JP2022523638A - 改変型硫酸アリール依存性酵素 - Google Patents

改変型硫酸アリール依存性酵素 Download PDF

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Abstract

本発明は、天然基質３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりのスルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類、特にヘパラン硫酸と反応するように操作したいくつかの非天然スルホトランスフェラーゼ酵素を提供する。改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のそれぞれは、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、又はグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する、スルホ基を受容するヘパロサン系多糖内の位置を特徴とする生物活性を有する。抗凝固活性を有する多糖類を有する、硫酸化ヘパロサン系多糖類を産生するように改変型スルホトランスフェラーゼを用いる方法もまた提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物である、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と反応するように操作された非天然スルホトランスフェラーゼ酵素に関する。
配列表の参照
本願は電子形式で配列表と共に出願されている。配列表は、２０１９年１２月３０日に作成された「ＯＰＴ－００１Ｘ ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供され、サイズは３９０，９２１バイトである。配列表の電子形式の情報はその全体が参照により組み込まれる。
スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体からスルホ基受容体へのスルホ基の転移を触媒する酵素の重要なクラスである。スルホトランスフェラーゼは、自然界ではほぼ遍在的であり、細菌、酵母、及びヒトを含む動物を含むほぼ全ての種類の生物に存在する。同様に、スルホトランスフェラーゼ酵素は、多くの種類のステロイド、多糖類、タンパク質、生体異物、及び他の分子を含む、広範囲のスルホ基受容体の硫酸化において不可欠な役割を果たす。
スルホ基受容体として利用することができる多糖類はいくつかあり、例えば、デルマタン、ケラタン、ヘパロサン、及びコンドロイチンが挙げられる。特に、ヘパロサンは、１→４グリコシド結合したグルクロン酸残基及びＮ－アセチル化グルコサミン（［β（１，４）ＧｌｃＡ－α（１，４）ＧｌｃＮＡｃ］ｎ）残基の反復二糖単位を有し、そのいずれもが、１つ以上の酵素触媒脱アセチル化、硫酸化、又はエピマー化反応によってさらに修飾することができる。ヘパロサン系多糖類の硫酸化は、最大４つのスルホトランスフェラーゼ酵素によって触媒することができ、１つ以上のグルコサミン残基の脱アセチル化及び１つ以上のグルクロン酸残基のエピマー化と共に特定の順序で行う場合、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸（heparan sulfate：ＨＳ）多糖類を形成するのに利用することができる。
しかしながら、一連のスルホ基受容体が広範囲かつ膨大であり得るので、スルホ基供与体としてスルホトランスフェラーゼ酵素によって利用することができる分子は２つしかない。４つのＨＳスルホトランスフェラーゼのそれぞれを含む、ほぼ遍在性のスルホ基供与体は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸である。これらのインビボ系は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸が短い半減期を有し、必要に応じて生物によって容易に合成及び代謝することができるので、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を排他的に利用するように進化した。しかしながら、同じ短い半減期により、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸は、スルホトランスフェラーゼの生物活性を能動的に阻害するアデノシン３’，５’－二リン酸へと容易に分解することができるので、スルホトランスフェラーゼを利用するほとんどのインビトロ合成、特に大規模合成には適さなくなる。結果として、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸をスルホ基供与体として排他的に利用するスルホトランスフェラーゼの天然の活性は、抗凝固性多糖類のインビトロ化学酵素合成に対する急峻な障壁を提示する。
ｐ－ニトロフェニル硫酸（ＰＮＳ）及び４－メチルウンベリフェリル硫酸（4-methylumbelliferyl sulfate：ＭＵＳ）などのアリール硫酸化合物は、ある特定の小分子生成物を合成するための非常に限られた数のスルホトランスフェラーゼを有するスルホ供与体として有用であり得る、安価で広く利用可能な化合物として同定されている（Malojcic, G., et al. (2008) Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (49): 19217-19222及びKaysser, L., et al., (2010) J. Biol. Chem. 285 (17): 12684-12694を参照のこと。この開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。しかし、少数の細菌性スルホトランスフェラーゼのみが、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と反応することが示されており、これらのいずれも、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類は言うまでもなく、多糖類と反応しない。結果として、スルホトランスフェラーゼを硫酸化多糖類のインビトロ合成に使用する場合、スルホ基転移を効果的に触媒するために３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を反応混合物に含めなければならず、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸でこの系を再配置するためにアリール硫酸化合物を間接的にのみ使用することができる（米国特許第6,255,088号明細書を参照のこと。この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
その結果、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物、及びスルホ基受容体としての多糖類と反応するスルホトランスフェラーゼ酵素を開発する必要がある。特に、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類の両方と反応することができるスルホトランスフェラーゼ酵素の開発は、インビトロでの抗凝固性多糖類の大規模合成の開発に向けて大きな前進をもたらすであろう。
本発明は、基質としてのアリール硫酸化合物を認識し、それに結合し、それと反応することができるいくつかの改変型生物活性酵素を提供する。本発明によれば、改変型酵素は、スルファターゼ活性を有することができる。本発明によれば、改変型酵素は、スルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。
本発明によれば、スルファターゼ及び／又はスルホトランスフェラーゼ活性を有する改変型酵素は、ｐ－ニトロフェニル硫酸（ＰＮＳ）、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２－ナフチル硫酸（２ＮａｐＳ）、及び４－ニトロカテコール硫酸（ＮＣＳ）からなる群から選択されるアリール硫酸化合物と反応することができる。本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのＰＮＳを認識し、結合し、反応することができる。本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのＮＣＳを認識し、結合し、反応することができる。本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのＰＮＳ又はＮＣＳのいずれかを認識し、結合し、反応することができる。
本発明のある面において、本発明の改変型酵素は、スルファターゼ生物活性を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性は、アリール硫酸化合物内の硫黄原子の求核攻撃を有し、硫酸基の加水分解を引き起こし、活性部位から芳香族部分を放出する。本発明によれば、硫黄原子の求核攻撃は、改変型酵素の活性部位内のアミノ酸残基、特にヒスチジン残基によって開始することができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物との反応は、硫酸基がアミノ酸求核剤、特にヒスチジン残基に共有結合しているスルホヒスチジン中間体をもたらすことができる。
本発明によれば、スルファターゼ活性を有する本発明の改変型酵素は、典型的には５００を超えるアミノ酸残基を有し、α－ホルミルグリシンになるように翻訳後修飾された少なくとも１つのシステイン又はセリン残基、及びα－ホルミルグリシンへのシステイン又はセリンの翻訳後修飾を指示するＣ／Ｓ－Ｘ－Ｐ－Ｓ／Ｘ－Ｒ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｌ／Ｘ－Ｔ／Ｘ－Ｇ／Ｘ－Ｒ／Ｘ又はＧ－Ｙ／Ｖ－Ｘ－Ｓ／Ｔ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｇ－Ｋ－Ｘ－Ｘ－Ｈという１つ以上の特徴的なシグネチャ配列を有する、他の公知のスルファターゼとは異なる。したがって、本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、５００個未満のアミノ酸残基を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、０個のα－ホルミルグリシン残基を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、Ｃ／Ｓ－Ｘ－Ｐ－Ｓ／Ｘ－Ｒ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｌ／Ｘ－Ｔ／Ｘ－Ｇ／Ｘ－Ｒ／Ｘ又はＧ－Ｙ／Ｖ－Ｘ－Ｓ／Ｔ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｇ－Ｋ－Ｘ－Ｘ－Ｈのいずれかを有するアミノ酸配列モチーフを有さなくともよい。
本発明によれば、活性部位アミノ酸残基、好ましくはヒスチジン残基によってアリール硫酸化合物の求核攻撃が開始される限り、スルファターゼ活性を有する本発明の改変型酵素は、任意のアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、上記のアミノ酸配列のいずれかの生物学的同等物である任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明の他の面において、本発明の改変型酵素は、スルホトランスフェラーゼ生物活性を有することができる。本発明によれば、スルホトランスフェラーゼ活性は、アリール硫酸化合物からスルホ基受容体へのスルホ基の酵素的転移を有する。本発明によれば、スルホ基受容体は多糖とすることができる。本発明によれば、スルホ基受容体多糖は、ヘパロサン系多糖とすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンとすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化ヘパロサンとすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化、２－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２Ｏ－ＨＳ）とすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化、２－Ｏ硫酸化、６－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ）とすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化、２－Ｏ硫酸化、３－Ｏ硫酸化、６－Ｏ硫酸化ヘパラン硫酸（Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ）とすることができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、ヘパロサン系多糖を構成する二糖単位のいずれかにおけるＮ－、２－Ｏ、３－Ｏ、及び／又は６－Ｏ位のいずれかで硫酸化することができる。本発明によれば、ヘパロサン系多糖は、グルクロン酸残基の代わりに置換された１つ以上のイズロン酸残基を有することができる。本発明によれば、イズロン酸残基の１つ以上は、２－Ｏ硫酸化することができる。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素によって触媒されるスルホ転移（sulfotransfer）反応は、酵素とアリール硫酸化合物との反応時にスルホヒスチジン中間体が最初に形成され、続いて活性部位内のヘパロサン系多糖の結合、及びその後のスルホヒスチジン中間体から多糖へのスルホ基の転移における反応機構を介して進行させることができる。あるいは、本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素によって触媒されるスルホ転移反応は、活性部位内でアリール硫酸化合物とヘパロサン系多糖の両方が結合し、酵素がアリール硫酸化合物から多糖へのスルホ基の直接転移を触媒する反応機構を介して進行させることができる。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、又はグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を含む、スルホ基を受容するヘパロサン系多糖内の位置を特徴とする生物活性を有することができる。各スルホトランスフェラーゼの生物活性は、以降、さらに詳術する。
本発明のある面において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖内の非置換グルコサミン残基のＮ位置へのスルホ基の転移を含む、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体がアリール硫酸化合物であり、スルホ基受容体がヘパロサン系多糖類である限り、任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素クラス（enzyme class：ＥＣ）２．８．２．８のメンバーであるＨＳグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有する天然スルホトランスフェラーゼの変異体とすることができる。本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素とは対照的に、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素は、アリール硫酸化合物と反応せず、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのみ反応する。しかしながら、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類により、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素と同じ生物活性を保持することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと共にスルホ受容体として利用することができるヘパロサン系多糖類は、下記式ＩＩ（式中、ｎは整数であり、Ｒは水素原子又はスルホ基からなる群から選択される。）の構造を有する１つ以上の二糖単位を有することができる。本発明によれば、二糖単位内の両方のＲ基は、水素原子とすることができる。
Figure 2022523638000001
本発明によれば、同じ多糖分子内のＲ基の全てが、水素原子とすることができる。スルホ受容体多糖が式ＩＩの構造を有するとき、アリール硫酸化合物からスルホ基が転移すると、硫酸化多糖生成物は、下記式ＩＩＩ（式中、ｎは整数であり、Ｒは水素原子又はスルホ基からなる群から選択される）の構造を有する。
Figure 2022523638000002
本発明によれば、スルホ基を受容するグルコサミン残基はＮ－非置換であるが、上記式ＩＩ及び式ＩＩＩで示すように、同じ多糖分子内の他のグルコサミン残基は、Ｎ－アセチル化、Ｎ－硫酸化、又はＮ－非置換、３－Ｏ硫酸化、及び／又は６－Ｏ硫酸化することができる。同様に、スルホ基を受容するグルコサミン残基に隣接していない多糖内の他の位置のヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸残基とすることができ、そのいずれも場合により２－Ｏ硫酸化することができる。本発明によれば、いくつかの好ましい態様において、ヘパロサン系多糖は、グルコサミン残基の全てがＮ－非置換であるか、又はＮ－アセチルグルコサミンとＮ－非置換グルコサミンとの混合物として存在する、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンとすることができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合及び反応することができる単一のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインからなることができる。しかしながら、ＥＣ２．８．２．８内のほとんどの天然酵素は二重のＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ活性を有し、ここで、１つのドメインはＮ－デアセチラーゼ活性のために構造的に構成され、別のドメインはＮ－スルホトランスフェラーゼ活性のために構造的に構成される。したがって、本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素はまた、ＥＣ２．８．２．８酵素のいずれかのＮ－デアセチラーゼドメインと同一又は変異したアミノ酸配列のいずれかを有する、Ｎ－デアセチラーゼドメインも有することができる。
スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのその排他的反応性を促進するために、天然ＥＣ２．８．２．８酵素は、典型的には、活性部位を定義し、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸との酵素の認識、結合、及び反応性を支配する高度に保存された又は同一のアミノ酸配列を有する。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物の結合を促進するために、天然ＥＣ２．８．２．８酵素と比較して１つ以上の変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有することができ、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、最大で少なくとも１００個のアミノ酸変異を含む。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位を定義することが知られている領域に、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のいずれかのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができ、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸変異、最大で少なくとも２０個のアミノ酸変異を含む。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、ＥＣ２．８．２．８内の１つ以上の天然酵素のアミノ酸配列と比較しての、特にＥＣ２．８．２．８内の１つ以上の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと比較しての「パーセント同一性」又は「％同一性」として表すことができ、その生物学的な機能的フラグメントを含む。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．８内の酵素のいずれかのＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと少なくとも５０％の配列同一性、及び最大で少なくとも９７％の配列同一性を有することができる。本発明によれば、そのような改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素はまた、ＥＣ２．８．２．８内の酵素のいずれかと同一であるか、又はそれと比較して１つ以上のアミノ酸変異を含むかのいずれかである、Ｎ－デアセチラーゼドメインを有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．８内の１つ以上の天然酵素に見られる保存されたアミノ酸配列モチーフと比較して、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。各変異アミノ酸配列モチーフは、存在する場合、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、次の保存されたグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼアミノ酸配列モチーフ：（Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａ－Ｌ－Ｙ－Ｌ）、（Ｔ－Ｆ－Ｅ－Ｅ）、（Ｆ－Ｅ－Ｋ－Ｓ－Ａ）、（Ｓ－Ｗ－Ｙ－Ｑ－Ｈ、及び（Ｃ－Ｌ－Ｇ－Ｋ／Ｒ－Ｓ－Ｋ－Ｇ－Ｒ）と比較して、１、２、３、４、又は５つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。変異アミノ酸配列モチーフの非限定的な例は以降、さらに詳述する。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、これら各々は、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインを定義する高度に保存されたアミノ酸配列と比較して作製されたいくつかのアミノ酸変異を含む。本発明によれば、本明細書に記載する方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素はまた、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列の、生物学的同等物及び／又は機能的フラグメントである任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、上記の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれも、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列によって開示するアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数の残基差異又は変異を有することができる。そのような残基差異の非限定的な例として、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそのような変化の任意の組合せが挙げられる。本発明によれば、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列における開示したアミノ酸配列との差異は、非保存的置換、保存的置換、並びに保存的及び非保存的アミノ酸置換の組合せを有することができる。本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と、スルホ基受容体として式ＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖との、そのグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５内の任意の位置に生じさせることができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１８のアミノ酸配列を有することができる。配列番号１８内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号５、配列番号７、及び配列番号１５のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。したがって、名称「Ｘａａ」とは、その位置のアミノ酸が、配列番号１８によって定義されるように、２つ以上のアミノ酸の群から選択できることを示す。
本発明によれば、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１９のアミノ酸配列を有することができる。配列番号１９内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。したがって、名称「Ｘａａ」とは、その位置のアミノ酸が、配列番号１９によって定義されるように、２つ以上のアミノ酸の群から選択できることを示す。
また、本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物とのそのグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５内の１つ以上の位置に生じさせることができる。本発明によれば、配列番号１８又は配列番号１９のアミノ酸配列からなる硫酸アリール依存性酵素は、スルホ基供与体であるアリール硫酸化合物とのグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を保持したまま、「Ｘａａ」とは表記しない位置に１つ以上のアミノ酸変異を任意に有してもよい。
本発明のある面において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、ヘパロサン系多糖内のアリール硫酸化合物からヘキスロン酸残基の２－Ｏ位へのスルホ基の転移を有する、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体がアリール硫酸化合物であり、スルホ基受容体がヘパロサン系多糖である限り、任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素クラス（ＥＣ）２．８．２．－のメンバーであるＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する天然スルホトランスフェラーゼの変異体とすることができる。本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とは対照的に、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物と反応せず、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのみ反応する。しかしながら、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類により、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と同じ生物活性を保持することができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと共にスルホ受容体として利用することができるヘパロサン系多糖類は、下記式ＩＶの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有することができる。
Figure 2022523638000003
式ＩＶに示すように、ヘキスロン酸残基はグルクロン酸である。本発明によれば、また、他の非限定的な例において、ヘキスロン酸残基がイズロン酸であるとき、ヘパロサン系多糖は、下記式Ｖの構造を有する。
Figure 2022523638000004
本発明によれば、ヘパロサン系多糖が式ＩＶの構造を有するとき、２－Ｏ硫酸化多糖生成物は下記式ＶＩの構造を有する。
Figure 2022523638000005
本発明によれば、ヘパロサン系多糖が式Ｖの構造を有するとき、２－Ｏ硫酸化多糖生成物は下記式ＶＩＩの構造を有する。
Figure 2022523638000006
本発明によれば、式ＩＶ又は式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化ヘパロサンとすることができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のスルホ基受容体は、式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有する複数のモチーフを有することができ、そのいずれか又は全てが、酵素によって硫酸化することができる。本発明によれば、上記式ＩＶ及び式Ｖに示すように、スルホ基を受容するヘキスロン酸残基に隣接するグルコサミン残基はどちらも、Ｎ－硫酸化されている。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、上記の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の硫酸化多糖生成物とすることができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって形成され、式ＶＩ及び／又は式ＶＩＩの構造を有する硫酸化多糖生成物は、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物である。
本発明によれば、スルホ基を受容するヘキスロン酸残基に隣接していない多糖内のグルコサミン残基は、場合により、Ｎ－、３－Ｏ、及び／又は６－Ｏ硫酸化、Ｎ－アセチル化、又はＮ－非置換とすることができる。同様に、スルホ基を受容するグルコサミン残基に隣接していない多糖内の他の位置のヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸残基とすることができ、そのいずれも場合により２－Ｏ硫酸化することができる。
本発明によれば、式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有する多糖類をグルクロニルＣ５－エピメラーゼ酵素と反応させて、Ｃ５－炭素の立体化学を可逆的に反転させ、グルクロン酸からイズロン酸を形成することができ、逆もまた同様とすることができる。しかしながら、一旦ヘキスロン酸残基が２－Ｏ硫酸化されると、これはもはやグルクロニルＣ５－エピメラーゼと反応することができない。ある好ましい態様において、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ酵素を使用して、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させる前に、式ＩＩＩの構造を有するＮ－硫酸化ヘパロサン多糖類内のヘキスロン酸残基の立体化学を反転させ、式Ｖの構造を有する構造モチーフを形成することができる。本発明によれば、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ酵素は、配列番号６７のアミノ酸配列、好ましくは配列番号６７の残基３４～６１７を有することができる。本発明によれば、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ酵素を使用して、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させる前に、Ｎ－硫酸化ヘパロサン内の１つ以上のグルクロン酸残基のイズロン酸残基への変換を触媒することができる。
スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのその排他的反応性を促進するために、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、典型的には、活性部位を定義し、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸との酵素の認識、結合、及び反応性を支配する高度に保存された又は同一のアミノ酸配列を有する。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物の結合を促進するために、ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と比較して１つ以上の変異を有することができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、最大で少なくとも１００個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位を定義することが知られている領域に、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのアミノ酸配列と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸変異、最大で少なくとも２０個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。
本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、その生物学的な機能的フラグメントを含む、ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較しての「パーセント同一性」又は「％同一性」として表すことができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと、少なくとも５０％の配列同一性、及び最大で少なくとも９７％の配列同一性を有することができる。
本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存されたアミノ酸配列モチーフと比較して、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。各変異アミノ酸配列モチーフは、存在する場合、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、次の保存されたヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列モチーフ：（Ｒ－Ｖ－Ｐ－Ｋ－Ｔ－Ａ／Ｇ－Ｓ－Ｔ）、（Ｎ－Ｔ－Ｓ／Ｔ－Ｋ－Ｎ）、（Ｙ－Ｈ－Ｇ－Ｈ）、（Ｆ－Ｌ－Ｒ－Ｆ／Ｈ－Ｇ－Ｄ－Ｄ／Ｎ－Ｆ／Ｙ）、（Ｒ－Ｒ－Ｋ／Ｒ－Ｑ－Ｇ）、及び（Ｓ－Ｈ－Ｌ－Ｒ－Ｋ／Ｒ－Ｔ）と比較して、１、２、３、４、５、又は６個の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。変異アミノ酸配列モチーフの非限定的な例は以降、さらに詳述する。
本発明によれば、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、これら各々は、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を定義する高度に保存されたアミノ酸配列と比較して作製されたいくつかのアミノ酸変異を含む。本発明によれば、本明細書に記載する方法のいずれかに従って利用される改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素はまた、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列の、生物学的同等物及び／又は機能的フラグメントである任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、上記の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれも、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列によって開示するアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数の残基差異又は変異を有することができる。そのような残基差異の非限定的な例として、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそのような変化の任意の組合せが挙げられる。本発明によれば、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列における開示したアミノ酸配列との差異は、非保存的置換、保存的置換、並びに保存的及び非保存的アミノ酸置換の組合せを有することができる。本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物、及びスルホ基受容体としての式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖にともに、そのヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、又は配列番号６９内の任意の位置に生じさせることができる。
本発明のある面において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、ヘパロサン系多糖内のアリール硫酸化合物からグルコサミン残基の６－Ｏ位へのスルホ基の転移を含む、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体がアリール硫酸化合物であり、スルホ基受容体がヘパロサン系多糖である限り、任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－のメンバーであるグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する天然スルホトランスフェラーゼの変異体とすることができる。本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とは対照的に、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物と反応せず、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのみ反応する。しかしながら、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類により、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と同じ生物活性を保持することができる。
本発明によれば、６－Ｏ位でスルホ基を受容するグルコサミン残基は、酵素と反応する前に、Ｎ－硫酸化、Ｎ－非置換、及び／又は３－Ｏ硫酸化することができる。本発明によれば、スルホ受容体多糖内の任意の他のグルコサミン残基は、場合により、Ｎ－、３－Ｏ、及び／又は６－Ｏ硫酸化、Ｎ－アセチル化、又はＮ－非置換とすることができる。本発明によれば、スルホ基を受容するグルコサミン残基に隣接するヘキスロン酸残基を含む、ヘパロサン系多糖内のヘキスロン酸残基のいずれかは、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させる前に、場合によりイズロン酸又はグルクロン酸であってもよく、場合により２－Ｏ硫酸化されていてもよい。
改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと共にスルホ受容体として利用することができるヘパロサン系多糖の１つの非限定的な例は、下記式ＶＩＩＩ（式中、Ｘは、式ＶＩＩＩに示すヘキスロン酸残基のいずれかを有する）の構造を有する１つ以上の構造モチーフを有するヘパロサン系多糖である。
Figure 2022523638000007
スルホ受容体多糖が式ＶＩＩＩの構造を有するとき、アリール硫酸化合物からスルホ基が転移すると、硫酸化多糖生成物は下記式ＩＸ（式中、Ｘは式ＩＸに示すヘキスロン酸残基のいずれかを有する）の構造を有する。
Figure 2022523638000008
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、式ＶＩＩＩの構造を有する複数の構造モチーフを有することができ、そのいずれか又は全ては、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって硫酸化することができる。本発明によれば、スルホ基受容体は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンとすることができる。本発明によれば、スルホ基受容体は、Ｎ－硫酸化ヘパロサンとすることができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼのスルホ基受容体は、Ｎ，２Ｏ－ＨＳとすることができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、上記の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素によって形成された硫酸化多糖生成物とすることができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、上記のような、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって形成された硫酸化多糖生成物とすることができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の硫酸化多糖生成物は、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物である。
スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのその排他的反応性を促進するために、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、典型的には、活性部位を定義し、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸との酵素の認識、結合、及び反応性を支配する高度に保存された又は同一のアミノ酸配列を有する。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物の結合を促進するために、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と比較して１つ以上の変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、最大で少なくとも１００個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位を定義することが知られている領域に、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのアミノ酸配列と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸変異、最大で少なくとも２０個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して、特にＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての「パーセント同一性」又は「％同一性」として表すことができ、その生物学的な機能的フラグメントを含む。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと、少なくとも５０％の配列同一性、及び最大で少なくとも９７％の配列同一性を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存されたアミノ酸配列モチーフと比較して、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。各変異アミノ酸配列モチーフは、存在する場合、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、次の保存されたグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列モチーフ：（Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｔ）、（Ｃ－Ｇ－Ｌ－Ｈ－Ａ－Ｄ）、（Ｌ－Ｒ－Ｄ－Ｖ－Ｐ－Ｓ）、（Ｓ－Ｅ－Ｗ－Ｒ／Ｋ－Ｈ－Ｖ－Ｑ－Ｒ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｗ－Ｋ）、又は（Ｌ－Ｔ－Ｅ－Ｆ／Ｙ－Ｑ）と比較して、１、２、３、４、又は５つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。変異アミノ酸配列モチーフの非限定的な例は以下にさらに詳述する。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、これら各々は、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の高度に保存されたアミノ酸配列と比較して作製されたいくつかのアミノ酸変異を含む。本発明によれば、本明細書に記載する方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素はまた、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列の、生物学的同等物及び／又は機能的フラグメントである任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、上記の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれも、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列によって開示するアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数の残基差異又は変異を有することができる。そのような残基差異の非限定的な例として、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそのような変化の任意の組合せが挙げられる。本発明によれば、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列における開示したアミノ酸配列との差異は、非保存的置換、保存的置換、並びに保存的及び非保存的アミノ酸置換の組合せを有することができる。本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と、スルホ基受容体としての上記のヘパロサン系多糖類のいずれかとの、そのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２内の任意の位置に生じさせることができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１１２のアミノ酸配列を有することができる。配列番号１１２内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。したがって、名称「Ｘａａ」とは、その位置のアミノ酸が、配列番号１１２によって定義されるように、２つ以上のアミノ酸の群から選択できることを示す。
本発明によれば、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１１３のアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、配列番号１１３内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。本発明によれば、配列番号１１３はまた、ＥＣ２．８．２．－内のいくつかの全長グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のＮ末端残基１～６６及びＣ末端残基３７８～４１１も含み、ここで、非限定的な例として、マウス、ヒト、及びブタのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を含む。したがって、名称「Ｘａａ」とは、その位置のアミノ酸が、配列番号１１３によって定義されるように、２つ以上のアミノ酸の群から選択できることを示す。
加えて、本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物とのそのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２内の１つ以上の位置に生じさせることができる。本発明によれば、配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列からなる硫酸アリール依存性酵素は、スルホ基供与体であるアリール硫酸化合物とのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持したまま、「Ｘａａ」とは表記しない位置に１つ以上のアミノ酸変異を任意に含んでいてもよい。
本発明のある面において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、ヘパロサン系多糖内のアリール硫酸化合物からグルコサミン残基の３－Ｏ位へのスルホ基の転移を有する、グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体がアリール硫酸化合物であり、スルホ基受容体がヘパロサン系多糖である限り、任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．２３のメンバーであるＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する天然スルホトランスフェラーゼの変異体とすることができる。本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とは対照的に、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物と反応せず、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのみ反応する。しかしながら、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類により、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と同じ生物活性を保持することができる。
