CN114763570A - 制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，以毕赤酵母GS115为出发菌株，在细胞内异源表达了肝素合成途径相关基因：双功能N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST)、葡萄糖醛酸C5‑变构酶(C5epi)、磺酸乙酰肝素2‑磺酸转移酶(2‑OST)、磺酸乙酰肝素6‑磺酸转移酶(6‑OST)、磺酸乙酰肝素3‑磺酸转移酶(3‑OST)，本发明实现了利用微生物发酵碳源生产肝素修饰酶，并首次实现了从ATP出发全酶法体外催化合成肝素。
Description
技术领域
本发明涉及制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建及其应用，属于生物医药领域。
背景技术
肝素是一类具有多种生物学功能的糖胺聚糖，由GlcA及GlcNAc经β-1,4、α-1,4糖苷键连接并经变构化、磺酸化修饰而成。动物体内几乎每种类型的细胞都具有合成肝素的能力。肝素以蛋白聚糖形式广泛存在于细胞表面或细胞外基质中。肝素与多种蛋白配体相互作用从而调节一系列生物学活性，包括发育过程、血管形成、血液凝固和肿瘤转移等。
肝素形成由二糖单元-GlcA-GlcNAc-组成的多糖骨架后，首先是应用具有两种催化功能的N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(N-deacetylase/N-sulfotransferases,NDST)将GlcNAc的乙酰基脱掉形成含有自由氨基的葡萄糖胺(GlcNAc)，然后N－磺酸转移酶转移一个磺酸基团到葡萄糖胺形成GlcNS。磺酸转移酶与磺酸基团的供体3’-磷酸－腺苷-5’－磷酰磺酸(3’-phosphoadenosine5/phosphosulfate，PAPS)相互作用将磺酸基团转移到糖单元相应的位置。葡萄糖胺N-位磺酸化修饰后，D-GlcA通过差向异构酶(C5-epimerase，C5-epi)形成L-IdoA，紧接着2-磺酸转移酶(2-sulfotransferases，2-OSTs)将磺酸基团转移到IdoA或GlcA的C2位形成IdoA2S或GlcA2S。然后GlcNS的C6位和C3位分别通过6-磺酸转移酶(6-sulfotransferases，6-OSTs)和3-磺酸转移酶(3-sulfotransferases，3-OSTs)发生磺酸化修饰。
目前商品化的肝素严重依赖于动物组织提取(肝脏，猪小肠等)，该方法存在许多问题，比如原料周期长，潜在动物病毒传染，环境污染，组织提取的肝素结构高度不均一，存在潜在的致病因子。动物组织来源的肝素作为临床上广泛使用的药物一直面临结构不稳定、成分复杂的问题。由于肝素中混有一定量的过磺酸软骨素造成了2007-2008年的百特伦事件。为了得到结构均一性较好、生物安全的肝素，利用微生物酶法进行肝素的合成可以有效避免上述问题。
发明内容
本发明为实现绿色高效制备肝素的目的，以毕赤酵母为平台菌株，分别表达肝素修饰酶(NDST1，C5 epi，2-OST，6-OST1和3-OST1)，并通过体系优化制备肝素修饰酶，制备不同磺酸化程度的肝素，此外，采用毕赤酵母共培养体系，通过体外添加PAPS及从ATP出发制备得到不同分子量的肝素。由于生物酶法具有反应条件温和、专一性高、产物易控制等优点，易于实现工业化生产制备肝素。
本发明通过系统优化，将多个催化体系有机的组合形成了一个可以通过多酶级联反应高效催化合成肝素的方法。本方法通过两种方式：(1)肝素前体、肝素修饰酶和PAPS或(2)肝素前体、肝素修饰酶、PAPS合成双功能酶ASAKS、PPKS、ATP和MgSO4反应即可得到最终肝素。本方法操作简便，成本低廉，有着重大的实用价值。
本发明的目的在于为了克服现有技术中的问题，实现微生物酶法定向生产肝素，克服了传统的组织提取法带来的各种弊端，及常规化学酶法催化合成肝素过程的低效和繁琐，并大大降低了生产成本。
本发明的目的是为了克服现有技术中的问题，通过毕赤酵母表达肝素修饰酶实现不同分子量肝素的合成，然后通过甲醇为诱导剂诱导肝素修饰酶的表达，实现以不同分子量肝素前体为底物，全酶法定向生产分子量范围1.1-37.51kDa的肝素。
本发明提供了一种对肝素前体磺酸化修饰的方法，所述方法为在含有肝素前体的体系中，加入PAPS和肝素修饰酶，所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于Homo sapiens；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于Homo sapiens；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于Mus musculus。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的Genbank号为NM_001543；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶的Genbank号为NP_056369.1；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989812.1；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989813.1；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的Genbank号NP_034604.1。
