JP2022523638A - 改変型硫酸アリール依存性酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は電子形式で配列表と共に出願されている。配列表は、2019年12月30日に作成された「OPT-001X PCT_Sequence_Listing.txt」という名称のファイルとして提供され、サイズは390,921バイトである。配列表の電子形式の情報はその全体が参照により組み込まれる。
「活性部位」という用語は、触媒作用が起こる触媒タンパク質の部位を指し、1つ以上の基質結合部位を含むことができる。活性部位は、特定のポリペプチドと特異的に相互作用し、特定のポリペプチドの活性を調節する化合物の同定において、著しく有用である。天然リガンド又は基質と、それらの対応する受容体又は酵素の活性部位との会合は、作用の多くの生物学的機構の基礎である。同様に、多くの化合物は、受容体及び酵素の活性部位との会合によってそれらの生物学的効果を発揮する。このような会合は、活性部位の全部又は任意の部分で起こり得る。そのような会合の理解は、3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物に結合し、それと反応することができるスルホトランスフェラーゼ内の、改変型活性部位の設計を導くのに役立つ。
本発明のある態様において、本明細書に開示する改変型酵素のいくつかはスルファターゼ活性を有し、アリール硫酸化合物内で硫酸エステルを加水分解することができる(Recksiek, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273 (11): 6096-6103を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる)。水溶液中でアリール硫酸化合物と結合すると、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、アリール硫酸化合物の加水分解を触媒して、芳香族化合物及び硫酸イオンを生成することができる。アリール硫酸化合物の非限定的な例として、p-ニトロフェニル硫酸(PNS)、4-メチルウンベリフェリル硫酸、7-ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、4-アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、1-ナフチル硫酸、2-ナフチル硫酸(2NapS)、及び4-ニトロカテコール硫酸(NCS)が挙げられる。非限定的な例として、図1に示すように、アリール硫酸化合物がPNSである場合、生成物はp-ニトロフェノール及び硫酸イオンである。p-ニトロフェノールのpKaより高いpHで行われる反応では、芳香族生成物は、p-ニトロフェノレートイオンである。
他の態様において、上記のように、本発明の改変型酵素のいくつかは、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有する。他の態様において、スルホ基供与体は、多糖、好ましくはヘパロサン系多糖である。各スルホ転移反応では、アリール硫酸化合物はスルホ基供与体として関与し、多糖はスルホ基受容体として関与する。多糖類をスルホ基受容体として認識するが、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物にも結合及び反応するスルホトランスフェラーゼ酵素は、自然界では観察されておらず、以前にも記載されていない。
自然界では、HSグルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼは、二重のN-デアセチラーゼ及びN-スルホトランスフェラーゼ活性を有し、同じ酵素が最初に、ヘパロサン内のグルコサミン残基からのN-アセチル基の除去を触媒し、次いで、3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸から第1の工程においてN-脱アセチル化された同じグルコサミン残基へのスルホ基の転移を触媒する。酵素の二重のN-デアセチラーゼ活性及びN-スルホトランスフェラーゼ活性は、2つの別個の構造ドメイン、すなわちN-デアセチラーゼドメイン及びN-スルホトランスフェラーゼドメインを介して達成される。しかしながら、一方のドメインの活性は他方のドメインの活性のための必要条件ではなく、N-デアセチラーゼ又はN-スルホトランスフェラーゼ活性のいずれかを有する組換え単一ドメイン酵素を発現及び精製することができる。同様に、本発明のある態様において、グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ活性を有する改変型酵素は、N-デアセチラーゼドメインをさらに有することなく、単一のN-スルホトランスフェラーゼドメインとして発現及び精製することができる。
自然界では、HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼは、スルホ基受容体としてN-硫酸化されたヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、それと反応する。一般に、グルコサミニル残基の大部分はN-硫酸化されており、スルホ基は、ヘキスロン酸残基、一般にはグルクロン酸又はイズロン酸の2-O位に転移される。上記の野生型グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼと同様に、野生型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としての3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸と反応する際に、スルホ基を多糖に転移させる。しかしながら、野生型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼは、EC2.8.2.-酵素クラスのメンバーである。野生型HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素によって認識されるヘパロサン系多糖類は、典型的には、2つの異なる構造モチーフの少なくとも1つを有する。第1の非限定的な例では、天然ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式IVの構造を有する多糖類を認識し、結合し、それと反応することができる。
自然界では、HSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼは、スルホ基受容体としてN-、2-O硫酸化ヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応する。さらに、隣接するいずれかのヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸のいずれかとすることができ、場合により、2-O硫酸化することができる。典型的には、6-Oスルホ基を受けるグルコサミン残基の非還元末端のヘキスロン酸は、2-O硫酸化イズロン酸であり、多くの場合、グルコサミン残基自体もまたN-硫酸化されている。天然グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ及びヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼと同様に、野生型グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としての3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸と反応すると、スルホ基を多糖に転移させる。野生型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼと同様に、野生型グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素もまた、EC2.8.2.-酵素クラスのメンバーである。非限定的な例では、EC2.8.2.-内のグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式VIII(式中、6-Oスルホ基を受容するグルコサミン残基は、N-硫酸化されており、その非還元末端で2-O硫酸化イズロン酸残基に隣接しており、Xは式VIIIに示すヘキスロニル残基のいずれかを有する)の構造を有するヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応させることができる。式VIIIの構造を有するものだがこれに限定されないN-、2-O硫酸化ヘパロサン系多糖類と生物活性を有するEC2.8.2.-内のグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、Xu, Y., et al., (2017) ACS Chem. Biol. 12 (1): 73-82及びHolmborn, K., et al., (2004) J. Biol. Chem. 279, (41): 42355-42358によって記載され、これらの開示はその全体が参照により組み込まれる。