本発明によれば、３－Ｏ位にスルホ基を受容することができるヘパロサン系多糖内のグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化されており、場合により６－Ｏスルホ基も有することができる。本発明によれば、スルホ受容体多糖内の任意の他のグルコサミン残基は、場合により、Ｎ－、３－Ｏ、及び／又は６－Ｏ硫酸化、Ｎ－アセチル化、又はＮ－非置換とすることができる。本発明によれば、３－Ｏ硫酸化されたグルコサミン残基を含む、ヘパロサン系多糖内のグルコサミン残基の１つ以上は、Ｎ－硫酸化及び６－Ｏ硫酸化の双方とすることができる。本発明によれば、３－Ｏ硫酸化されているグルコサミン残基は、非還元末端の非硫酸化グルクロン酸残基及び還元末端のイズロン酸残基に隣接させることができる。本発明によれば、３－Ｏ硫酸化されているグルコサミン残基の還元末端のイズロン酸残基は、場合により２－Ｏ硫酸化されていてもよい。本発明によれば、グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼに対するスルホ基受容体として作用するヘパロサン系多糖内の他のヘキスロン酸残基のいずれもが、場合によりイズロン酸又はグルクロン酸であってもよく、そして場合により２－Ｏ硫酸化されていてもよい。改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと共にスルホ受容体として利用することができるヘパロサン系多糖の１つの非限定的な例は、下記式Ｘ（式中、Ｘはスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙはスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである。）の構造を有する１つ以上の構造モチーフを有するヘパロサン系多糖である。
Figure 2022523638000009
本発明によれば、いくつかの好ましい態様において、Ｘはスルホ基であってもよく、Ｙはスルホ基であってもよい。ヘパロサン系多糖が式Ｘの構造を有するとき、３－Ｏ硫酸化多糖生成物は、下記式Ｉ（式中、Ｘはスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙはスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである）の構造を有する。
Figure 2022523638000010
本発明によれば、いくつかの好ましい態様において、Ｘはスルホ基であってもよく、Ｙはスルホ基であってもよい。本発明によれば、式Ｉの構造を有し、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応すると形成されるＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、抗凝固活性を有することができる。Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の抗凝固活性は、以降、さらに詳述する。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、式Ｘの構造を有する複数の構造モチーフを有することができ、そのいずれか又は全ては、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって硫酸化することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼのスルホ基受容体は、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳとすることができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に対するスルホ基受容体は、上記の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって形成された硫酸化多糖生成物とすることができる。
スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのその排他的反応性を促進するために、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、典型的には、活性部位を定義し、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸との酵素の認識、結合、及び反応性を支配する高度に保存された又は同一のアミノ酸配列を有する。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物の結合を促進するために、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と比較して１つ以上の変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、最大で少なくとも１００個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素の活性部位を定義することが知られている領域に、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのアミノ酸配列と比較して、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸変異、最大で少なくとも２０個のアミノ酸変異を含む、少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列は、ＥＣ２．８．２．２３内の１つ以上の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して、特にＥＣ２．８．２．２３内の１つ以上の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての「パーセント同一性」又は「％同一性」として表すことができ、その生物学的な機能的フラグメントを含む。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと、少なくとも５０％の配列同一性、及び最大で少なくとも９７％の配列同一性を有することができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．２３内の１つ以上の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存されたアミノ酸配列モチーフと比較して、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。各変異アミノ酸配列モチーフは、存在する場合、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有することができる。本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、次の保存されたグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列モチーフ：（Ｇ－Ｖ－Ｒ－Ｋ－Ｇ－Ｇ）、（Ｐ－Ａ／Ｇ－Ｙ－Ｆ）、（Ｓ－Ｄ－Ｙ－Ｔ－Ｑ－Ｖ）、又は（Ｙ－Ｋ－Ａ）と比較して、１、２、３、又は４つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。変異アミノ酸配列モチーフの非限定的な例は以下でさらに詳述する。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができ、各々、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の高度に保存されたアミノ酸配列と比較して作製されたいくつかのアミノ酸変異を含む。本発明によれば、本明細書に記載する方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素はまた、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列の、生物学的同等物及び／又は機能的フラグメントである任意のアミノ酸配列を有することができる。
本発明によれば、上記の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれも、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列によって開示するアミノ酸配列と比較して、１つ又は複数の残基差異又は変異を有することができる。そのような残基差異の非限定的な例として、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそのような変化の任意の組合せが挙げられる。本発明によれば、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列における開示したアミノ酸配列との差異は、非保存的置換、保存的置換、並びに保存的及び非保存的アミノ酸置換の組合せを有することができる。本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と、スルホ基受容体としての上記のヘパロサン系多糖類のいずれかとの、そのグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０内の任意の位置に生じさせることができる。
本発明によれば、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１５４のアミノ酸配列を有することができる。配列番号１５４内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。したがって、名称「Ｘａａ」とは、その位置のアミノ酸が、配列番号１１２によって定義されるように、２つ以上のアミノ酸の群から選択できることを示す。
加えて、本発明によれば、変異酵素が、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物とのそのグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持する限り、アミノ酸変異は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０内の１つ以上の位置に生じさせることができる。本発明によれば、配列番号１５４のアミノ酸配列からなる硫酸アリール依存性酵素は、スルホ基供与体であるアリール硫酸化合物とのグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を保持したまま、「Ｘａａ」とは表記しない位置に１つ以上のアミノ酸変異を任意に有してもよい。
他の面において、本発明は、アリール硫酸化合物から多糖にスルホ基を酵素的に転移させて、硫酸化多糖生成物を形成する方法を提供する。本発明によれば、多糖は、ヘパロサン系多糖とすることができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へとスルホ基を酵素的に転移させる方法は、（ａ）アリール硫酸化合物を提供する工程；（ｂ）上記の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを提供する工程であって、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がスルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物による生物活性を有する工程；（ｃ）ヘパロサン系多糖を提供する工程；（ｄ）アリール硫酸化合物、スルホトランスフェラーゼ酵素、及びヘパロサン系多糖を反応混合物へと組合せる工程；（ｅ）スルホトランスフェラーゼ酵素を用いてアリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へとスルホ基を転移させることによって、硫酸化多糖生成物を形成する工程；を有することができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなるものから選択することができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物はＰＮＳとすることができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物はＮＣＳとすることができる。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、上記の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれか、好ましくは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素とすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンとすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、式ＩＩの構造を有する１つ以上の二糖単位を有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、硫酸化多糖生成物は、式ＩＩＩの構造を有する。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、上記の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれか、好ましくは配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ－硫酸化ヘパロサンとすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有する１つ以上の構造モチーフ、好ましくは式Ｖの構造を有する少なくとも１つの構造モチーフを有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、該方法は、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ、好ましくは配列番号６７のアミノ酸配列を有するグルクロニルＣ５－エピメラーゼ、より好ましくは配列番号６７の残基３４～６１７を提供する工程をさらに有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、硫酸化多糖生成物は、式ＶＩ及び／又は式ＶＩＩの構造を有する。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、上記の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれか、好ましくは配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に適したスルホ受容体である上記のヘパロサン系多糖類のいずれかとすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ，２Ｏ－ＨＳとすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、式ＶＩＩＩの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、硫酸化多糖生成物は式ＩＸの構造を有する。
本発明によれば、改変型スルホトランスフェラーゼは、上記の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれか、好ましくは配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素とすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳとすることができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、ヘパロサン系多糖は、式Ｘの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、硫酸化多糖生成物は式Ｉの構造を有する。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、式Ｉの構造を有する硫酸化多糖生成物は、抗凝固活性を有することができる。
本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、出発物質として使用されるヘパロサン系多糖又は硫酸化多糖生成物を有する任意の反応混合物又は組成物内において、多糖類は、可変鎖長、分子量、Ｎ－アセチル化、及び／又はＮ－、２－Ｏ、６－Ｏ、若しくは３－Ｏ硫酸化を有する多糖類の多分散混合物として存在することができる。あるいは、本発明によれば、上記の多糖類のいずれも、同一の鎖長、分子量、Ｎ－アセチル化、及び／又はＮ－、２－Ｏ、６－Ｏ、若しくは３－Ｏ硫酸化を有する多糖類で構成される均質な組成物として存在することができる。
本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、基質としてアリール硫酸化合物を有するスルファターゼ及び／又はスルホトランスフェラーゼ活性を有する本発明の改変型酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を有する、核酸から発現させることができる。本発明によれば、そのようなヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、及び配列番号１５２からなる群から選択することができ、これはそれぞれ、アミノ酸配列である、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１をコードする。当業者は、上記のヌクレオチド配列及び所望の改変型酵素の同一性に基づいて、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号６６、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、適切なヌクレオチド配列を決定することができる。
本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、上記の改変型酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する核酸は、発現ベクターを保持し、所望の酵素を過剰発現するように構成された生物学的宿主細胞へと挿入されるように操作された、発現ベクターに挿入することができる。本発明によれば、発現ベクターに挿入される核酸は、上記の改変型酵素のいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を有することができ、特に配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有するものを有することができる。本発明によれば、発現ベクターに挿入される核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、及び配列番号１５２からなる群から選択される任意のヌクレオチド配列を有することができる。
本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、発現ベクターは、本発明の改変型酵素の産生を補うタンパク質又は宿主認識部位をコードする、１つ以上の核酸配列又は遺伝子を場合によりさらに有することができる。非限定的な例として、プロモータ配列、抗生物質耐性遺伝子、並びに改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のフォールディング及び安定性を補助する融合タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。本発明によれば、上記の発現ベクターのいずれも、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする、大腸菌由来のｍａｌＥ遺伝子をさらに有することができる。本発明によれば、上記の発現ベクターのいずれも、ＳＵＭＯ１タンパク質をコードする、低分子ユビキチン様修飾因子（small ubiquitin-related modifier：ＳＵＭＯ）タンパク質をコードする遺伝子、好ましくはＳＵＭＯ１遺伝子をさらに有することができる。結果として、本発明によれば、一旦タンパク質発現が開始されると、ＭＢＰ又はＳＵＭＯのいずれか、及び配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する改変型酵素を有する、融合タンパク質を形成することができる。
発現ベクターは、典型的には、酵素を過剰発現及び抽出することができる宿主細胞に形質転換される。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、宿主細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２に記載の核酸配列、又は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する酵素をコードする任意の配列を含む、発現ベクターで形質転換することができる。本発明によれば、宿主細胞に形質転換された上記の発現ベクターのいずれも、ｍａｌＥ又はＳＵＭＯ１遺伝子をさらに有することができる。本発明によれば、形質転換宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、又は哺乳動物細胞とすることができる。本発明によれば、宿主細胞は、細菌細胞とすることができる。本発明によれば、細菌細胞は、大腸菌（E.coli）の非病原性株に由来することができる。
本発明の他の面において、上記の方法のいずれかによる、硫酸化多糖生成物、特に抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成するためのキットが提供される。本発明によれば、キットは、少なくとも１つの改変型硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ及び少なくとも１つのアリール硫酸化合物、好ましくはＰＮＳ又はＮＣＳを有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、キットは、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ、及び／又は改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼを有することができ、これらはそれぞれ、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と反応して、多糖、好ましくはヘパロサン系多糖へのスルホ基の転移の触媒に依存する。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、キットは、スルホ基供与体として上記のヘパロサン系多糖類のいずれかをさらに有することができる。本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、キットは、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ、好ましくは配列番号６７のアミノ酸配列を有するエピメラーゼ、より好ましくは配列番号６７のアミノ酸残基３４～６１７を有するエピメラーゼをさらに有することができる。
本発明、上記の面及び態様のいずれか１つ以上と組み合わせると有用であるものによれば、上記の方法のいずれかに従って調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を含む硫酸化多糖生成物のいずれかは、薬学的に許容される塩、特に、限定されないが、ナトリウム塩、リチウム塩、又はカルシウム塩を含むアルカリ塩又はアルカリ土類塩として調製することができる。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであろう。
図１は、ＰＮＳが基質である場合の、本発明の改変型酵素の１つによって触媒されるスルファターゼ活性を示す。 図２は、硫酸エステル結合の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成の理論的反応機構を示す。 図３Ａ及び図３Ｂは、α－ホルミルグリシン残基を用いて触媒される天然スルファターゼ酵素について、提案された２つの反応機構を示す。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、天然のヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖の間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、天然のヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖の間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、天然のヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖の間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図５は、本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用することができる、ヘパロサン系多糖の非限定的な例を示す。 図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、全体的な配列同一性に関係なく存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、１５個の野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの多重配列アラインメントを示す。 図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、全体的な配列同一性に関係なく存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、１５個の野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの多重配列アラインメントを示す。 図６Ａ、図６Ｂ及び図６Ｃは、全体的な配列同一性に関係なく存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、１５個の野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの多重配列アラインメントを示す。 図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びＮ－脱アセチル化ヘパロサンの間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びＮ－脱アセチル化ヘパロサンの間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びＮ－脱アセチル化ヘパロサンの間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図８は、ＥＣ．２．８．２．８酵素クラス由来の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの結晶構造に重ね合わせた、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内に結合したＰＮＳの三次元モデルを示す。 図９は、活性部位内に存在するアミノ酸変異を示す、図８でモデル化された、改変型酵素の三次元モデルを示す。 図１０は、ＥＣ．２．８．２．８酵素クラス由来の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの結晶構造に重ね合わせた、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内に結合したＰＮＳの別の三次元モデルを示す。 図１１は、活性部位内に存在するアミノ酸変異を示す、図１０でモデル化された、改変型酵素の三次元モデルを示す。 図１２は、図示した各配列間のアミノ酸残基差異の位置及び同一性を示す、それぞれ、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドの配列アラインメントを示す。 図１３は、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用することができる、ヘパロサン系多糖の非限定的な例を示す。 図１４は、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用することができるヘパロサン系多糖の別の非限定的な例を示し、ここで、硫酸基は、ヘパロサン系多糖内のグルクロン酸残基の２－Ｏ位に転移される。 図１５は、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用することができるヘパロサン系多糖の別の非限定的な例を示し、ここで、硫酸基は、多糖内のイズロン酸残基の２－Ｏ位に転移される。 図１６は、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用することができるヘパロサン系多糖の別の非限定的な例を示し、ここで、硫酸基は、多糖内における、グルクロン酸残基の２－Ｏ位及びイズロン酸残基の２－Ｏ位の両方に転移される。 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ及び図１７Ｄは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１２個の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ及び図１７Ｄは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１２個の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ及び図１７Ｄは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１２個の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ及び図１７Ｄは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１２個の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１８Ｃは、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖内の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１８Ｃは、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖内の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図１８Ａ、図１８Ｂ及び図１８Ｃは、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖内の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図１９は、天然２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の結晶構造に重ね合わされた、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内のＮＣＳの結合を可能にする、変異アミノ酸配列モチーフの三次元モデルを示す。 図２０は、本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を有するスルホ基受容体として使用することができるヘパロサン系多糖の非限定的な例を示す。ここで、複数のグルコサミン残基の６－Ｏ位は、スルホ基を受容することができる。 図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１５個の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１５個の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．－内の１５個の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２２Ａ、図２２Ｂ及び図２２Ｃは、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖内の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図２２Ａ、図２２Ｂ及び図２２Ｃは、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖内の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図２２Ａ、図２２Ｂ及び図２２Ｃは、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖の保存された残基間の、スルホ転移反応の結果として形成される、提案された反応機構、遷移状態、及び生成物を示す。 図２３、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の結晶構造に重ね合わされた、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内のＰＮＳの結合を可能にする、変異アミノ酸配列モチーフの三次元モデルを示す。 図２４は、図示した各配列間のアミノ酸残基差異の位置及び同一性を示す、それぞれ、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの配列アラインメントを示す。 図２５は、本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と共にスルホ基受容体として使用して、式Ｉの構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成することができる、ヘパロサン系多糖の非限定的な例を示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ及び図２６Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．２３内の１５個の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ及び図２６Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．２３内の１５個の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ及び図２６Ｃは、全体的な配列同一性にかかわらず存在する保存されたアミノ酸配列モチーフを示す、ＥＣ２．８．２．２３内の１５個の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の多重配列アラインメントを示す。 図２７は、天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の結晶構造に重ね合わされた、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内のＰＮＳの結合を可能にする、変異アミノ酸配列モチーフの三次元モデルを示す。 図２８は、図示した各配列間のアミノ酸残基差異の位置及び同一性を示す、それぞれ、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの配列アラインメントを示す。 図２９は、業界標準と比較した、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素を用いて合成したＮ－硫酸化多糖生成物の一連のオーバーレイＳＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図３０Ａ及び図３０Ｂは、それぞれ配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を用いて合成した、２－Ｏ硫酸化多糖生成物のＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３０Ａ及び図３０Ｂは、それぞれ配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を用いて合成した、２－Ｏ硫酸化多糖生成物のＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３１Ａ、図３１Ｂ及び図３１Ｃは、それぞれ配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼを用いて合成した、６－Ｏ硫酸化多糖生成物のＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３１Ａ、図３１Ｂ及び図３１Ｃは、それぞれ配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼを用いて合成した、６－Ｏ硫酸化多糖生成物のＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３１Ａ、図３１Ｂ及び図３１Ｃは、それぞれ配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼを用いて合成した、６－Ｏ硫酸化多糖生成物のＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３２Ａ及び図３２Ｂは、一連の二糖及び多糖標準と比較した、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を用いて合成した硫酸化多糖生成物の一連の６つのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３２Ａ及び図３２Ｂは、一連の二糖及び多糖標準と比較した、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を用いて合成した硫酸化多糖生成物の一連の６つのＬＣＭＳクロマトグラムを示す。 図３３は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）試験のための、目的のプロトンの重水素標識のための反応スキームを示す。 図３４は、ＰＮＳ又はＮＣＳのいずれかと反応させた際の、本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって形成された硫酸化多糖生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図３５は、図３４の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの３．５ｐｐｍ～４．５ｐｐｍ領域の拡大図を示す。 図３６は、業界標準と比較した、化学的Ｎ－硫酸化多糖生成物のＳＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図３７は、業界標準と比較した、実施例８の化学的Ｎ－硫酸化多糖生成物をスルホ受容体多糖として用いて調製した酵素的２－Ｏ硫酸化多糖生成物のＳＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図３８は、業界標準と比較した、実施例８の化学的Ｎ－硫酸化多糖生成物をスルホ受容体多糖として用いて、反応混合物にＣ５－ヘキスロニルエピメラーゼを含めて調製した、酵素的２－Ｏ硫酸化多糖生成物のＳＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図３９は、業界標準と比較した、実施例９の２－Ｏ硫酸化多糖生成物をスルホ基受容体として用いて調製した酵素的６－Ｏ硫酸化多糖生成物のＳＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
定義
「活性部位」という用語は、触媒作用が起こる触媒タンパク質の部位を指し、１つ以上の基質結合部位を含むことができる。活性部位は、特定のポリペプチドと特異的に相互作用し、特定のポリペプチドの活性を調節する化合物の同定において、著しく有用である。天然リガンド又は基質と、それらの対応する受容体又は酵素の活性部位との会合は、作用の多くの生物学的機構の基礎である。同様に、多くの化合物は、受容体及び酵素の活性部位との会合によってそれらの生物学的効果を発揮する。このような会合は、活性部位の全部又は任意の部分で起こり得る。そのような会合の理解は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにアリール硫酸化合物に結合し、それと反応することができるスルホトランスフェラーゼ内の、改変型活性部位の設計を導くのに役立つ。
「アミノ酸」という用語は、中心炭素原子（アルファ炭素原子）が、水素原子、カルボン酸基（この炭素原子は、本明細書では「カルボキシル炭素原子」という）、アミノ基（この窒素原子は、本明細書では「アミノ窒素原子」という）、及び側鎖基Ｒに結合した構造を有する分子を指す。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に組み込まれる場合、アミノ酸は、１つのアミノ酸を互いに結合する脱水反応において、そのアミノ基及びカルボン酸基の１つ以上の原子を失う。その結果、タンパク質に組み込まれる場合、アミノ酸は「アミノ酸残基」と呼ばれる。天然に存在するタンパク質の場合、アミノ酸残基のＲ基は、タンパク質が合成される２０個のアミノ酸を区別するが、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基は、生物系におけるタンパク質への組込み後に誘導体化又は修飾され得る（例えば、グリコシル化によって及び／又は隣接していない２つのシステインアミノ酸残基のチオール側鎖の酸化によるシステインの形成によって、タンパク質のフォールディング立体配座の安定化などにおいて重要な役割を果たすことが多い、ジスルフィド共有結合をもたらす）。加えて、アルファ炭素原子が４つの異なる基を有する場合（炭素原子に結合した２個の水素原子を有するグリシンを除いて、タンパク質を合成するために生物系によって使用される２０個のアミノ酸の場合のように）、Ｄ及びＬと命名された各アミノ酸の２つの異なるエナンチオマ型が存在する。哺乳動物では、Ｌ－アミノ酸のみが天然に存在するポリペプチドに組み込まれる。本発明で利用される改変型酵素は、１つ以上のＤ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸を組み込むことができ、又はＤ－アミノ酸残基若しくはＬ－アミノ酸残基のみから構成することができる。
非天然アミノ酸はまた、本発明の改変型酵素のいずれか、特に硫酸アリール依存性活性を有する改変型スルホトランスフェラーゼ酵素に組み込むことができる。そのようなアミノ酸の非限定的な例として、αアミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ｌ－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、βアラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナアミノ酸（designer amino acid）（例えば、βメチルアミノ酸、αメチルアミノ酸、αメチルアミノ酸）、及び一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。
「及び／又は」という用語は、実体の列挙の文脈で使用される場合、実体が単独で又は組み合わせて存在することを指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個別に含むが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤのあらゆる全ての組合せ及び部分的な組合せをも含む。
「アリール硫酸」又は「アリール硫酸化合物」という用語は、芳香環に直接結合した水素原子の１つ以上が硫酸エステル官能基によって置き換えられている、芳香環に由来する任意の化合物、官能基、又は置換基を指す。典型的には、硫酸エステル官能基は、硫酸エステル結合を介してアリール硫酸化合物の芳香族部分に共有結合している。本発明の改変型酵素のいずれかとの基質として使用することができるアリール硫酸化合物の非限定的な例として、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳが挙げられるが、これらに限定されない。
「硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ」という用語は、スルホ供与体としてのアリール硫酸化合物との生物学的又は触媒活性を保有する、改変型スルホトランスフェラーゼの集合的な群を指す。スルホトランスフェラーゼの生物活性が依存し得るアリール硫酸化合物の非限定的な例として、ＰＮＳ及びＮＣＳが挙げられる。本明細書で記載するように、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物との生物活性を有する改変型スルホトランスフェラーゼは、スルホ基受容体としての多糖類、特にヘパロサン系多糖類との生物活性を保有することができる。「硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ」はまた、本明細書に開示する配列に由来する変異体を含む、任意の硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼをコードする核酸及びポリペプチドの両方を含む。
本発明の方法のいずれかに従って使用又は製造される多糖出発物質、中間体及び／又は生成物のいずれかに関して「平均分子量」という用語は、特に明示されない限り、「数平均分子量」、「質量平均分子量」、「重量平均分子量」、「Ｚ（遠心分離）平均モル質量」、又は「粘度平均モル質量」を含むがこれらに限定されない、様々な重合度、官能化度、及びモル質量を有するポリマーの混合物のモル質量分布又はモル質量平均を決定する、任意の許容される尺度を指すことができる。
「重量平均分子量」ＭＷという用語は、下記式を使用して、試料内の多糖類のモル分率分布を用いて計算された、混合物中の多糖類の平均分子量を報告する方法を指す。式中、Ｎｉは分子質量Ｍｉの多糖類の数である。
Figure 2022523638000011
「数平均分子量」Ｍｎという用語は、下記式を使用して、試料中の全ての多糖類の総重量を試料中の多糖類の数で割ることによって計算される、混合物中の多糖類の平均分子量を報告する方法を指す。ここで、Ｎｉは分子質量の多糖類の数Ｍｉである。
Figure 2022523638000012
したがって、重量平均分子量ＭＷは、必然的に、同じ混合物内の他の多糖類よりも大きい試料内の多糖類に対応するより高い値に向かって傾斜し、試料が単分散であり、ＭＷがＭｎに等しい場合を除いて、常に数平均分子量Ｍｎよりも大きい。試料内の多糖類の特定の試料が実重量の大きな分散を有する場合、ＭＷはＭｎよりもはるかに大きい。逆に、試料中の多糖類の重量分散が狭くなるにつれて、ＭＷはＭｎに近づく。
「相対分子量」又は「相対モル質量」（Ｍｒ）という用語は、混合物中の多糖類の平均分子量を無単位量として報告する別の方法を指し、最も広義には、分子の平均質量を１原子質量単位（ａｍｕ）又は１ダルトン（Ｄａ）などの原子質量定数で割ることによって決定される。多糖類に関して、Ｍｒは、試料中の多糖類の異なる鎖長、官能化、及び／又は重量分布を考慮せず、代わりに、小分子と同様に、試料中の多糖類の真の平均質量を単に表す。
「生物活性」又は「触媒活性」という用語は、１つ又は複数の特定の基質の特異的認識によって特定の化学反応を触媒して、１つ又は複数の特定の生成物を産生する、酵素の能力を指す。ある態様において、本発明の改変型酵素は、基質としてのアリール硫酸化合物、特にＰＮＳ又はＮＣＳとの結合及び反応に依存する、生物活性又は触媒活性を保有する。さらに、いくつかの改変型酵素は、ＭＵＳ、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、及び２ＮａｐＳを含むがこれらに限定されない、ＰＮＳに加えて１つ以上の代替のアリール硫酸化合物で、乱雑な触媒活性を有することができる。
「コード配列」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸、例えば遺伝子の部分を指す。
「コドン最適化された」という用語は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、特定の生物において優先的に使用されるものに対する、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの変化を指す。遺伝コードは、ほとんどのアミノ酸がいくつかのコドンによって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることは周知である。本発明のある態様において、改変型酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。
「に対応する」、「を参照する」、又は「と比較して」という用語は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される場合、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号又は残基位置は、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置によってではなく、参照配列に関して指定される。
「欠失」という用語は、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去によるポリペプチドの修飾を指す。欠失は１つ以上のアミノ酸の除去を有することができ、その最終結果は、参照ポリペプチドの触媒活性を保持している。欠失はポリペプチドの内部部分及び／又は末端部分が対象とすることができる。加えて、欠失は、連続的なセグメントを有することができるか、又は不連続とすることができる。
「二糖単位」という用語は、線状多糖類を含む多くの多糖類内の最小反復骨格単位を指し、最小反復単位は、２つの糖残基からなる。ヘパロサン系多糖に関して、二糖単位は、ヘキスロン酸残基及びグルコサミン残基からなり、これらはいずれも官能化することができ、ヘキスロン酸残基はグルクロン酸又はイズロン酸のいずれかとすることができる。ヘパロサン系多糖内の各二糖単位は、その骨格構造、並びに存在するスルホ基の数及び位置によって説明することができる。さらに、同じ多糖内及び／又は多糖類の同じ試料内の同じ構造を有する二糖単位の相対存在量を特徴付けて、本明細書に記載のスルホトランスフェラーゼのいずれかと反応した結果として特定の位置での硫酸化の量を決定することができる。