在一种实施方式中，将肝素修饰酶同时或逐级添加至反应体系中。
在一种实施方式中，所述逐级添加为先将N－脱乙酰/N－磺酸转移酶加入含有肝素前体和PAPS的反应体系中反应；反应结束后，再将葡萄糖醛酸C5-变构酶和磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶加入反应体系中反应；反应结束后，向反应体系中加入磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶反应；反应结束后，再加入磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶反应。
在一种实施方式中，PAPS相较于肝素前体过量添加，即肝素前体与PAPS摩尔比大于1:1。
本发明提供了一种制备不同分子量肝素的方法，所述方法是以不同分子量的肝素前体为底物，加入PAPS、N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶，催化生成得到不同分子量的肝素；
或是，在含有ATP的体系中，加入PAPS合成双功能酶，加入肝素修饰酶反应，生成得到不同分子量的肝素；
所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于Homo sapiens；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于Homo sapiens；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于Mus musculus。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的Genbank号为NM_001543；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶的Genbank号为NP_056369.1；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989812.1；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989813.1；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的Genbank号NP_034604.1。
在一种实施方式中，所述肝素前体的分子量为1.1～35kDa。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶分别添加至反应体系中，或以混合酶液的形式加入反应体系。
在一种实施方式中，所述混合酶液，是利用重组菌按比例接种，发酵得到的，所述重组菌为分别表达N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的重组毕赤酵母，所述重组菌按菌浓＝(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)的比例混合，加入毕赤酵母发酵培养基发酵得到。
在一种实施方式中，所述重组菌按菌浓1:1:1:1:1、2:1:1:1:1，1:2:1:1:1，1:1:2:1:1，1:1:1:2:1或1:1:1:1:2的比例，比例1对应的OD600≈20。
在一种实施方式中，所述重组菌以毕赤酵母GS115为出发菌株，以pGAPZB、pAO815或pPIC3.5K为表达载体。
在一种实施方式中，所述肝素前体是由E.coli strain Nissle 1917或E.coli K5发酵得到，再按不低于4U/g肝素前体的量加入肝素裂解酶III，反应0～8h，得到不同分子量的肝素前体。
在一种实施方式中，向肝素前体中加入肝素裂解酶III后，在37℃下，反应不同时间：
反应0min时肝素前体分子量为35kDa；反应15min时肝素前体分子量为15kDa；反应30min时肝素前体分子量为8kD；应45min时肝素前体分子量为4kDa；反应60min时肝素前体分子量为2kDa；反应120min时肝素前体分子量为1.4kDa；反应240min时反应120min时肝素前体分子量为1.3kDa；反应360min时肝素前体分子量为1.2kDa；反应480min时肝素前体分子量为1.1kDa。
在一种实施方式中，所述肝素裂解酶III公开于授权公告号CN111471669B的专利文献中，为其中记载的突变体S264F/Y490K/D321N。
在一种实施方式中，所述肝素前体的制备方法为挑取单菌落，接种至LB培养基中，35～40℃，200～250r/min过夜培养，转接至新的LB培养基中，35～40℃，200～250r/min培养8h后按照10％(V/V)接种到肝素前体发酵培养基；在整个发酵过程中，通过1M HCl或2MNaOH控制发酵液的pH维持在7.0；从发酵第8小时开始，流加新鲜的培养基(800g/L葡萄糖，20g/L MgSO4·7H2O及0.2g/L硫胺素)维持发酵液中的葡萄糖浓度大于10g/L至发酵结束，总共发酵48h。
本发明提供了一种酶法制备肝素的方法，所述方法是向在含有肝素前体的反应体系中，加入PAPS和肝素修饰酶，在35～45℃下反应20～25h，制备得到肝素；或是在含有ATP的体系中，加入PAPS合成双功能酶和肝素修饰酶反应，制备得到肝素；