自然界では、HSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼは、一般に、スルホ基受容体としてのN,2O-HS及びN,2O,6O-HSヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応する。一般に、3-O位でスルホ基を受容するグルコサミン残基はN-硫酸化されており、場合により、6-O硫酸化もされていてもよい。さらに、隣接するいずれかのヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれも場合により2-O硫酸化されていてもよい。多くの場合、3-O硫酸化されているグルコサミン残基は、その非還元末端でグルクロン酸に隣接し、その還元末端で2-O硫酸化イズロン酸に隣接する。上記の野生型スルホトランスフェラーゼの各々と同様に、天然に存在するグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としての3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸と反応すると、スルホ基をヘパロサン系多糖に転移する。スルホ基供与体として3’-ホスホアデノシン5’-ホスホ硫酸を利用する野生型グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、EC2.8.2.23酵素クラスのメンバーである。非限定的な例では、EC2.8.2.23内の天然グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式X(式中、中心グルコサミン残基は、N-硫酸化されており、その非還元末端でグルクロン酸に隣接し、その還元末端で2-O硫酸化イズロン酸残基に隣接しており、Xは、場合により硫酸基又はアセチル基であってもよく、Yは、場合により硫酸基又はヒドロキシル基であってもよい。)の構造を有するN,2O,6O-HS多糖類を認識し、結合し、反応することができる。
本発明のある態様において、上記の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを利用して、硫酸化ヘパロサン系多糖類を合成することができる。一般に、硫酸化は、ヘパロサン系多糖及びアリール硫酸化合物を改変型スルホトランスフェラーゼ酵素で処理して、硫酸化生成物を形成することによって、達成することができる。上記のように、特定の理論に制限されるものではないが、ヘパロサン系多糖類をスルホ基受容体として認識するが、スルホ供与体としてのアリール硫酸化合物にも結合及び反応するスルホトランスフェラーゼ酵素は、自然界では観察されておらず、以前にも記載されていないと考えられている。
一般に、開示する核酸及びアミノ酸配列によってコードされる改変型酵素は、後述のものを含む、当技術分野で公知の任意の微生物学的技術を使用して発現及び精製することができる。各精製酵素の硫酸アリール依存性活性は、出発物質及び/又は硫酸化多糖生成物を特徴付けるために、分光光度的若しくは蛍光的に、及び/又は質量分析法(MS)若しくは核磁気共鳴(NMR)分光法を使用して決定することができる。そのような方法は実施例の項で後述する。
本開示の態様に従って、本発明による遺伝子を、改変型硫酸アリール依存性酵素、特にスルホトランスフェラーゼ活性を有する酵素を過剰発現することができる宿主細胞に形質転換することができるかどうかを決定するための試験を行った。発現後、各硫酸アリール依存性酵素を、宿主細胞から単離し、精製した。
一般に、PNS、MUS、7-ヒドロキシクマリン硫酸塩、硫酸フェニル、4-アセチルフェニル硫酸塩、インドキシル硫酸塩、1ナフチル硫酸塩、2NapS、及びNCSを含むがこれらに限定されない、多くのアリール硫酸化合物の脱硫芳香族生成物は、それぞれ近紫外又は可視スペクトルの光を吸収する又は蛍光を発する能力を有するので、硫酸アリール依存性酵素のスルファターゼ活性を容易に決定することができる。脱硫された芳香族生成物による吸光又は蛍光は、それぞれ、分光光度計又は蛍光光度計を用いて検出することができる。当業者は、特定のアリール硫酸化合物及びその脱硫芳香族生成物のスペクトル特性に基づいて、反応の進行を監視するためにどの機器を使用するかを容易に決定することができるであろう。
質量分析(MS)を使用して、それらのスルホ転移反応の結果として形成されるN-硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、又は配列番号15のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ活性を確認するために、本開示の態様に従って試験を行った。各改変型酵素を実施例1の手順に従って精製した。スルホトランスフェラーゼ活性を、50μM酵素を含有する反応物100μLにおいてモニタした。各精製タンパク質溶液について、アリール硫酸化合物20mg(PNS又はNCSのいずれか)を反応緩衝液2mL(50mM MES pH7.0、2mM CaCl2)に溶解し、タンパク質溶液に添加し、37℃で10分間インキュベートした。N-脱アセチル化ヘパロサンの2mg/mL溶液2.5mLをタンパク質/供与体溶液に添加し、37℃で一晩インキュベートした。N-脱アセチル化ヘパロサンは、Balagurunathan, K. et al (eds.) (2015), Glycosaminoglycans: Chemistry and Biology, Methods in Molecular Biology, vol. 1229, DOI 10.1007/978-1-4939-1714-3_2, cSpringer Science+Business Media, New York, pp.11-19 (section 3.1)に記載のプロトコルに従って合成した。N-硫酸化生成物を精製するために、インキュベートした反応混合物を翌日5,000×gで10分間遠心分離した。フィルタを水2mLで1回洗浄し、再度遠心分離した。濾液を1K MWCO透析膜に添加し、Milli-Q水中で2日間透析し、1時間、2時間、8時間、16時間、32時間で水を交換し、次いで凍結乾燥した。
本開示の態様に従って、実施例3と同様の手順を用いて、スルホ転移反応の結果として形成される2-O硫酸化多糖生成物の存在を検出することにより、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、又は配列番号65のアミノ酸配列を有する酵素のヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ活性を確認するための試験を実施したが、スルホ受容体多糖は、化学的手段(製品DSH001/2、Galen Laboratory Suppliesより入手可能)により2-O硫酸基が選択的に除去された市販のヘパラン硫酸であり、硫酸化生成物を含む消化試料の分析は、質量分析を用い、SAXベースの高速液体クロマトグラフィ(LCMS)と組み合わせて行った。