「フラグメント」又は「セグメント」という用語は、アミノ末端又はカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が参照配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。フラグメントは、少なくとも５０アミノ酸長以上とすることでき、酵素のアミノ酸配列の最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、及び９９％まで有する。
「機能部位」又は「機能ドメイン」という用語は、一般に、タンパク質に機能を付与するタンパク質中の任意の部位を指す。代表的な例として、活性部位（すなわち、触媒作用が起こる触媒タンパク質中の部位）及びリガンド結合部位が挙げられる。リガンド結合部位には、金属結合部位、補因子結合部位、抗原結合部位、基質チャネル及びトンネル、並びに基質結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。酵素において、基質結合ドメインであるリガンド結合部位もまた活性部位とすることができる。機能部位はまた、複数の機能部位の複合体であってもよく、ここで、複合体を含む１つ以上の部位が存在しないと、機能が失われる。非限定的な例として、特定のスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位は、スルホ供与体に対する１つの部位及びスルホ受容体に対する１つの部位を含む、複数の結合部位又はクレフトを有することができる。
「遺伝子」、「遺伝子配列」、及び「遺伝子セグメント」という用語は、機能性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする核酸単位の機能単位を指す。当業者によって理解されるように、この機能用語は、ゲノム配列及びｃＤＮＡ配列の両方を含む。「遺伝子」、「遺伝子配列」、及び「遺伝子セグメント」という用語は、さらに、改変型酵素遺伝子産物、タンパク質又は多糖をコードする本明細書に開示のポリヌクレオチド配列と実質的に同一であり、関連する制御配列の任意の組合せを有することができる、任意のＤＮＡ配列を指す。この用語はまた、そのようなＤＮＡ配列に相補的なＲＮＡ又はアンチセンス配列を指す。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡセグメント」という用語は、プラスミド、コスミド、ファージ、及びウイルスを含むがこれらに限定されない組換えベクターを含まずに単離されている、単離されたＤＮＡ分子を含む。
「グリコサミノグリカン」という用語は、反復二糖単位からなる長い線状多糖類を指す。グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の例として、コンドロイチン、デルマタン、ヘパロサン、ヒアルロン酸、及びケラタンが挙げられる。ＧＡＧは、一般に、質量、長さ、二糖単位構造及び官能化、硫酸化の程度に関して不均一である。
用語「ヘパロサン」は、ＧｌｃＡがグルクロン酸であり、ＧｌｃＮＡｃがＮ－アセチルグルコサミンである、反復［β（１，４）ＧｌｃＡ－α（１，４）ＧｌｃＮＡｃ］ｎ二糖単位を有する特定のＧＡＧを指す。
「ヘパロサン系多糖」という用語は、二糖単位が１→４グリコシド結合したヘキスロン酸及びグルコサミン残基を含む、ヘパロサンと同じ骨格構造を有する多糖類を指す。ヘキスロン酸残基は、ヘパロサンのようにグルクロン酸であっても、又はイズロン酸であってもいずれでもよく、任意に２－Ｏ位にスルホ基を有していてもよい。グルコサミン残基は、ヘパロサンの場合のように、Ｎ－アセチル化、Ｎ－硫酸化、又はＮ－非置換のいずれかとすることができ、Ｎ－、３－Ｏ、又は６－Ｏの位置で任意に硫酸化することができる。本明細書で使用される場合、グルコサミン残基に関して「Ｎ－非置換」という用語は、「Ｎ－脱アセチル化」グルコサミン残基と同等であり、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼを使用して化学的又は酵素的のいずれかでスルホ基を受容することができる、アミン官能基を指す。本発明によれば、ヘパロサン系多糖類は、出発物質として利用することができ、中間体として形成することができ、スルホ基受容体として作用し、及び／又は本明細書に記載の方法のいずれかによる生成物として合成することができる。
「挿入」という用語は、参照ポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分、又はポリペプチドのＣ末端若しくはＮ末端への挿入とすることができる。挿入は、当技術分野で公知であり、後述する融合タンパク質を有することができる。挿入は、参照ポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上によって分離された、アミノ酸の連続セグメント又は複数の挿入を有することができる。
天然に存在する配列に由来する核酸に関して、本明細書で使用される「単離された核酸」という用語は、天然に存在するヌクレオチド配列を含み、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作することができるが、それが由来する生物の天然に存在するゲノムのその５’及び３’末端に直接隣接するヌクレオチド配列に共有結合していない、リボ核酸又はデオキシリボ核酸を意味する。合成核酸に関して本明細書で使用される場合、「単離された核酸」という用語は、天然には存在せず、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作することができるヌクレオチド配列を有する、リボ核酸又はデオキシリボ核酸を意味する。単離された核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、インビトロ翻訳、他の核酸（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）へのライゲーション、他の核酸（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）からの制限、細胞の形質転換、ハイブリダイゼーション・スクリーニング・アッセイなどに使用することができる場合、標準的な組換えＤＮＡ技術によって操作することができる。
「天然に存在する」又は「野生型」という用語は、自然で見出される酵素の形態を指す。例えば、天然に存在する又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作によって意図的に改変されていない生物に存在する配列である。野生型ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列はまた、インビトロで合成、増幅、及び／又は発現することができ、インビボで産生される酵素と同じ配列及び生物活性を有する、組換えタンパク質又は核酸を指すことができる。天然に存在する又は野生型スルホトランスフェラーゼ酵素とは対照的に、本発明の方法に従って利用される改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、固有のアミノ酸及び核酸配列を有し、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の代わりにスルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物との生物活性を有し、自然界では見出すことができない。
「オリゴ糖」という用語は、各分子内に少数、典型的には３～９個の糖残基を含む、糖ポリマーを指す。
「パーセント同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はアミノ酸配列間の類似性の定量的測定を指す。非限定的な例として、本発明の２つ以上の改変型酵素間、２つ以上の天然に存在する酵素間、又は１つ以上の改変型酵素と１つ以上の天然に存在する酵素との間の、パーセント同一性を評価することができる。パーセント同一性は、２つ以上の全長配列、２つ以上の切断配列、又は全長配列と切断配列との組合せに関して評価することができる。
「多糖」という用語は、グリコシド結合によって互いに結合された反復単位、典型的には単糖又は二糖単位で形成されたポリマー炭水化物構造を指し、直鎖から高度に分岐した三次元構造までの範囲にわたることができる。当技術分野で使用される「多糖」という用語は、分子あたり１０個超の糖残基を有する糖ポリマーを指すことができるが、「多糖」は、当技術分野で「オリゴ糖」として定義することができる３～９個の糖残基を有する糖ポリマーを含む、１個超の糖残基を有する糖ポリマーを説明するために本明細書で用いられる。本発明によれば、「多糖」という用語はまた、コンドロイチン、デルマタン、ヘパロサン、ヒアルロン酸、及びケラタン化合物を含むＧＡＧ及びＧＡＧ系の化合物を一般的に説明するために使用される。
「タンパク質」、「遺伝子産物」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、アミノ酸残基の１つ以上の鎖からなる生体分子を説明するために交換可能に使用することができる。さらに、複数のポリペプチドサブユニット（例えば、二量体、三量体、又は四量体）を含むタンパク質、並びに他の非タンパク質性触媒分子もまた、本明細書で使用される「タンパク質」の意味の範囲内に含まれると理解される。同様に、「タンパク質フラグメント」、すなわちタンパク質の全てのアミノ酸残基よりも少ないアミノ酸残基を含むアミノ酸残基のストレッチもまた、本発明の範囲内であり、本明細書では「タンパク質」と呼ばれることがある。さらに、「タンパク質ドメイン」もまた、「タンパク質」という用語に含まれる。「タンパク質ドメイン」は、疎水性コア及び極性外面を有するそれ自体特徴的な球形形状を有する、それ自体半独立したフォールディング領域から構成されるタンパク質の一部を表す。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、核酸、又はポリペプチドに関して使用される場合、別段では自然界に存在しない様式で修飾された材料を指す。非限定的な例として、とりわけ、細胞の天然（非組換え）形態内に見られない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
「参照配列」という用語は、配列比較の基礎として使用される開示又は定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば全長遺伝子又はポリペプチド配列のセグメントとすることができる。一般に、参照配列は、全長配列の少なくとも一部、典型的には少なくとも２０個のアミノ酸、又は核酸若しくはポリペプチドの全長配列を指す。
「糖（saccharide）」という用語は、糖（sugar）としても知られる炭水化物を指し、炭素、水素、及び酸素を有してなる化学物質の広義の用語である。ここで、水素原子の数は、本質的に酸素原子の数の２倍である。多くの場合、反復単位の数は糖間で異なってもよい。したがって、二糖、オリゴ糖、及び多糖類は全て、スルホ基受容体として本発明の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素によって認識される糖単位で構成される、鎖の全ての例である。
出発物質として利用するか、中間体として形成されるか、スルホ基受容体として作用するか、及び／又は本明細書に記載する方法のいずれかに従って生成物として合成される多糖類に関して、「実質的に等価」という用語は、先行技術で特徴付けられる多糖試料で見られるものと同一の多糖試料の１つ以上の特性を指す。そのような特性として、化学構造、硫酸化頻度及び位置、二糖単位組成、分子量プロファイル、及び／又は抗凝固活性を挙げることができるがこれらに限定されない。２つの多糖試料が異なる可能性のある追加の特性を有する場合でも、そのような違いはそれらの実質的な同等性に著しくは影響しない。非限定的な例として、本発明の方法に従って改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼを使用して合成した抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、化学構造、分子量プロファイル、及び／又は抗凝固活性に関して米国薬局方（ＵＳＰ）参照標準（ＣＡＳ番号９０４１－０８－１）と実質的に等価とすることができるが、天然源から単離され、同じ試料中に非微量の他のＧＡＧを含有することができるＵＳＰ参照標準とは異なる純度で製造することができる。
タンパク質調製物に関して「実質的に純粋」という用語は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、目的のタンパク質を（乾燥重量で）少なくとも６０％含有する調製物を指す。特に、調製物は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、目的のタンパク質の乾燥重量で少なくとも７５％、より具体的には少なくとも９０％、最も具体的には少なくとも９９％である。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）分析によって測定することができる。調製物が本発明の２つ以上の異なるタンパク質を意図的に含む場合、「実質的に純粋な」調製物は、本発明のタンパク質の総乾燥重量が、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、総乾燥重量の少なくとも６０％である調製物を意味する。特に、本発明の２つ以上のタンパク質を含有するそのような調製物について、本発明のタンパク質の総重量は、他の意図的に含まれる化合物の重量を除いて、調製物の総乾燥重量の少なくとも７５％、より具体的には少なくとも９０％、最も具体的には少なくとも９９％とすることができる。
「スルホ」又は「スルフリル」という用語は、アリール硫酸化合物から除去することができ、及び／又は供与体化合物から受容体化合物に転移することができる化学式ＳＯ３Ｈ－を有する官能基、置換基、又は部分を指す。ある態様において、本発明の改変型スルホトランスフェラーゼは、アリール硫酸化合物から、多糖、特にヘパロサン及び／又はヘパロサン系多糖へのスルホ基の転移を触媒する。
「スルホトランスフェラーゼ」という用語は、スルホ供与体化合物からスルホ受容体化合物へのスルホ基の転移を触媒するために使用される、インビボ又はインビトロプロセスにおける任意の酵素を指す。「スルホトランスフェラーゼ」は、インビボでスルホ転移反応を触媒する酵素を記載するため、又はインビトロでスルホ転移反応を触媒する本発明の改変型酵素を記載するために、互換的に使用することができる。
「形質転換」という用語は、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、ネイキッド核酸の直接注入、粒子媒介送達、ウイルス媒介形質導入、又は該核酸の一過性若しくは安定な発現、若しくは該核酸の該宿主細胞若しくはその子孫のゲノムへの組込みをもたらす核酸を宿主細胞に送達する任意の他の手段を含むが、これらに限定されない、外因性核酸を細胞に導入する任意の方法を指す。
本開示は、基質としてのアリール硫酸化合物を認識、結合、反応するように構成される改変型酵素を記載する。スルファターゼ及びスルホトランスフェラーゼを含む、インビボで細菌及び真核生物の酵素の一般的な基質である多くのスルファート含有化合物は、インビトロでそれらの同じ反応の基質として使用するには非実用的であることが多いので、本発明の酵素は特に有用である。アリール硫酸化合物は、遍在性であり、安価であり、安定であり、実験室環境での作業が比較的容易であるが、これらはインビボでごく少数の酵素と反応することができる。特に、真核生物スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合又は反応することができず、代わりに、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とのみ反応することができる。結果として、スルホトランスフェラーゼの３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸へのほぼ普遍的な依存は、硫酸化生成物、特に硫酸化多糖生成物の大規模な化学酵素的又は酵素的インビトロ合成に対する克服できない障害であった。
以下に開示する本発明の改変型酵素は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を排他的に認識、結合、反応するが、代わりに基質としてのアリール硫酸化合物と結合及び反応するように操作された、天然スルホトランスフェラーゼ酵素の変異体である。本発明のある態様において、改変型酵素の多くは、酵素がアリール硫酸化合物からのスルホ基の加水分解を触媒するスルファターゼ活性を保有する。特定の理論に制限されるものではないが、スルファターゼの反応機構は、保存されたシグナル配列及び翻訳後修飾されたアミノ酸を保有する公知の天然スルファターゼと比較して、独特であると考えられる。本発明の天然酵素及び改変型酵素の両方のスルファターゼ活性を以下でさらに詳述する。
本発明の他の態様において、改変型酵素のいくつかは、この酵素がアリール硫酸化合物からスルホ基受容体へのスルホ基の転移を触媒するスルホトランスフェラーゼ活性を保有する。他の態様において、スルホ基受容体は、多糖、特にヘパロサン系多糖である。特定の理論に制限されるものではないが、多糖類をスルホ基受容体として認識するが、スルホ供与体としてのアリール硫酸化合物にも結合及び反応するスルホトランスフェラーゼ酵素は、自然界では観察されておらず、以前にも記載されていないと考えられている。当業者は、本発明の改変型硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ酵素が、スルホ転移を触媒するためにアリール硫酸化合物と結合及び反応することができないインビトロ及びインビボ反応機構を超える、いくつかの利点を有することを理解するであろう。
例示的な態様を参照し、それらを説明するために特定の用語が使用されているが、本発明の範囲の限定は意図されていないことを理解されたい。本明細書に記載する方法のさらなる修正、並びに当業者が想到し、本開示を有するであろう記載された本発明の原理のさらなる適用は、本発明の範囲内であると考えられるべきである。さらに、特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この特定の発明の態様が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。使用される用語は、それらの態様を説明することのみを目的としており、そのように指定されない限り、限定することを意図しない。見出しは便宜上提供されているにすぎず、決して本発明を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲を通して、所与の化学式又は名称は、全ての光学異性体及び立体異性体、並びにそのような異性体及び混合物が存在する場合はラセミ混合物を包含するものとする。
硫酸アリール依存性スルファターゼ
本発明のある態様において、本明細書に開示する改変型酵素のいくつかはスルファターゼ活性を有し、アリール硫酸化合物内で硫酸エステルを加水分解することができる（Recksiek, et al., (1998) J. Biol. Chem. 273 (11): 6096-6103を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる）。水溶液中でアリール硫酸化合物と結合すると、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、アリール硫酸化合物の加水分解を触媒して、芳香族化合物及び硫酸イオンを生成することができる。アリール硫酸化合物の非限定的な例として、ｐ－ニトロフェニル硫酸（ＰＮＳ）、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２－ナフチル硫酸（２ＮａｐＳ）、及び４－ニトロカテコール硫酸（ＮＣＳ）が挙げられる。非限定的な例として、図１に示すように、アリール硫酸化合物がＰＮＳである場合、生成物はｐ－ニトロフェノール及び硫酸イオンである。ｐ－ニトロフェノールのｐＫａより高いｐＨで行われる反応では、芳香族生成物は、ｐ－ニトロフェノレートイオンである。
特定の理論に制限されるものではないが、本発明の改変型酵素によって触媒される硫酸エステルの加水分解は、酵素の活性部位内のアリール硫酸化合物の結合時に起こることができる。図２に示すように、活性部位ヒスチジン残基のイミダゾール環内の塩基性窒素原子の孤立電子対は、ＰＮＳ内の硫黄原子の求核攻撃を開始し、隣接するＣ－Ｏ結合の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成を引き起こす。第２の工程では、スルホヒスチジン中間体自体を活性部位内の水分子によって求核攻撃して、ヒスチジン側鎖からスルホ基を放出させ、酵素をその反応前状態に回復させることができる。
活性部位内のヒスチジン残基を利用して硫酸エステルを加水分解する反応機構を進めることにより、他の公知のスルファターゼと比較して、本発明の改変型酵素に固有のニッチが形成される。自然界では、スルファターゼは、原核生物種及び真核生物種の両方にわたって連続的、構造的、及び機構的に高度に保存されており、細胞発生及び解毒、硫黄捕捉、化合物の分解、及び浸透圧保護などの機能を有する、酵素のクラス（ＥＣ３．１．５．６）を有する。天然スルファターゼ間のそのような類似性には、コンセンサス配列モチーフを含有する高度に保存されたＮ末端配列領域と、天然スルファターゼ活性に必要な独特の翻訳後修飾された活性部位アルデヒド残基である、α－ホルミルグリシンが含まれる（Hanson, S. R., et al., (2004) Agnew. Chem. Int. Ed. 43: 5736-5763を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる）。さらに、天然スルファターゼは、典型的には、多くの場合、いくつかの真核生物スルファターゼについては最大約８００アミノ酸残基を含む、５００アミノ酸残基を超えるアミノ酸残基を含む大きなタンパク質である。
特定の理論に制限されるものではないが、全ての公知の天然加水分解性スルファターゼは、スルファターゼシグネチャ配列Ｉ及びＩＩとして以前に同定された２つの高度に相同なアミノ酸モチーフを含み、これらは両方ともＮ末端配列領域に見出されると考えられる（上記のHanson, S. R., et al.を参照のこと）。シグネチャ配列Ｉがアミノ酸Ｃ／Ｓ－Ｘ－Ｐ－Ｓ／Ｘ－Ｒ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｌ／Ｘ－Ｔ／Ｘ－Ｇ／Ｘ－Ｒ／Ｘを有する一方、シグネチャ配列ＩＩはアミノ酸Ｇ－Ｙ／Ｖ－Ｘ－Ｓ／Ｔ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｇ－Ｋ－Ｘ－Ｘ－Ｈを有する。両方のシグネチャ配列は、天然のスルファターゼ酵素活性において重要な役割を果たす。シグネチャ配列Ｉは、α－ホルミルグリシン残基を含有するように活性部位の翻訳後修飾を指示するために必要であり（以下でさらに詳述する）、シグネチャ配列ＩＩは、α－ホルミルグリシン含有活性部位内の硫酸エステル触媒作用を最適化するために重要である、重大な結合接点を含む。
特に、活性部位内のα－ホルミルグリシンの存在は、天然スルファターゼ内で最も顕著な特徴であり、これまでに特徴付けられた原核生物及び真核生物のスルファターゼの全てに見られる（Uhlhorn-Dierls, G., et al., (1998) Agnew. Chem. 37: 2453及びUhlhorn-Dierls, G., et al., (1998) Agnew. Chem. 110: 2591を参照のこと。これらの開示はその全体が参照により組み込まれる）。α－ホルミルグリシン残基は、活性部位内のシステイン（最も一般的）又はセリン残基から形成することができ、その修飾はシグネチャ配列Ｉによって指示されることが決定されている。シグネチャ配列Ｉ内で、ペンタペプチド配列モチーフＣ／Ｓ－Ｘ－Ｐ－Ｓ／Ｘ－Ｒは、α－ホルミルグリシンの形成を指示するだけでなく、触媒作用中に活性部位内のα－ホルミルグリシン残基を安定化することが同定されている。
いくつかの天然スルファターゼの結晶構造に基づいて、触媒作用のためにα－ホルミルグリシン残基を顕著に利用する２つの反応機構が提案されている。図３Ａに示す第１の機構は、α－ホルミルグリシン残基が、そのアルデヒド形態において基質内の硫酸基酸素原子の１つによって求核攻撃されて、硫酸ジエステルを形成することが提案されている。次いで、アルコールコンジュゲートは、活性化された水分子などの求核剤の作用によって放出されて、硫酸ヘミアセタールを形成する。その後の硫酸ヘミアセタール内の求核中心のアルコールによる攻撃は、活性部位からの硫酸分子の放出を引き起こし、将来の触媒作用のために酵素を再生する。図３Ｂに示す第２の機構は、その水和形態のα－ホルミルグリシンが、図３Ａの機構と同様に、ＳＮ２反応を介して硫酸原子を求核攻撃して硫酸ヘミアセタールを形成し、最終的に活性部位から硫酸基を放出することができる。続いて、水を添加すると、α－ホルミルグリシンアルデヒドが再水和して、水和したα－ホルミルグリシン残基が再形成される。
しかしながら、他の態様において、本発明の改変型酵素は、シグネチャ配列Ｉ、シグネチャ配列ＩＩ、及び／又は任意のα－ホルミルグリシン残基が存在することなく、合成することができる。他の態様において、シグネチャ配列Ｉ、シグネチャ配列ＩＩ、及び／又はα－ホルミルグリシン残基を含まず、スルファターゼ活性を有することが示されている酵素（以下の実施例を参照）は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１からなる群から選択することができる。他の態様において、スルファターゼ活性を有する改変型酵素は、以下の「核酸及びポリペプチドの調製」の項で定義されるように、スルファターゼ活性を有する上記ポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列と実質的に同一であるか、又は生物学的同等物である、アミノ酸配列を有することができる。
したがって、他の態様において、本発明は、アリール硫酸化合物を酵素的に加水分解するための方法であって、アリール硫酸化合物を提供する工程；アリール硫酸化合物及び多糖、好ましくはヘパロサン系多糖と結合するように構成された活性部位を有する、改変型酵素を提供する工程；アリール硫酸化合物及び改変型酵素を反応混合物に組み合わせる工程；改変型酵素を使用してアリール硫酸化合物の加水分解を触媒する工程；を有する方法を提供する。他の態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなる群から選択される。他の態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。他の態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。他の態様において、アリール硫酸化合物は２ＮａｐＳである。他の態様において、アリール硫酸化合物の加水分解は、アリール硫酸化合物内の硫黄原子の求核攻撃を含む機構によって進行し、隣接するＣ－Ｏ結合の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成を引き起こす。他の態様において、求核攻撃はヒスチジン残基によって開始される。
硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ
他の態様において、上記のように、本発明の改変型酵素のいくつかは、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と共にスルホトランスフェラーゼ活性を有する。他の態様において、スルホ基供与体は、多糖、好ましくはヘパロサン系多糖である。各スルホ転移反応では、アリール硫酸化合物はスルホ基供与体として関与し、多糖はスルホ基受容体として関与する。多糖類をスルホ基受容体として認識するが、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物にも結合及び反応するスルホトランスフェラーゼ酵素は、自然界では観察されておらず、以前にも記載されていない。
１つの特定の多糖であるヘパロサンは、インビボ、特に真核生物内での多数の硫酸化多糖類の合成における出発物質である。典型的には、ヘパロサンは、ゴルジ体内の生物によってグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）として合成され、ＧｌｃＡがグルクロン酸であり、ＧｌｃＮＡｃがＮ－アセチルグルコサミンである、［β（１，４）ＧｌｃＡ－α（１，４）ＧｌｃＮＡｃ］ｎ二糖単位の反復コポリマーを有する。次いで、ヘパロサンＧＡＧを、特に１つ以上のヘパラン硫酸（ＨＳ）－スルホトランスフェラーゼ酵素によって修飾して、官能化されたヘパロサン系多糖生成物、特にＨＳを形成することができる。そのようなヘパロサンの修飾には、グルコサミンのＮ－脱アセチル化及びＮ－硫酸化、イズロン酸を形成するためのグルクロン酸のＣ５－エピマー化、イズロン酸及び／又はグルクロン酸の２－Ｏ－硫酸化、並びにグルコサミン残基の６－Ｏ－硫酸化及び３－Ｏ－硫酸化が含まれる。インビボにおいてヘパロサン及びヘパロサン系多糖類のＮ－アセチル化及びＮ－硫酸化、２－Ｏ－硫酸化、６－Ｏ－硫酸化、並びに３－Ｏ－硫酸化を触媒する天然のスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体として、排他的に３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を認識及び結合する。特定の理論に制限されるものではないが、４つのＨＳスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれも、スルホ基供与体としてのいかなるアリール硫酸化合物とも活性ではないと考えられる。
４つの天然ＨＳスルホトランスフェラーゼ酵素の各々は、一般に、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸からヘパロサン系多糖へのスルホ基の直接転移を単一工程で触媒する。ＨＳスルホトランスフェラーゼ酵素によって触媒される典型的なスルホ転移反応機構の例を図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示し、これらは、ヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸、及びヘパロサン系多糖の間の反応で形成される、提案された機構、遷移状態、及び生成物をまとめて示す。特に、４３位のグルタミン酸残基は、ヘパロサン系多糖内のＮ－、６－Ｏ硫酸化スルホグルコサミン残基の３－Ｏ位からプロトンを引き抜き、求核攻撃及び３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸からのスルホ基の除去を可能にする一方、Ｈｉｓ－４５及びＡｓｐ－４８は、硫酸化多糖生成物が活性部位から放出される前に、酵素の遷移状態を安定化するように配位する。
しかしながら、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸は真核生物において排他的なスルホ供与体であるが、短い半減期を有し、スルホ転移反応中に競合阻害剤として作用するアデノシン３’，５’－二リン酸へと容易に分解することができる。動物は、アデノシン３’、５’－二リン酸を代謝して競合阻害を防ぎ、また、必要に応じて各スルホ転移反応のために３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を補充することができるので、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を効率的に利用することができる。一方、限られた数の細菌系においてスルホ供与体として利用することができるアリール硫酸化合物（上記のMalojcic, G., et al.を参照のこと）は、ＨＳ及び他のヘパロサン系多糖類のインビボにおける合成に関与するものを含む、真核生物における公知の天然スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれとも反応することができない。特定の理論に制限されるものではないが、真核生物のスルホトランスフェラーゼの活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合ポケットは、結合を促進するのに充分に高い硫酸アリール化合物に対する親和性を有していないか、及び／又はアリール硫酸化合物が活性部位に入るのを立体的に全く妨げられているかのいずれかと考えられる。
ヘパラン硫酸及び他のヘパロサン系多糖類は、ウイルス感染の補助、血液凝固及び胚発生の調節、腫瘍増殖の抑制、並びに特定の調節タンパク質と相互作用することによる試験対象の摂食行動の制御を含む、インビボでの様々で重要な生物学的過程において重要な役割を果たす。役割に応じて、ヘパロサン多糖類は、特定の生物学的プロセスに関与する特定のタンパク質（複数可）によって認識される、１つ以上の固有のパターン又はモチーフを有することができる。特に、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸多糖類、及びインビトロでそのような多糖類を合成する経路は、製薬業界内で非常に興味深いトピックである。
本開示は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのヘパロサン系多糖類との活性を有する、以下でさらに詳述する改変型スルホトランスフェラーゼ酵素を含む。改変型スルホトランスフェラーゼ酵素の各々は、対応する天然ＨＳスルホトランスフェラーゼ：グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ、及びグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼの変異体であるように設計される。各例において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体として１つ以上のアリール硫酸化合物（３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸ではなく）との活性を有するが、スルホ基受容体としての特定のヘパロサン系多糖に対する天然ＨＳ－スルホトランスフェラーゼ酵素の親和性を保持する。非限定的な例として、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物及びスルホ基受容体としてのＮ－硫酸化ヘパロサンとのスルホトランスフェラーゼ活性を有することができる。改変型スルホトランスフェラーゼ酵素の各々は、それらの配列、構造、及び生物活性を含めて、以下でさらに詳述する。改変型スルホトランスフェラーゼ酵素及びアリール硫酸化合物を使用してインビトロで硫酸化ヘパロサン系多糖類を合成する方法もまた、後述する。本発明のある態様において、抗凝固活性を有するヘパラン硫酸多糖類を、インビトロで合成することができる。
改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ
自然界では、ＨＳグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼは、二重のＮ－デアセチラーゼ及びＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有し、同じ酵素が最初に、ヘパロサン内のグルコサミン残基からのＮ－アセチル基の除去を触媒し、次いで、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸から第１の工程においてＮ－脱アセチル化された同じグルコサミン残基へのスルホ基の転移を触媒する。酵素の二重のＮ－デアセチラーゼ活性及びＮ－スルホトランスフェラーゼ活性は、２つの別個の構造ドメイン、すなわちＮ－デアセチラーゼドメイン及びＮ－スルホトランスフェラーゼドメインを介して達成される。しかしながら、一方のドメインの活性は他方のドメインの活性のための必要条件ではなく、Ｎ－デアセチラーゼ又はＮ－スルホトランスフェラーゼ活性のいずれかを有する組換え単一ドメイン酵素を発現及び精製することができる。同様に、本発明のある態様において、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有する改変型酵素は、Ｎ－デアセチラーゼドメインをさらに有することなく、単一のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインとして発現及び精製することができる。
スルホ基供与体として３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を利用するＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有する天然に存在する酵素は、ＥＣ２．８．２．８酵素クラスのメンバーである。一般に、Ｎ－デアセチラーゼドメインＥＣ２．８．２．８酵素は、ヘパロサン内のＮ－アセチルグルコサミン残基の１つ以上を脱アセチル化してＮ－脱アセチル化ヘパロサンを形成し、次いで、これを酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインによってスルホ基受容体として認識することができる。しかしながら、ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインは、下記式ＩＩ（式中、ｎは整数であり、Ｒは水素原子又はスルホ基からなる群から選択される）の構造を有する１つ以上の二糖単位を有するヘパロサン系多糖類とのスルホトランスフェラーゼ活性を有することを示す。
Figure 2022523638000013
さらに、酵素と反応する多糖の部分は式ＩＩの構造を有するが、多糖内の他のグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化、Ｎ－アセチル化、３－Ｏ硫酸化、及び／又は６－Ｏ硫酸化されていてもよく、ヘキスロニル残基はグルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれもが２－Ｏ硫酸化されていてもよい。典型的には、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン及び式ＩＩの構造を有する他のヘパロサン系多糖類は、合計で少なくとも４つの二糖単位、又は少なくとも８つの糖残基を有する。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンをスルホ基受容体として利用するスルホ転移反応は、Sheng, J., et al., (2011) J. Biol. Chem. 286 (22): 19768-76,及び Gesteira, T. F., et al., (2013) PLoS One 8 (8): e70880にて考察されており、これらの開示はその全体が参照により組み込まれる。
３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と、式ＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖との結合に成功すると、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を有する天然ＥＣ２．８．２．８酵素は、スルホ基の非置換グルコサミンへの転移を触媒し、下記式ＩＩＩ（式中、ｎは整数であり、Ｒは水素原子又はスルホ基からなる群から選択される。）の構造を有するＮ－硫酸化ヘパロサン生成物を形成することができる。
Figure 2022523638000014
他の態様において、改変型硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと反応するヘパロサン系多糖内の反復二糖単位の各々は、式ＩＩの構造を有する。さらなる態様において、グルコサミニル残基の６－Ｏ位及びグルクロン酸残基の２－Ｏ位のＲ基の両方が、多糖内の二糖単位の全てを含む１つ以上において、水素原子である。他の態様において、多糖内のいくつかの位置では、図５に示すように、グルコサミン残基の少なくとも一部が依然としてＮ－アセチル化されているが、Ｎ－アセチル化されているポリマー内のグルコサミニル残基は、本発明の改変型スルホトランスフェラーゼとスルホ基受容体として直接関与することはできない。しかしながら、多糖内のＮ－アセチル化残基の存在は、同じ多糖内の非アセチル化残基に対して改変型スルホトランスフェラーゼが有する結合親和性に影響を及ぼさない。他の態様において、ヘパロサン系多糖の構造にかかわらず、式ＩＩの構造を有する二糖単位を、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素及びアリール硫酸化合物を有するスルホ受容体として利用して、式ＩＩＩの構造を有するＮ－硫酸化生成物を生成することができる。
他の態様において、式ＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖内に複数の二糖単位が存在する場合、それらの二糖単位のいずれかの内のグルコサミン残基をＮ－硫酸化することができる。同様に、他の態様において、式ＩＩの構造を有する複数の二糖単位を有する多糖内で、多糖内の利用可能なグルコサミン残基の最大全てを含む複数のグルコサミン残基をＮ－硫酸化することができる。
野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインは、典型的には、それらの配列が大きく異なり得るおよそ３００～３５０個のアミノ酸残基を有するが、最終的には全く同じ機能、すなわちＮ－脱アセチル化ヘパロサン内の非置換グルコサミン残基のＮ－硫酸化を触媒する機能を有する。特定の理論に制限されるものではないが、野生型ＥＣ２．８．２．８酵素の各々は、全ての種にわたって同一又は高度にのいずれかで保存されている複数のアミノ酸配列モチーフ及び二次構造があるため、同じ化学反応を触媒することができると考えられる。
さらに、保存されたアミノ酸配列モチーフのいくつかは、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及び／又は多糖のいずれかの結合に直接関与するか、又は化学反応自体に関与すると考えられる。天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン間の保存されたアミノ酸配列モチーフの同一性は、活性部位内のアミノ酸残基が同定された既知の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＮＳＴ）を有するヒトＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列を、ＥＣ２．８．２．８酵素クラス内の他の天然スルホトランスフェラーゼのＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列と比較することによって実証することができる。いくつかの真核生物及びヒト酵素のいくつかのアイソフォームを含む、１５個の酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの多重配列アラインメントを、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ５２８４８）と比較してのパーセント同一性と共に図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃに示す。図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃに示すように、配列は、ラットＮ－スルホトランスフェラーゼドメインについてはＰ５２８４８参照配列（エントリｓｐ｜Ｑ０２３５３｜ＮＤＳＴ１＿ＲＡＴ）と９８．４％の配列同一性を有するものから、ショウジョウバエＮ－スルホトランスフェラーゼドメインについては最低で５５．６％の配列同一性（エントリｓｐ｜Ｑ９Ｖ３Ｌ１｜ＮＤＳＴ＿ＤＲＯＭＥ）までの範囲である。当業者は、多重配列アラインメントは明確化のために１５配列に限定されており、同定され、高度に保存された活性部位及び／又は結合領域も有する他の野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインをコードする数百のアミノ酸配列が存在することを理解するであろう。
図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃにおいて、特定の位置で黒背景に白色で示すアミノ酸は、全ての配列にわたって１００％同一である。アミノ酸が同一であること、又は化学的若しくは構造的に類似していることのいずれかを意味する、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、黒い縁取りで囲まれている。高度に保存された領域内では、配列の大部分に存在するコンセンサスアミノ酸は太字である。同一でないか又は高度に保存されていない特定の位置のアミノ酸は、典型的には可変である。配列内の期間（period）は、高度に保存された又は同一の領域の間にさらなる残基を有する他の配列（複数可）との配列アラインメントを容易にするために、配列に挿入されたギャップを示す。最後に、各配列ブロックの上には、アラインメント内のアミノ酸の同一性に基づいて、野生型ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の構造を参照として使用して、全ての配列にわたり保存されている二次構造を示す一連の矢印及びコイルがある。矢印に隣接するβ記号はβシートを指し、α記号又はη記号に隣接するコイルは螺旋二次構造を指す。
図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃの１５個の整列した配列内には、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの結晶構造に基づいて、活性部位を構成する１つ以上のアミノ酸を含むいくつかの保存されたアミノ酸モチーフが存在する。図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃ内のアミノ酸残基の番号付けに基づくこれらの保存されたアミノ酸配列モチーフは、残基４０～４６（Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａ）；残基６６～６９（Ｔ－Ｆ－Ｅ－Ｅ）；残基１０１～１０５（Ｆ－Ｅ－Ｋ－Ｓ－Ａ）；残基１３９～１４３（Ｓ－Ｗ－Ｙ－Ｑ－Ｈ）；及び残基２５５～２６２（Ｃ－Ｌ－Ｇ－Ｋ／Ｒ－Ｓ－Ｋ－Ｇ－Ｒ）を含む。さらなる態様において、保存されたアミノ酸配列モチーフＱ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａを有するＥＣ２．８．２．８内の野生型スルホトランスフェラーゼ酵素のいくつかのアイソフォームは、残基４０～４９からの拡張保存されたアミノ酸配列モチーフＱ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａ－Ｌ－Ｙ－Ｌをさらに有する。
特定の理論に制限されるものではないが、これらの残基は、化学反応を促進するか若しくはそれに関与するか、又は活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸若しくは多糖の結合を可能にするかのいずれかであると考えられる。特に図７Ａ、図７Ｂ、及び図７Ｃに示すように、１４３位のヒスチジン残基（Ｎ－デアセチラーゼドメインも含む全長天然スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の７１６位に対応する）は、多糖内の非置換グルコサミニル残基のアミン官能基内の２つのプロトンのうちの一方を引き抜き、窒素原子が３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の求核攻撃を開始してスルフリル基を除去することを可能にする位置にある。さらに、４１位及び２６０位のリジン残基も普遍的に保存されており、スルフリル部分と配位すると考えられ、活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合を促進し、反応の過程で遷移状態を安定化する（上記のGesteira, T. F., et al.,及びSueyoshi, T., et al., (1998) FEBS Letters 433: 211-214を参照のこと。これらの開示は、その全体が参照により組み込まれる）。
しかしながら、上記のように、ＥＣ２．８．２．８内の天然スルホトランスフェラーゼ酵素は、天然スルホトランスフェラーゼの活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合ポケットが、結合を促進するのに充分高いアリール硫酸化合物に対する親和性を有しないか、及び／又はアリール硫酸化合物が活性部位に入るのを立体的に妨げられるかのいずれかと考えられるので、アリール硫酸化合物から多糖への硫酸基の転移を触媒することができない。その結果、及び他の態様において、ＥＣ２．８．２．８酵素を、そのアミノ酸配列内のいくつかの位置で変異させて、活性部位内のアリール硫酸化合物の結合を可能にし、及び／又は多糖への硫酸基の転移が起こることができるようにアリール硫酸化合物を最適に配置することができる。
したがって、他の態様において、本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃに例示するアミノ酸配列を有する酵素を含めて、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のいずれかのＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと比較して変異している単一のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインを有することができる。他の態様において、本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のいずれかのＮ－デアセチラーゼドメインと同一又は変異したアミノ酸配列を有する、Ｎ－デアセチラーゼドメインをさらに有することができる。