所述肝素修饰酶所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于Homo sapiens；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于Homo sapiens；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于Mus musculus。
在一种实施方式中，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶的Genbank号为NM_001543；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶的Genbank号为NP_056369.1；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989812.1；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶的Genbank号为NP_989813.1；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的Genbank号NP_034604.1。
在一种酶法制备肝素的方法中，所述方法是向在含有肝素前体的反应体系中，加入ATP、MgSO4、PAPS合成双功能酶ASAKS和肝素修饰酶，在35～45℃下反应20～25h，制备得到肝素；所述肝素修饰酶所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶。
在一种实施方式中，所述肝素修饰酶是由毕赤酵母工程菌株混菌发酵获得。
在一种实施方式中，所述PAPS合成双功能酶ASAKS和PPKS是由重组大肠杆菌发酵获得，挑取大肠杆菌单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照2％接种量接种于TB培养基中，继续培养至OD600为0.6-0.8时进行诱导表达，诱导条件：0.3-0.5mM的IPTG诱导表达(25℃，220rpm)，诱导表达时间为8-12h。然后离心收集菌体，用去离子水洗涤菌体2次后，用PBS溶液重悬细胞，然后在800bar条件下高压匀浆破壁5min，离心收集破壁上清液。
在一种实施方式中，所述ATP浓度为3-6g/L，MgSO4浓度为1-3g/L。
本发明的有益效果：
本发明利用合成生物学技术和基因工程手段，以毕赤酵母GS115为出发菌株，在细胞内异源表达了肝素合成途径相关基因：双功能N－脱乙酰/N－磺酸转移酶(NDST)、葡萄糖醛酸C5-变构酶(C5 epi)、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶(2-OST)、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶(6-OST)、磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶(3-OST)，成功制备得到了酶液，并首次实现了全酶法体外催化合成肝素，制备得到的肝素抗凝血活性，抗Fxa活性可达88.74ng/mL，抗IIa活性可达50.46ng/mL。
附图说明
图1是全酶法修饰肝素前体生产肝素示意图。
图2是不同来源NDST1酶活。
图3是不同来源C5 epi酶活。
图4是不同来源2-OST酶活。
图5是不同来源6-OST酶活。
图6是不同来源3-OST酶活。
图7是不同分子量肝素前体随时间变化。
图8是GlcA-GlcNAc(m/z：378.3)的LC-MS图。
图9是GlcA-GlcNS(m/z：416.3)的LC-MS图。
图10是GlcA-GlcNAc6S(m/z：458.05)的LC-MS图。
图11是IndoA-GlcNS6S(m/z：496.4)的LC-MS图。
图12是IndoA2S-GlcNS6S(m/z：577.5)的LC-MS图。
图13是抗凝血活性结果图。
图14是方法一制备得到的肝素图。
图15是方法二制备得到的肝素图。
具体实施方式
材料：
1.毕赤酵母GS115保藏于本研究室。
2.PrimeSTAR DNA聚合酶、DNAMarker、Solution I等酶类试剂购自TaKaRa(大连)。
3.ClonExpress一步法定向克隆试剂盒购自Beyotime Biotechnology(上海)。
4.胶回收试剂盒，快切酶购自Thermo fisher Scientific公司。
5.质粒抽提试剂盒购自生物工程(上海)有限公司。
6.各种分析纯试剂购自国药集团。
7.GS115感受态制备方法及转化步骤参照Thermo Fisher Invitrogen's PichiaEasyCompo Kit。
8.肝素裂解酶III公开于授权公告号CN111471669B的专利文献中，为其中记载的突变体S264F/Y490K/D321N。
肝素裂解酶I的NCBI登录号：WP_055300818.1。
9.下述实施例中所使用的PAPS，其制备方法参见公布号为CN113046403A的发明专利及文章1，具体为：利用所述专利文件中制备得到的双功能酶和谷氨酸棒杆菌来源的聚磷酸激酶合成PAPS；