スルホ受容体多糖は、Kariya, Y., et al., (2000) J. Biol. Chem. 275 (34): 25949-25958に記載の手順に従って、市販のUF-HS(CASコード:9041-08-1、Millipore Sigmaより入手可能)を6-Oで化学的に脱硫酸して調製した以外、本開示の態様に従い、実施例4と同様のLCMS手順を用いて、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、又は配列番号108のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ活性を、それらのスルホ転移反応の結果として6-O硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって確認する試験を行った。
スルホ受容体多糖が市販のUF-HS(CASコード:9041-08-1、Millipore Sigmaより入手可能)であった以外、本開示の態様に従い、実施例4と同様のLCMS手順を用いる反応を用いて、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149又は配列番号151のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ活性を、それらのスルホ転移反応の結果として3-O硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって確認する試験を行った。未修飾UF-HSは約3.5%(w/w)の3-O硫酸化グルコサミン残基を含有するが、グルコサミン残基の約60%はN,6-硫酸化されており、式Xのように2-O硫酸化ヘキスロン酸残基に隣接している。その結果、これらのN,6-硫酸化グルコサミン残基は依然として3-O硫酸化することができる。
配列番号147、配列番号149、及び配列番号151のアミノ酸配列を有する改変型酵素の3-Oスルホトランスフェラーゼ活性、特にスルホ基供与体としてPNSを用いる配列番号149のアミノ酸配列を有する酵素の活性を確認するために本開示の態様に従って試験を行った。各酵素を実施例1の手順に従って精製した。各精製タンパク質溶液に、反応緩衝液2mL(50mM MES pH7.0、2mM CaCl2)に溶解したアリール硫酸化合物20mg(PNS又はNCS)をタンパク質溶液に添加し、37℃で10分間インキュベートした。実施例6で利用した市販のUF-HS多糖類の2mg/mL溶液2.5mLをタンパク質/供与体溶液に添加し、37℃で一晩インキュベートした。
本開示の態様に従って、スルホ受容体多糖類として使用するためのN-硫酸化ヘパロサンを、本発明の改変型硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ、特に改変型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと化学合成する試験を行った。上記Balagurunathan, K. et al.に記載のプロトコルに従って、N-脱アセチル化ヘパロサンを調製した。特に、DEAE樹脂から溶出したヘパロサンを、酢酸ナトリウムで飽和したエタノール中において-30℃で一晩沈殿させた後、水に再懸濁し、1,000Daの分画分子量(MWCO)を有するセルロース透析膜内で透析した。
改変型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ及び実施例8で合成したN-硫酸化ヘパロサンをスルホ受容体として用いて、式VI又は式VIIのいずれかの構造を有するN,2O-HS多糖生成物を合成するために、本開示の態様に従って試験を行った。円錐底の遠心管中で、NCSの80mMアリコートを50mM MES pH7.0、2mM CaCl2に溶解した。各溶液に、酵素試料の280nmの吸光度に基づいて配列番号63の配列を有する酵素2mgを添加した(約4mL)。実施例8で合成した凍結乾燥N-硫酸化ヘパロサン5mgを水1mLに再懸濁し、酵素及びNCSを含む反応混合物に添加した。次いで、反応混合物全体を30rpmで振盪しながら34℃で48時間インキュベートした。インキュベートする前に、配列番号67のアミノ酸配列を有するC5-ヘキスロニルエピメラーゼ2mgも反応混合物に添加したことを除いて、同じ手順を用いて第2の組の反応物を調製した。
実施例9のエピマー化N,2O-HS生成物をスルホ受容体多糖として使用し、配列番号104のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼを酵素として使用したことを除いて、実施例9の手順を用いて、式IXの構造を有するN,2O,6O-HS生成物を合成するために本開示の態様に従って試験を行った。
実施例10の化学合成したN-、2-O、6-O硫酸化多糖をスルホ受容体多糖として使用し、配列番号147、配列番号149、又は配列番号151のアミノ酸配列を有する改変型3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素をスルホトランスフェラーゼとして使用することを除いて、実施例9の手順を用いて、式Iの構造を有し、N-、6-O、3-O硫酸化グルコサミン及び2-O硫酸化ヘキスロン酸残基を有する硫酸化多糖生成物を合成するために、本開示の態様に従って試験を行う。硫酸化多糖生成物を、SAXを使用して実施例9の手順に従って消化し、分析する。N-、6-O、3-O硫酸化グルコサミン残基を含む消化された市販の四糖と比較すると、反応の結果として硫酸化多糖生成物が3-O硫酸化されていると決定されることが予想される。
アンチトロンビンに対する結合親和性を有すると予想される本明細書に記載のグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを使用して、実施例6又は実施例7の手順に従って生成したN,2O,3O,6O-HS生成物を決定するために、本開示の態様に従って試験を行う(Meneghetti, G., et al. (2017) Org. Biomol. Chem. 15: 6792-6799を参照のこと)。USP参照標準(CAS番号9041-08-1)などのアンチトロンビンとの活性を有することが知られている市販のN,2O,3O,6O-HS生成物を含む対照反応物。ヒトアンチトロンビン(AT)(1mg/mL)を、SyproOrange(商標)色素(Invitrogen)などの色素の存在下で異なる基質とインキュベートする。色素を水(1単位のSypro:50単位の水(v/v))で希釈し、希釈した色素3.5μLをPBS緩衝液中の混合物反応に添加する。SyproOrange(商標)色素は、300nm又は470nmの励起波長を有し、疎水性残基に結合すると570nmで発光する。25μgのN,2O,3O,6O-HS生成物が各反応混合物に含まれる。反応物を31℃で2分間インキュベートした後、0.5℃段階で32~85℃まで段階的な温度勾配に供する。各温度段階の間に、試料の平衡を確実にするために5秒間のインキュベート期間をとることができる。反応はリアルタイムPCRシステムを使用して開発することができる。USP参照標準並びに合成したN,2O,3O,6O-HS生成物との対照反応の融解曲線は、それぞれ色素及びATのみを含む標準よりも高い温度にシフトすることが予想され、これは、N,2O,3O,6O-HS生成物が式Iの構造を有する少なくとも1つのAT認識配列を有するので、ATがN,2O,3O,6O-HS生成物に結合することができることを示している。