他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に操作された変異は、アリール硫酸化合物がスルホ基供与体として酵素に結合及び反応することができる生物活性を促進する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合及び反応することができるが、スルホ基受容体としてのＮ－脱アセチル化ヘパロサンを含むがこれに限定されない式ＩＩの構造を有する二糖単位を有する、ヘパロサン系多糖類との天然ＥＣ２．８．２．８酵素の生物活性を保持する。特定の理論に制限されるものではないが、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に挿入された変異のために、それらのスルホトランスフェラーゼ活性は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がアリール硫酸化合物で置換されていることを除いて、上記の図７Ａ～図７Ｃに記載されているのと同様の機構を用いる、アリール硫酸化合物からスルホ受容体多糖へのスルホ基の直接転移を有することができると考えられる。そうでなければ、変異のために、スルホトランスフェラーゼ活性は、アリール硫酸化合物の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成、続いてＮ－硫酸化生成物を形成するためのＮ－脱アセチル化ヘパロサン内のＮ－非置換グルコサミンによるスルホヒスチジン中間体の求核攻撃を含む、２工程のプロセスを有することができると考えられる。いずれの機構によっても、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、実施例に後述するように、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルホ転移を達成することができる。
他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、上述のように、図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃの多重配列アラインメントに示すように、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインに見られる保存アミノ酸配列モチーフと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に存在する各変異アミノ酸配列モチーフは、ＥＣ２．８．２．８内の天然酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、１つの変異アミノ酸配列モチーフを有する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、２つの変異アミノ酸配列モチーフを有する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、３つの変異アミノ酸配列モチーフを有する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、４つの変異アミノ酸配列モチーフを有する。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、５つの変異アミノ酸配列モチーフを有する。他の態様において、ＥＣ２．８．２．８内の天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと比較して少なくとも１つの変異アミノ酸配列モチーフを有する、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
他の態様において、三次元分子視覚化システム（非限定的な例として、オープンソースソフトウェアであるＰｙＭＯＬ）においてヒトＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素（ＰＤＢコード：１ＮＳＴ）のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの結晶構造を見ると、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを含有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の配列などの関連配列の構造を、図８～図１１に示す比較のためにモデル化することができる。非限定的な一例では、図８は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が重ねられた、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの活性部位の拡大図を示す。ここで、改変型酵素の構造は、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインアミノ酸配列と比較して変異を作製した際に計算される。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がスルホ供与体であり、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインと共結晶化したスルホ転移反応の生成物である、アデノシン３’，５’－二リン酸もまた、活性部位内に示されている。ＰＮＳはまた、そのような解が可能である場合、多糖結合部位（図示せず）に隣接する酵素活性部位内のリガンドの最適化された位置及び配向を計算するように設計された分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの共通解を使用して、改変型酵素活性部位にモデル化される。
図８に示すように、図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃに示すヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ５２８４８）の配列と比較して、配列番号１３内にいくつかの変異があるが、それぞれのタンパク質骨格は、互いにほぼ同一の位置にあり、活性部位の一対一比較を可能にする。配列番号１３の配列を有する改変型酵素の構造内において、ＭＤシミュレーションからの共通解は、ＰＮＳ内の硫酸部分は、同様にＥＣ２．８．２．８内で普遍的に保存されている天然アミノ酸残基トレオニンと比較して変異しているヒスチジン残基Ｈｉｓ－４５に隣接して結合するのに有利であることを示す。一方、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン内では、アデノシン３’，５’－二リン酸は、上記の保存されたＨｉｓ－１４３の近くに位置する。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸基質内に含まれるであろうスルホ基は示されていないが、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸が存在する場合、硫酸基はＨｉｓ－１４３にすぐ隣の位置に配向し、ＰＮＳ内の硫酸基と部分的に重複するであろうことが当業者には理解されよう。特定の理論に制限されるものではないが、硫酸基のほぼ重複する位置は、多糖内のグルコサミニル残基からプロトンを除去するためにＨｉｓ－１４３を塩基として使用することによって、スルホ基転移を促進する改変型酵素の能力を説明すると考えられる。
しかしながら、硫酸基が活性部位内のほぼ同一の位置で結合することができるとしても、多糖へのスルホ基転移を促進するために、アリール硫酸化合物を天然ＥＣ２．８．２．８酵素と共に利用することはできない。上記のように、天然酵素の活性部位内のアミノ酸残基は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸に対して強い結合親和性を有するように進化しており、酵素は、結合及びスルホトランスフェラーゼ活性を駆動するのに充分なアリール硫酸化合物に対する親和性を有していない可能性が高いと考えられる。したがって、活性部位内のアリール硫酸化合物の結合を進めるために、改変型酵素内に他の変異が存在しなければならない。図９は、Ｔｒｐ－１０６、Ｈｉｓ－６９、及びＨｉｓ－４０を含む、配列番号１３のアミノ酸配列を有する改変型酵素内のＰＮＳを取り囲む、他の変異を示す図である。ＰＮＳ炭素原子は、ＰＮＳと、ＰＮＳ内の芳香族部分とのπ－πスタッキング結合接点を提供するように配置されたＴｒｐ－１０６及びＨｉｓ－６９と、の視覚的な区別を補助するために白色で示す。さらに、Ｈｉｓ－６９及びＨｉｓ－４０内のε２窒素原子は、スルフリル基と直接配位する。天然の酵素配列から保持されたリジン残基である、Ｌｙｓ－４１（明確化のため図示せず）及びＬｙｓ－１０３は、遷移状態を安定化するために転移中に硫酸基と配位する位置にある。注目すべきことに、天然アミノ酸残基であるＬｙｓ－２６０は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸中の硫酸基とも配位しており、改変型酵素配列内のバリン残基に変異している。特定の理論に制限されるものではないが、ＰＮＳとの反応に必要なＨｉｓ－４５は、位置２６０のリジン残基との電荷反発を呈し、バリン残基への変異は、電荷反発を排除しながら結合部位内にいくらかの立体容積を保持するものと考えられる。それにもかかわらず、Ｌｙｓ－１０３は、図９に示すように、特にスルフリル基がＨｉｓ－４５と会合又は結合している場合、スルフリル基と配位するように配置される。
別の非限定的な例では、図１０は、配列番号５のアミノ酸配列を有する異なる改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素がオーバーレイされた、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｐ５２８４８）の活性部位の拡大図を示す。上記のように、ＰＮＳを、改変型酵素活性部位にモデル化する。配列番号１３のアミノ酸配列を有する改変型酵素と同様に、配列番号５のアミノ酸配列を有する改変型酵素のタンパク質骨格もまた、ヒト酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインとほぼ同一の構造を有する。しかしながら、ＭＤシミュレーションからの共通解は、ＰＮＳ内の硫酸部分が、いくつかのＥＣ２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの活性部位に保存されている天然ロイシン残基から変異している、異なるヒスチジン変異（Ｈｉｓ－４９）に隣接して結合することが好ましいことを示している。結果として、ＰＮＳとの結合接点を形成した配列番号１３内の変異は、配列番号５には必ずしも存在しない。図１１に例示するように、そして配列番号１３と同様に、ＰＮＳの芳香族部分Ｔｒｐ－４５及びＨｉｓ－６７を取り囲むπ－πスタッキング結合接点を形成する２つの変異が配列番号５内に存在する。ＰＮＳと配位する側鎖を有する他の変異には、Ｓｅｒ－６９（ＰＮＳのニトロ官能基と配位）及びＨｉｓ－２６０（硫酸部分と配位）が含まれる。配列番号１３と同様に、２６０位の天然のリジン残基が変異しているので、天然のＬｙｓ－１０３残基を配列番号５内で利用して、ＰＮＳ内の硫酸部分と配位させる。
当業者は、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５によって記載されるものを含むがこれらに限定されない任意の他のアミノ酸配列の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が、ヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメイン、並びに配列番号５及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素と同様の構造を呈する可能性が高いことを理解するであろう。特定の理論に制限されるものではないが、ＮＣＳはまた、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかの活性部位内のＰＮＳと同様の位置で結合するとも考えられる。これは、２つのアリール硫酸化合物の構造が、硫酸基はニトロ基に対してパラではなく、むしろニトロ基に対して芳香環上のオルトに位置することを除いて、非常に類似しているからである。
さらに、本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、上記変異を１つ以上有する変異アミノ酸配列モチーフ、並びに基質の結合、スルホ転移反応、又はタンパク質発現中の酵素の安定性を促進する他の変異を含むことができる。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．８内の保存されたアミノ酸配列Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａ－Ｌ－Ｙ－Ｌから変異した、変異アミノ酸配列モチーフＸ１－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ａ－Ｗ／Ｆ－Ａ／Ｌ－Ｌ－Ｘ２－Ｈを含むことができる。ここで、Ｘ１はグルタミン、セリン、及びアラニンからなる群から選択され、Ｘ２はチロシン、トレオニン、及びヒスチジンからなる群から選択される。変異アミノ酸配列モチーフＸ１－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ａ－Ｗ／Ｆ－Ａ／Ｌ－Ｌ－Ｘ２－Ｈを含む改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素には、配列番号５（上記）、並びに配列番号７、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２５が含まれるが、これらに限定されない。さらなる態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、保存されたアミノ酸配列Ｔ－Ｆ－Ｅ－Ｅから変異した変異アミノ酸配列モチーフＴ－Ｘ３－Ｘ４－Ｓをさらに含むことができる。ここで、Ｘ３は、ヒスチジン及びグリシンからなる群から選択されるＥＣ２．８．２．８内の天然スルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての変異であり、Ｘ４は、グリシン、ヒスチジン、及びセリンからなる群から選択されるＥＣ２．８．２．８内の天然スルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての変異であり、Ｘ３及びＸ４の少なくとも１つは、ヒスチジン残基である。いくつかのなおさらなる態様において、Ｘ１はグルタミンであり、Ｘ２はチロシンであり、Ｘ３はヒスチジンであり、Ｘ４はグリシンであり、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＣ－Ｌ－Ｇ－Ｋ／Ｒ－Ｓ－Ｈ－Ｇ－Ｒをさらに有する。他のなおさらなる態様において、Ｘ１はセリンであり、Ｘ２はトレオニンであり、Ｘ３はグリシンであり、Ｘ４はヒスチジンであり、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＣ－Ｈ－Ｇ－Ｋ／Ｒ－Ｒ－Ｗ－Ｇ－Ｒをさらに有する。また他のなおさらなる態様において、Ｘ１はアラニンであり、Ｘ２はヒスチジンであり、Ｘ３はヒスチジンであり、Ｘ４はセリンであり、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＣ－Ａ－Ｈ－Ｋ／Ｒ－Ｇ－Ｌ－Ｇ－Ｒをさらに有する。
他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、保存されたアミノ酸配列Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｔ－Ｔ－Ａから変異した、変異アミノ酸配列モチーフＨ－Ｘ５－Ｔ－Ｇ－Ｘ６－Ｈ－Ａを有することができる。ここで、Ｘ５は、リジン及びグリシンからなる群から選択され、Ｘ６は、グリシン及びバリンからなる群から選択される、ＥＣ２．８．２．８内の天然スルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての変異である。変異アミノ酸配列モチーフＨ－Ｘ５－Ｔ－Ｇ－Ｘ６－Ｈ－Ａを有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素には、配列番号１３（上記）、並びに配列番号９、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４が含まれるが、これらに限定されない。さらなる態様において、Ｘ５はグリシンであり、Ｘ６はグリシンである。いくつかのなおさらなる態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＣ－Ｇ－Ｇ－Ｋ／Ｒ－Ｈ－Ｌ－Ｇ－Ｒをさらに有する。他のなおさらなる態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＦ－Ｅ－Ｈ－Ｓ－Ｇをさらに有する。
他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフＨ－Ｘ５－Ｔ－Ｇ－Ｘ６－Ｈ－Ａを含む改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいくつかで、Ｘ５はリジン及びグリシンからなる群から選択され、Ｘ６はグリシン及びバリンからなる群から選択される、ＥＣ２．８．２．８内の天然スルホトランスフェラーゼ酵素と比較しての変異である。さらなる態様において、Ｘ５はリジンであるように選択され、Ｘ６はバリンであるように選択され、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、変異アミノ酸配列モチーフＴ－Ｇ－Ｎ－Ｈをさらに有する。
さらに、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物で活性であると実験的に決定されている、６つの改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５）（以下の実施例３参照）を、多重配列アラインメントにおいてヒトグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列（エントリｓｐ｜Ｐ５２８４８｜ＮＤＳＴ１＿ＨＵＭＡＮ）と比較して、各酵素の間に変異間の関係があるかどうかを決定することができる。改変型酵素のアミノ酸配列内の期間は、特定の位置におけるヒトＮ－スルホトランスフェラーゼドメインとの同一性を示す。図１２に示すように、配列アラインメントは、６つのスルホトランスフェラーゼ配列内のアミノ酸残基の９０％超が同一であるが、複数のアミノ酸を選択することができるいくつかの位置があることを実証する。特定の理論に制限されるものではないが、これらの酵素は、ＥＣ２．８．２．８を含むＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインとして互いに同様の関係を有する。結果として、他の態様において、複数のアミノ酸を定義された位置において選択することができるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素を配列番号１８及び配列番号１９として開示する。アミノ酸の同一性が可能な残基の選択から選択できる位置は、「Ｘａａ」、「Ｘｎ」、又は「位置ｎ」という用語で示し、ｎは残基位置を指す。
他の態様において、配列番号１８又は配列番号１９のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素内で、４１位のアミノ酸残基はリジンであり、４４位のアミノ酸残基はアラニンであり、４５位のアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸残基、好ましくはチロシン又はフェニルアラニンであり、４９位のアミノ酸残基はヒスチジンである。他の態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素が４１～４９位の上記残基を有する場合、６７位のアミノ酸残基はグリシン又はヒスチジンであり、６８位のアミノ酸残基はグリシン、ヒスチジン、及びセリンからなる群から選択され、６９位のアミノ酸残基はセリンである。
他の態様において、配列番号１８又は配列番号１９のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素内で、４０位のアミノ酸残基はヒスチジンであり、４５位のアミノ酸残基はヒスチジンである。さらなる態様において、４１位のアミノ酸残基はグリシンであり、４４位のアミノ酸残基はグリシンである。他のさらなる態様において、４１位のアミノ酸残基はリジンであり、４４位のアミノ酸残基はバリンである。なおさらなる面において、６７位のアミノ酸残基はグリシンであり、６９位のアミノ酸残基はヒスチジンである。よりさらなる態様において、１０６位のアミノ酸残基は、トリプトファンである。なおよりさらなる態様において、２６０位のアミノ酸残基は、バリンである。
他の態様において、配列番号１８又は配列番号１９のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素内で、任意のそのような変異が酵素のグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ及び／又は硫酸アリール依存性活性を排除しない限り、アミノ酸配列は、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない残基位置に１つ以上の変異を任意に有することができる。他の態様において、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない位置での硫酸アリール依存性活性を排除しないそのような変異は、置換、欠失及び／又は付加を含むことができる。
したがって、他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、任意のアリール硫酸化合物と反応することができる。さらなる態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、ＭＵＳ、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなる群から選択される。いくつかのなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。他のなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。
改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ
自然界では、ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基受容体としてＮ－硫酸化されたヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、それと反応する。一般に、グルコサミニル残基の大部分はＮ－硫酸化されており、スルホ基は、ヘキスロン酸残基、一般にはグルクロン酸又はイズロン酸の２－Ｏ位に転移される。上記の野生型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼと同様に、野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と反応する際に、スルホ基を多糖に転移させる。しかしながら、野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．－酵素クラスのメンバーである。野生型ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって認識されるヘパロサン系多糖類は、典型的には、２つの異なる構造モチーフの少なくとも１つを有する。第１の非限定的な例では、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式ＩＶの構造を有する多糖類を認識し、結合し、それと反応することができる。
Figure 2022523638000015
別の非限定的な例では、天然ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式Ｖの構造を有する多糖類を認識し、結合し、それと反応することができる。
Figure 2022523638000016
どちらの場合においても、ヘキスロン酸残基（式ＩＶ中のグルクロン酸、式Ｖ中のイズロン酸）は、そうでなければ３－Ｏ及び６－Ｏ位で置換されていないＮ－硫酸化グルコサミン残基が両側に隣接している。野生型ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、及び式ＩＶ又は式Ｖの構造を有する多糖類とのそれらの生物活性は、Rong, J., et al., (2001) Biochemistry 40 (18): 5548-5555に記載され、この開示はその全体が参照により組み込まれる。
上記のように、酵素と反応するヘパロサン系多糖の部分は式ＩＶ又は式Ｖの構造を有するが、多糖内の他のグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化、Ｎ－アセチル化、３－Ｏ硫酸化、及び／又は６－Ｏ硫酸化されていてもよく、ヘキスロニル残基はグルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれもが２－Ｏ硫酸化されていてもよい。同様に、ヘパロサン系多糖類は、同じ多糖内に式ＩＶの構造及び／又は式Ｖの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有することができ、そのいずれもが同じ酵素によって２－Ｏ硫酸化することができる。典型的には、式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有するＮ－硫酸化ヘパロサン系多糖類は、少なくとも８個の単糖残基を有する。他の態様において、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．－内の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様に、ヘパロサン系多糖類、特にスルホ受容体として式ＩＶ及び式Ｖの構造を有するものと同じ生物活性を有する。
式ＩＶ又は式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖類中のヘキスロン酸残基の立体化学は、グルクロニルＣ５－エピメラーゼの存在によって制御することができ、これは、ヘキスロン酸残基のＣ５－炭素の立体化学を可逆的に反転させる。しかしながら、式ＩＶ又は式Ｖの構造を有する多糖内のヘキスロニル残基が２－Ｏ硫酸化されると、ヘキスロン酸残基はもはやエピマー化することができない。一般に、インビボでヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと反応することができるＮ－硫酸化多糖類は、ほぼ排他的にＮ－スルホグルコサミン及びグルクロン酸の二糖単位として合成される。これらのグルクロン酸残基の１つ以上は、しばしば、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応して２－Ｏ硫酸化イズロン酸残基を形成する前に、イズロン酸残基にエピマー化される。しかしながら、特定の理論に制限されるものではないが、野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、概して、式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖類と結合して反応することが好ましく、そしてインビボで産生されるほとんどのＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖類は一般に、２－Ｏ硫酸化イズロン酸を有すると考えられる。
３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と、式ＩＶの構造を有するヘパロサン系多糖との結合に成功すると、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する天然酵素は、グルクロン酸残基の２－Ｏ位へのスルホ基の転移を触媒し、下記式ＶＩの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ生成物を形成することができる。
Figure 2022523638000017
３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と、式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖との結合に成功すると、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有する天然酵素は、イズロン酸残基の２－Ｏ位へのスルホ基の転移を触媒し、下記式ＶＩＩの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ生成物を形成することができる。
Figure 2022523638000018
他の態様において、２－Ｏ硫酸化されるため、グルクロン酸又はイズロン酸残基は、式ＩＶ及び式Ｖに示すように、２つのＮ－硫酸化グルコサミン残基に隣接していなければならない。１つのそのような多糖の非限定的な例を図１３に示す。図１３において、多糖４０内のヘキスロニル残基１０は、それぞれ、Ｎ－硫酸化、Ｎ－アセチル化、又は非置換のいずれかであるグルコサミニル残基２０、２１、及び２２に隣接している。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと多糖４０を反応させると、２つのＮ－硫酸化グルコサミン残基２０に隣接するヘキスロニル残基１０のみが２－Ｏ硫酸化され、最終的に、生成多糖４１内に２－Ｏ硫酸化ヘキスロニル残基１１０を形成することができる。
別の非限定的な例において、式ＩＶ及び式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖類の部分を図１４、図１５、及び図１６の各々の多糖５０によって示す。図１４、図１５、及び図１６では、ヘキスロニル残基１０及びエピマー化ヘキスロニル残基３０は、多糖５０内の３つのＮ－スルホグルコサミニル残基２０の間で交互になっている。ヘキスロニル残基１０及び３０は椅子型配座で表されているが、より長いオリゴ糖鎖又は多糖鎖内のそのような単糖残基は、椅子型、半椅子型、ボート型、スキュー型、及びスキュー舟型配座を含むいくつかの異なる立体配座をとることができ、それらのさらなる立体配座は、明確化のために省略されていることを、当業者は理解することができる。
他の態様において、改変型硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と多糖５０を反応させると、酵素は、生成多糖５１内に硫酸化ヘキスロニル残基１１０を形成するためのヘキスロニル残基１０へのスルホ基転移（図１４）、生成物多糖５２内に硫酸化エピマー化ヘキスロニル残基１３０を形成するためのエピマー化ヘキスロニル残基３０へのスルホ基転移（図１５）、又は生成物多糖５３内に硫酸化ヘキスロニル残基１１０及び硫酸化エピマー化ヘキスロニル残基１３０をそれぞれ形成するためのヘキスロニル残基１０及びエピマー化ヘキスロニル残基３０の両方へのスルホ基転移（図１６）を触媒することができる。
ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは一般に、およそ３２５～３７５個のアミノ酸残基を有し、場合によってはそれらの配列が大きく異なるが、最終的には全く同じ機能を有し、すなわち、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸から、特に式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有するものであるヘパロサン系多糖類内のヘキスロニル残基の２－Ｏ位へのスルホ基の転移を触媒する。特定の理論に制限されるものではないが、ＥＣ２．８．２－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼの各々は、全ての種にわたって同一又は高度に保存されたかのいずれかである複数のアミノ酸配列モチーフ及び二次構造が存在するので、同じ化学反応を触媒することができると考えられる。
さらに、保存されたアミノ酸配列モチーフのいくつかは、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及び／又は多糖のいずれかの結合に直接関与するか、又は化学反応自体に関与すると考えられる。天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素間の同一性は、活性部位内のアミノ酸残基が同定されている既知の結晶構造（ＰＤＢコード：３Ｆ５Ｆ及び４ＮＤＺ）を有する、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を、ＥＣ２．８．２．－内の他のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによって実証することができる。ニワトリ、ヒト、及び他の真核生物のＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を含む１２種類の酵素の多重配列アラインメントを、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ参照配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ７６ＫＢ１）と比較してのパーセント同一性と共に、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄに示す。図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄに例示するように、配列は、ヨコシマガラガラヘビのヘキスロニル２－ＯスルホトランスフェラーゼについてはＱ７６ＫＢ１参照配列（エントリｔｒ｜Ｔ１ＤＭＶ２｜Ｔ１ＤＭＶ２＿ＣＲＯＨＤ）と９４．９％の配列同一性を有するものから、ブラウンイヤーマダニ（brown ear tick）のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼについては最低で５６．３％の配列同一性（エントリｔｒ｜Ａ０Ａ１３１Ｚ２Ｔ４｜Ａ０Ａ１３１Ｚ２Ｔ４＿ＲＨＩＡＰ）までの範囲である。ヒト酵素（エントリｓｐ｜Ｑ７ＬＧＡ３｜ＨＳ２ＳＴ＿ＨＵＭＡＮ）は、Ｑ７６ＫＢ１参照配列と９４．１％の配列同一性を有する。当業者は、多重配列アラインメントが明確化のために１２配列に限定されており、同定され、高度に保存された活性部位及び／又は結合領域も有する天然ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする数百のアミノ酸配列が存在することを理解するであろう。
図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄにおいて、特定の位置で黒背景に白色で示すアミノ酸は、全ての配列にわたって１００％同一である。特定の位置で、アミノ酸が同一であること、又は化学的若しくは構造的に類似していることのいずれかを意味する、高度に保存されているアミノ酸は、黒い縁取りで囲まれている。高度に保存された領域内では、配列の大部分に存在するコンセンサスアミノ酸は太字である。同一でないか又は高度に保存されていない特定の位置のアミノ酸は、典型的には可変である。配列内の期間は、高度に保存された又は同一の領域の間にさらなる残基を有する他の配列（複数可）との配列アラインメントを容易にするために、配列に挿入されたギャップを示す。最後に、各配列ブロックの上には、アラインメント内のアミノ酸の同一性に基づいて、天然ニワトリＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の構造を参照として使用し、全ての配列にわたり保存されている二次構造を示す一連の矢印及びコイルがある。矢印に隣接するβ記号はβシートを指し、α記号又はη記号に隣接するコイルは螺旋二次構造を指す。
図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄの１２個の整列した配列内には、上記のニワトリＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の結晶構造に基づいて、活性部位を有する１つ以上のアミノ酸を有するいくつかの保存されたアミノ酸モチーフが存在する。図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄ内のアミノ酸残基の番号付けに基づいて、これらのモチーフは、残基１２～１９（Ｒ－Ｖ－Ｐ－Ｋ－Ｔ－Ａ／Ｇ－Ｓ－Ｔ）、残基４０～４４（Ｎ－Ｔ－Ｓ／Ｔ－Ｋ－Ｎ）、残基７１～７４（Ｙ－Ｈ－Ｇ－Ｈ）、残基１０８～１１５（Ｆ－Ｌ－Ｒ－Ｆ／Ｈ－Ｇ－Ｄ／Ｎ－Ｆ／Ｙ）、残基１２１～１２５（Ｒ－Ｒ－Ｋ／Ｒ－Ｑ－Ｇ）、及び残基２１７～２２２（Ｓ－Ｈ－Ｌ－Ｒ－Ｋ／Ｒ－Ｔ）を含む。特定の理論に制限されるものではないが、これらの残基は、化学反応を促進するか若しくはそれに関与するか、又は活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸若しくは多糖の結合を可能にするかのいずれかであると考えられる。特に、図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図１８Ｃに示すように、７４位のヒスチジン残基は多糖内のイズロン酸残基の２－Ｏ位からプロトンを引き抜き、求核攻撃及び３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸からのスルホ基の除去を可能にする一方、１５位のリジン残基は３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸のリン酸部分と配位して、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物が活性部位から放出される前に酵素の遷移状態を安定化させる。
しかしながら、上記のように、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物から多糖への硫酸基の転移を触媒することができない。天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼと同様に、天然スルホトランスフェラーゼの活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合ポケットは、結合を促進するのに充分に高い硫酸アリール化合物に対する親和性を有していないか、及び／又はアリール硫酸化合物が活性部位に入るのを立体的に妨げられているかのいずれかと考えられる。その結果、及び他の態様において、ＥＣ２．８．２．－内の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を、そのアミノ酸配列内のいくつかの位置で変異させて、活性部位内のアリール硫酸化合物の結合を可能にするか、及び／又は多糖類への硫酸基の転移が起こることができるようにアリール硫酸化合物を最適に配置することができる。
したがって、他の態様において、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄに例示するアミノ酸配列を有する酵素を含む、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の変異体であってもよい。
他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼのアミノ酸配列に操作された変異は、アリール硫酸化合物がスルホ基供与体として酵素に結合及び反応することができる生物活性を促進する。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合して反応することができるが、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の生物活性を、Ｎ－硫酸化された、特にスルホ基受容体としての式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有するものであるヘパロサン系多糖類と共に保持することができる。特定の理論に制限されるものではないが、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に挿入された変異のために、それらのスルホトランスフェラーゼ活性は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がアリール硫酸化合物で置換されていることを除いて、上記図１８Ａ～図１８Ｃに記載されているのと同様の機構を用いる、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルフリル基の直接転移を有することができると考えられる。そうでなければ、変異のために、スルホトランスフェラーゼ活性は、アリール硫酸化合物の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成、続いてＮ，２Ｏ－ＨＳ生成物を形成するためのヘキスロン酸残基の２－Ｏ位の酸素原子によるスルホヒスチジン中間体の求核攻撃を有する、２工程のプロセスを有することができると考えられる。いずれの機構によっても、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、実施例に後述するように、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルホ転移を達成することができる。
他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、上述のように、図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄの多重配列アラインメントに示すように、ＥＣ２．８．２．－内の天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存アミノ酸配列モチーフと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型酵素のアミノ酸配列に存在する各変異アミノ酸配列モチーフは、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、１つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、２つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、３つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、４つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、５つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、６つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、ＥＣ２．８．２．－内の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して少なくとも１つの変異アミノ酸配列モチーフを有する、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
他の態様において、三次元分子視覚化システム（非限定的な例として、オープンソースソフトウェアであるＰｙＭＯＬ）においてニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ（ＰＤＢコード：３Ｆ５Ｆ）の結晶構造を見ると、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列と比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを含有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の配列などの関連配列の構造を、図１９に示す比較のためのモデル化をすることができる。図１９は、配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する２つの改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素で重ね合わされた、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位の拡大図を示し、ここで、改変型酵素の構造は、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列と比較して変異を作製した際に計算される。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がスルホ供与体であり、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと共結晶化したスルホ転移反応の生成物である、アデノシン３’，５’－二リン酸もまた、活性部位内に示されている。天然の基質、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸中に存在するであろう硫酸基は、反応を開始する前の活性部位内のそのおおよその位置を示すために、５’－ホスフェート官能基上にモデル化される。ＮＣＳはまた、そのような解が可能である場合、多糖結合部位（図示せず）に隣接する酵素活性部位内のリガンドの最適化された位置及び配向を計算するように設計された分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの共通解を使用して、改変型酵素の活性部位にモデル化される。水素原子は示されていない。
図１９に示すように、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼに関して、配列番号６３及び配列番号６５と比較して行われたいくつかの変異があるが、それぞれのタンパク質骨格は互いにほぼ同一の位置にあり、活性部位の一対一比較を可能にする。２つの活性部位を比較すると、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸はバックグラウンドに位置し、リジン残基に隣接している（図１７ＡのＱ７６ＫＢ１配列の１５位）一方、上記のＭＤシミュレーションからの収束解は、改変型酵素内のＮＣＳ結合が活性部位の反対側で有利であることを示している。しかしながら、ＮＣＳの結合は、天然酵素において、リジン残基及び近傍のαヘリックス上に位置するフェニルアラニン残基（図１７ＢのＱ７６ＫＢ１配列の１０８位）によって、部分的に立体障害されるであろう。特定の理論に制限されるものではないが、配列番号６３のアミノ酸配列を有する改変型酵素の活性部位におけるＮＣＳの結合は、リジン残基のヒスチジン残基への変異によって促進され、これにより活性部位内にさらなる空間が形成され、ＮＣＳ内の芳香環にπ－πスタッキングパートナが提供されるものと考えられる。また、特定の理論に制限されるものではないが、配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型酵素の活性部位におけるＮＣＳの結合は、ヒスチジン残基にへのプロリン残基（図１７ＡのＱ７６ＫＢ１配列の１４位）の隣接変異と協調した、アルギニン残基へのリジンの変異によって促進されるものと考えられる。アルギニン側鎖の立体配座自由度数の増加は、転移反応中に遷移状態を安定化するための極性接触を提供する位置に依然としてありながら、ＮＣＳの進入を容易にする一方、隣接するヒスチジンはＮＣＳのための他の結合接点を提供する。
注目すべき別の変異には、アルギニン残基（図１７ＣのＱ７６ＫＢ１配列の２２０位）からヒスチジン残基への変異、配列番号６３及び配列番号６５の両方において２２１位で見られる変異が含まれる。特定の理論に制限されるものではないが、変異ヒスチジン残基は、ＮＣＳからの硫酸基の除去を容易にするための好ましい位置にある。ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素からの他の図示された変異、特に配列番号６５に存在する変異（Ｈｉｓ－２０、Ｓｅｒ－１１４、Ｌｙｓ－１１６、Ｍｅｔ－１２２）は、ＮＣＳ（Ｈｉｓ－２０）内の硫酸部分と接触する直接結合接点を提供することによって、他の変異残基（Ｈｉｓ－２２１と配位するＳｅｒ－１１４）と配位することによって、又はＮＣＳ（Ｍｅｔ－１２２）付近の疎水性環境を増加させることによってのいずれかで、活性部位内のＮＣＳの結合を同様に促進し得る。
当業者は、配列番号６８及び配列番号６９によって開示するものを含むが、これらに限定されない、任意の他のアミノ酸配列の遺伝子改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ、並びに配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様の構造を示す可能性が高いことを理解するであろう。特定の理論に制限されるものではないが、ＰＮＳは、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかの活性部位内のＮＣＳと同様の位置で結合すると考えられる。これは、２つのアリール硫酸化合物の構造が、硫酸基はＰＮＳのニトロ基に対してパラではなく、むしろＮＣＳのニトロ基に対して芳香環上のオルトに位置することを除いて、非常に類似しているからである。
したがって、他の態様において、本発明の改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素は、任意のアリール硫酸化合物と反応することができる。さらなる態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、ＭＵＳ、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２－ナフチル硫酸、及びＮＣＳからなる群から選択される。いくつかのなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。他のなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。
他の態様において、任意の天然又は改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素、特に配列番号６３、配列番号６５、配列番号６８、又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を有する反応混合物内で、反応混合物は、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物の形成を触媒するグルクロニルＣ５－エピメラーゼをさらに有することができる。ある態様において、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物は、式ＶＩの構造を有することができる。他の態様において、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物は、式ＶＩＩの構造を有することができる。他の態様において、グルクロニルＣ５－エピメラーゼは、配列番号６７のアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、グルクロニルＣ５－エピメラーゼは、配列番号６７の残基３４～６１７を有することができる。
改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ
自然界では、ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基受容体としてＮ－、２－Ｏ硫酸化ヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応する。さらに、隣接するいずれかのヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸のいずれかとすることができ、場合により、２－Ｏ硫酸化することができる。典型的には、６－Ｏスルホ基を受けるグルコサミン残基の非還元末端のヘキスロン酸は、２－Ｏ硫酸化イズロン酸であり、多くの場合、グルコサミン残基自体もまたＮ－硫酸化されている。天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ及びヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様に、野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と反応すると、スルホ基を多糖に転移させる。野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様に、野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素もまた、ＥＣ２．８．２．－酵素クラスのメンバーである。非限定的な例では、ＥＣ２．８．２．－内のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式ＶＩＩＩ（式中、６－Ｏスルホ基を受容するグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化されており、その非還元末端で２－Ｏ硫酸化イズロン酸残基に隣接しており、Ｘは式ＶＩＩＩに示すヘキスロニル残基のいずれかを有する）の構造を有するヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応させることができる。式ＶＩＩＩの構造を有するものだがこれに限定されないＮ－、２－Ｏ硫酸化ヘパロサン系多糖類と生物活性を有するＥＣ２．８．２．－内のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、Xu, Y., et al., (2017) ACS Chem. Biol. 12 (1): 73-82及びHolmborn, K., et al., (2004) J. Biol. Chem. 279, (41): 42355-42358によって記載され、これらの開示はその全体が参照により組み込まれる。
Figure 2022523638000019
上記のように、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応するヘパロサン系多糖の部分は式ＶＩＩＩ構造を有することができるが、多糖内の他のグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化、Ｎ－アセチル化、３－Ｏ硫酸化、及び／又は６－Ｏ硫酸化されていてもよく、ヘキスロニル残基はグルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれもが２－Ｏ硫酸化されていてもよい。上記の他の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素と同様に、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、同じ多糖分子内の複数のグルコサミン残基にスルホ基を転移させることができ、同じ多糖分子内の複数のグルコサミン残基は、同じポリペプチドによって６－Ｏ硫酸化することができる。典型的には、式ＶＩＩＩの構造を有するものを含む、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応することができるヘパロサン系多糖類は、少なくとも３つの単糖残基を有することができる。他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ヘパロサン系スルホ受容体多糖類、特に、ＥＣ２．８．２．－内の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼとして式ＶＩＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖類と同じ生物活性を有することができる。
３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と、式ＶＩＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖との結合に成功すると、野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、グルコサミン残基の６－Ｏ位へのスルホ基の転移を触媒して、下記式ＩＸ（式中、Ｘは、式ＩＸに示すヘキスロニル残基のいずれかを有する）の構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成することができる。
Figure 2022523638000020
他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ、及び改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ（以下でさらに詳述する）によって、スルホ基受容体として認識されるヘパロサン系多糖類を含む、本明細書に記載の任意のヘパロサン系多糖類と結合して反応することができる。他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、式ＩＸの構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成するために、式ＶＩＩＩの構造を有するヘパロサン系多糖類に結合して反応することができる。スルホ基受容体としての改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応することができる１つのそのようなヘパロサン系多糖の非限定的な例を図２０に示す。図２０は、アセチル基２１１又は硫酸基２１２のいずれかでＮ－置換することができる３つのＮ－置換グルコサミン残基２１０を含む、多糖２４０を示す。多糖２４０内で、スルホ受容体として作用することができるＮ－置換グルコサミン残基２１０は、２つのヘキスロニル残基に隣接している。ヘキスロニル残基は、式ＶＩＩＩの官能基「Ｘ」によって表される任意の残基、特にグルクロニル残基２２０及びイズロニル（iduronyl）残基２３０を含むことができる。グルクロニル残基２２０又はイズロニル残基２３０のいずれかは、２－Ｏ位で硫酸基２３１によってさらに置換することができる。多糖２４０を改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素及びスルホ基供与体と反応させると、グルコサミン残基２１０のいずれかの６－Ｏ位２１３を硫酸化し、最終的に生成多糖２４１内に６－Ｏ硫酸化グルコサミン残基３１０を形成することができる。
ＥＣ２．８．２．－内の天然のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は一般に、それらの配列においていくつかの場合に大きく変動し得るおよそ３００～７００個のアミノ酸残基を有するが、最終的には全く同じ機能、すなわち、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸から、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ多糖類、特に式ＶＩＩＩの構造を有する多糖類内のグルコサミン残基の６－Ｏ位へのスルフリル基の転移を触媒する機能を有する。特定の理論に制限されるものではないが、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼの各々は、全ての種にわたって同一又は高度のいずれかで保存されている複数のアミノ酸配列モチーフ及び二次構造があるため、同じ化学反応を触媒することができると考えられる。
さらに、保存されたアミノ酸配列モチーフのいくつかは、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及び／又は多糖のいずれかの結合に直接関与するか、又は化学反応自体に関与すると考えられる。天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素間の同一性は、活性部位内のアミノ酸残基が同定されている既知の結晶構造（ＰＤＢコード：５Ｔ０３、５Ｔ０５、及び５Ｔ０Ａ）を有する、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼアイソフォーム３－Ｂ酵素のアミノ酸配列を、ＥＣ２．８．２．－内の他の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによって実証することができる。１５個の酵素の多重配列アラインメントを、マウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ（アイソフォーム１）参照配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ９ＱＹＫ５）と比較しての各配列のパーセント同一性と共に、図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示す。図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示すように、配列は、Ｑ９ＱＹＫ５参照配列（エントリＯ６０２４３｜Ｈ６ＳＴ１＿ＨＵＭＡＮ）との９７．３％の同一性から、最低で５３．７％の同一性（エントリＡ０Ａ３Ｐ８Ｗ３Ｍ９｜Ａ０Ａ３Ｐ８Ｗ３Ｍ９＿ＣＹＳＮＥ）までの範囲である。比較のために、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼアイソフォーム３－Ｂ酵素（エントリＡ０ＭＧＺ７｜Ｈ６Ｓ３Ｂ＿ＤＡＮＲＥ）は、Ｑ９ＱＹＫ５参照配列と６０．４％の配列同一性を有する。当業者は、多重配列アラインメントは明確化のために１５配列に限定されており、同定され、高度に保存された活性部位及び／又は結合領域も有する天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする数百のアミノ酸配列が存在することを理解するであろう。
図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃにおいて、特定の位置で黒背景に白色で示すアミノ酸は、全ての配列にわたって１００％同一である。特定の位置で、アミノ酸が同一であること、又は化学的若しくは構造的に類似していることのいずれかを意味する、高度に保存されているアミノ酸は、黒い縁取りで囲まれている。高度に保存された領域内では、配列の大部分に存在するコンセンサスアミノ酸は太字である。同一でないか又は高度に保存されていない特定の位置のアミノ酸は、典型的には可変である。配列内の期間は、高度に保存された又は同一の領域の間にさらなる残基を有する他の配列（複数可）との配列アラインメントを容易にするために、配列に挿入されたギャップを示す。最後に、各配列ブロックの上には、アラインメント内のアミノ酸の同一性に基づいて、天然ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の構造を参照として使用して、全ての配列にわたり保存されている二次構造を示す一連の矢印及びコイルがある。矢印に隣接するβ記号はβシートを指し、α記号に隣接するコイルは螺旋二次構造を指す。図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示す１５個の整列された配列の各々は、本発明の改変型酵素、特に配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有するものと一致するように、それらの天然の全長配列に対して切断されている。特に、図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示す残基は、マウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のＱ９ＱＹＫ５参照配列の残基６７～３７７と整列されている。
図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃの１５個の整列した配列内には、上記のゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（エントリＡ０ＭＧＺ７｜Ｈ６Ｓ３Ｂ＿ＤＡＮＲＥ）の結晶構造に基づいて、活性部位を有する１つ以上のアミノ酸を含む、いくつかの保存されたアミノ酸配列モチーフが存在する。図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃ内のアミノ酸残基の番号付けに基づいて、これらの保存されたアミノ酸配列モチーフは、アミノ酸残基２９～３４（Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｔ）；８１～８６（Ｃ－Ｇ－Ｌ－Ｈ－Ａ－Ｄ）；１２７～１３９（Ｓ－Ｅ－Ｗ－Ｒ／Ｋ－Ｈ－Ｖ－Ｑ－Ｒ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｗ－Ｋ）；１７８～１８４（Ｎ－Ｌ－Ａ－Ｎ－Ｎ－Ｒ－Ｑ）；及び２２７～２３１（Ｌ－Ｔ－Ｅ－Ｆ／Ｙ－Ｑ）を含む。特に、図２２Ａ、図２２Ｂ、及び図２２Ｃに示すように、Ｃ－Ｇ－Ｌ－Ｈ－Ａ－Ｄ保存アミノ酸配列モチーフ内のヒスチジン残基は、Ｎ－スルホグルコサミン残基の６’－ヒドロキシル基から水素原子を引き抜く位置にあり、負に荷電した酸素原子が次いで３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の求核攻撃を開始し、硫酸基を除去することを可能にする。さらに、Ｑ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｔ保存アミノ酸配列モチーフ内の普遍的に保存されたリジン残基は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸中の５’－リン酸と配位するが、１３１位及び１３８位の普遍的に保存されたヒスチジン残基及びトリプトファン残基は、Ｎ－スルホグルコサミン残基と配位する（上記のXu, Y., et al.を参照のこと）。
しかしながら、上記のように、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物から多糖への硫酸基の転移を触媒することができない。特定の理論に制限されるものではないが、上記の天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ及びヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様に、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼの活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合ポケットは、結合を促進するのに充分に高い硫酸アリール化合物に対する親和性を有していないか、及び／又はアリール硫酸化合物が活性部位に入るのを立体的に妨げられているかのいずれかと考えられる。その結果、及び他の態様において、ＥＣ２．８．２．－内の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を、そのアミノ酸配列内のいくつかの位置で変異させて、活性部位内のアリール硫酸化合物の結合を可能にするか、及び／又は多糖への硫酸基の転移が起こることができるようにアリール硫酸化合物を最適に配置することができる。
したがって、他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、図２１Ａ、図２１Ｂ及び図２１Ｃに例示するアミノ酸配列を有する酵素を含む、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の変異体であってもよい。
他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に操作された変異は、アリール硫酸化合物がスルホ基供与体として酵素に結合及び反応することができる生物活性を促進する。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合して反応することができるが、スルホ基受容体としての式ＶＩＩＩの構造を有するものを含むがこれに限定されないＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖類との天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の生物活性を保持することができる。特定の理論に制限されるものではないが、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に挿入された変異のために、それらのスルホトランスフェラーゼ活性は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がアリール硫酸化合物で置換されていることを除いて、上記の図２２Ａ～図２２Ｃに記載されているのと同様の機構を用いる、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルフリル基の直接転移を有することができると考えられる。そうでなければ、変異のために、スルホトランスフェラーゼ活性は、アリール硫酸化合物の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成、続いて６－Ｏ硫酸化ＨＳ生成物を形成するためのグルコサミン残基の６－Ｏ位の酸素原子によるスルホヒスチジン中間体の求核攻撃を含む、２工程のプロセスを有することができると考えられる。他の態様において、スルホ転移機構のいずれかの６－Ｏ硫酸化ＨＳ生成物は、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物である。本発明の改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、実施例で後述するように、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルホ基転移を達成することができる。
他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、上述のように、図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃの多重配列アラインメントに示すように、ＥＣ２．８．２．－内の天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存アミノ酸配列モチーフと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型酵素のアミノ酸配列に存在する各変異アミノ酸配列モチーフは、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を有する。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、１つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、２つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、３つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、４つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、５つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、ＥＣ２．８．２．－内の野生型ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して少なくとも１つの変異アミノ酸配列モチーフを含む、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
他の態様において、三次元分子視覚化システム（非限定的な例として、オープンソースソフトウェアであるＰｙＭＯＬ）においてゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ａ０ＭＧＺ７）の結晶構造のいずれかを見ると、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ構造のいずれかと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを含有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の配列などの関連配列の構造を、図２３に示す比較のためにモデル化することができる。図２３は、配列番号１０８のアミノ酸配列を有する本発明の改変型酵素の１つを有するゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（ＰＤＢコード：５Ｔ０３）の活性部位の拡大図を示し、ここで、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の構造は、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼアミノ酸配列と比較して変異を生成した際に計算される。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がスルホ供与体であり、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼと共結晶化したスルホ転移反応の生成物である、アデノシン３’，５’－二リン酸もまた、活性部位内に示されている。ＰＮＳはまた、そのような解が可能である場合、多糖結合部位（図示せず）に隣接する酵素活性部位内のリガンドの最適化された位置及び配向を計算するように設計された分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの共通解を使用して、改変型酵素の活性部位にモデル化される。水素原子は、明確化のために示されていない。
図２３に示すように、ゼブラフィッシュグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に関して、配列番号１０８を作製したいくつかの変異があるが、それぞれのタンパク質骨格は互いにほぼ同一の位置にあり、活性部位の一対一比較を可能にする。しかしながら、２つの活性部位を比較すると、上記のＭＤシミュレーションからの収束解によって決定されるように、アデノシン３’，５’－二リン酸生成物は、ＰＮＳ分子としての中心αヘリックスの反対側に位置する。特定の理論に制限されるものではないが、収束ＭＤシミュレーション解は、ゼブラフィッシュ酵素内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と同じ又は類似の位置のＰＮＳに対する親和性が充分ではないため、αヘリックスの反対側にＰＮＳを配置すると考えられる。上記Xu, Y., et al.に記載されるように、全長アミノ酸配列の１５８位の保存されたヒスチジンは、Ｎ－スルホグルコサミンの６’ヒドロキシル基からプロトンを引き抜く触媒ヒスチジンであり、これはその後、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と反応してスルホ基転移を開始することができる。しかし、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及びＰＮＳの結合ポケットの明らかな違いにもかかわらず、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は全て、実施例で後述するように、ヘパロサン系多糖内の１つ以上のグルコサミン残基の６－Ｏ位へのアリール硫酸化合物からのスルホ基転移を達成した。
結果として、特定の理論に制限されるものではないが、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の活性部位内に存在する１つ以上の変異は、スルホ受容体ＨＳ多糖類に転移することができる位置で、アリール硫酸化合物の硫酸部分の結合を補助し得る。図２３に示すように、改変型酵素は配列番号１０８のアミノ酸配列を有し、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。しかしながら、ヘパロサン系多糖は図示していない。非限定的な例では、配列番号１０８の３１位に操作されたヒスチジン残基は、上記Malojcic, et alに記載された機構と同様のピンポン機構を使用して、ＰＮＳからの硫酸基の除去を容易にする位置にあり得る。さらに、配列番号１０８の１３３位に操作されたヒスチジン残基は、配列番号１０８の１３２位の保存されたヒスチジン（図２１Ｂの各配列の１３１位に対応する）と共に硫酸部分とさらに配位し得る。配列番号２２の１３７位～１３９位でのＧ－Ａ－Ｎへの変異（図２１Ｂの配列の１３６位～１３８位での保存されたＡ－Ｔ－Ｗモチーフに対応）は、配列番号１０８の３１位で操作されたヒスチジンによって硫酸が引き抜かれ得る位置でのＰＮＳの結合を妨げ得る立体容積を除去する。Ａ－Ｔ－Ｗを含有するループ内のＧ－Ａ－Ｎへの変異はまた、ループをＰＮＳから遠ざけるようにし、これはＰＮＳがその結合ポケットに到達するのをさらに補助し得る。最後に、上記の全長ゼブラフィッシュグルコサミニル６－ＯスルホトランスフェラーゼのＨｉｓ－１５８に対応する天然ヒスチジンに直接隣接する、配列番号１０８の８４位に操作されたセリン残基は、さらなる水素結合接点を形成して、ゼブラフィッシュ酵素のスルホ受容体多糖との天然の活性の保持における改変型酵素を補助することができる。
当業者は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２によって開示するものを含むがこれらに限定されない任意の他のアミノ酸配列の、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、特に活性部位内で同様の構造モチーフを示すことを理解するであろう。特定の理論に制限されるものではないが、ＮＣＳは、改変型酵素のいずれかの活性部位内のＰＮＳと同様の位置で結合すると考えられる。これは、２つのアリール硫酸化合物の構造が、硫酸基はニトロ基に対してパラではなく、むしろニトロ基に対して芳香環上のオルトに位置することを除いて、非常に類似しているからである。
他の態様において、本発明の方法に従って利用することができる改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができ、これは、図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃの多重配列アラインメントにおいて示す保存されたアミノ酸配列モチーフを、非限定的な例として、図２３に示す酵素を含むがこれらに限定されない野生型酵素及び／又はモデル化された改変型酵素の既知の構造と比較することによって部分的に決定することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内に有することができる変異アミノ酸配列モチーフは、（ａ）Ｇ－Ｈ－Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｔ；（ｂ）Ｃ－Ｇ－Ｘ１－Ｘ２－Ａ－Ｄ（式中、Ｘ１はトレオニン及びセリンからなる群から選択され、Ｘ２はアスパラギン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択される）；（ｃ）Ｘ３－Ｘ４－Ｗ－Ｒ－Ｈ－Ｘ５－Ｑ－Ｒ－Ｇ－Ｇ－Ｘ６－Ｎ－Ｋ（式中、Ｘ３はセリン及びグリシンからなる群から選択され、Ｘ４はグリシン及びヒスチジンからなる群から選択され、Ｘ５はヒスチジン及びトレオニンからなる群から選択され、Ｘ－６はアラニン及びトレオニンからなる群から選択される）；及び（ｄ）Ｎ－Ｌ－Ｘ７－Ｎ－Ｎ－Ｒ－Ｑ（式中、Ｘ７はアラニン及びグリシンからなる群から選択される）；（これらの任意の組合せ含む）からなる群から選択することができる。変異アミノ酸配列モチーフの各々は上記図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示す保存アミノ酸モチーフに対応する：配列モチーフ（ａ）は保存アミノ酸配列モチーフＱ－Ｋ－Ｔ－Ｇ－Ｇ－Ｔに対応する；変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）は保存アミノ酸配列モチーフＣ－Ｇ－Ｌ－Ｈ－Ａ－Ｄに対応する；変異アミノ酸配列モチーフ（ｃ）は保存アミノ酸配列モチーフＳ－Ｅ－Ｗ－（Ｒ／Ｋ）－Ｈ－Ｖ－Ｑ－Ｒ－Ｇ－Ａ－Ｔ－Ｗ－Ｋに対応する；変異アミノ酸配列モチーフ（ｄ）は保存アミノ酸配列モチーフＮ－Ｌ－Ａ－Ｎ－Ｒ－Ｑに対応する。他の態様において、上記の少なくとも１つの変異アミノ酸配列モチーフを有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択することができる。
他の態様において、また非限定的な一例では、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、同じアミノ酸配列内に変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）を有することができる。変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）を含む改変型酵素は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２のアミノ酸配列を有する酵素を含むが、これらに限定されない。他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）を含む改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の各々は、図２３に示すように、配列番号１０８と同様の活性部位を有する。別の理論に限定されるものではないが、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）内に含まれる変異のいくつかは、これらに限定されないが、スルホトランスフェラーゼ活性中に以下の１つ以上の機能を有すると考えられる：結合ポケットのサイズを減少させることによって活性部位に対するアリール硫酸化合物の親和性を増加させること、ポケットの疎水性を増加させること、極性若しくは水素結合接点を除去又は作成すること、及び／又はアリール硫酸化合物の芳香族部分とのπ－π相互作用を作成すること、化学反応中の酵素の遷移状態を安定化させること、並びに／又は化学反応自体に関与すること。
他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、Ｘ４はグリシンであり、Ｘ５はヒスチジンである。他の態様において、Ｘ４はヒスチジンであり、Ｘ５はトレオニンである。
他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）及び（ｃ）を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、Ｘ３はセリンであり、Ｘ６はアラニンであり、Ｘ７はグリシンである。他の態様において、Ｘ３はグリシンであり、Ｘ６はトレオニンであり、Ｘ７はアラニンである。
さらに、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物で活性スルホトランスフェラーゼであると実験的に決定された３つの改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８）（以下の実施例５参照）を、多重配列アラインメントでマウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（エントリＱ９ＱＹＫ５｜Ｈ６ＳＴ１＿ＭＯＵＳＥ）と比較して、各酵素の間に変異間の関係があるかどうかを決定することができる。改変型酵素のアミノ酸配列内の期間は、特定の位置におけるマウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素との同一性を示す。図２４に示すように、配列アラインメントは、３つのスルホトランスフェラーゼ配列内のアミノ酸残基の９０％超が同一であるが、複数のアミノ酸を選択することができるいくつかの位置があることを実証する。特定の理論に制限されるものではないが、これらの酵素は、ＥＣ２．８．２．－を含むグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素として互いに同様の関係を有する。結果として、他の態様において、複数のアミノ酸を定義された位置において選択することができるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を配列番号１１２及び配列番号１１３として開示する。アミノ酸の同一性が可能な残基の選択から選択できる位置は、「Ｘａａ」、「Ｘｎ」、又は「位置ｎ」という用語で示し、ｎは残基位置を指す。
他の態様において、配列番号１１２内で、「Ｘａａ」という名称を有する残基は、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列内の特定の位置において同一性を欠く、公知の例を示す。他の態様において、アミノ酸配列、配列番号１１３はまた、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列内の特定の位置に同一性の欠如がある既知の例を示すが、配列番号１１３は、ＥＣ２．８．２．－内のいくつかの天然の全長グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のＮ末端残基１～６６及びＣ末端残基３７８～４１１をさらに有し、非限定的な例として、マウス、ヒト、及びブタのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を含む。対照的に、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、及び配列番号１１２のアミノ酸残基は、ＥＣ２．８．２．－内のいくつかの全長グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の残基６７～３７７に対応し、非限定的な例として、マウス、ヒト、及びブタのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を含む。タンパク質発現を促進するために、Ｎ末端メチオニン残基を、マウス、ヒト、及びブタのグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の残基６７～３７７に対して、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、及び配列番号１１２のアミノ酸配列のそれぞれに付加した。
他の態様において、得られた酵素がスルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と反応したときにグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を維持する限り、配列番号１１２又は配列番号１１３のアミノ酸配列によって定義されるＸａａ残基に対して、任意の選択を行うことができる。
他の態様において、配列番号１１２のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１２９位のアミノ酸残基はグリシンであり、１３３位のアミノ酸残基はヒスチジンである。他の態様において、配列番号１１２のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１２９位のアミノ酸残基はヒスチジンであり、１３３位のアミノ酸残基はトレオニンである。他の態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１９４位のアミノ酸残基はグリシンであり、１９８位のアミノ酸残基はヒスチジンである。他の態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１９４位のアミノ酸残基はヒスチジンであり、１９８位のアミノ酸残基はトレオニンである。
他の態様において、配列番号１１２のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１２８位のアミノ酸残基はセリンであり、１３８位のアミノ酸残基はアラニンであり、１８１位のアミノ酸残基はグリシンである。他の態様において、配列番号１１２のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１２８位のアミノ酸残基はグリシンであり、１３８位のアミノ酸残基はトレオニンであり、１８１位のアミノ酸残基はアラニンである。他の態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１９３位のアミノ酸残基はセリンであり、２０３位のアミノ酸残基はアラニンであり、２４６位のアミノ酸残基はグリシンである。他の態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１９３位のアミノ酸残基はグリシンであり、２０３位のアミノ酸残基はトレオニンであり、２４６位のアミノ酸残基はアラニンである。
他の態様において、配列番号１１２又は配列番号１１３のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、任意のそのような変異が酵素のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ及び／又は硫酸アリール依存性活性を排除しない限り、アミノ酸配列は、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない残基位置に１つ以上の変異を任意に有することができる。他の態様において、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない位置での硫酸アリール依存性活性を排除しないそのような変異は、置換、欠失及び／又は付加を有することができる。
したがって、他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２のアミノ酸配列を有する、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素。さらなる態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなる群から選択される。いくつかのなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。他のなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。
改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ
自然界では、ＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、一般に、スルホ基受容体としてのＮ，２Ｏ－ＨＳ及びＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳヘパロサン系多糖類を認識し、結合し、反応する。一般に、３－Ｏ位でスルホ基を受容するグルコサミン残基はＮ－硫酸化されており、場合により、６－Ｏ硫酸化もされていてもよい。さらに、隣接するいずれかのヘキスロン酸残基は、グルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれも場合により２－Ｏ硫酸化されていてもよい。多くの場合、３－Ｏ硫酸化されているグルコサミン残基は、その非還元末端でグルクロン酸に隣接し、その還元末端で２－Ｏ硫酸化イズロン酸に隣接する。上記の野生型スルホトランスフェラーゼの各々と同様に、天然に存在するグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としての３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と反応すると、スルホ基をヘパロサン系多糖に転移する。スルホ基供与体として３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を利用する野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＥＣ２．８．２．２３酵素クラスのメンバーである。非限定的な例では、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、下記式Ｘ（式中、中心グルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化されており、その非還元末端でグルクロン酸に隣接し、その還元末端で２－Ｏ硫酸化イズロン酸残基に隣接しており、Ｘは、場合により硫酸基又はアセチル基であってもよく、Ｙは、場合により硫酸基又はヒドロキシル基であってもよい。）の構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類を認識し、結合し、反応することができる。
Figure 2022523638000021
上記のように、グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応するヘパロサン系多糖の部分は式ＶＩＩＩ構造を有することができるが、多糖内の他のグルコサミン残基は、Ｎ－硫酸化、Ｎ－アセチル化、３－Ｏ硫酸化、及び／又は６－Ｏ硫酸化されていてもよく、ヘキスロニル残基はグルクロン酸又はイズロン酸であってもよく、そのいずれもが２－Ｏ硫酸化されていてもよい。上記の他の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素と同様に、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、同じ多糖分子内の複数のグルコサミン残基にスルホ基を転移させることができ、同じ多糖分子内の複数のグルコサミン残基は、ポリペプチドによって３－Ｏ硫酸化することができる。典型的には、スルホ基受容体としての天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼと反応することができるヘパロサン系多糖類は、典型的には、式Ｘに示すように、少なくとも５個の単糖残基を含む。他の態様において、ヘパロサン系多糖類は式Ｘの構造を含み、そして少なくとも３２個の単糖残基を有することができるスルホ基受容体として天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼと反応することができる。他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、スルホ受容体としてヘパロサン系多糖類、特に、ＥＣ２．８．２．２３内の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素として式Ｘの構造を有する多糖類と同じ生物活性を有することができる。
３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と、式Ｘの構造を有するヘパロサン系多糖との結合に成功すると、野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、中心グルコサミン残基の３－Ｏ位へのスルホ基の転移を触媒し、下記式Ｉ（式中、Ｘはスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙはスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである。）の構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成することができる。スルホ基受容体として式Ｘの構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類と生物活性を有し、式Ｉの構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成する、ＥＣ２．８．２．２３内の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、Xu, D., et al., (2008) Nat. Chem. Biol. 4 (3): 200-202及びEdavettal, S. C., et al., (2004) J. Biol. Chem. 24 (11): 25789-25797に記載され、これらの開示はその全体が参照により組み込まれる。さらに、式Ｉの構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、しばしば抗凝固活性を有する。改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼを使用して抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を形成する方法は、以降さらに詳述する。
Figure 2022523638000022
スルホ基受容体として本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応することができる１つのヘパロサン系多糖の非限定的な例を図２５に示す。図２５は、各Ｎ位にＮ－スルホ基４１１及び各６－Ｏ位にＯ－スルホ基４１２を有する、３つのグルコサミン残基４１０を含む多糖４４０を示す。多糖４４０内で、スルホ受容体として作用することができるグルコサミン残基４１０は、２つのヘキスロン酸残基に隣接していなければならない。ヘキスロン酸残基は、式Ｘ中の官能基「Ｘ」によって表される任意の残基を含むことができ、図２５にグルクロン酸残基４２０及びイズロン酸残基４３０として示されている。いずれのヘキスロン酸残基も、２－Ｏ位においてスルホ基４３１でさらに置換することができる。多糖４４０をＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素及びスルホ基供与体と反応させると、グルコサミニル残基４１０のいずれかの３－Ｏ位置４１３を硫酸化することができる。図２５に示すように、中心グルコサミン残基４１０はスルホ基を受容し、最終的に硫酸化生成多糖４４１内に３－Ｏ硫酸化グルコサミニル残基５１０を形成する。また示すように、硫酸化生成多糖４４１は、式Ｉの構造を有する。
ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は一般に、およそ３００～３２５個のアミノ酸残基を有し、場合によってはそれらの配列が大きく異なり得るが、最終的には全く同じ機能を有し、すなわち３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸から、特に式Ｘの構造を有するものであるＮ，２Ｏ－ＨＳ又はＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類内のＮ－スルホグルコサミン残基の３－Ｏ位へのスルフリル基の転移を触媒する。特定の理論に制限されるものではないが、ＥＣ２．８．２．２３酵素クラス内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼの各々は、全ての種にわたって同一又は高度に保存されたかのいずれかである複数のアミノ酸配列モチーフ及び二次構造が存在するので、同じ化学反応を触媒することができると考えられる。
さらに、保存されたアミノ酸配列モチーフのいくつかは、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及び／又は多糖のいずれかの結合に直接関与するか、又は化学反応自体に関与すると考えられる。天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素間の同一性は、活性部位内のアミノ酸残基が同定されている既知の地殻構造（crustal structure）（ＰＤＢコードは、それぞれ３ＵＡＮ及び１ＺＲＨ）を有する、マウス又はヒトのグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアイソフォーム１のアミノ酸配列を、ＥＣ２．８．２．２３内の他のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによって実証することができる。さらに、マウス及びヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ構造の直接比較は、２つの酵素が互いに８３％の配列同一性しか有しない場合であっても、両方の酵素がほぼ同一の活性部位及び全体的なフォールディングを有することを示す。
マウス及びヒトの酵素を含むＥＣ２．８．２．２３内の１５個の酵素の多重配列アラインメントを、ヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ（アイソフォーム１）参照配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｏ１４７９２）と比較しての各配列のパーセント同一性と共に、図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃに示す。図２６Ａ、図２６Ｂ及び図２６Ｃに示すように、配列は、アカゲザルＨＳグルコサミニル３－ＯスルホトランスフェラーゼについてはＯ１４７９２参照配列（エントリｔｒ｜Ｈ９ＺＧ３９｜Ｈ９ＺＧ３９＿ＭＡＣＭＵ）と９８％の同一性を有するものから、ヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼのアイソフォーム５については最低で５３％の同一性（エントリｓｐ｜Ｑ８ＩＺＴ８｜ＨＳ３Ｓ５＿ＨＵＭＡＮ）までの範囲である。当業者は、多重配列アラインメントは明確化のために１５配列に限定されており、同定され、高度に保存された活性部位及び／又は結合領域も有する天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする数百のアミノ酸配列が存在することを理解するであろう。
図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃにおいて、特定の位置で黒背景に白色で示すアミノ酸は、全ての配列にわたって１００％同一である。特定の位置で、アミノ酸が同一であること、又は化学的若しくは構造的に類似していることのいずれかを意味する、高度に保存されているアミノ酸は、黒い縁取りで囲まれている。高度に保存された領域内では、配列の大部分に存在するコンセンサスアミノ酸は太字である。同一でないか又は高度に保存されていない特定の位置のアミノ酸は、典型的には可変である。配列内の期間は、高度に保存された又は同一の領域の間にさらなる残基を有する他の配列（複数可）との配列アラインメントを容易にするために、配列に挿入されたギャップを示す。最後に、各配列ブロックの上には、アラインメント内のアミノ酸の同一性に基づいて、天然型ヒトスルホトランスフェラーゼ酵素の構造を参照として使用して、全ての配列にわたり保存されている二次構造を示す一連の矢印及びコイルがある。矢印に隣接するβ記号はβシートを指し、α記号又はη記号に隣接するコイルは螺旋二次構造を指す。