100mL的反应体系(50mM Tris-HCl buffer pH 7.5)，其中，PAPS合成双功能酶1mg/mL(比酶活：18～20U/mg)，聚磷酸激酶1mg/mL(比酶活：15～20U/mg)，底物ATP 5g/L，硫酸镁3g/L。其中PAPS合成双功能酶加入时间为反应开始后0h，聚磷酸激酶加入的时间为反应开始后10～15h，反应40～50h完成反应(反应体系中没有ATP检出时即视为反应结束)，反应结束后测定PAPS的产量，得到纯度为85％的PAPS。
10.培养基：
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，琼脂粉20。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10。
TB液体培养基(g/L)：蛋白胨24，酵母粉12，甘油4，K2HPO4·3H2O 12.64，KH2PO42.31。
种子培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
毕赤酵母重组菌发酵培养基(g/L)：甘油40，K2SO4 18，MgSO4·7H2O 14.9，KOH4.13，85％H3PO4 26.7mL/L，CaSO4·2H2O 0.93，4.35mL/PTM1微量元素；其中，PTM1(g/L)：CuSO4·5H2O 6，KI 0.09，MnSO4·H2O 3，H3BO3 0.02，MoNa2O4·2H2O 0.2，C℃l2·6H2 O 0.5，ZnCl2 20，FeSO4·7H2O 65，生物素0.2，H2SO4 5.0mL。
肝素前体发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，硫胺素0.3，KH2PO4 13.5，(NH4)2HPO4 4.0，MgSO4·7H2O 1.4，柠檬酸1.7，微量金属离子10mL。其中，金属离子组分(g/L)：FeSO4·7H2O10，CaCl2 2.0，ZnSO4·7H2O 2.2，MnSO4·4H2O 0.5，CuSO4·5H2O 1.0，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.1，Na2B4O7·10H2O 0.02溶于5M的HCl中。
11.肝素前体的制备
利用E.coli strain Nissle 1917或E.coli K5发酵生产肝素前体。
(1)E.coli strain Nissle 1917或E.coli K5培养条件：挑取单菌落，接种至3mLLB培养基中，37℃，220r/min过夜培养，转接至50mL LB培养基中，37℃，220r/min培养8h后按照10％(V/V)接种到肝素前体发酵培养基(3L/7L发酵罐)。在整个发酵过程中，通过1MHCl或2M NaOH控制发酵液的pH维持在7.0。从第8小时开始，流加新鲜的培养基(800g/L葡萄糖，20g/L MgSO4·7H2O及0.2g/L硫胺素)维持发酵液中的葡萄糖浓度大于10g/L至发酵结束(48h)。
(2)E.coli strain Nissle 1917培养结束后，8,000g离心收集上清。加入终浓度为15g/L的NaCl，3倍体积的乙醇，-80℃冷冻过夜。12,000g，4℃离心收集沉淀，20mM Tris-HCl(pH 7.4)重悬沉淀。加入终浓度为1mg/L的DNase，37℃反应1h去除溶液中的杂质DNA。加入2.5mg/mL的蛋白酶K，55℃反应2h除去溶液中的蛋白。12,000g，4℃离心收集上清，过0.22μm水膜后，过AMBERLITETMFPA98 Cl树脂吸附软骨素，所得洗脱液经AMBERLITETMIR120Na树脂除去阳离子杂质，最后经DOWEX*OPTIPORE*L493脱色和
FILMTECTM浓缩后冷冻干燥得到纯度为90％的肝素前体样品。
12.肝素前体及肝素分子量大小的测定：使用高效体积排阻色谱系统(Highperformance size exclusion chromatography，HPSEC)：HPSEC体系是由G1310A泵和G1329B针头和G1362A示差检测器组成的一套安捷伦1260系统。分析条件：色谱柱：UltrahydrogelTMLinear column 7.8×300mm；流动相：0.1mol/L NaNO3溶液；流速：0.75mL/min；柱温：37℃；进样量：20μL。根据葡聚糖标准样品的洗脱体积，使用凝胶渗透色谱分析法(Gel permeation chromatography，GPC)制作出分子量和洗脱体积之间的标准曲线。在相同的条件下，测出每个样品的洗脱体积，GPC软件可计算出每个样品的重均分子量、数均分子量及分子量分布。
实施例1：不同来源的NDST、C5 epi、2-OST、6-OST、3-OST筛选
(1)选取不同来源的NDST、C5 epi、2-OST、6-OST、3-OST，如表1所示。
表1不同来源的基因及其Genbank号