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上述のように、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、又は配列番号15のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスEC2.8.2.8のメンバーであるヒトグルコサミニルN-デアセチラーゼ/N-スルホトランスフェラーゼ酵素(上記の図6A、図6B、及び図6Cのエントリsp|P52848|NDST_1_HUMANを参照)のN-スルホトランスフェラーゼドメインの変異体とするように操作する。EC2.8.2.8内の他のグルコサミニルN-デアセチラーゼ/N-スルホトランスフェラーゼ酵素の1つ以上のN-スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び/又は配列番号15のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を有する、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型EC2.8.2.8酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ヒトグルコサミニルN-デアセチラーゼ/N-スルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型2.8.2.8酵素のN-スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列を選択すると、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び/又は配列番号15のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、又は配列番号25のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例1の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、又は配列番号25のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、コドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例3の手順を用いて、それぞれ配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、又は配列番号25の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。SAX試験により、N-脱アセチル化ヘパロサン及びアリール硫酸化合物を、それぞれ配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、又は配列番号25の配列を有する改変型酵素の各々と反応させた結果形成される、N-硫酸化多糖生成物の存在が確認されると予想される。
さらなる硫酸アリール依存性ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号63及び配列番号65のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素クラスEC2.8.2.-のメンバーであるニワトリHSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素(上記の図17A、図17B、図17C、及び図17Dのエントリsp|Q76KB1|HS2ST_CHICKを参照)の変異体となるように操作されている。EC2.8.2.-内の1つ以上の他のHSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号63及び/又は配列番号65のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を有する、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ニワトリHSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型HSヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号63及び/又は配列番号65のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができる追加の変異体を形成することができる。
配列番号68又は配列番号69のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例1の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号68又は配列番号69のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、コドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号68又は配列番号69のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例4の手順を用いて、それぞれ配列番号68又は配列番号69の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。MS試験により、それぞれ配列番号68及び配列番号69の配列を有する各改変型酵素と、N-硫酸化ヘパロサン系多糖及びアリール硫酸化合物とを反応させた結果形成された、N,2O-HS生成物の存在が確認されると予想される。両方の酵素が、式IV又は式Vのいずれか又は両方をするヘパロサン系多糖類で活性であることも予想される。
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号104、配列番号106、又は配列番号108のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスEC2.8.2.-のメンバーであるマウスHSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素(上記の図21A、図21B、及び図21CのエントリQ9QYK5|H6ST1_MOUSEを参照)のアイソフォーム1の変異体とするように操作する。EC2.8.2.-内の1つ以上の他のHSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号104、配列番号106、及び/又は配列番号108のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性HSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の両方を含む、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型HSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型HSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。マウスHSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型HSグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号104、配列番号106、及び/又は配列番号108のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、又は配列番号122のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例1の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、又は配列番号122のアミノ酸配列を有する酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を、それぞれ、所望の発現宿主に基づいて決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例5の手順を用いて、それぞれ配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、又は配列番号122を含む変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。MS試験により、N,2O-HS多糖類及びアリール硫酸化合物を、それぞれ配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122の配列を有する改変型酵素のそれぞれと反応させた結果形成される、N,2O,6O-HS生成物の存在が確認されると予想される。