図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃの１５個の整列した配列内には、上記のマウス（エントリｓｐ｜Ｏ３５３１０｜ＨＳ３Ｓ１＿ＭＯＵＳＥ）及びヒトのグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ（エントリｓｐ｜Ｏ１４７９２｜ＨＳ３Ｓ１＿ＨＵＭＡＮ）酵素の結晶構造に基づいて、活性部位を含む１つ以上のアミノ酸を含むいくつかの保存されたアミノ酸配列モチーフが存在する。図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃ内のアミノ酸残基の番号付けに基づいて、これらのモチーフは、残基１６～２７（残基１８～２３由来のＧ－Ｖ－Ｒ－Ｋ－Ｇ－Ｇを含む）、残基４３～４８（Ｅ－Ｖ／Ｉ－Ｈ－Ｆ－Ｄ）、残基７８～８１（Ｐ－Ａ／Ｇ－Ｙ－Ｆ）、残基１１２～１１７（Ｓ－Ｄ－Ｙ－Ｔ－Ｑ－Ｖを含む）、及び残基１４５～１４７（Ｙ－Ｋ－Ａ）を含む。これらの残基は、化学反応を促進するか若しくはそれに関与するか、又は活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸若しくは多糖の結合を可能にするかのいずれかであると考えられる。特に、残基４３～４８内では、上記のように、並びに図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃに示すように、４３位のグルタミン酸残基は、多糖内のＮ－スルホグルコサミン残基の３－Ｏ位からプロトンを引き抜き、求核攻撃及び３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸からのスルホ基の除去を可能にする一方、ｉｓ－４５及びＡｓｐ－４８は、スルフリル化（sulfurylated）多糖生成物が活性部位から放出される前に、酵素の遷移状態を安定化するように配位する。
しかしながら、上記のように、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、アリール硫酸化合物から多糖への硫酸基の転移を触媒することができない。特定の理論に制限されるものではないが、上記の天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ、及びグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様に、天然スルホトランスフェラーゼの活性部位内の３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の結合ポケットは、結合を促進するのに充分に高い硫酸アリール化合物に対する親和性を有していないか、及び／又はアリール硫酸化合物が活性部位に入るのを立体的に妨げられているかのいずれかと考えられる。その結果、及び他の態様において、ＥＣ２．８．２．２３内の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を、そのアミノ酸配列内のいくつかの位置で変異させて、活性部位内のアリール硫酸化合物の結合を可能にし、及び／又は多糖への硫酸基の転移が起こることができるようにアリール硫酸化合物を最適に配置することができる。
したがって、他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃに例示するアミノ酸配列を有する酵素を含む、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の変異体であってもよい。
他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に操作された変異は、アリール硫酸化合物がスルホ基供与体として酵素に結合及び反応することができる生物活性を促進する。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物と結合して反応することができるが、スルホ基受容体としての式Ｘの構造を有するものを含むがこれに限定されないヘパロサン系多糖類との天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の生物活性を保持することができる。特定の理論に制限されるものではないが、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列に挿入された変異のために、それらのスルホトランスフェラーゼ活性は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がアリール硫酸化合物で置換されていることを除いて、上記の図４Ａ～図４Ｃに記載されているのと同様の機構を用いる、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルフリル基の直接転移を有することができると考えられる。そうでなければ、変異のために、スルホトランスフェラーゼ活性は、アリール硫酸化合物の加水分解及びスルホヒスチジン中間体の形成、続いて３－Ｏ硫酸化ＨＳ生成物を形成するためのグルコサミン残基の３－Ｏ位の酸素原子によるスルホヒスチジン中間体の求核攻撃を含む、２工程のプロセスを有することができると考えられる。他の態様において、スルホ転移機構のいずれかの３－Ｏ硫酸化生成物は、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物である。本発明の改変型酵素は、実施例で後述するように、アリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へのスルホ基転移を達成することができる。
他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、上述のように、図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃの多重配列アラインメントに示すように、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存アミノ酸配列モチーフと比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型酵素のアミノ酸配列に存在する各変異アミノ酸配列モチーフは、天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内の対応する保存アミノ酸配列モチーフと比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、１つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、２つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、３つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、４つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、５つの変異アミノ酸配列モチーフを有することができる。他の態様において、ＥＣ２．８．２．２３内の野生型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと比較して少なくとも１つの変異アミノ酸配列モチーフを含む、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
他の態様において、三次元分子視覚化システム（非限定的な例として、オープンソースソフトウェアであるＰｙＭＯＬ）においてマウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼの結晶構造を見ると、マウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｏ３５３１０）構造と比較して１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを含有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の配列などの関連配列の構造を、図２７に示す比較のためにモデル化することができる。図２７は、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有する、３つの改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を有するマウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（ＰＤＢコード：３ＵＡＮ）の活性部位の拡大図を示す。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸がスルホ供与体であり、マウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼと共結晶化したスルホ転移反応の生成物である、アデノシン３’，５’－二リン酸もまた、活性部位内に示されている。ＰＮＳはまた、そのような解が可能である場合、多糖結合部位（図示せず）に隣接する酵素活性部位内のリガンドの最適化された位置及び配向を計算するように設計された分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの共通解を使用して、改変型酵素の活性部位にモデル化される。水素原子は、明確化のために示されていない。
図２７に示すように、天然マウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼに関して、配列番号１４７、配列番号１４９及び配列番号１５１と比較して行われたいくつかの変異があるが、それぞれのタンパク質骨格は互いにほぼ同一の位置にあり、活性部位の一対一比較を可能にする。しかしながら、２つの活性部位を比較すると、天然のスルホ転移反応由来のアデノシン３’，５’－二リン酸生成物はリジン残基に隣接しているが、上記のＭＤシミュレーションからの収束解は、改変型酵素内のＰＮＳ結合が活性部位の反対側で有利であることを示している。特定の理論に制限されるものではないが、収束ＭＤシミュレーション解は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と同じ又は類似の位置のＰＮＳに対する親和性が充分ではないため、活性部位の反対側にＰＮＳを配置すると考えられる。しかし、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸及びＰＮＳの結合ポケットの明らかな違いにもかかわらず、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は全て、実施例で後述するように、ヘパロサン系多糖内の１つ以上の位置の３－Ｏ位へのアリール硫酸化合物からのスルホ転移を達成した。
さらに、マウスグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼの２０位に対応し、図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃに示す他のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の全てにおいて保存されているアルギニン残基は、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に存在する場合、図２７に示す位置におけるＰＮＳの結合を阻止するようである。したがって、他の態様において、ＰＮＳに結合する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、ＰＮＳが結合ポケット内に結合するための全ての立体障害を除去する、活性部位アルギニン残基のグリシン残基への変異を有することができる。配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、及び配列番号１５７のアミノ酸配列に示すように、アルギニンからグリシンへの変異は２１位にある。配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０のアミノ酸配列に示すように、アルギニンからグリシンへの変異は９９位にある。
同様に、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、及び配列番号１５７のアミノ酸配列の２２位に対応する各改変型酵素の次のアミノ酸残基は、ヒスチジン残基に変異している。特定の理論に制限されるものではないが、保存されたリジン残基からヒスチジン残基への変異（図２６Ａのアミノ酸配列の各々の２１位に対応）は、上記Malojcic,et alに記載されたのと同様の機構を使用して、ＰＮＳからの硫酸基の除去を促進すると考えられる。配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０のアミノ酸配列に示すように、リジンからヒスチジン残基は、１００位にある。
当業者は、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０によって開示するものを含むがこれらに限定されない、任意の他のアミノ酸配列の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素が、特に活性部位内で、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型酵素と同様の構造モチーフを示すことを理解するであろう。特定の理論に制限されるものではないが、ＮＣＳはまた、改変型酵素のいずれかの活性部位内のＰＮＳと同様の位置で結合するとも考えられる。これは、２つのアリール硫酸化合物の構造が、硫酸基はニトロ基に対してパラではなく、むしろニトロ基に対して芳香環上のオルトに位置することを除いて、非常に類似しているからである。
他の態様において、本発明の改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、１つ以上の変異アミノ酸配列モチーフを有することができ、これは、図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃの多重配列アラインメントにおいて示す保存されたアミノ酸配列モチーフを、図２７に示す改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を含むがこれらに限定されない野生型酵素及び／又はモデル化された改変型酵素の既知の構造と比較することによって部分的に決定することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内に有することができる変異アミノ酸配列モチーフは、（ａ）Ｇ－Ｖ－Ｇ－Ｈ－Ｇ－Ｇ；（ｂ）Ｈ－Ｓ－Ｙ－Ｆ；（ｃ）Ｓ－Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｈ－Ｘ３（式中、Ｘ１はアラニン及びロイシンからなる群から選択され、Ｘ２はチロシン及びグリシンからなる群から選択され、Ｘ３はメチオニン及びロイシンからなる群から選択される）；及び（ｄ）Ｙ－Ｘ４－Ｇ（式中、Ｘ４はバリン及びトレオニンからなる群から選択される）；（これらの任意の組合せを含む）からなる群から選択することができる。変異アミノ酸配列モチーフの各々は、上記の図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃに示す保存アミノ酸モチーフに対応する。変異アミノ酸配列モチーフＧ－Ｖ－Ｇ－Ｈ－Ｇ－Ｇは保存アミノ酸配列モチーフＧ－Ｖ－Ｒ－Ｋ－Ｇ－Ｇに対応する；変異アミノ酸配列モチーフＨ－Ｓ－Ｙ－Ｆは保存アミノ酸配列モチーフＰ－Ａ／Ｇ－Ｙ－Ｆに対応する；変異アミノ酸配列モチーフＳ－Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｈ－Ｘ３は保存アミノ酸配列モチーフＳ－Ｄ－Ｙ－Ｔ－Ｑ－Ｖに対応する；変異アミノ酸配列モチーフＹ－Ｘ４－Ｇは保存アミノ酸配列モチーフＹ－Ｋ－Ａに対応する。他の態様において、上記の各変異アミノ酸配列モチーフを有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択することができる。
他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフの各々は、ＥＣ２．８．２．２３内の天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素に見られる保存アミノ酸と比較して作られる、少なくとも１つの変異を有することができる。他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフ（ａ）は、保存アミノ酸配列モチーフＧ－Ｖ－Ｒ－Ｋ－Ｇ－Ｇと比較して、Ｒ－ＫからＧ－Ｈへの変異を含む。他の態様において、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）は、保存アミノ酸配列モチーフＰ－Ａ／Ｇ－Ｙ－Ｆと比較して、Ｐ－Ａ／ＧからＨ－Ｓへの変異を含む。他の態様において、Ｘ１位、Ｘ２位、及びＸ３位で行われる潜在的変異に加えて、変異アミノ酸配列モチーフ（ｃ）は、保存アミノ酸配列モチーフＳ－Ｄ－Ｙ－Ｔ－Ｑ－Ｖと比較して、ＱからＨへの変異を有する。他の態様において、Ｘ４位の変異に加えて、変異アミノ酸配列モチーフ（ｄ）は、保存アミノ酸配列モチーフＹ－Ｋ－Ａと比較して、ＡからＧへの変異を有する。
他の態様において、Ｘ１はアラニンであり、Ｘ２はチロシンであり、Ｘ３はメチオニンであり、Ｘ４はバリン又はトレオニンである。他の態様において、Ｘ１はロイシンであり、Ｘ２はグリシンであり、Ｘ３はロイシンであり、Ｘ４はトレオニンである。別の理論に限定されるものではないが、変異アミノ酸配列モチーフ（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）内に含まれる１つ以上の変異は、化学反応中の酵素の遷移状態の安定化において、又は活性部位に対するアリール硫酸化合物の親和性の増加において、例えば、結合ポケットのサイズの縮小、ポケットの疎水性の増加、及び／若しくはアリール硫酸化合物の芳香族部分とのπ－π相互作用の作成によって役割を果たすと考えられる。
さらに、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物で活性であると実験的に決定された３つの改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１）（以下の実施例６参照）を、多重配列アラインメントでヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の第１のアイソフォームのアミノ酸配列（エントリｓｐ｜Ｏ１４７９２｜ＨＳ３Ｓ１＿ＨＵＭＡＮ）と比較して、各酵素の間に変異間の関係があるかどうかを決定することができる。改変型酵素のアミノ酸配列内の期間は、特定の位置におけるヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素との同一性を示す。図２８に示すように、配列アラインメントは、３つのスルホトランスフェラーゼ配列内のアミノ酸残基の９０％超が同一であるが、複数のアミノ酸を選択することができるいくつかの位置があることを実証する。結果として、他の態様において、複数のアミノ酸を定義された位置において選択することができるアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を配列番号１５４として開示する。アミノ酸の同一性が可能な残基の選択から選択できる位置は、「Ｘａａ」、「Ｘｎ」、又は「位置ｎ」という用語で示し、ｎは残基位置を指す。
他の態様において、配列番号１５４のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１１４位のアミノ酸残基はアラニンであり、１１８位のアミノ酸残基はメチオニンである。さらなる態様において、１４７位のアミノ酸残基は、バリン及びトレオニンからなる群から選択される。
他の態様において、配列番号１５４のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、１１４位のアミノ酸残基はロイシンであり、１１８位のアミノ酸残基はロイシンであり、１２１位のアミノ酸残基はバリンである。さらなる態様において、１１５位のアミノ酸残基はグリシンである。なおさらなる態様において、１４７位のアミノ酸残基はトレオニンである。
他の態様において、配列番号１５４のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素内で、任意のそのような変異が酵素のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ及び／又は硫酸アリール依存性活性を排除しない限り、アミノ酸配列は、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない残基位置に１つ以上の変異を任意に有することができる。他の態様において、「Ｘｎ」又は「Ｘａａ」によって特定されない位置での硫酸アリール依存性活性を排除しないそのような変異は、置換、欠失及び／又は付加を有することができる。
したがって、他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用される改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９及び配列番号１６０のアミノ酸配列を有する、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、任意のアリール硫酸化合物と反応することができる。さらなる態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなる群から選択される。いくつかのなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。他のなおさらなる態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。
硫酸化多糖類のインビトロ合成
本発明のある態様において、上記の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを利用して、硫酸化ヘパロサン系多糖類を合成することができる。一般に、硫酸化は、ヘパロサン系多糖及びアリール硫酸化合物を改変型スルホトランスフェラーゼ酵素で処理して、硫酸化生成物を形成することによって、達成することができる。上記のように、特定の理論に制限されるものではないが、ヘパロサン系多糖類をスルホ基受容体として認識するが、スルホ供与体としてのアリール硫酸化合物にも結合及び反応するスルホトランスフェラーゼ酵素は、自然界では観察されておらず、以前にも記載されていないと考えられている。
硫酸化ヘパロサン系多糖類（以下、「ＨＳ多糖類」）について、多糖類がインビボで産生される動物源、特にブタ及びウシから単離することにより、工業的、商業的、又は薬学的な用途で利用するＨＳ多糖類を、大量に得ることができる（Xu, Y., et al., (2011) Science 334 (6055): 498-501を参照のこと）。抗凝固性ＨＳ多糖類の２００７年及び２００８年の世界的な汚染危機は、動物源からのそれらの入手のみに依存するという脆弱性に焦点を当てた。その結果、動物由来の製品を補完又は置換するのに充分な量で、インビトロにおいて抗凝固性ＨＳ多糖類を合成するための合成経路を開発する動きがある。この流れは、２０１９年に、世界中、特に中国の豚集団を減少させたアフリカブタインフルエンザの流行によってさらに強化されただけである。
硫酸化多糖類をインビトロで合成するために、歴史的には２つの反応スキーム、つまり完全化学合成及び化学酵素合成が存在した。両方のタイプの反応スキームも、場合によっては均質である精製産物をもたらしたが、合成経路は、全体として工業規模において硫酸化多糖類、特に抗凝固性ＨＳ多糖類を製造するには不充分であった。実際、完全化学合成を使用したそのような多糖類の産生は、歴史的には６０もの工程が必要であり、収率が非常に低かった（Balagurunathan, K., et al., (eds.) (2015) Glycosaminoglycans: Chemistry and Biology, Methods in Molecular Biology, vol.1229, DOI 10.1007/978-1-4939-1714-3_2,c Springer Science+Business Media New Yorkを参照のこと）。
一方、化学酵素合成経路は概して、はるかに少ない工程を利用し、生成した抗凝固性製品の規模を多ミリグラム量へと増大させる（米国特許第8,771,995号及び同第9,951,149号を参照のこと。これらの開示はその全体が参照により組み込まれる）。得られる生成物の量の改善は、ヘパロサン系多糖類へのスルホ基の転移を触媒するために、反応容器中で、組換えＨＳスルホトランスフェラーゼを３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と組み合わせる能力に起因し得る。しかし、この時点までの化学酵素法は、米国特許第5,541,095号、同第5,817,487号、同第5,834,282号、同第6,861,254号、同第8,771,995号、同第9,951,149号、及び米国特許公開第2009/0035787号、同第2013/0296540号、及び同第2016/0122446号（これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるように、野生型スルホトランスフェラーゼの活性が３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸に依存しているため、グラムスケール又は大量の抗凝固性ＨＳ多糖類を合成するには依然として適していない。３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸は、ｐＨ８．０での３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸の半減期がわずか約２０時間であるので、抗凝固性ＨＳ多糖類を含む酵素的に硫酸化された生成物の大規模生産の障害となっている、非常に高価かつ不安定な分子である。
さらに、アデノシン３’，５’－二リン酸による生成物阻害もまた、硫酸化生成物の大規模合成の制限因子であった。アデノシン３’，５’－二リン酸による生成物阻害の非常に悪い影響は、アデノシン３’，５’－二リン酸を３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸に変換する、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸再生システム（上記の米国特許第6,255,088号、及びBurkhart, et al. (2000) J. Org. Chem. 65: 5565-5574参照）を使用することによっていくらか低減することができる。しかしながら、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸再生システムにもかかわらず、天然スルホトランスフェラーゼとの化学反応を開始するために３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を供給することの絶対的な必要性は、それでもなお、抗凝固性ＨＳ多糖類を含む硫酸化生成物を工業的な生産グレードの規模で合成するためには桁違いに高いコスト障壁を作り出す。
活性を推進するために３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸をスルホ供与体として必要とする硫酸化多糖類の既知の化学酵素合成とは対照的に、本発明の方法は、３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を使用する必要性を完全に回避する。これは、本発明のスルホトランスフェラーゼの各々は、天然のＨＳスルホトランスフェラーゼと反応しないアリール硫酸化合物をスルホ供与体として認識し、結合し、反応するように操作されているからである。特定の理論に制限されるものではないが、本発明の改変型スルホトランスフェラーゼは、スルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物、及びスルホ基受容体としての多糖類、特にヘパロサン系多糖類と結合することができる唯一の公知のスルホトランスフェラーゼであると考えられる。
したがって、他の態様において、本発明は、ＨＳ多糖類を合成するための方法及びキットを提供する。概して、本発明の改変型スルホトランスフェラーゼを用いてヘパロサン系多糖を硫酸化する方法は、（ａ）アリール硫酸化合物を提供する工程；（ｂ）上記の改変型スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを提供する工程であって、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がスルホ基供与体としてのアリール硫酸化合物による生物活性を有する工程；（ｃ）ヘパロサン系多糖を提供する工程；（ｄ）アリール硫酸化合物、スルホトランスフェラーゼ酵素、及びヘパロサン系多糖を反応混合物へと組合せる工程；（ｅ）スルホトランスフェラーゼ酵素を用いてアリール硫酸化合物からヘパロサン系多糖へとスルホ基を転移させることによって、硫酸化多糖生成物を形成する工程；を有することができる。他の態様において、アリール硫酸化合物は、ＰＮＳ、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳからなるものから選択することができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物はＰＮＳとすることができる。本発明によれば、アリール硫酸化合物はＮＣＳとすることができる。
他の態様において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素である場合、ヘパロサン系多糖は、式ＩＩの構造を有する１つ以上の二糖単位を有するＮ－脱アセチル化ヘパロサン多糖であってもよく、改変型スルホトランスフェラーゼは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、Ｎ－硫酸化ＨＳ多糖類は、式ＩＩＩの構造を有する１つ以上の二糖単位を有する。
他の態様において、式ＩＩの構造を有する二糖単位を有するＮ－脱アセチル化ヘパロサン及び／又は他のヘパロサン系多糖類は、市販のものであってもよい。他の態様において、本発明の改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼと反応するためのヘパロサン系多糖組成物は、天然源からヘパロサンを単離し、１つ以上のグルコサミン残基をＮ－脱アセチル化するように化学的に修飾し、組成物内の多糖類の分子量を制御することによって得ることができる。特に、ヘパロサンは、代謝産物及び他の外因性材料による細胞移入を調節するカプセルとして細菌内に見出すことができる。そのような細菌としては、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）及び大腸菌が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、ヘパロサンは、様々な分子量を有する多糖分子の多分散混合物として、大腸菌、特に大腸菌のＫ５株から抽出及び精製することができる。大腸菌のＫ５株からヘパロサンを単離するための手順は、Wang, Z., et al., (2010) Biotechnol. Bioeng. 107 (6): 964-973（この開示はその全体が参照により組み込まれる）；DeAngelis, P. L. (2015) Expert Opinion on Drug Delivery 12 (3): 349-352；Ly, M., et al., (2010) Anal. Bioanal. Chem. 399: 737-745；及びZhang, C., et al., (2012) Metabolic Engineering 14: 521-527（この開示もまた、その全体が参照により組み込まれる）にて論じられ、提供されている。
他の態様において、ヘパロサン組成物の一部又は全部は、塩基、特に水酸化リチウム又は水酸化ナトリウムで処理することによって、Ｎ－脱アセチル化することができる（Wang, Z., et al., (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1): 91-99（この開示はその全体が参照により組み込まれる）参照；さらに、ＰＣＴ公開第PCT/US2012/026081号（この開示はその全体が参照により組み込まれる）も参照）。他の態様において、塩基は、水酸化ナトリウムである。所望のＮ－脱アセチル化の程度、ヘパロサンの濃度、及び塩基の濃度に応じて、当業者は、上記Wang, et al., (2011)に記載される手順に従って、ヘパロサンを塩基とどのくらい長くインキュベートするかを決定することができる。
他の態様において、以下でさらに詳述する米国薬局方（ＵＳＰ）によって示すベンチマークの１つ以上を満たす、抗凝固性ＨＳ多糖類を合成するのに有用な分子量及びＮ－アセチル含有量で、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを得ることができる。他の態様において、所望量のＮ－アセチル化グルコサミン残基がＮ－脱アセチル化生成物内に残るまで、ヘパロサンを、塩基、好ましくは水酸化ナトリウムとインキュベートすることができる。他の態様において、Ｎ－アセチルグルコサミン残基は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン内のグルコサミン残基の３０％未満、２０％未満、１８％未満、１６％未満、１４％未満、１２％未満、又は１０％未満を含む６０％未満と、最低で５％未満まで、好ましくは１２％～最大１８％までの範囲のグルコサミン残基を有することができる。他の態様において、Ｎ－アセチルグルコサミンは、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン内にグルコサミン残基の約１５％を有することができる。
さらに、特定の理論に制限されるものではないが、Ｎ－脱アセチル化グルコサミン残基に加えて、ヘパロサンと塩基との間の反応は、ヘパロサン多糖類を同時に解重合し、それらの分子量を減少させることができ、これにより、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの重量平均分子量（Ｍｗ）を減少させることができると考えられる。典型的には、大腸菌を含むがこれに限定されない、細菌から単離されたヘパロサン多糖類は、約３，０００Ｄａ～約１５０，０００Ｄａの範囲の分子量を有し、単離されたヘパロサンの組成物は、約２５，０００Ｄａ～最大約５０，０００Ｄａの範囲でＭｗを有することができる（上述のLy, M., et al. and Wang, et al., (2011)を参照のこと）。他の態様において、市販の供給源から得るか、又は大腸菌を含むがこれに限定されない細菌から単離されるかのいずれかであるヘパロサン組成物は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＭｗを標的レベル又は所望のレベルまで低下させるのに充分な時間にわたり、塩基、好ましくは水酸化ナトリウムで処理することができる。他の態様において、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、少なくとも２，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、８，５００Ｄａ、９，０００Ｄａ、９，５００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、１０，５００Ｄａ、１１，０００Ｄａ、１１，５００Ｄａ、１２，０００Ｄａ、１２，５００Ｄａ、１３，０００Ｄａ、１３，５００Ｄａ、１４，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１６，０００Ｄａ、又は１８，０００Ｄａ、最大で少なくとも２０，０００Ｄａを含む、少なくとも１，０００ＤａのＭｗを有することができる。他の態様において、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、１８，０００Ｄａ未満、１６，０００Ｄａ未満、１５，０００Ｄａ未満、１４，０００Ｄａ未満、１３，５００Ｄａ未満、１３，０００Ｄａ未満、１２，５００Ｄａ未満、１２，０００Ｄａ未満、１１，５００Ｄａ未満、１１，０００Ｄａ未満、１０，５００Ｄａ未満、１０，０００Ｄａ未満、９，５００Ｄａ未満、９，０００Ｄａ未満、８，５００Ｄａ未満、８，０００Ｄａ未満、７，０００Ｄａ未満、６，０００Ｄａ未満、又は４，０００Ｄａ未満、最低で２，０００Ｄａ未満までを含む、２０，０００ＤａのＭｗを有することができる。他の態様において、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、１，０００Ｄａ～２０，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲、好ましくは９，０００Ｄａ～１２，５００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲のＭｗを有することができる。
このような分子量特性及びＮ－アセチル含有量を有するＮ－脱アセチル化ヘパロサンの調製は、上記のWang, et al., (2011)で詳述されている。他の態様において、ヘパロサンを、塩基、好ましくは水酸化ナトリウムと反応させて、９，０００Ｄａ～１２，５００Ｄａの範囲のＭｗ、並びに１２％～最大１８％の範囲のＮ－アセチルグルコサミン含有量を有するＮ－脱アセチル化ヘパロサン生成物を形成するのに充分な時間は、ヘパロサン出発物質の分子量特性及び濃度、並びに反応を実施するために使用される塩基の同一性及び濃度に応じて、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、又は１８時間、最大で少なくとも２４時間までを含む、少なくとも１時間とすることができる。
他の態様において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素である場合、ヘパロサン系多糖は、式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有するＮ－硫酸化ＨＳ多糖類であってもよく、改変型スルホトランスフェラーゼは、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、本方法は、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ、好ましくは配列番号６７のアミノ酸配列を有するグルクロニルＣ５－エピメラーゼ、より好ましくは配列番号６７の残基３４～６１７を提供する工程、及びグルクロニルＣ５－エピメラーゼを反応混合物へと組み合わせる工程をさらに有することができる。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させるためのヘパロサン系多糖は、市販のものであってもよい。他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させるためのヘパロサン系多糖は、改変型又は天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素の硫酸化ＨＳ多糖生成物とすることができる。他の態様において、硫酸化多糖生成物は、式ＶＩ及び／又は式ＶＩＩの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖類である。
他の態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼのためのスルホ基受容体として利用されるＮ－硫酸化ＨＳ多糖類は、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを化学的にＮ－硫酸化することによって得ることができる。他の態様において、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、三酸化硫黄及び／又は１つ以上の三酸化硫黄含有化合物若しくは付加物を含む組成物によって、化学的に硫酸化することができる。三酸化硫黄を用いた多糖類内のグルコサミン残基の化学的Ｎ－硫酸化は、当技術分野で一般に知られている（Lloyd, A. G., et al., (1971) Biochem. Pharmacol. 20 (3): 637-648；Nadkarni, V. D., et al., (1996) Carbohydrate Research 290: 87-96；Kuberan, B., et al., (2003) J. Biol. Chem. 278 (52): 52613-52621；Zhang, Z., et al., (2008) J. Am. Chem. Soc. 130 (39): 12998-13007；及び上述のWang, et al., (2011)を参照のこと；また、米国特許第6,991,183号及び米国特許公開第2008/020789号も参照のこと。これらの開示はその全体が参照により組み込まれる）。三酸化硫黄錯体は、水酸化ナトリウムとは異なり、一般に、脱重合を起こすことなく多糖類の選択的なＮ－硫酸化を可能にするのに充分温和な塩基である（Gilbert, E. E., (1962) Chem. Rev. 62 (6): 549-589を参照のこと）。三酸化硫黄含有錯体の非限定的な例として、二酸化硫黄－ピリジン、二酸化硫黄－ジオキサン、二酸化硫黄－トリメチルアミン、二酸化硫黄－トリエチルアミン、二酸化硫黄－ジメチルアニリン、二酸化硫黄－チオキサン、二酸化硫黄－ビス（２－クロロエチル）エーテル、二酸化硫黄－２－メチルピリジン、二酸化硫黄－キノリン、又は二酸化硫黄－ジメチルホルムアミドが挙げられる。
他の態様において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素である場合、ヘパロサン系多糖は、式ＶＩＩＩの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有するＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖類であってもよく、改変型スルホトランスフェラーゼは、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させるためのヘパロサン系多糖は、市販のものであってもよい。他の態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のためのヘパロサン系多糖は、改変型又は天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の硫酸化Ｎ，２Ｏ－ＨＳ多糖生成物とすることができる。他の態様において、硫酸化多糖生成物は、式ＩＸの構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類である。
他の態様において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素である場合、ヘパロサン系多糖は、式Ｘの構造を有する１つ以上の構造モチーフを有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類であってもよく、改変型スルホトランスフェラーゼは、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素と反応させるためのヘパロサン系多糖は、市販のものであってもよい。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のためのヘパロサン系多糖は、改変型又は天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の硫酸化Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖生成物とすることができる。他の態様において、硫酸化多糖生成物は、式Ｉの構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類である。
上記のように、式Ｉの構造を有するＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、抗凝固活性を有することができる（Desai, U. R., et al., (1998) J. Biol. Chem. 273 (13): 7478-7487を参照のこと）。抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の医学的使用は、数十年にわたって充分に文書化されている。Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の抗凝固活性のいくつかには、血液凝固カスケードに不可欠な２つのタンパク質である、第ＩＩａ因子（トロンビン）及び／又は第Ｘａ因子の不活性化が含まれるが、これらに限定されない。特に、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類がアンチトロンビン（ＡＴ）に結合すると、多糖、ＡＴ、及びトロンビン又は第Ｘａ因子のいずれかとの間の三元複合体の形成を可能にする酵素の立体構造変化を引き起こす（Li, W., et al., (2004) Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (9): 857-862を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる）。ＡＴと結合し、その立体構造変化を誘導するために、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、典型的には、式Ｉの構造と同等な特定の５残基ＡＴ認識配列を有する。
ＡＴ認識配列のみからなるオリゴ糖にアンチトロンビンを結合させることによって抗凝固を誘導することができるが、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類が５個を超える糖残基を含む場合、典型的には、血液凝固の阻害が増強される（Grey, E., et al., (2008) Thromb. Haemost. 99: 807-818を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる）。Grey, et alによって報告されているように、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類が、ＡＴ認識配列の両側いずれかで少なくとも１３個の糖残基を含むことで、多糖がトロンビンに結合する一方でＡＴにも結合することを可能にする「ブリッジ」として作用する場合、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖とトロンビンとの間に二次結合相互作用が形成することができる。結果として、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖、ＡＴ、及びトロンビンの間に三元複合体を潜在的に形成するために、典型的には最小１８個の糖残基を必要とする。しかしながら、特定の理論に制限されるものではないが、特定の多糖分子内のＡＴ認識配列の分布はランダムであるため、１８～３１個の糖残基のいくつかのＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、理論的には、両側に１３個の隣接する糖残基を有しない分子の中心に向かってＡＴ認識配列を有することができると考えられる。結果として、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、典型的には、ＡＴ認識配列が分子内のどこにあっても、ＡＴ認識配列に隣接する１３残基の「ブリッジ」が形成できることを確実にするために、少なくとも３２個の糖残基を含まなければならない。結果として、ある態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖生成物は、少なくとも５個の糖残基、好ましくは少なくとも１８個の糖残基、より好ましくは少なくとも３２個の糖残基とすることができる。
他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、生成物純度、特に限定されないがコンドロイチン硫酸を含む他の硫酸化多糖類からの純度に関して、医薬ＵＦ－ＨＳ組成物についてＵＳＰによって決定されたベンチマーク要件を満たすことができる。特に、過硫酸化コンドロイチン硫酸（over-sulfated chondroitin sulfate：ＯＳＣＳ）は、２００７年及び２００８年に世界中で数百人の死を引き起こした医薬ＵＦ－ＨＳ組成物内の汚染源であると判定された。他の態様において、特定の理論に制限されるものではないが、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を使用して調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、出発物質として使用するヘパロサン系多糖類が、動物源から単離された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類中に本質的に存在する同じ多糖汚染物質なしに、インビトロで提供及び／又は調製することができるので、コンドロイチン硫酸、特にＯＳＣＳを実質的に含まないように形成することができる。
ＵＳＰは、全ての医薬組成物が測定される抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳの参照標準（Chemical Abstracts Service（ＣＡＳ）番号９０４１－０８－１）を定義している。ＵＳＰ準拠抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ組成物の分子量特性は、次のベンチマークの全てを満たさなければならない：（１）２４，０００Ｄａを超える分子量を有する組成物中の多糖類の割合が２０％以下である；（２）組成物自体のＭｗが１５，０００Ｄａ～１９，０００Ｄａの間である；（３）８，０００Ｄａ～１６，０００Ｄａの分子量を有する組成物中の多糖類の数に対する１６，０００Ｄａ～２４，０００Ｄａの分子量を有する組成物中の多糖類の数の比が、１．０：１以上である（Mulloy, B., et al., (2014) Anal. Bioanal. Chem. 406: 4815-4823を参照のこと。この開示はその全体が参照により組み込まれる）。さらに、ＵＳＰ準拠抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ組成物の抗凝固活性は、次のベンチマークの全てを満たさなければならない：ミリグラム当たり１８０国際単位（ＩＵｍｇ－１）以上の抗ＩＩａ活性；１８０ＩＵｍｇ－１以上の抗Ｘａ活性；及び、０．９：１～最大１．１：１までの範囲の抗Ｘａ活性対抗ＩＩａ活性の比。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、医薬ＵＦ－ＨＳ組成物について米国薬局方（ＵＳＰ）によって決定された上記の抗凝固活性及び分子量要件のいずれか又は複数を満たすことができる。