(2)基因序列由基因合成公司合成，将合成得到的基因分别连接至pPIC3.5K的多克隆酶切位点处，分别构建得到重组质粒pPIC3.5K-Homo sapiens NDST1、pPIC3.5K-Musmusculus NDST1、pPIC3.5K-Homo sapiens C5 epi、pPIC3.5K-Danio rerio C5、pPIC3.5K-Gallus 2-OST、pPIC3.5K-Danio rerio 2-OST、pPIC3.5K-Homo sapiens 2-OST、pPIC3.5K-Mus musculus 2-OST、pPIC3.5K-Mus musculus 2-OST、pPIC3.5K-Rattus norvegicus 2-OST、pPIC3.5K-Xenopus laevis 2-OST、pPIC3.5K-Gallus 6-OST、pPIC3.5K-Danio rerio6-OST、pPIC3.5K-Gallus gallus 6-OST、pPIC3.5K-Homo sapiens 6-OST、pPIC3.5K-Homosapiens 6-OST1、pPIC3.5K-Homo sapiens 6-OST3、pPIC3.5K-Mus musculus 6-OST、pPIC3.5K-Danio rerio 3-OST、pPIC3.5K-Homo sapiens 3-OST3、pPIC3.5K-Homo sapiens3-OST5、pPIC3.5K-Mus musculus 3-OST；
制备毕赤酵母GS115感受态细胞，将上述得到的重组质粒使用SalI线性化后使用电转化至毕赤酵母GS115感受态中，电转到GS115酵母细胞中，使用MD平板筛选得到的阳性克隆，之后使用4mg/mL G418筛选拷贝数，筛选获得拷贝数大于10的菌株。
将筛选获得的菌株进行摇瓶培养：分别接种至5mL YPD培养基30℃，220rpm培养16-24h培养后转接至50mL BMGY培养基培养24h，之后转接BMMY并进行甲醇诱导培养96h，将培养结束后的菌体用Tris-HCl(25mmol/L，pH7.4)洗两遍细胞，并用50mL Tris-HCl重悬菌体，用高压匀浆仪破碎细胞进行酶活测定。
(3)酶活测定：
通过测定N-(5-硝基-2-吡啶基)脯氨醇(PNP)的含量来表征NDST总活力：所用标准反应条件为900μL的底物母液(50mM PNPS，0.5mM PAP，0.5mg ASST IV和10mg N-脱乙酰肝素前体溶解在20mM Tris-HCl(pH 7.4)中)，37℃预热5min后加入100μL 1g/L NDST，37℃反应1h，加入0.2mL 10M NaOH溶液终止反应。12,000g离心10min后去除沉淀，400nm下测定酶联反应产生的PNP的吸光值。
C5epi的酶活测定采用C5epi与2-OST偶联测定检测PNP的生成量：标准反应条件为900μL的底物母液(50mM PNPS，0.5mM PAP，0.5mg ASST IV和10mg N-硫酸化肝素前体溶解在20mM Tris-HCl(pH 7.4)中)，37℃预热5min后加入100μL 1g/L的C5差向异构酶和2g/L的HS2ST，37℃反应1h后加入0.2mL 10M NaOH溶液终止反应。12,000g离心10min后去除沉淀，400nm下测定酶联反应产生的PNP的吸光值。
肝素磺基转移酶(2-OST、6-OST、3-OST)酶活测定采用分光光度计检测PNP的生成：标准反应条件为900μL的底物母液(50mM PNPS，0.5mM PAP，0.5mg ASST IV和10mg肝素溶解在20mM Tris-HCl(pH7.4)中)，37℃预热5min后加入100μL 1g/L的磺基转移酶酶液，37℃反应1h后加入0.2mL 10M NaOH溶液终止反应。12,000g离心10min后去除沉淀，400nm下测定酶联反应产生的PNP的吸光值。一个硫酸转移酶的酶活单位定义为在pH 7.4，37℃条件下，每小时释放1μM PNP所需要的酶量。对照反应为相同条件下加入等量已灭活的酶液。每个反应均做3个生物学重复，取平均值为最终的酶活值。
(4)得到以下几种的来源酶活较高的基因，来源于Homo sapiens的NDST1(NM_001543)。来源于Homo sapiens的C5 epi(NP_056369.1)，来源于Gallus的2-OST(NP_989812.1)，来源于Gallus的6-OST(NP_989813.1)，来源于Mus musculus的3-OST(NP_034604.1)，将含有相应基因的菌株分别命名为：GS115/NDST1、GS115/C5 epi、GS115/2-OST、GS115/6-OST、GS115/3-OST，经测定，酶活分别为：45U/L，105U/L，203U/L，345.5U/L，257U/L，用于体外酶法生产肝素基因工程菌的构建。
实施例2：逐级催化制备肝素
(1)发酵生产肝素修饰酶
将实施例1中构建得到的重组菌株GS115/NDST1、GS115/C5 epi、GS115/2-OST、GS115/6-OST、GS115/6-OST分别进行3-L分批补料发酵。
首先分区划线得到单菌落，挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中，在30℃，220rpm条件下培养16-18h，然后按10％接种量分别转接至三瓶50mLY PD液体培养基中，于30℃220rpm培养24h左右(OD600为60-70)，然后按15％接种于含有1L发酵培养基的3-L发酵罐中，控制发酵温度为28℃，pH为5.5，通气量为4.0vvm，搅拌转速和溶氧相关联，控制溶氧在30％，搅拌转速在300-1000rpm。待发酵培养基中的甘油被消耗殆尽继续饥饿培养2-3h后，饥饿培养后以恒速流加方式进行50％(v/v)甘油(含12mL/L PTM1)补料10h，补料速率为20mL·h-1·L-1，补料结束后继续饥饿培养2h，进入甲醇诱导阶段，转速不变。用含12mL·L- 1PTM1的甲醇流加诱导并且将甲醇终浓度控制在18g/L，甲醇流加速率和培养基中甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制，诱导108h。收集发酵得到的菌体，用去离子水洗涤菌体两遍后重悬菌体，采用高压匀浆破壁后离心得到胞内上清。