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号147、配列番号149又は配列番号151のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスEC2.8.2.23のメンバーであるヒトHSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素(上記の図26A、図26B、及び図26Cのエントリsp|O14792|HS3S1_HUMANを参照)のアイソフォーム1の変異体とするように操作する。EC2.8.2.23内の1つ以上の他のHSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号147、配列番号149及び/又は配列番号151のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性HSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の両方を含む、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型HSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型HSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ヒトHSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型HSグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号147、配列番号149、及び/又は配列番号151のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、又は配列番号160のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例1の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159又は配列番号160のアミノ酸配列を有する酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159及び配列番号160のアミノ酸配列のそれぞれをコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例6及び/又は実施例7の手順を用いて、それぞれ配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、又は配列番号160の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。MS及び/又はNMR試験は、それぞれ配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、及び配列番号160の配列を有する改変型酵素の各々とN,2O,6O-HS多糖類及びアリール硫酸化合物を反応させた結果形成される、N,2O,3O,6O-HS生成物の存在を確認すると予想される。
Claims (49)
- スルホ基供与体、あらゆるアリール硫酸化合物からなる該スルホ基供与体からヘパロサン系多糖へとスルホ基を触媒的に転移させる生物活性を有する、改変型生物活性スルホトランスフェラーゼ酵素であって、
前記アリール硫酸化合物は、p-ニトロフェニル硫酸、4-メチルウンベリフェリル硫酸、7-ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、4-アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、1-ナフチル硫酸、2-ナフチル硫酸、及び4-ニトロカテコール硫酸からなる群から好ましくは選択され、より好ましくはp-ニトロフェニル硫酸又は4-ニトロカテコール硫酸であり、
前記スルホトランスフェラーゼ酵素の前記生物活性は、グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ活性、ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ活性、グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ活性、及びグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される、改変型生物活性スルホトランスフェラーゼ酵素。 - 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、酵素クラス(EC)2.8.2.8内のいずれかの前記天然グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項2に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項3に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項3に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.-内のいずれかの前記天然ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項6に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号63及び配列番号65からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項7に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号68及び配列番号69からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項7に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.-内のいずれかの前記天然グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項10に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号104、配列番号106、及び配列番号108からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項11に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項11に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.23内のいずれかの前記天然グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項14に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号147、配列番号149、及び配列番号151からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項15に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、及び配列番号160からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項15に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記アリール硫酸化合物がp-ニトロフェニル硫酸である請求項1~17のいずれか一項に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 前記アリール硫酸化合物が4-ニトロカテコール硫酸である請求項1~18のいずれか一項に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