特に、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の分子量特性に関して、これらは、スルホ基受容体として利用されるヘパロサン系多糖の分子量特性の制御に部分的に基づいて制御することができる。上記のように、ヘパロサン系多糖の分子量を制御する最も制御可能な機会は、ヘパロサンのＮ－脱アセチル化及び解重合によるものである。したがって、他の態様において、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の分子量を制御するために、一連のスルホ転移反応を実施することができる。他の態様において、一連のスルホ転移反応は、次の工程に従って行うことができる：（ａ）グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼを使用して、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンからＮ－硫酸化ヘパロサン生成物を形成する工程；（ｂ）（ａ）工程のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ及びＮ－硫酸化ヘパロサン生成物を使用して、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ多糖生成物を形成する工程；（ｃ）グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ及び（ｂ）工程のＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖生成物を使用して、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖生成物を形成する工程；（ｄ）グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ及び（ｃ）工程のＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖生成物を使用して、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖生成物を形成する工程。他の態様において、全てのスルホトランスフェラーゼは改変型スルホトランスフェラーゼであり、各反応におけるスルホ供与体はアリール硫酸化合物、好ましくはＰＮＳ又はＮＣＳである。他の態様において、上記Wang, et al., (2011)に記載されるように、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、９，０００Ｄａ～１２，５００Ｄａの範囲のＭｗと、１２％～最大１８％までの範囲のＮ－アセチルグルコサミン含有量を有する。あるいは、他の態様において、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼのためのスルホ基受容体として利用されるＮ－硫酸化ヘパロサン生成物は、上記のように、Ｎ－脱アセチル化されたヘパロサンから化学的に硫酸化することができる。
したがって、他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、少なくとも２，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、１１，０００Ｄａ、１２，０００Ｄａ、１３，０００Ｄａ、１４，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１６，０００Ｄａ、１７，０００Ｄａ、１８，０００Ｄａ、１９，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、２１，０００Ｄａ、２２，０００Ｄａ、２３，０００Ｄａ、又は２４，０００Ｄａ、最大で少なくとも５０，０００Ｄａまでを含む、少なくとも１，０００ＤａのＭｗを有することができる。したがって、他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、２４，０００Ｄａ未満、２３，０００Ｄａ未満、２２，０００Ｄａ未満、２１，０００Ｄａ未満、２０，０００Ｄａ未満、１９，０００Ｄａ未満、１８，０００Ｄａ未満、１７，０００Ｄａ未満、１６，０００Ｄａ未満、１５，０００Ｄａ未満、１４，０００Ｄａ未満、１３，０００Ｄａ未満、１２，０００Ｄａ未満、１１，０００Ｄａ未満、１０，０００Ｄａ未満、９，０００Ｄａ未満、８，０００Ｄａ未満、７，０００Ｄａ未満、６，０００Ｄａ未満、５，０００Ｄａ未満、４，０００Ｄａ未満、又は３，０００Ｄａ未満、最低で２，０００Ｄａ未満を含む、５０，０００Ｄａ未満のＭｗを有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、１，０００Ｄａ～５０，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲、好ましくは１５，０００Ｄａ～約１９，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲のＭｗを有することができる。
同様に、他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物内のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、又は２％未満、最低で１％未満を含む、５０％未満が、２４，０００Ｄａを超える分子量を有するようなサイズ分布を有することができる。他の態様において、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物中のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の２０％以下が、２４，０００Ｄａを超える分子量を有する。他の態様において、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物中のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の２０％以下が２４，０００Ｄａを越える分子量を有する場合、抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、１，０００Ｄａ～２４，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲、好ましくは１５，０００Ｄａ～約１９，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲のＭｗを有することができる。
他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、８，０００Ｄａ～１６，０００Ｄａの分子量を有する組成物内の多糖類の数に対する１６，０００Ｄａ～２４，０００Ｄａの分子量を有する組成物内の多糖類の数の比が、０．７５：１、０．９：１、１．０：１、１．１：１、１．３：１、又は１．５：１以上、最大で２．０：１以上、好ましくは１．０：１以上を含む、０．５：１以上であるようなサイズ分布を有することができる。他の態様において、８，０００Ｄａ～１６，０００Ｄａの分子量を有する組成物内の多糖類の数に対する１６，０００Ｄａ～２４，０００Ｄａの分子量を有する組成物内の多糖類の数の比が１．０：１以上である、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物はまた、１，０００Ｄａ～２４，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲、好ましくは１５，０００Ｄａ～約１９，０００Ｄａの上記に列挙された任意の範囲でＭｗを有してもよく、ここで、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物内のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類の２０％以下は、２４，０００Ｄａより大きい分子量を有する。
他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、少なくとも約５０ＩＵｍｇ－１、少なくとも７５ＩＵｍｇ－１、１００ＩＵｍｇ－１、１５０ＩＵｍｇ－１、２００ＩＵｍｇ－１、又は５００ＩＵｍｇ－１、最大ｓｗ少なくとも約１，０００ＩＵｍｇ－１を含む、少なくとも約１ＩＵｍｇ－１の抗Ｘａ活性を有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、少なくとも約５０ＩＵｍｇ－１、少なくとも７５ＩＵｍｇ－１、１００ＩＵｍｇ－１、１５０ＩＵｍｇ－１、２００ＩＵｍｇ－１、又は５００ＩＵｍｇ－１、最大で少なくとも約１，０００ＩＵｍｇ－１を含む、少なくとも約１ＩＵｍｇ－１の抗ＩＩａ活性を有することができる。他の態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって調製された抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物は、抗Ｘａ活性対抗Ｘａ活性の比が、少なくとも０．７５：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．３：１、１．５：１、２．０：１、３．０：１、４．０：１、５．０：１、６．０：１、７．０：１、８．０：１、９．０：１、１０．０：１、２０：１、４０：１、６０：１、又は８０：１、最大で少なくとも１００：１を含む、少なくとも０．５：１とすることができる。しかしながら、３２個以上の糖残基であり、ＡＴ及びトロンビンと三次複合体を形成することができる抗凝固性Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類は、典型的には、抗Ｘａ活性対抗ＩＩａ活性の比が通常は１：１に近く、およそ０．９：１～１．１：１である（Keire, D.A., et al., (2011) Anal. Bioanal. Chem. 399: 581-591を参照のこと。この開示は、その全体が参照により組み込まれる）。
改変型硫酸アリール依存性酵素の調製
一般に、開示する核酸及びアミノ酸配列によってコードされる改変型酵素は、後述のものを含む、当技術分野で公知の任意の微生物学的技術を使用して発現及び精製することができる。各精製酵素の硫酸アリール依存性活性は、出発物質及び／又は硫酸化多糖生成物を特徴付けるために、分光光度的若しくは蛍光的に、及び／又は質量分析法（ＭＳ）若しくは核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して決定することができる。そのような方法は実施例の項で後述する。
本発明の改変型遺伝子産物、タンパク質、及びポリペプチドはまた、開示したＤＮＡ又はペプチド配列と比較して、挿入、欠失、又は変異を含み、また、アリール硫酸化合物が基質である反応を触媒する酵素をコードする類似体も有することができる。他の態様において、各類似体は、アリール硫酸化合物がスルホ供与体として利用されるスルホ転移反応を同様に触媒する。類似体は、本明細書に開示するヌクレオチド又はアミノ酸配列から誘導することができ、又はこれらはコンピュータモデリング技術を使用してインシリコ又はデノボで合成的に設計することができる。当業者は、まだ開示されていないか又は発見されていない他の類似体を使用して、本発明の異なる硫酸依存性酵素を設計及び／又は構築することができることを理解するであろう。遺伝子産物、タンパク質、又はポリペプチドは、本明細書に開示する改変型酵素の核酸又はアミノ酸配列の全て又は実質的に全てを含む必要はない。そのような配列は、本明細書では「セグメント」と呼ばれる。さらに、本明細書で論じられ開示する遺伝子産物、タンパク質、及びポリペプチドはまた、本発明で開示する配列の全長配列又は生物学的に機能的なセグメントを含む融合又は組換え改変型酵素も有することができる。そのようなタンパク質を調製する方法は当技術分野で公知である。
本明細書に開示する核酸及びアミノ酸配列に加えて、本発明の方法のいずれも、開示するアミノ酸配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０）と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するか、又は開示したヌクレオチド配列（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２）と実質的に同一であるヌクレオチド配列を有する核酸から発現される、改変型酵素によって実施することができる。当業者は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２のヌクレオチド配列に基づいて、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号６６、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、適当なヌクレオチド配列を決定することができる。
当技術分野で使用される「実質的に同一」な配列は、１つ以上の欠失、置換、又は付加によって特定の参照配列とは異なる配列を指し、その実際の効果は、参照配列によってコードされる改変型ポリペプチドの生物活性の少なくとも一部を保持することである。すなわち、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素の生物活性は、アリール硫酸化合物からスルホ基受容体として作用する多糖へのスルホ基の転移を含む。他の態様において、多糖は、ヘパロサン系及び／又はＨＳ多糖類である。したがって、本発明の改変型酵素を記載するのに用いるとき、「実質的な同一性」は、改変型酵素の特定の遺伝子産物、ポリペプチド、若しくはアミノ酸配列、又は改変型酵素をコードする遺伝子若しくは核酸配列との同一性のいずれかを指すことができる。そのような配列は、開示した配列の変異、又は生物活性がある程度変化、増強、若しくは減少するが、開示した参照核酸配列によってコードされる開示した参照アミノ酸配列又はポリペプチドの元の生物活性の少なくとも一部を保持する配列を有することができる。
あるいは、ＤＮＡ類似体配列は、（ａ）ＤＮＡ類似体配列が、開示する核酸配列のいずれかのコード領域に由来する場合、又は（ｂ）ＤＮＡ類似体配列が、ストリンジェントな条件下において（ａ）のＤＮＡ配列をハイブリダイゼーション可能であり、生物活性な遺伝子産物をコードする場合、又は（ｃ）ＤＮＡ配列が、（ａ）及び／又は（ｂ）で定義されたＤＮＡ類似体配列に対する代替遺伝子コードの結果として縮重している場合、本明細書に開示する特定のＤＮＡ配列と実質的に同一である。実質的に同一の類似体タンパク質は、天然タンパク質の対応する配列と約６０％超同一である。より低い程度の同一性を有するが、同等の生物活性を有する配列、すなわち、アリール硫酸化合物から、多糖類、特にヘパロサン系又はＨＳ多糖類へスルホ基を転移させる配列もまた、実質的に同一であると考えられる。核酸配列の実質的同一性を決定する際に、実質的に同一のアミノ酸配列をコードすることができる全ての対象核酸配列は、生物学的に機能的な等価物を作り出すためのコドン配列又はアミノ酸置換の違いにかかわらず、参照核酸配列と実質的に同一であると見なされる。
生物学的レベルでは、同一性とは、すなわち遺伝子ファミリの所与のファミリメンバー中の同じ相対位置にある同じアミノ酸のことをいう。相同性及び類似性は、一般に、より広い用語として見なされる。例えば、生化学的に類似したアミノ酸、例えばロイシン及びイソロイシン又はグルタミン酸／アスパラギン酸は、代替的に同じ位置に存在することができ、これらはそれ自体同一ではないが、生化学的に「類似している」。本明細書に開示するように、これらは保存的差異（conservative difference）又は保存的置換と呼ばれる。これは、両方ともセリンをコードするコードされたアミノ酸、例えばＴＣＣからＴＣＡへの変化を起こさずにヌクレオチド配列を変化させる、ＤＮＡレベルでの保存的変異とは異なる。
ある態様において、遺伝子及び遺伝子産物は、それぞれの配列内に、改変型酵素又はその対応するタンパク質をコードする遺伝子の「本質的に同様」の配列を有する。改変型酵素をコードする遺伝子の配列と本質的に同様の配列は、開示した核酸配列の一部と実質的に同一又は実質的に類似であり、開示したタンパク質若しくは遺伝子の配列と同一ではないか、又は生物学的に機能的同等物ではない少数の塩基又はアミノ酸（ＤＮＡ又はタンパク質にかかわらない）を含む、配列を指す。生物学的機能的同等性は、当技術分野において充分に理解されており、以下でさらに詳細に論じられる。ヌクレオチド配列は「本質的に同じ」であり、これらは、開示する遺伝子のヌクレオチド配列と同一である核酸残基の、約７５％～約８５％、又は特に約８６％～約９０％、又はより具体的には９０％超、又はさらにより具体的には約９１％～約９５％、又はさらにより具体的には約９６％～約９９％を有する。同様に、開示したポリペプチド配列のアミノ酸と同一又は機能的に同等若しくは生物学的に機能的に同等である、約８０％、又は９０％、又は特に９０～９５％、又はより具体的には９６％超、又はさらにより具体的には９５～９８％、又はさらにより具体的には９９％以上のアミノ酸を有するペプチド配列は、「本質的に同じ」配列であろう。
さらに、機能的に等価なコドンを含む代替の核酸配列もまた、本発明に包含される。機能的に等価なコドンとは、同じアミノ酸をコードするコドン、例えば、セリンのＡＣＧ及びＡＧＵコドンを指す。したがって、以下の表１の機能的に等価なコドンの、上で開示したヌクレオチド配列のいずれかの配列例への置換は、最終的に、スルホ転移を触媒するために、結合に依存し、アリール硫酸化合物と反応する、生物学的に機能的な等価な酵素をコードする。したがって、本発明は、そのような置換を含むが、便宜上その全体が本明細書に記載されないアミノ酸及び核酸配列を有する。
当業者は、アミノ酸及び核酸配列が、さらなるＮ末端若しくはＣ末端アミノ酸又は５’若しくは３’核酸配列などのさらなる残基を有することができるが、それでもなお、配列がスルホ供与体としてのアリール硫酸化合物との結合及び反応に関してその生物活性を保持する限り、本明細書に開示する配列の１つに本質的に示す通りとすることができることを認識するであろう。末端配列の付加は、特に、例えばコード領域の５’若しくは３’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を有することができるか、又は遺伝子内で生じることが知られている様々な内部配列若しくはイントロンを有することができる核酸配列に適用される。
Figure 2022523638000023
上述のように、開示した改変型酵素のいずれかの配列は、同様の又は他の望ましい特徴を有する分子を依然として構成しながら、保存的及び非保存的変異、欠失、及び付加を含む、修飾及び変更を行うことができる。例えば、特定の構造又は化合物、特にアリール硫酸化合物及び／若しくはスルホ受容体多糖類との相互作用能力の顕著な喪失なしに、特定のアミノ酸を、タンパク質構造中の他のアミノ酸で置換することができる。これは、タンパク質がその環境内の他の構造又は化合物を認識し、結合し、反応する能力が、配列自体ではなくそのタンパク質の生物学的機能活性を定義するために起こり得る。したがって、同一の、増強されるか又は減少した特性を有するタンパク質を得るために、そのタンパク質の配列において特定のアミノ酸配列置換を行うことができる。相互作用活性の明らかな喪失なしに起こり得るそのようなアミノ酸置換の１つの非限定的な例には、タンパク質のフォールディング及び溶解性に影響を及ぼさないタンパク質の外部ドメイン又は表面における置換が含まれる。同様に、タンパク質がその基質をフォールディングするか又はその基質を認識して結合する能力が、有害に影響されない限り、タンパク質のいずれかの末端にアミノ酸を潜在的に付加することができる。当業者は、いくつかの他の方法及び／又は戦略を利用して、その活性に影響を与えることなく酵素の配列を変更することができることを理解することができる。
したがって、修飾酵素が親酵素の生物活性を保持する親酵素の構造又は配列に対する変異、欠失、付加又は他の改変は、親酵素と生物学的に機能的に同等であると定義することができる。したがって、改変型硫酸アリール依存性酵素と比較して、生物学的に機能的な同等の酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０に開示するアミノ酸配列の任意の置換又は修飾を有することができる。ここで、得られた修飾酵素は、多糖類、特にヘパロサン系及び／又はＨＳ多糖類へのスルホ転移を触媒するために、アリール硫酸化合物、特にＰＮＳ又はＮＣＳとの相互作用に依存する。特に、そのような置換又は修飾は、後述するように、タンパク質の任意の部分のアミノ酸配列における保存的変異から生じることができるが、酵素の非触媒活性領域における非保存的変異もまた企図される。したがって、改変型酵素は、生物学的に機能的な同等の酵素をコードするヌクレオチド配列を有する任意の核酸から発現され得るが、そのようなヌクレオチド配列は、便宜上その全体が本明細書に記載されていない。
あるいは、組換えＤＮＡ技術を使用して、交換されるアミノ酸の特性を考慮してタンパク質構造の変化を操作することができる生物学的に機能的に等価なタンパク質又はペプチドを作製することができる。合理的に設計された変更は、例えば、特定の変異が酵素の硫酸アリール依存性触媒活性及び／又は酵素の活性部位内のスルホ供与体若しくは受容体の結合に、正又は負の影響を及ぼすかどうかを試験するために、部位特異的突然変異誘発技術の適用によって導入することができる。
アミノ酸置換（例えば、本明細書に記載する改変型酵素のいずれかを修飾する際に使用することができる置換）は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、及びサイズなどに基づく。当業者は、アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状、及びタイプなどの特定のアミノ酸間の類似性に精通している。非限定的な例として、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが全て正に荷電した残基であること；アラニン、グリシン、及びセリンは全て同じサイズであること；フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは全て、概して同様の形状を有することなどの関係が挙げられる。結果として、以下の基（アルギニン、リジン、及びヒスチジン；アラニン、グリシン、及びセリン；並びにフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）を含むアミノ酸は、本明細書では、同じ基の他のアミノ酸に対する生物学的に機能的な等価物として定義される。他の生物学的に機能的に等価な変化は、当業者には理解されるであろう。
生物学的に機能的な等価物を評価するためのそのような方法の１つは、各アミノ酸のヒドロパシ指標を評価及び考慮することである。２０個の共通アミノ酸の各々には、それらの疎水性及び電荷特性に基づいてヒドロパシ指標が割り当てられており、これらは以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；アルギニン（－４．５）。
アミノ酸残基のヒドロパシ指標とタンパク質の生物学的機能との間の関係は、当技術分野で一般的に理解されている（Kyte,J., et al., (1982) J. Mol. Biol. 157 (1): 105-132）。特定のアミノ酸は、類似のヒドロパシ指標又はスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、依然として類似の生物活性を保持することができることが知られている。ヒドロパシ指標に基づいて変更を行う場合、ヒドロパシ指標が元の値の±２以内であるアミノ酸の置換が、この置換が生物学的に機能的に等価であるかどうかを決定するための好ましい尺度であるが、ここで、元の値の±１以内である置換が特に好ましく、元の値の±０．５以内である置換がさらに特に好ましい。
同様に、アミノ酸のような置換は親水性に基づいて効果的に行うことができることも、当技術分野で理解されている。米国特許第4,554,101号（この開示はその全体が参照により組み込まれる）は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、そのタンパク質の免疫原性、抗原性、及び他の生物学的特性と相関することを述べている。アミノ酸は、同様の親水性値を有する別のものに置換することができ、それでもなお生物学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。米国特許第4,554,101号に報告されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。
アミノ酸のヒドロパシ指標に基づいて変異を作製する場合と同様に、親水性に関して同様の変更を行うことができる。したがって、親水性値が元の値の±２以内であるアミノ酸の置換が、この置換が生物学的に機能的に等価であるかどうかを決定するための好ましい尺度であるが、ここで、元の値の±１以内である置換が特に好ましく、元の値の±０．５以内である置換がさらに特に好ましい。
他の態様において、本発明の改変型酵素をコードする単離された核酸又はその機能的フラグメントが提供される。ある態様において、改変型酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。他の態様において、本発明は、本発明の改変型酵素の機能的フラグメントをコードする単離された核酸、又は上記の改変型酵素のいずれかのアミノ酸配列中の特定の残基と比較して保存的置換が行われたその変異体を提供する。
さらに、本発明の改変型酵素のいずれかを発現するために使用される単離された核酸は、様々な用途で使用するために他の核酸配列と結合させることができる。したがって、例えば、単離された核酸は、当技術分野で一般的に知られており、実施例で後述するように、クローニングベクター又は発現ベクターにライゲーションすることができる。さらに、核酸は、当技術分野で一般的に知られているように、融合タンパク質を形成するように別のポリペプチドをコードする配列にインフレームで結合させることができる。融合タンパク質は、溶解性、精製、又は免疫検出などのために、所望の機能を有する他のタンパク質又はペプチドと同じ発現単位内で整列された、改変型酵素のコード領域を有することができる。したがって、他の態様において、本発明の改変型酵素をコードする上記の核酸のいずれかを含むクローニング、発現、及び融合ベクターもまた提供される。
さらに、本発明の核酸セグメントは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列、例えばプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多回クローニングサイト、及び他のコードセグメントなどと、それらの全長がかなり変化し得るように組み合わせることができる。当業者は、ほぼ任意の長さの核酸フラグメントを使用することができ、全長は、典型的には、意図された組換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用の容易さによって制限されることを認識するであろう。
特に、遺伝子又はＤＮＡセグメントのコード部分がプロモータの制御下に位置する組換えベクターが、特に有用である。ある態様において、コードＤＮＡセグメントは、細菌細胞、ウイルス細胞、真核細胞、又は哺乳動物細胞から単離されたプロモータと会合することができる。発現のために選択された細胞型に特異的なプロモータがしばしば最も効果的である。タンパク質発現のためのプロモータと細胞型の組合せの使用は分子生物学の当業者に一般的に知られている（例えば、その全体が参照により組み込まれる、Sambrook et al. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。使用されるプロモータは構成的又は誘導性であってもよく、例えば、組換えタンパク質又はペプチドの大規模生産において有利であるなどの、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するために適切な条件下で使用することができる。高レベルの発現に有効であることが多い適切なプロモータ系には、ワクシニア・ウイルス・プロモータ、バキュロウイルスプロモータ、及びＰｔａｃプロモータが含まれるが、これらに限定されない。
したがって、ある態様において、本発明に適した生物活性な改変型酵素をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターを利用することができる。一例では、発現ベクターは、硫酸アリール依存性遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を有することができる。さらなる態様において、発現ベクターは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。他のさらなる態様において、発現ベクターは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、任意のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。なおさらなる態様において、本発明の改変型酵素をコードする任意の核酸配列は、酵素を産生するために使用される発現宿主に基づいて、コドン最適化することができる。組換えベクターの調製及びコドン最適化は当業者に周知であり、例えばSambrook et al. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.などの多くの参考文献に記載される。
当業者は、発現されるＤＮＡコード配列、この場合、改変型遺伝子産物をコードするＤＮＡコード配列が、プロモータに隣接し、プロモータの制御下にあるベクターに配置されることを認識するであろう。当技術分野で公知のように、プロモータは、典型的には、転写が開始する点（すなわち、転写開始部位）の上流（すなわち、５’から）の約１００ヌクレオチド対以内のＤＮＡ分子の領域である。その領域は、典型的には、異なる遺伝子において同様の相対位置に位置するいくつかのタイプのＤＮＡ配列エレメントを含む。コード配列をそのようなプロモータの制御下に置くために、選択されたプロモータの約１～約５０ヌクレオチド「下流」に（すなわち、３’に）発現される遺伝子産物の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を一般に配置することが、当技術分野で理解されている。
元の挿入されたＤＮＡ内に適切なポリアデニル化部位が含まれていない場合、適切なポリアデニル化部位（例えば、５’－ＡＡＴＡＡＡ－３’）をベクターの転写単位に組み込むこともまた望まれ得る。典型的には、ポリＡ付加部位は、コード配列の約３０～２０００ヌクレオチド「下流」の転写終結前の位置に配置される。
別のタイプの別個の転写調節配列エレメントは、エンハンサである。エンハンサは、特定のコード領域又は遺伝子に時間、位置、及び発現レベルの特異性を課す。エンハンサの主な機能は、そのエンハンサに結合する１つ以上の転写因子を含有する細胞におけるコード配列の転写レベルを増加させることである。エンハンサは、プロモータが存在する限り、転写開始部位から可変距離に位置する場合に機能することができる。
場合により、本発明の発現ベクターは、エンハンサプロモータに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「エンハンサプロモータ」という語句は、エンハンサエレメントとプロモータエレメントの両方を含有する複合単位を意味する。例えば、発現ベクターは、真核生物プロモータであるエンハンサプロモータに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含むことができ、発現ベクターは、カルボキシ末端アミノ酸の３’及びコードされたポリペプチドの転写単位内に位置するポリアデニル化シグナルをさらに含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という語句は、コード配列の転写がそのエンハンサプロモータによって制御及び調節されるように、エンハンサプロモータがコード配列に接続されていることを意味する。コード配列にエンハンサプロモータを作動可能に連結するための技術は当技術分野で周知である。目的のコード配列に対する正確な配向及び位置は、とりわけ、エンハンサプロモータの特異的性質に依存する。
本発明のベクター構築物に使用されるエンハンサプロモータは、トランスフェクトされる細胞における発現を駆動する任意のエンハンサプロモータとすることができる。周知の特性を有するエンハンサプロモータを使用することによって、遺伝子産物発現のレベル及びパターンを最適化することができる。
本発明の改変型酵素は、それらの核酸のクローン増殖及び／又はそれによってコードされるタンパク質若しくはペプチドの発現を引き起こすように本発明の核酸が導入された、原核生物又は真核生物のいずれかの細胞又は細胞株内で発現され得る。そのような細胞又は細胞株は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２に開示されているものを含む、核酸を増殖及び産生するのに有用である。そのような細胞又は細胞株はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列に記載されるものを含む、改変型酵素それ自体を産生するのにも有用である。本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」という用語は、形質転換、トランスフェクション、形質導入、感染、又は他の手段によるかどうかにかかわらず、本発明の核酸のいずれかが導入された、任意の細胞又は任意の細胞の子孫を包含するように意図される。適切なベクターを作製し、それらのベクターで細胞を形質転換し、形質転換体を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Sambrook et al. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。
形質転換細胞の産生に有用な原核細胞には、細菌属エシェキリア（Escherichia）（例えば、大腸菌）、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、緑膿菌（P. aeruginosa））、及びバチルス（Bacillus）（例えば、枯草菌（B.subtilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus））のメンバー、並びに当技術分野でよく知られており、頻繁に使用されている、他の多くのものが含まれる。原核細胞は、大量のタンパク質又はペプチド（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する改変型酵素、これらの配列のフラグメント、又はそれらの配列を有する融合タンパク質）の産生に特に有用である。細菌細胞（例えば、大腸菌）は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモータ系、バクテリオファージλ調節配列又はＭ１３ファージ調節エレメントを有するプラスミドを含む様々な発現ベクター系と共に使用することができる。細菌宿主はまた、例えばプロテインＡ、ｌａｃＺ、ｔｒｐＥ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ポリ－Ｈｉｓタグ、又はグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を作製する、融合タンパク質ベクターで形質転換することができる。これらの全て、並びに多くの他の原核生物発現系は、当技術分野で周知であり、広く市販されている（例えば、ＧＳＴ融合物の場合、ｐＧＥＸ－２７（Ａｍｒａｄ、米国））。
本発明のある態様において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２に記載の核酸配列を有する発現ベクターはまた、任意の改変型酵素との融合タンパク質をコードする遺伝子又は核酸配列を有することができる。さらなる態様において、発現ベクターは、マルトース結合タンパク質をコードするｍａｌＥ遺伝子をさらに有することができる。そのような発現ベクターからタンパク質発現を誘導する際、発現された遺伝子産物は、マルトース結合タンパク質を含む融合タンパク質と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０に記載のアミノ酸配列を有する改変型酵素と、を含む。他のさらなる態様において、上記の改変型酵素のいずれかをコードする上記の核酸のいずれかを含む発現ベクターは、ＳＵＭＯ修飾因子、例えば非限定的な例では、ＳＵＭＯ－１をコードする遺伝子をさらに有することができる。
他の態様において、本発明による発現ベクターは、ポリ－Ｈｉｓタグをコードする核酸配列をさらに有することができる。そのような発現ベクターからタンパク質発現を誘導する際、発現された遺伝子産物は、ポリ－Ｈｉｓタグを含む融合タンパク質と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０に記載のアミノ酸配列を有する改変型酵素と、を含む。さらなる態様において、発現ベクターは、ポリ－Ｈｉｓタグをコードする核酸配列と、ｍａｌＥ遺伝子又はＳＵＭＯ遺伝子の両方を含むことができ、そこから、ポリ－Ｈｉｓタグ、ＭＢＰ、又はＳＵＭＯを含む融合タンパク質を任意の改変型酵素と共に発現させることができる。
形質転換細胞を作製するために有用な真核細胞及び細胞株には、哺乳動物細胞（例えば、内皮細胞、肥満細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、線維芽細胞、ハイブリドーマ、卵母細胞、胚性幹細胞）、昆虫細胞株（例えば、Drosophila Schneider細胞）、酵母、及び真菌が含まれる。そのような細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ－７細胞、ＣＨＯ、細胞、マウス初代心臓微小血管内皮細胞（ＣＭＥ）、マウス肥満細胞株Ｃ５７．１、臍帯静脈のヒト初代内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、Ｆ９胚性がん腫細胞、ラット脂肪パッド内皮細胞（ＲＦＰＥＣ）、及びＬ細胞（例えば、マウスＬＴＡｔｋ－細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リン酸ストロンチウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、マイクロビーズへのバリスティック挿入、プロトプラスト融合を含むがこれらに限定されない当技術分野で周知の様々な方法によって、又はウイルス若しくはファージベクターの場合、組換えウイルス若しくはファージによる感染によって、レシピエント又は「宿主」細胞に導入することができる。
ある態様において、本発明は、生物活性のためにアリール硫酸化合物と反応することに依存する改変型酵素の実質的に純粋な調製物を提供する。さらなる態様において、精製された改変型酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０として開示したアミノ酸配列を有することができる。
他の態様において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０として開示するアミノ酸配列内のある特定の残基について保存的又は非保存的置換が行われた、改変型酵素バリアントを提供する。保存的又は非保存的置換は、酵素が測定可能な触媒活性（すなわち、アリール硫酸化合物から多糖、特にヘパロサン系及び／又はＨＳ多糖類へのスルホ基の転移）を保持する限り、活性部位を取り囲むか又は触媒作用に関与する残基を含む、アミノ酸配列の任意の地点で行うことができる。他の態様において、アリール硫酸化合物はＰＮＳである。さらに他の態様において、アリール硫酸化合物はＮＣＳである。
他の態様において、改変型スルホトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０として開示したアミノ酸配列と比較して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を含む、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する一方、アリール硫酸化合物から多糖、特にヘパロサン系及び／又はＨＳ多糖類へのスルホ基の転移のその触媒活性を維持する。そのような配列を当業者は日常的に生成することができ、スルホトランスフェラーゼ活性は、本明細書に開示するものなどの日常的な方法によって試験することができる。
さらに、他の態様において、本明細書に記載の方法のいずれかに従って利用される改変型スルホトランスフェラーゼのいずれかのアミノ酸配列（複数可）は、スルホトランスフェラーゼが硫酸アリール依存性活性を有する限り、スルホ供与体として３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸を使用して同じ反応を触媒する野生型スルホトランスフェラーゼとのパーセント同一性として特徴付けることができる。例えば、他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用することができる改変型硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．８酵素クラス内の任意の野生型酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列（その生物学的機能的フラグメントを含む）と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。さらなる態様において、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼは、野生型ヒトグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃ中の、エントリｓｐ｜Ｐ５２８４８｜ＮＤＳＴ＿１＿ＨＵＭＡＮ）のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有することができる。
他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用することができる改変型硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．－酵素クラス内の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのアミノ酸配列（その生物学的機能的フラグメントを含む）と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％の配列同一性を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。さらなる態様において、改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼは、野生型ニワトリヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄのエントリｓｐ｜Ｑ７６ＫＢ１｜ＨＳ２ＳＴ＿ＣＨＩＣＫ）のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有することができる。
他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用することができる改変型硫酸アリール依存性グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．－酵素クラス内の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかのアミノ酸配列（その生物学的機能的フラグメントを含む）と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％の配列同一性を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。さらなる態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、マウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ寄託番号Ｑ９ＱＹＫ５）の第１のアイソフォームのアミノ酸配列と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有することができる。さらなる態様において、改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼは、マウスグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ（上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１ＣにおけるエントリＱ９ＱＹＫ５｜Ｈ６ＳＴ１＿ＭＯＵＳＥ）の第１のアイソフォームのアミノ酸配列の残基６７～３７７と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有することができる。
他の態様において、本発明の方法のいずれかに従って利用することができる改変型硫酸アリール依存性グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、ＥＣ２．８．２．２３酵素クラス内の野生型酵素のいずれかのアミノ酸配列（その生物学的機能的フラグメントを含む）と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％の配列同一性を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。さらなる態様において、改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼは、野生型ヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ（上記の図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６ＣにおけるエントリＯ１４７９２｜ＨＳ３Ｓ１＿ＨＵＭＡＮ）の第１のアイソフォームのアミノ酸配列の残基４８～３１１と、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％、最大で少なくとも９７％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有することができる。
実質的に純粋な改変型酵素は、様々な用途で使用するために他のポリペプチド配列に結合することができる。したがって、例えば、改変型酵素は、当技術分野で一般的に知られているように、融合タンパク質を形成するように１つ以上の追加のポリペプチドに結合することができる。追加のポリペプチドは、改変型酵素のＮ末端、Ｃ末端、又は両末端に結合することができる。そのような融合タンパク質は、追加のポリペプチド配列が容易に同定されるか（例えば、抗原決定基を提供することによって）、容易に精製されるか（例えば、親和性精製のためのリガンドを提供することによって）、又は溶液中の改変型酵素の溶解性を高める場合に、特に有用であり得る。
他の態様において、実質的に純粋なタンパク質は、改変型酵素のアミノ酸配列の一部又はフラグメントのみを有することができる。場合によって、特に最小フラグメントが酵素の溶解性又は反応性を高める場合、硫酸アリール依存性活性を保持する最小フラグメントを使用することが好ましい場合がある。したがって、ある態様において、本発明の方法は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０（これらの最小の機能的フラグメントを含む）のアミノ酸配列によって記載した全長形態を含む、任意の長さの実質的に純粋な改変型スルホトランスフェラーゼを用いて実施することができる。さらに、これらのタンパク質は、上記の保存的又は非保存的置換バリアントも有することができる。
改変型酵素は、それらのタンパク質配列によって明らかにされた特性に基づいて選択された様々な方法のいずれかによって実質的に精製することができる。典型的には、改変型酵素、融合タンパク質、又はそのフラグメントは、上記のように、発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞から精製することができる。昆虫、酵母、真核生物、又は原核生物の発現系を使用することができ、当技術分野で周知である。タンパク質又はフラグメントが、ゴルジ体、小胞体、又はそのような細胞の他の膜含有構造に由来するミクロソーム内に局在する場合、タンパク質は適切な細胞画分から精製することができる。あるいは、タンパク質がこれらの構造内に局在しないか、又は組換え細胞内の封入体中に凝集しない場合（例えば、原核細胞）、タンパク質は、標準的な手段によって全溶解細胞又は可溶化された封入体から精製することができる。
精製は、親和性クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ）、高速クロマトフォーカスクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、免疫沈降、又は免疫親和性精製を含むが、これらに限定されない、標準的なタンパク質精製手順を使用して達成することができる。ゲル電気泳動（例えば、ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を使用して、その分子量、電荷特性、及び疎水性に基づいてタンパク質又はペプチドを単離することもできる。