N-磺酸化肝素前体(-GlcA-GlcNS-)(p01)制备的反应体系：反应体系中肝素前体浓度为1g/L，向其中添加过量NDST1酶液，PAPS终浓度为0.5g/L(过量)，在37℃，pH7.4条件下反应24h。图8和图9表示成功制备含有-GlcA-GlcNS-结构的N-磺酸化肝素前体，转化率为91％。
-IndoA2S-GlcNS-(p02)的制备：反应体系中的N-磺酸化肝素前体(p01)浓度为1g/L，向其中添加过量C5 epi酶液和2-OST酶液，PAPS终浓度为0.5g/L，在37℃，pH7.4条件下反应24h。图10和11表示成功制备得到含有-IndoA2S-GlcNS-的多糖，转化率为87.7％
-IndoA2S-GlcNS6S-(p03)的制备：反应体系中的-IndoA2S-GlcNS-(p02)浓度为1g/L，向其中添加过量6-OST1酶液，PAPS终浓度为0.5g/L，在37℃，pH7.4条件下反应24h。图12表示成功制备得到含-IndoA2S-GlcNS-结构的多糖，转化率为91.5％。
3-磺酸化肝素(p04)的制备：反应体系中的-IndoA2S-GlcNS6S-(p03)浓度为1g/L，向其中添加过量3-OST1酶液，PAPS终浓度为0.5g/L，在37℃，pH7.4条件下反应24h。肝素最终产量为0.95g/L，转化率为95％。
实施例3：不同分子量肝素前体的制备
不同分子量肝素前体制备，酶解肝素前体反应液(10g/L肝素前体)：
肝素前体的分子量通过控制肝素裂解酶I和III的浓度和反应时间来获得，反应体系为在50mmol/L Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中进行：终浓度1g/L肝素前体，10μl 4U/L肝素裂解酶I，10μL 4U/mL的肝素裂解酶III，37℃条件下反应。反应结束后检测肝素前体及肝素分子量大小。
结果显示，0min时肝素前体分子量为35kDa，反应15min时肝素前体分子量为15kDa，反应30min时肝素前体分子量为8kDa，反应45min时肝素前体分子量为4kDa，反应60min时肝素前体分子量为2kDa，反应120min时肝素前体分子量为1.4kDa，反应240min时反应120min时肝素前体分子量为1.3kDa，反应360min时肝素前体分子量为1.2kDa，反应480min时肝素前体分子量为1.1kDa。
实施例4：重组大肠杆菌发酵培养获取PAPS合成双功能酶ASAKS和PPKS
本实施例所用PAPS合成双功能酶ASAKS5(atpsS(Gene ID:853466)和apskE(GenBank:M74586.1)融合)和PPKS(GeneID:878853)的表达、纯化及制备根据文献获得(Closed-Loop System Driven by ADP Phosphorylation from Pyrophosphate AffordsEquimolar Transformation of ATP to 3’-Phosphoadenosine-5’-phosphosulfate，2021年)。
挑取重组大肠杆菌单菌落于LB培养基中过夜培养，将种子按照2％接种量接种于TB培养基中，继续培养至OD600为0.6-0.8时进行诱导表达，诱导条件：0.3-0.5mM的IPTG诱导表达(30℃，220rpm)，诱导表达时间为8-12h。然后离心收集菌体，用去离子水洗涤菌体2次后，用50mM Tris-HCl(pH7.5)溶液重悬细胞，然后在800bar条件下高压匀浆破壁5min，离心收集破壁上清液。重组蛋白使用AKTA start 25中的镍亲和层析柱纯化，并使用Hi TrapDesalting脱盐柱进行脱盐处理，分别得到纯化后的ASAKS5和PPKS。
实施例5：一种基于PAPS制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建
NDST1、C5 epi、2-OST、6-OST、3-OST由摇瓶培养或发酵罐获得，在制备肝素时，催化反应在50mL 50mmol/L MES(pH7.4)缓冲溶液中进行：5mL 10g/L不同分子量肝素前体、5mL 3500U/L NDST1、5mL 3500U/L C5 epi、5mL 3500U/L 2-OST、5mL 3500U/L 6-OST、5mL3500U/L 3-OST及终浓度为0.5g/L的PAPS，40℃条件下反应24h，收集反应液。
对于收集得到的反应液的处理方法：向收集得到的反应上清中加4倍预冷的无水乙醇沉淀大分子的多糖和杂质，离心去除沉淀，小分子量的肝素溶解在上清中。将含有乙醇的样品进行冷冻干燥得到产量20g/L，纯度均80％以上的不同分子量的肝素的样品。
实施例6：一种从ATP出发制备不同分子量肝素的磺酸化修饰体系构建
NDST1、C5 epi、2-OST、6-OST、3-OST由摇瓶培养或发酵罐获得，在制备肝素时，催化反应在50mL 50mmol/L MES(pH7.4)缓冲溶液中进行：5mL 10g/L不同分子量肝素前体、5mL 3500U/L NDST1、5mL3500U/L C5-epi、5mL 3500U/L 2-OST、5mL 3500U/L 6-OST、5mL3500U/L 3-OST、10μM ASAKS5、0.5g/L PPKS及终浓度为5g/L的ATP，2g/L的MgSO4，40℃条件下反应48h，收集反应液。