- 請求項1~19に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子。
- 前記単離された核酸分子が、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号62、配列番号64、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号148、配列番号150、及び配列番号152からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項20に記載の単離された核酸分子。
- 請求項20に記載の単離された核酸分子のいずれかを有するベクター。
- 前記ベクターが、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号62、配列番号64、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号148、配列番号150、及び配列番号152からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項22に記載のベクター。
- 前記ベクターが、大腸菌由来の前記malE遺伝子をさらに有する請求項22又は請求項23のいずれかに記載のベクター。
- 前記ベクターが、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)タンパク質をコードする遺伝子、好ましくはSUMO1遺伝子をさらに有する請求項22又は請求項23のいずれかに記載のベクター。
- 請求項22~25のいずれか一項に記載のベクターを有する単離された宿主細胞。
- 前記単離された宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択され、好ましくは大腸菌宿主細胞である請求項26に記載の単離された宿主細胞。
- スルホ基をヘパロサン系多糖へと酵素的に転移させて硫酸化多糖生成物を形成する方法であって、
p-ニトロフェニル硫酸、4-メチルウンベリフェリル硫酸、7-ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、4-アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、1-ナフチル硫酸、2-ナフチル硫酸、及び4-ニトロカテコール硫酸からなる群から選択されるアリール硫酸化合物を提供する工程;
請求項1~19に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを提供する工程;
ヘパロサン系多糖を提供する工程;
前記アリール硫酸化合物、前記スルホトランスフェラーゼ酵素、及び前記ヘパロサン系多糖を反応混合物へと組み合わせる工程;及び
前記スルホトランスフェラーゼ酵素を用いて前記アリール硫酸化合物から前記ヘパロサン系多糖へと前記スルホ基を転移させることによって、前記硫酸化多糖生成物を形成する工程;を有する、上記方法。 - 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式IIの構造を有する請求項28に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.8内のいずれかの前記天然グルコサミニルN-スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項29に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、及び配列番号15からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項30に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、及び配列番号25からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項30に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式IV及び/又は式Vの構造を有する請求項28に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.-内のいずれかの前記天然ヘキスロニル2-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項33に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号63及び配列番号65からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項34に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号68及び配列番号69からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項34に記載の方法。
- 前記方法が、グルクロニルC5-エピメラーゼ、好ましくは配列番号67のアミノ酸配列を有するグルクロニルC5-エピメラーゼ、より好ましくは配列番号67のアミノ酸残基34~617を有するグルクロニルC5-エピメラーゼを提供する工程をさらに有する請求項33~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式VIIIの構造を有する請求項28に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.-内のいずれかの前記天然グルコサミニル6-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項38に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号104、配列番号106、及び配列番号108からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項39に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、及び配列番号122からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項39に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式Xの構造を有する請求項28に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、EC2.8.2.23内のいずれかの前記天然グルコサミニル3-Oスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項42に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号147、配列番号149、及び配列番号151からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項43に記載の方法。
- 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、及び配列番号160からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項43に記載の方法。
- 前記硫酸化多糖生成物が抗凝固活性を有する請求項46に記載の方法。
- 前記アリール硫酸化合物がp-ニトロフェニル硫酸である請求項28~47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アリール硫酸化合物が4-ニトロカテコール硫酸である請求項28~47のいずれか一項に記載の方法。
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