第741位的丝氨酸突变为脯氨酸；
(d)将第839位的谷氨酸突变为脯氨酸；
(e)将第842位的亮氨酸突变为脯氨酸；
(f)将第779位的赖氨酸突变为天冬酰胺并将第782位的精氨酸突变为缬氨酸；
(g)将N端前4个氨基酸敲除、将第637位的丝氨酸突变为脯氨酸、将第741位的丝氨酸突变为脯氨酸、将第839位的谷氨酸突变为脯氨酸、将第842位的亮氨酸突变为脯氨酸、将第779位的赖氨酸突变为天冬酰胺并将第782位的精氨酸突变为缬氨酸。
10.权利要求1所述的肝素N-磺基转移酶突变体、权利要求2所述的基因或权利要求5或6所述的微生物细胞在催化获得N-磺酸化肝素前体、制备肝素及硫酸乙酰肝素中的应用。
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