按照实施例5乙醇沉淀法分离与纯化大分子肝素及小分子量肝素，得到不同分子量的肝素。
实施例7：毕赤酵母共培养简化肝素生产工艺
开发一种有效的方法来合成肝素对于理解其生物合成机制也是必不可少的。为提高肝素的合成能力，简化生产工艺，在3-L生物反应器中对共培养体系进行了放大。
一级种子液为将GS115/NDST1、GS115/C5 epi、GS115/2-OST、GS115/6-OST、GS115/3-OST接种至5mLYPD培养基培养16h(OD600≈6.0)，二级种子液按照10％接种比例接种至500mL摇瓶，之后按照接种比例为NDST1(OD600≈20)：C5 epi(OD600≈20)：2OST(OD600≈20)：6OST(OD600≈20)：3OST(OD600≈20)＝1:1:1:1:1，按照10％接种量接入在3-L生物反应器(含有毕赤酵母发酵培养基)，并加入终浓度为0.1mM的甲醇诱导，在诱导108h后，收集细胞使用缓冲溶液(50mM MES，pH7.4)重悬细胞并在4℃下使用高压匀浆破碎获得混合酶液。
具体酶催化反应在50mL 50mmol/LMES(pH7.4)缓冲溶液中进行：40℃条件下，将25mL适量的混合酶液加入终浓度0.5g/L PAPS及不同终浓度肝素前体(0.5g/L，0.4g/L，0.3g/L，0.2g/L，0.1g/L)制备不同磺酸化程度的肝素，混合均匀，在40℃条件下充分反应24h。反应结束后，将产物煮沸5min，离心去除杂蛋白，上清使用乙醇沉淀法醇沉两次。使用LC-MS鉴定不同位置磺酸化二糖分布如下表所示：
表2不同位置磺酸化二糖分布
产物使用HiPrep Q HP 16/10柱纯化。柱体积(CV)：20mL；流速：3mL·min-1；检测波长：210nm；平衡液：浓度0.02mol·L-1的pH8.0磷酸盐缓冲液；洗脱液：含1mol·L-1NaCl的磷酸盐缓冲液；洗脱梯度：0-80mmol·mL-1NaCl，3CV(柱体积)；上样量：100mg肝素产物；分离程序：平衡-上样-清洗(冲洗样品中未与柱子结合的部分)-洗脱-平衡，为一个循环。
实施例8：不同比例毕赤酵母共培养制备不同抗凝血活性的肝素
将实施例7中NDST1：C5 epi：2OST：6OST：3OST的比例分别替换为2:1:1:1:1，1:2:1:1:1，1:1:2:1:1，1:1:1:2:1，1:1:1:1:2(比例1对应OD600≈20)，按照上述培养方法在3-L生物反应器培养，按照以下两种方法制备肝素：方法1，将50mL不同的混合酶液加入0.5g/LPAPS及0.1g/L的肝素前体，混合均匀，在40℃条件下充分反应24h方法2，将50mL不同的混合酶液加入10μM ASAKS5、0.5g/L PPKS，终浓度为5g/L的ATP，2g/L的MgSO4，在40℃条件下充分反应24h，制备得到抗凝血活性的肝素。
实施例9：不同分子量肝素的制备
以实施例3得到的不同分子量(35kDa，15kDa，8kDa，4kDa，2kDa，1.4kDa，1.3kDa，1.2kDa，1.1kDa)的肝素前体，以实施例7中1:1:1:1:1接种比例得到混合酶液在50mL50mmol/L MES(pH7.4)缓冲溶液中进行以下两种催化反应：
(1)取25mL的混合酶液加入终浓度0.5g/L PAPS及0.1g/L的肝素前体，混合均匀，在40℃条件下充分反应24h，反应后测定产物的分子量，制备得到不同分子量的肝素。
(2)取25mL的混合酶液，加入10μM ASAKS5、0.5g/L PPKS，终浓度为5g/L的ATP，2g/L的MgSO4，在40℃条件下充分反应24h，反应后测定产物的分子量，制备得到不同分子量的肝素。
表3不同分子量肝素前体制备得到不同分子量肝素
实施例10：肝素的LC-MS检测
取500μl实施例6制备得到的肝素样品，加入10μl 4U/L肝素裂解酶I和4U/L肝素裂解酶III，置于37℃水浴锅中处理10h。将裂解后的溶液置于90℃加热10min使蛋白失活变性，离心后取上清进行LC-MS检测。LC-MS检测使用HILIC色谱柱(3μm，2.0×150mm，YMC,Japan)。洗脱液A为超纯水，洗脱液B为乙腈。所用的洗脱梯度设定如下：0-2分钟，90％B；2-8分钟，90-50％B；8-12分钟，50％B；12-13分钟，90％B。柱温保持在35℃，流速为0.2mL/min。在负离子模式下对m/z 100-800的质量范围进行扫描监测。
肝素的二糖分子在负离子模式下质荷比应含有以下离子流：m/z：378.3，m/z：416.3，m/z：496.4，m/z：458.05，m/z：577.6。如图8、图9，图10，图11，图12所示的质谱结果可以看出本实施例实现了不同分子量肝素的合成。
实施例11：肝素的抗凝血活性测定
将实施例5中实施例5中0.5g/L，0.4g/L，0.3g/L，0.2g/L，0.1g/L浓度肝素前体及按不同比例重组菌制备得到的生物工程肝素测定其抗凝血活性。
首先应用含有1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的PBS将FXa因子和human ATIII分别稀释至60nM和0.65pM。显色底物S-2765和S-2238溶于水制备成1mg/mL原液。测试用的寡糖用PBS稀释成浓度为200nM。首先将60μL ATIII和15μL上述肝素溶液涡旋混匀，室温条件下孵肓2min。然后加入90μL Fxa溶液，室温条件下孵育4min，最后分别加入30μL显色底物S-2765和S-2238。在405nm条件下测量反应混合物的吸光度，将不同的样品浓度对初始反应速率作图计算测试寡糖的IC50。
实施例5中0.5g/L，0.4g/L，0.3g/L，0.2g/L，0.1g/L浓度肝素前体及按1:1:1:1:1比例重组菌制备得到的生物工程肝素采用体外比色法评价的抗FXa因子和抗IIa因子活性(左侧柱子表示抗FXa因子活性，右侧柱子表示抗IIa因子活性)。如图13所示，添加0.1g/L肝素前体获得的肝素抗Fxa活性为79.94ng/mL，抗IIa活性为37.07ng/mL，与Sango生物技术(上海)的肝素相似(图13Heparin)，但高于其他生物工程肝素，抗Fxa/抗IIa比值(2.16±0.31)。
如图14和15所示，不同接种比例按照实施例9的方法一和方法二获得的肝素具有不同的抗凝血活性，其中，1:1:1:2:1接种比例得到的肝素抗凝血活性：方法一获得的肝素抗Fxa活性为86.61ng/mL，抗IIa活性为54.53ng/mL，抗Fxa/抗IIa比值(1.79±0.24)，方法二抗Fxa活性为79.62ng/mL，抗IIa活性为40.85ng/mL，抗Fxa/抗IIa比值(1.95±0.27)；1:1:1:1:2接种比例得到的肝素抗凝血活性结果：方法一获得的肝素抗Fxa活性为88.74ng/mL，抗IIa活性为50.46ng/mL，抗Fxa/抗IIa比值(1.75±0.31)方法二抗Fxa活性为89.53ng/mL，抗IIa活性为54.47ng/mL，抗Fxa/抗IIa比值(1.64±0.29)。因此，本发明所提供的体外全酶法在生物活性肝素的生产中具有很大的潜力。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种对肝素前体磺酸化修饰的方法，其特征在于，在含有肝素前体的体系中，加入PAPS和肝素修饰酶进行反应；所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于Homo sapiens；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于Homo sapiens；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于Mus musculus。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述肝素修饰酶同时或逐级添加至反应体系中。
4.一种制备不同分子量肝素的方法，其特征在于，所述方法为(a)或(b)所述任一：
(a)以不同分子量的肝素前体为底物，加入PAPS和肝素修饰酶反应，生成得到不同分子量的肝素；
(b)在含有ATP的体系中，加入PAPS合成双功能酶和PPKS，加入肝素修饰酶反应，生成得到不同分子量的肝素；
所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述肝素修饰酶分别添加至反应体系中，或以混合粗酶液的形式加入反应体系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合粗酶液，是利用重组毕赤酵母按比例接种，发酵得到的；所述重组毕赤酵母为分别表达N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶的重组毕赤酵母，所述重组菌按菌浓＝(1～2):(1～2):(1～2):(1～2):(1～2)的比例混合，加入毕赤酵母发酵培养基发酵得到。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组菌以毕赤酵母GS115为处出发菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肝素前体是由E.coli strain Nissle1917或E.coli K5发酵得到，再按不低于4U/g肝素前体的量加入肝素裂解酶，反应0～8h，得到不同分子量的肝素前体。
9.一种酶法制备肝素的方法，其特征在于，所述方法是向在含有肝素前体的反应体系中，加入PAPS和肝素修饰酶，在35～45℃下反应20～25h，制备得到肝素；或是在含有ATP的体系中，加入PAPS合成双功能酶和PPKS，再加入肝素修饰酶反应，制备得到肝素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肝素修饰酶所述肝素修饰酶包括N－脱乙酰/N－磺酸转移酶、葡萄糖醛酸C5-变构酶、磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶、磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶和磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶；所述N－脱乙酰/N－磺酸转移酶来源于Homo sapiens；所述葡萄糖醛酸C5-变构酶来源于Homo sapiens；所述磺酸乙酰肝素2-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素6-磺酸转移酶来源于Gallus；所述磺酸乙酰肝素3-磺酸转移酶来源于Mus musculus。
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