改変型酵素又はそのフラグメントは、抗原決定基、ポリヒスチジンタグ（例えば、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓベクター、ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏｒｐ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）、又はより大きなタンパク質（例えば、ｐＧＥＸ－２７ベクターを使用したＧＳＴ（Ａｍｒａｄ、米国）、Ｇｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎベクターを使用した緑色蛍光タンパク質（GlBCO/BRL. Gaithersburg、メリーランド州）、ｐＭＡＬベクターを使用したマルトース結合タンパク質（New England Biolabs、Ipswich、マサチューセッツ州）、又はＳＵＭＯタンパク質などの別のペプチドに融合した所望の配列を有する融合タンパク質を作製することによっても、簡便に精製することができる。融合タンパク質は、原核細胞又は真核細胞から発現及び回収され、融合ベクター配列に基づく任意の標準的な方法によって精製することができる。例えば、融合タンパク質は、融合物の非硫酸アリール依存性酵素部分に対する抗体との免疫親和性若しくは免疫沈降によって、又はポリ－Ｈｉｓタグの場合、ニッケルカラムへの親和性結合によって精製することができる。次いで、所望の改変型酵素タンパク質又はフラグメントを、融合タンパク質の酵素的切断によって融合タンパク質からさらに精製することができる。タンパク質の精製のためにそのような融合構築物を調製及び使用する方法は当技術分野で周知であり、現在、この目的のために多数のキットが市販されている。
さらに、ある態様において、任意の改変型酵素をコードする単離された核酸を使用して、宿主細胞を形質転換することができる。次いで、得られたタンパク質を、以下の実施例に記載する方法を含むがこれらに限定されない周知の方法によって実質的に精製することができる。あるいは、単離された核酸は、無細胞インビトロ翻訳系において利用することができる。このような系もまた当技術分野で周知である。
本発明の特定の態様を説明したが、本発明は、本開示の精神及び範囲内でさらに変更することができる。当業者は、本明細書に記載の特定の手順、態様、特許請求の範囲、及び実施例に対する多数の等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、そのような同等物は、本発明の範囲内にあると考えられ、したがって、本出願は、その一般的な原理を使用して本発明の任意の変形、使用、又は適合を網羅することを意図している。さらに、本発明は、本発明が関連し、添付の特許請求の範囲に含まれる技術分野における既知の又は慣習的な実施に含まれるような本開示からの逸脱を網羅することを意図している。
明確にするために、別個の態様の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の態様において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の態様の文脈で記載される本発明の様々な特徴はまた、別個に、又は任意の適切な部分的組合せで、又は本発明の任意の他の記載された態様で適切であるように提供されてもよい。様々な態様の文脈で説明される特定の特徴は、態様がそれらの要素なしでは動作不能でない限り、それらの態様の本質的な特徴と見なされるべきではない。
本明細書で言及される全ての参考文献、特許、及び特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれ、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。本明細書に組み込まれた刊行物及び特許出願の全ては、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示しており、あたかも各個々の刊行物又は特許出願が具体的に示され、個々に参照によって示されたのと同じ程度まで組み込まれる。
本発明を以下の実施例及び予測例によってさらに説明するが、いずれも本発明を限定するものと解釈すべきではない。さらに、項目の見出しが使用される範囲では、それらは必ずしも限定的であると解釈すべきではない。建設的又は予測的であると別途示されている例を説明するための過去時制のいかなる使用も、建設的又は予測例が実際に実行されたことを反映することを意図していない。
以下の実施例及び予測例は、現在最もよく知られている本発明の態様を示す。しかしながら、以下は、本発明の原理の適用の単なる例示又は説明であることを理解されたい。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって多数の改変及び代替の組成物、方法、及びシステムが考案することができる。したがって、本発明を具体的に上述したが、以下の実施例は、本発明の最も実用的で好ましい態様であると現在考えられているものに関連してさらに詳細を提供する。
実施例１：改変型硫酸アリール依存性酵素のクローニング、発現、及び精製
本開示の態様に従って、本発明による遺伝子を、改変型硫酸アリール依存性酵素、特にスルホトランスフェラーゼ活性を有する酵素を過剰発現することができる宿主細胞に形質転換することができるかどうかを決定するための試験を行った。発現後、各硫酸アリール依存性酵素を、宿主細胞から単離し、精製した。
一般に、任意の配列の遺伝子をコードするＤＮＡは、オリゴヌクレオチド合成及びアニーリングを含むがこれらに限定されない、当技術分野で一般的に公知の方法によってデノボで合成することができる。あるいは、ＤＮＡを商業的に合成しても、ThermoFisher Scientific（GenScript、ＤＮＡ２．０）又はOriGeneを含むがこれらに限定されない、所与の配列の遺伝子を定期的に合成するいくつかの実験室のいずれかから購入してもよい。当業者は、同じサービスを提供するいくつかの会社が存在し、上記に提供したリストはそれらのほんの一例にすぎないことを理解するであろう。目的の遺伝子は、独立して合成され、続いて、従来の分子生物学技術を使用して細菌若しくは他の発現ベクターに挿入することができるか、又はこの遺伝子は、発現ベクター自体を有するＤＮＡと同時に合成することができる。目的の遺伝子と同様に、適切な発現ベクターも合成又は商業的に入手することができる。多くの場合、細菌発現ベクターは、宿主細胞に選択的抗生物質耐性を付与する遺伝子、及びイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加に応答して細胞が目的のタンパク質を過剰産生することを可能にする遺伝子を含む。タンパク質発現を誘導するためにＩＰＴＧを使用する目的のタンパク質の細菌産生は、当技術分野で広く知られている。
上記のように、発現ベクターはまた、タンパク質フォールディング及び溶解性を補助するために追加の公知のタンパク質と同時発現される所望のタンパク質を含む、融合タンパク質の産生を可能にする遺伝子を含むことができる。一般的に産生され、当技術分野で周知である融合タンパク質の非限定的な例として、ＭＢＰ、ＳＵＭＯ、又は緑色蛍光タンパク質との融合物が挙げられる。特に、ＭＢＰ融合タンパク質は、ＭＢＰがいくつかの親和性クロマトグラフィカラムで使用されるアミロース系樹脂に対して高い親和性を有するので、より容易な精製を促進する一方、ＳＵＭＯ融合タンパク質は、固定相としてＮｉ２＋系樹脂を用いたカラムでの親和性精製を可能にするポリヒスチジンタグを有することができる。多くの場合、目的のタンパク質とＭＢＰ及び／又はＳＵＭＯとの間の融合タンパク質は、場合により、２つのタンパク質を連結するアミノ酸連結配列を有することができる。ＭＢＰ融合タンパク質を産生するために購入することができる市販の発現ベクターの非限定的な例として、New England Biolabsから入手することができるｐＭＡＬ－ｃ５Ｅ（商標）及びｐＭＡＬ－ｃ５Ｘ（商標）ベクターが挙げられる。同様に、別の非限定的な例では、市販の発現ベクターを購入して、Life Sensors, Inc.から入手可能なｐＥ－ＳＵＭＯｐｒｏ ＡＭＰベクターなどのＳＵＭＯ融合タンパク質を産生することもできる。融合タンパク質が産生され、精製されると、切断が活性に必要な場合に、プロテアーゼを利用して、融合タンパク質及び任意の関連リンカー配列を酵素から切断することができる。
さらに、発現ベクターはまた、目的のタンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかで合成することができるポリヒスチジンタグをコードするＤＮＡを有することができる。ＭＢＰ融合物と同様に、ポリヒスチジンタグを含むタンパク質は、タグが多くの精製カラムで利用されるＮｉ２＋樹脂に対して高い親和性を有するので、酵素精製を単純化する。さらに、酵素の最適な活性に必要な場合、精製後にポリヒスチジンタグを切断してもよい。Ｃ末端ポリヒスチジンタグをコードする発現ベクターの非限定的な例は、Ｎｏｖａｇｅｎから入手可能なｐＥＴ２１ｂベクターである。ポリヒスチジンタグをコードする発現ベクターの別の非限定的な例は、ＳＵＭＯタンパク質のＮ末端にポリヒスチジンタグをコードするｐＥ－ＳＵＭＯベクターである。
本実施例では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型硫酸アリール依存性酵素をそれぞれコードする、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２のヌクレオチド配列を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’（ＩＤＴ）ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｅｒｖｉｃｅを用いて合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を開始して、発現ベクターへの挿入を容易にするために、適切な制限酵素認識配列を有する順方向及び逆方向プライマを使用し、各二本鎖ＤＮＡフラグメントのコピーを生成した。配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型酵素をコードする、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、又は配列番号１５２のヌクレオチド配列を有する遺伝子は、それぞれ、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素認識配列を含有し、ＮＥＢによって提供されるクイックライゲーションキットを用いてｐＭＡＬ－ｃ５ｘ発現ベクターにライゲーションした。次いで、発現ベクターをコンピテントＤＨ５－α大腸菌細胞に形質転換した。単一クローンを、１００μＬ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地中でインキュベートした。形質転換宿主細胞内の各遺伝子及び発現ベクターのヌクレオチド配列を、市販のＤＮＡシーケンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ）によって確認した。
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型酵素のタンパク質発現は、確認されたＤＮＡ構築物をコンピテントＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ＥｘｐｒｅｓｓｌｙｓＹ大腸菌細胞に形質転換することによって達成されたが、しかしながら、タンパク質発現は、確認されたＤＮＡ構築物をコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換することによってもまた達成される。いずれかの構築物から、得られたコロニーを使用してＬＢ培地中２５０ｍＬの培養物に接種し、これを振盪し、およそ０．４～０．６の６００ｎＭ（ＯＤ６００）での光学密度が観察されるまで３２℃でインキュベートした。１８℃で各培養物に１００μＭ ＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導した。
１８℃で一晩インキュベートし際、３，６２０ｇで遠心分離し、ペレットを再懸濁緩衝液１０ｍＬ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム；１０μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）中に再懸濁することによって、発現細胞を回収した。再懸濁した細胞を、氷上で１０秒間３回のパルスの超音波処理で溶解し、続いて０．４５μｍシリンジフィルタに通した。得られた上清を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む結合緩衝液に懸濁したＤｅｘｔｒｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂（GE Biosciences）を有する、５ｍＬスピンカラム（Ｇ－ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５；０．１５Ｍ ＮａＣｌ；及び４０ｍＭマルトースを含む溶出緩衝液を添加すると、目的の酵素がカラムから溶出した。
一方、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、又は配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型酵素をコードする、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、又は配列番号１０９のヌクレオチド配列を有する遺伝子は、それぞれ、ＢｓａＩ及びＸｂａＩ制限酵素認識配列を含有し、ｐＥ－ＳＵＭＯベクター（LifeSensors, Inc.）にライゲーションされた。次いで、発現ベクターをコンピテントＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌細胞に形質転換した。単一クローンを、１００μＬ／ｍＬのアンピシリンを含むテリフィックブロス（Terrific Broth）中でインキュベートした。形質転換宿主細胞内の各遺伝子及び発現ベクターのヌクレオチド配列を、市販のＤＮＡシーケンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ）によって確認した。
配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、又は配列番号１０８のアミノ配列を有する改変型酵素のタンパク質発現は、５００ｍＬの培養物をテリフィックブロス中にアンピシリンと共に接種し、培養物をおよそ０．６～０．８のＯＤ６００に達するまで３５℃で振盪しながらインキュベートすることによって達成した。０．２ｍＭ ＩＰＴＧを１８℃で添加することによってタンパク質発現を誘導した。次いで、培養物を１８℃で一晩インキュベートし、続いて溶解し、上記と同一の手順を使用して濾過した。その後、改変型酵素を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び３０ｍＭイミダゾールを含む結合緩衝液に懸濁したＨｉｓＰｕｒ Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を有する、５ｍＬスピンカラム（Ｇ－ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び３００ｍＭイミダゾールを含む溶出緩衝液を添加すると、目的の酵素がカラムから溶出した。
実施例２：硫酸アリール依存性スルファターゼ活性の確認
一般に、ＰＮＳ、ＭＵＳ、７－ヒドロキシクマリン硫酸塩、硫酸フェニル、４－アセチルフェニル硫酸塩、インドキシル硫酸塩、１ナフチル硫酸塩、２ＮａｐＳ、及びＮＣＳを含むがこれらに限定されない、多くのアリール硫酸化合物の脱硫芳香族生成物は、それぞれ近紫外又は可視スペクトルの光を吸収する又は蛍光を発する能力を有するので、硫酸アリール依存性酵素のスルファターゼ活性を容易に決定することができる。脱硫された芳香族生成物による吸光又は蛍光は、それぞれ、分光光度計又は蛍光光度計を用いて検出することができる。当業者は、特定のアリール硫酸化合物及びその脱硫芳香族生成物のスペクトル特性に基づいて、反応の進行を監視するためにどの機器を使用するかを容易に決定することができるであろう。
非限定的な一例では、ＰＮＳを基質として利用する反応は、硫酸エステル結合の加水分解時に生成物としてｐ－ニトロフェノールを生成する。ｐ－ニトロフェノール（約７．１５）のｐＫａよりも大きいｐＨを有する反応混合物は、負に荷電したｐ－ニトロフェノレートイオンが中性に荷電したｐ－ニトロフェノールよりも優勢であるため、黄色になる。典型的には、ｐ－ニトロフェノラートイオンを含む溶液による可視光の最大吸光度は、約４０５ｎｍの波長で観察することができる。その結果、同一の緩衝液条件でＰＮＳのみを含有する陰性対照よりも大きい反応条件下での吸光度値は、酵素が活性であることを示す。同様に、特定の硫酸アリール依存性酵素による触媒作用の結果としてより多くのｐ－ニトロフェノラートイオンが生成されるので、時間の関数として反応混合物の吸光度を約４０５ｎｍで測定して、反応速度及び他の動力学的情報を決定することができる。別の非限定的な例として、硫酸エステル結合の加水分解時のＮＣＳの脱硫生成物である４－ニトロカテコールの生成は、約５１５ｎｍの波長で可視光の吸光度を観察することによって、４－ニトロカテコールのｐＫａよりも高いｐＨ（約７．１７）を有する反応で測定することができる。
別の限定的な例として、２ＮａｐＳの脱硫生成物は、より低波長の放射によって励起されるのに応答して溶液中で蛍光を発することができる。溶液のｐＨに応じて、脱硫生成物は２－ナフトール又は２－ナフトラートイオン（ｐＫａ＝９．５）のいずれかである。溶液中の単一の２－ナフチル種の存在を確実にするために、完了した反応を有する組成物は、典型的には、３５５ｎＭ程度の発光最大値を有する２－ナフトール又は約４１０ｎｍの発光最大値を有する２－ナフトラートイオンの完全な形成のいずれかに平衡を推進するために、酸又は塩基のいずれかでクエンチされる。いずれの場合も、脱硫生成物は３２０ｎｍ程度の波長で励起することができる。
したがって、本開示の態様に従って、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する精製酵素のスルファターゼ活性を決定するための試験を実施した。ＰＮＳ、ＮＣＳ、及び２ＮａｐＳによる非定常状態スルファターゼ活性を、溶出緩衝液中５０μＭ酵素及び５ｍＭ基質を含有する反応液１００μＬ中でモニタした。ＰＮＳを含む反応物において、ｐ－ニトロフェノラートの生成の結果としての反応混合物の吸光度を、４０１ｎｍで測定した。ＮＣＳを含む反応物において、４－ニトロカテコールの生成の結果としての反応混合物の吸光度を、５１５ｎｍで測定した。２ＮａｐＳを含有する反応混合物を、０．１Ｍ ＮａＯＨを添加することによってクエンチして、反応の結果として生成した２－ナフトールの全てを２－ナフトレートイオンに変換した。全ての活性実験セットは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Molecular Dynamics）を用いて行った。さらに、溶出緩衝液（上記参照）中にアリール硫酸化合物を含有したが、酵素が存在しない陰性対照反応条件を、各実験について設定した。改変型酵素の活性実験をいくつかのデータセットで行った。全ての生データを標準化し、酵素以外の全ての他の成分を添加した対照に対するシグナルの増加の割合として評価し、結果を以下の表２～表１０に報告した。特に、天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼの変異体である酵素の結果を表２、表３、及び表４に報告し、天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼの変異体である酵素の結果を表５及び表６に報告し、天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼの変異体である酵素の結果を表７及び表８に報告し、天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼの変異体である酵素の結果を表９及び表１０に報告する。
Figure 2022523638000024
Figure 2022523638000025
Figure 2022523638000026
Figure 2022523638000027
Figure 2022523638000028
Figure 2022523638000029
Figure 2022523638000030
Figure 2022523638000031
Figure 2022523638000032
上記の表に見られるように、酵素の一部はＰＮＳで活性であり、一部はＮＣＳで活性であり、多くはＰＮＳ及びＮＣＳの両方で活性である。一般に、いずれかのアリール硫酸化合物と活性な酵素を含有する反応混合物は、陰性対照よりもおよそ１．１～２．５倍大きい吸光度を示した。
実施例３：改変型硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のＮ－硫酸化多糖生成物の質量分析特性評価
質量分析（ＭＳ）を使用して、それらのスルホ転移反応の結果として形成されるＮ－硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を確認するために、本開示の態様に従って試験を行った。各改変型酵素を実施例１の手順に従って精製した。スルホトランスフェラーゼ活性を、５０μＭ酵素を含有する反応物１００μＬにおいてモニタした。各精製タンパク質溶液について、アリール硫酸化合物２０ｍｇ（ＰＮＳ又はＮＣＳのいずれか）を反応緩衝液２ｍＬ（５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）に溶解し、タンパク質溶液に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンの２ｍｇ／ｍＬ溶液２．５ｍＬをタンパク質／供与体溶液に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンは、Balagurunathan, K. et al (eds.) (2015), Glycosaminoglycans: Chemistry and Biology, Methods in Molecular Biology, vol. 1229, DOI 10.1007/978-1-4939-1714-3_2, cSpringer Science+Business Media, New York, pp.11-19 (section 3.1)に記載のプロトコルに従って合成した。Ｎ－硫酸化生成物を精製するために、インキュベートした反応混合物を翌日５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。フィルタを水２ｍＬで１回洗浄し、再度遠心分離した。濾液を１Ｋ ＭＷＣＯ透析膜に添加し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で２日間透析し、１時間、２時間、８時間、１６時間、３２時間で水を交換し、次いで凍結乾燥した。
続いて、各反応からの凍結乾燥Ｎ－硫酸化生成物を、配列番号１６１、配列番号１６２、及び配列番号１６３のアミノ酸配列を有する３つの炭素－酸素リアーゼの混合物で消化した。これは、ヘパロサン系多糖類のβ脱離切断を触媒する。そのようなリアーゼは、数ある化学的及び生物学的な商業団体の中でも、New England Biolabsから入手可能である。各リアーゼ１μＬを凍結乾燥硫酸化多糖生成物５０μｇ及び提供された消化緩衝液とインキュベートし、各リアーゼと共にNew England Biolabsによって提供された、パッケージされた説明書に従って、２４時間にわたりインキュベートした。消化後、リアーゼ酵素を１００℃に５分間加熱することによって不活性化した。試料を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、強陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＳＡＸ）分析に導入した。ＳＡＸ分析はＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＬＣシステムインターフェースで行った。分離は、粒径５．０μｍの４．６×２５０ｍｍ Ｗａｔｅｒｓ Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ分析カラムで４５℃にて行った。移動相溶液Ａは２．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）であり、移動相溶液Ｂは２．５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）及び１．２Ｍ過塩素酸ナトリウムであった。各試料をカラムに充填した後、移動相溶液Ａを９８％、移動相溶液Ｂを２％の比率にて流速１．４ｍＬ／分で５分間カラムに適用した。５分後、移動相溶液Ｂを増加させる直線勾配を、移動相溶液Ａと移動相溶液Ｂとの比率が５０：５０になるまで適用した。
ＳＡＸ分析を使用して、試験した８つの酵素のうち６つがスルホトランスフェラーゼとして活性であることを決定した。しかしながら、各スルホトランスフェラーゼは、ＰＮＳ及びＮＣＳの両方で必ずしも活性ではなかった。配列番号５、配列番号７、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する酵素はＮＣＳのみに活性を有し、配列番号１５のアミノ酸配列を有する酵素はＰＮＳのみに活性を有していた。配列番号９及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する酵素は、いずれのアリール硫酸化合物に対しても活性を有していた。
反応の結果として生成したＮ－硫酸化生成物の存在を示すＳＡＸ分析からの代表的なクロマトグラムを図２９に示す。配列番号１３によって製造したＮ－脱アセチル化ヘパロサン出発物質及びＮ－硫酸化生成物の両方を、配列番号１６１、配列番号１６２、及び配列番号１６３のアミノ酸配列を有するリアーゼで、上記の消化手順に従って消化した。Iduron, Ltdから市販される２つの二糖標準（ＨＤ００５及びＨＤ０１３）もまたＳＡＸを用いて分析した。ＨＤ０１３二糖は非置換グルコサミン残基及び還元されたヘキスロン酸を有する。ＨＤ００５二糖は、グルコサミン残基がＮ－硫酸化されていることを除いて、ＨＤ０１３と同じである。重ね合わされたクロマトグラムは全て標準化されているので、各クロマトグラムの最も顕著なピークに標準化相対蛍光値１．０が割り当てられる。
図２９に示すように、ＨＤ０１３二糖の最も顕著なピーク（＊記号で示す）はほぼすぐに溶出するが、ＨＤ００５二糖の最も顕著なピーク（＊＊記号で示す）はおよそ１７分後に溶出する。正に荷電した種（ＨＤ０１３など）は典型的にはカラムに結合しないが、負に荷電した種（ＨＤ００５など）はカラムに結合するので、これはＳＡＸ条件下で予想される。同様に非硫酸化であるＮ－脱アセチル化ヘパロサンは、ＨＤ０１３とほぼ同一の時間に最も顕著に溶出する。同様に、反応中に生成した凍結乾燥試料は、ＨＤ００５とほぼ同一の時間にピークを示し、試料がＮ－硫酸化生成物を含有することを示す。各クロマトグラム内、特に合成した出発物質及び生成物内の他のピークは、各例で多糖類を精製する唯一の基礎としてのスピン濾過カラムの使用に基づく試料純度の欠如を示す。当業者は、より精製された生成物が望まれる場合に利用することができるいくつかの他の分離技術があることを理解するであろう。さらに、クロマトグラムにおける蛍光シグナルのベースラインの上方へのドリフトは、移動相を介して塩の量が増加してカラムに導入される場合、既知の現象である。
実施例４：改変型硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の２－Ｏ硫酸化多糖生成物の質量分析特性評価
本開示の態様に従って、実施例３と同様の手順を用いて、スルホ転移反応の結果として形成される２－Ｏ硫酸化多糖生成物の存在を検出することにより、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、又は配列番号６５のアミノ酸配列を有する酵素のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を確認するための試験を実施したが、スルホ受容体多糖は、化学的手段（製品ＤＳＨ００１／２、Galen Laboratory Suppliesより入手可能）により２－Ｏ硫酸基が選択的に除去された市販のヘパラン硫酸であり、硫酸化生成物を含む消化試料の分析は、質量分析を用い、ＳＡＸベースの高速液体クロマトグラフィ（ＬＣＭＳ）と組み合わせて行った。
配列番号１６１、配列番号１６２、及び配列番号１６３のアミノ酸配列を有する炭素－酸素リアーゼを用い、実施例３に記載の手順に従って２－Ｏ硫酸化生成物を消化して得られた二糖を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－８０５０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで定量した。消化した各試料１００ｎｇを、１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ１０）で希釈した。二糖をＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ ＨＰＬＣカラム（１００×２．１ｍｍ、５μｍ）で分離した。移動相は１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ１０）からなり、二糖を０％～２０％のアセトニトリル勾配で２．５分間溶出し、次の２．５分間は２０％に保持し、次の注入前に０％で２分間平衡化した。流速は０．２ｍＬ／分であり、総運転時間は７．１分であった。
ＬＣＭＳからの抽出イオンクロマトグラムを、それぞれ、配列番号６３又は配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型酵素との反応から得られた２－Ｏ硫酸化生成物に対応する図３０Ａ及び図３Ｂに示す。ピークを、一連の８つの二糖標準のクロマトグラム、及び同様にリアーゼ混合物も使用して消化した市販のＵＦ－ＨＳ多糖類（ＣＡＳコード：９０４１－０８－１、Millipore Sigmaから入手可能）１００ｎｇからのクロマトグラムと比較した。８つの参照二糖標準（Ｄ０Ａ０、Ｄ０Ｓ０、Ｄ０Ａ６、Ｄ２Ａ０、Ｄ０Ｓ６、Ｄ２Ｓ０、Ｄ２Ａ６、Ｄ２Ｓ６）は、Ｎ－、２－Ｏ、及び６－Ｏ位で可変的に硫酸化されている二糖を表す。特に、二糖Ｄ２Ｓ０は、２－Ｏ位に硫酸化されたヘキスロニル残基と、Ｎ－硫酸化グルコサミン残基とを有する二糖を表す。二糖標準（図示せず）、消化した市販の硫酸化多糖（図示せず）、及び配列番号６３又は配列番号６５のアミノ酸配列を有する改変型酵素の硫酸化多糖生成物の全てからのスペクトルからの保持時間及びピーク面積を下記表１１にまとめる。個々の二糖のイオン化は異なるため、ＥＩＣクロマトグラムにおける現在のパーセントは、それらの実際の存在量を表していない可能性がある。しかしながら、イオン化効率は、試料ごとに各二糖について同一である。したがって、試料ごとの同じ糖類のピーク面積パーセントの比較は、依然として達成できると考えられる。
Figure 2022523638000033
改変型酵素のスルホトランスフェラーゼ活性を、反応前に以前に脱硫されていたスルホ受容体多糖内のヘキスロン酸残基の２－Ｏ位での再硫酸化によって確認した。これは、改変型酵素及びＮＣＳの両方の反応から単離された生成物内のＤ２Ｓ０二糖の存在によって示される。特定の理論に制限されるものではないが、改変型酵素の活性は、ヘキスロン酸残基がＮ－硫酸化されているが６－Ｏ硫酸化されていないグルコサミン残基に隣接している多糖の一部との反応に依存するとも考えられる。これは、単離された硫酸化多糖生成物内に検出されたＤ２Ｓ６（２－Ｏ硫酸化ヘキスロン酸残基及びＮ，６－硫酸化グルコサミン残基）及びＤ２Ａ６（２－Ｏ硫酸化ヘキスロン酸残基及び６－Ｏ硫酸化Ｎ－アセチルグルコサミン残基）二糖の欠如によって示される。これは、ＥＣ２．８．２．－内の野生型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼと同様の反応性であり、式ＩＶ又は式Ｖのいずれかの構造を有するＮ－硫酸化ヘパロサンと反応すると考えられる。
実施例５：改変型硫酸アリール依存性グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の６－Ｏ硫酸化多糖生成物の質量分析特性評価
スルホ受容体多糖は、Kariya, Y., et al., (2000) J. Biol. Chem. 275 (34): 25949-25958に記載の手順に従って、市販のＵＦ－ＨＳ（ＣＡＳコード：９０４１－０８－１、Millipore Sigmaより入手可能）を６－Ｏで化学的に脱硫酸して調製した以外、本開示の態様に従い、実施例４と同様のＬＣＭＳ手順を用いて、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、又は配列番号１０８のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を、それらのスルホ転移反応の結果として６－Ｏ硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって確認する試験を行った。
配列番号１０４、配列番号１０６、又は配列番号１０８のアミノ酸配列を有する改変型酵素との反応から得られた６－Ｏ硫酸化生成物に対応する抽出イオンクロマトグラムをそれぞれ、図３１Ａ、図３１Ｂ及び図３１Ｃに示す。配列番号１０４及び配列番号１０６の配列を有する酵素は、ＮＣＳがスルホ基供与体である場合に活性であり、配列番号１０８の配列を有する酵素は、ＰＮＳがスルホ基供与体である場合に活性であった。割り当てたピークは、８つの参照二糖標準の決定された保持時間に基づいた。８つの参照二糖標準（Ｄ０Ａ０、Ｄ０Ｓ０、Ｄ０Ａ６、Ｄ２Ａ０、Ｄ０Ｓ６、Ｄ２Ｓ０、Ｄ２Ａ６、及びＤ２Ｓ６）は、Ｎ－、２－Ｏ、及び６－Ｏ位で可変的に硫酸化されている二糖を表す。ＤＯＡ６、Ｄ０Ｓ６、Ｄ２Ａ６、及びＤ２Ｓ６は、６－Ｏ硫酸化グルコサミン残基を有する。Ｓ６はＮ，６－硫酸化グルコサミン残基を示し、Ａ６は６－Ｏ硫酸化Ｎ－アセチルグルコサミン残基を示す。各クロマトグラムは、Ｎ，６－硫酸化グルコサミン残基の合成に相関する２つの積分可能なピークである、Ｄ０Ｓ６及びＤ２Ｓ６を示し、それぞれ２－Ｏ位で非硫酸化又は硫酸化のいずれかであるヘキスロン酸残基に隣接する。全ての標識化二糖のピーク面積％を以下の表１２に示す。個々の二糖のイオン化は特にＤ０Ａ０及びＤ２Ｓ６について異なるため、ＥＩＣクロマトグラムにおける現在のパーセントは、それらの実際の存在量を表していない可能性がある。しかしながら、イオン化効率は、試料ごとに各二糖について同一である。したがって、試料ごとの同じ糖類のピーク面積パーセントの比較は、依然として達成できると考えられる。
Figure 2022523638000034
改変型酵素のスルホトランスフェラーゼ活性を、上記のY., et alによる手順によって脱硫酸されたグルコサミン残基の６－Ｏ位での再硫酸化によって確認した。これは、各酵素との反応から単離された生成物中のＤ０Ｓ６及びＤ２Ｓ６二糖の存在によって示される。各改変型酵素の中で、Ｄ０Ｓ６及びＤ２Ｓ６二糖のピーク面積百分率を比較すると、配列番号１０８のアミノ酸配列を有するグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼが最も活性であったと思われる。しかしながら、Ｄ０Ａ６及びＤ２Ａ６多糖類は、特定の理論に制限されるものではないが、改変型酵素によって生成した６－Ｏ硫酸化生成物のいずれにおいても観察されなかったが、これらの酵素は、特にＥＣ２．８．２．－．内の天然の野生型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼの反応性に基づいて、反応前にＮ－アセチルグルコサミン残基の存在が確認される酵素及び／又は多糖の濃度を増加させることによって、異なる反応条件でスルホ基をＮ－アセチルグルコサミン残基に転移させることができると考えられる。
実施例６：改変型硫酸アリール依存性グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の３－Ｏ硫酸化多糖生成物の質量分析特性評価
スルホ受容体多糖が市販のＵＦ－ＨＳ（ＣＡＳコード：９０４１－０８－１、Millipore Sigmaより入手可能）であった以外、本開示の態様に従い、実施例４と同様のＬＣＭＳ手順を用いる反応を用いて、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する酵素のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を、それらのスルホ転移反応の結果として３－Ｏ硫酸化多糖生成物の存在を検出することによって確認する試験を行った。未修飾ＵＦ－ＨＳは約３．５％（ｗ／ｗ）の３－Ｏ硫酸化グルコサミン残基を含有するが、グルコサミン残基の約６０％はＮ，６－硫酸化されており、式Ｘのように２－Ｏ硫酸化ヘキスロン酸残基に隣接している。その結果、これらのＮ，６－硫酸化グルコサミン残基は依然として３－Ｏ硫酸化することができる。
抽出したイオンクロマトグラムを、一連の１０個の参照標準及び市販の多糖１００ｎｇ（これもまたリアーゼ混合物を使用して消化した）のクロマトグラムと共に、図３２Ａ及び図３２Ｂに示す。１０個の参照標準（Ｄ０Ａ０、Ｄ０Ｓ０、Ｄ０Ａ６、Ｄ２Ａ０、Ｄ０Ｓ６、Ｄ２Ｓ０、Ｄ２Ａ６、Ｄ２Ｓ６、Ｄ０Ａ６Ｇ０Ｓ３、及びＤ０Ａ６Ｇ０Ｓ９）は、Ｎ－、２－Ｏ、３－Ｏ、及び６－Ｏの位置で可変的に硫酸化されている二糖又は四糖を表す（図３２Ａ、上部）。明確化のために、３－Ｏ硫酸化グルコサミン残基（Ｄ０Ａ６Ｇ０Ｓ３）及び（Ｄ０Ａ６Ｇ０Ｓ９）を含む参照ピークを、消化した市販の多糖スペクトルで示す（図３２Ａ、中央）。配列番号１４７（ＰＮＳ、図３２Ｂ、中央）、配列番号１４９（ＰＮＳ、図３２Ｂ、下部）（ＮＣＳ、図３２Ａ、下部）、及び配列番号１５１（ＮＣＳ、図３２Ａ、上部）のアミノ酸配列を有する酵素との反応から消化した硫酸化多糖生成物を表す４つの質量スペクトルを、消化しれた市販の多糖スペクトルの下に示す。標識された二糖及び四糖全てのピーク面積％は下記表１３に示す。個々の二糖のイオン化は特にＤ０Ａ０及びＤ２Ｓ６について異なるため、ＥＩＣクロマトグラムにおける現在のパーセントは、それらの実際の存在量を表していない可能性がある。しかしながら、イオン化効率は、試料ごとに各二糖又は四糖について同一である。したがって、試料ごとの同じ糖類のピーク面積パーセントの比較は、依然として達成できると考えられる。
Figure 2022523638000035
各改変型酵素のスルホトランスフェラーゼ活性を、市販のＵＦ－ＨＳ試料と比較した、Ｄ０Ａ６Ｇ０Ｓ３（ヘキスロン酸－６－Ｏ－硫酸化Ｎ－アセチルグルコサミン－グルクロン酸－Ｎ，３，６－硫酸化グルコサミン）及びＤ０Ａ６Ｇ０Ｓ９（ヘキスロン酸－６－Ｏ－硫酸化Ｎ－アセチルグルコサミン－グルクロン酸－Ｎ，３－硫酸化グルコサミン）四糖の存在量の増加によって確認した。しかしながら、配列番号１４９のＰＮＳ試料中の二糖の総存在量は、他の試料よりもはるかに低かった。その後の試験には、１０倍の注入量で実験を再実行すること、及びリアーゼ混合物で試料を再消化することが含まれた。にもかかわらず、Ｄ２Ｓ６二糖のみを見出すことができたことから、最初に単離された配列番号１４９のＰＮＳ硫酸化多糖試料の存在量が非常に低かったこと、及び／又は多糖がリアーゼ消化に抵抗し、１時間を超える保持時間でカラムから生成物が溶出する可能性があることが示された。
それでもなお、ＮＭＲ試験（実施例７において以下に示す）は、ＰＮＳがアリール硫酸化合物である場合、配列番号１４９のアミノ酸配列を有する酵素による３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を示した。また、配列番号１４９のアミノ酸配列を有する酵素は、ＮＣＳがアリール硫酸化合物の場合、スルホトランスフェラーゼとして活性であると判定した。したがって、ＬＣＭＳ実験中に配列番号１４９のＰＮＳ硫酸化多糖試料について観察された結果は、酵素自体の活性ではなく、実験の目的のために製造された試料からの結果であると考えられる。その他の点では、市販のＵＦ－ＨＳ標準と比較して、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１からの他の硫酸化多糖生成物の全てにおいて、より高い存在量の３－Ｏ硫酸化が見出された。
実施例７：核磁気共鳴を使用した改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼのスルホトランスフェラーゼ活性の確認
配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型酵素の３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、特にスルホ基供与体としてＰＮＳを用いる配列番号１４９のアミノ酸配列を有する酵素の活性を確認するために本開示の態様に従って試験を行った。各酵素を実施例１の手順に従って精製した。各精製タンパク質溶液に、反応緩衝液２ｍＬ（５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．０、２ｍＭ ＣａＣｌ２）に溶解したアリール硫酸化合物２０ｍｇ（ＰＮＳ又はＮＣＳ）をタンパク質溶液に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。実施例６で利用した市販のＵＦ－ＨＳ多糖類の２ｍｇ／ｍＬ溶液２．５ｍＬをタンパク質／供与体溶液に添加し、３７℃で一晩インキュベートした。
各反応物を５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、予め湿らせた３０Ｋ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ－１５フィルタに適用し、５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。フィルタを水２ｍＬで１回洗浄し、再度遠心分離した。濾液を１Ｋ ＭＷＣＯ透析膜に添加し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で２日間透析し、１時間、２時間、８時間、１６時間、３２時間で水を交換し、次いで凍結乾燥した。乾燥した白色粉末をＤ２Ｏ ４００μＬに再懸濁し、凍結乾燥して交換可能なプロトンを除去し、次いでＤ２Ｏ ６００μＬに再懸濁して、ＮＭＲチューブ（Ｗｉｌｍａｄ、０．３８ｍｍ×７インチ）に移した。スルホ転移が生じたかどうかを決定するために、水抑制を伴うＢｒｕｋｅｒ ６００ ＭＨｚ ＮＭＲ、３２スキャンで１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを得た。全体的な反応スキームを図３３に示す。図３３において、グルコサミン残基のいずれかの３－Ｏ位置は、グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素によって硫酸化することができる。硫酸化３－Ｏ位置は、中心の多糖において丸で囲まれている。重水素交換時に共鳴を示す能力を有する交換可能なプロトンは、底部の多糖において太字で示す。粗混合物ピークを、スルホ受容体多糖及び関連する３－Ｏ硫酸化生成物の文献参照スペクトルに統合した。
図３４の重複スペクトルに示すように、市販のＵＦ－ＨＳに存在する２－Ｏ硫酸化イズロン酸のＣ２炭素のプロトンに相関する５．１５ｐｐｍの鋭いピークは、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列を有する酵素と反応すると消失する。目的のプロトンは、スペクトルの上に示す多糖において丸で囲まれている。ＰＮＳ及び／又はＮＣＳのいずれかと反応させた、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する酵素によって合成した３－Ｏ硫酸化生成物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを全て示す。各生成物スペクトルにおいて、ＩｄｏＡ２Ｓピークはおよそ５．０～５．０５ｐｐｍにシフトする。天然のヒトスルホトランスフェラーゼ酵素を同じ多糖基質及び３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸と共にインキュベートした場合、同様の遷移が示される（データ示さず）。
図３５に示すように、４．５～３．５の領域は、グルコサミン残基の３－Ｏ位への硫酸基の付加に応答して同様にシフトするいくつかのピークを示し、これらは全て、野生型ヒトグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を同じ市販のＵＦ－ＨＳ基質及び３’－ホスホアデノシン５’－ホスホ硫酸とインキュベートしたときに観察される同じシフトと相関する。シフトするピークを曲線の矢印で示し、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する酵素が生成する３－Ｏ硫酸化多糖類由来のピークの位置を直線の矢印で示す。最大のシフトは、ＧｌｃＮＳ３Ｓ６ＳのＨ３について、３．７ｐｐｍ～４．２ｐｐｍに生じる。これは新たに付加された３－Ｏ硫酸基に最も近いことに起因する。さらに、Ｉｄｏ２ＳのＨ３プロトン及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６ＳのＨ５は両方とも４．０７ｐｐｍのピークに向かって収束し、これは２つの重複するピークを示す。ＧｌｃＮＳ３Ｓ６ＳのＨ４は、３．７ｐｐｍ領域から３．８ｐｐｍ領域へと緩やかに低磁場側にシフトし、参照によると、ＧｌｃＮＳ６ＳからのＨ３及びＨ４、ＧｌｃＡからのＨ３、Ｈ４、Ｈ５等の多くのピークが３．７ｐｐｍ領域から３．６ｐｐｍ領域にシフトしている。
実施例８：本発明の改変型スルホトランスフェラーゼと共に使用するためのＮ－硫酸化ヘパロサンの化学合成
本開示の態様に従って、スルホ受容体多糖類として使用するためのＮ－硫酸化ヘパロサンを、本発明の改変型硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ、特に改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかと化学合成する試験を行った。上記Balagurunathan, K. et al.に記載のプロトコルに従って、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンを調製した。特に、ＤＥＡＥ樹脂から溶出したヘパロサンを、酢酸ナトリウムで飽和したエタノール中において－３０℃で一晩沈殿させた後、水に再懸濁し、１，０００Ｄａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有するセルロース透析膜内で透析した。
ヘパロサンをＮ－脱アセチル化するために、充分な水酸化ナトリウムペレット（約４．０ｇ）を溶解して、水中に透析されたヘパロサンの４０ｍＬアリコート中の２．５Ｍ溶液を作製した。溶液を１００ｒｐｍで振盪しながら５５℃で１６時間インキュベートした。次いで、試料中の水酸化ナトリウムを、溶液のｐＨが約７．０に達するまで酢酸で中和し、次いで、１，０００ ＭＷＣＯ透析膜内で一晩水中にて透析した。
その後、炭酸ナトリウム１００ｍｇ及び三酸化硫黄－トリエチルアミン錯体１００ｍｇを添加し、固体の全てが溶解するまで組成物を４８℃でインキュベートすることによって、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサンのＮ－硫酸化を達成した。次いで、酢酸を使用して、溶液のｐＨを約９．５に再調整した。１００ｒｐｍで振盪しながら４８℃で一晩インキュベートした後、追加の炭酸ナトリウム１００ｍｇ及び三酸化硫黄－トリエチルアミン錯体１００ｍｇを添加し、その後酢酸を使用してｐＨを約９．５に再調整した。溶液を４８℃でさらに２４時間インキュベートした。硫酸化多糖溶液を酢酸でｐＨを約７．０に中和し、１，０００ ＭＷＣＯ透析膜内で水中で一晩透析した。次いで、透析したＮ－硫酸化ヘパロサンを更に使用する前に凍結乾燥した。次いで、Ｎ－硫酸化ヘパロサンをＺｅｎｉｘＳＥＣ－１００カラムに充填し、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ９．０）で均一濃度にて溶出することによってさらに精製した。
精製したヘパロサン系多糖の官能化を、配列番号１６１、配列番号１６２、及び配列番号１６３のアミノ酸配列を有する３つの炭素－酸素リアーゼの混合物で消化し、上記と同様の手順を用いて、ＳＡＸを使用して消化された試料を分析することによって特徴付けた。陽性対照として、Ｎ－硫酸化グルコサミン残基を含有する実施例３の市販のＨＤ００５二糖も分析した。両方の試料の代表的なクロマトグラムを図３６に示す。両クロマトグラムにおいて、約１６．５分に強いピークが存在し、これは合成した試料がＮ－硫酸化グルコサミン残基を含有することを示す。
実施例９：Ｎ，２Ｏ－ＨＳ多糖生成物の調製
改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ及び実施例８で合成したＮ－硫酸化ヘパロサンをスルホ受容体として用いて、式ＶＩ又は式ＶＩＩのいずれかの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ多糖生成物を合成するために、本開示の態様に従って試験を行った。円錐底の遠心管中で、ＮＣＳの８０ｍＭアリコートを５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．０、２ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解した。各溶液に、酵素試料の２８０ｎｍの吸光度に基づいて配列番号６３の配列を有する酵素２ｍｇを添加した（約４ｍＬ）。実施例８で合成した凍結乾燥Ｎ－硫酸化ヘパロサン５ｍｇを水１ｍＬに再懸濁し、酵素及びＮＣＳを含む反応混合物に添加した。次いで、反応混合物全体を３０ｒｐｍで振盪しながら３４℃で４８時間インキュベートした。インキュベートする前に、配列番号６７のアミノ酸配列を有するＣ５－ヘキスロニルエピメラーゼ２ｍｇも反応混合物に添加したことを除いて、同じ手順を用いて第２の組の反応物を調製した。
両方の反応セットからの多糖生成物を、最初に反応容器を沸騰水中に１０分間置き、高速で遠心分離してペレットを形成することによって、反応混合物からタンパク質を沈殿させることにより精製した。多糖生成物を含有する上清をペレットからデカントし、１，０００ ＭＷＣＯ透析膜内の水中で一晩透析した。次いで、透析された生成物を、将来の使用のために凍結乾燥した。
多糖生成物を特徴付けるために、凍結乾燥試料を４００μＬの水に再懸濁し、Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｏｌｕｍｎ（GE Biosciences）を使用して精製した。試料を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、０～２Ｍ ＮａＣｌの範囲の勾配を用いてカラムから溶出した。次いで、精製多糖類を、２－Ｏ硫酸化ウロン酸の二糖及びＮ－硫酸化グルコサミンを含有する市販の多糖ＨＤ００２（Iduron）と共に、上記の実施例３の手順に従ってＳＡＸによって消化し、分析した。エピメラーゼ酵素を含まないか又は含むかのいずれかの反応の代表的なクロマトグラムをそれぞれ、図３７及び図３８に示す。図３７において、ＨＤ００２二糖についてのクロマトグラムは、約２１．１分に単一の鋭いピークを有し、これは、反応生成物中のほぼ同一の時間における鋭いピークと相関しており、式ＶＩの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ生成物が反応の結果として形成された時間を示している。図３８において、ＨＤ００２二糖は、他の二糖標準物質を含有する混合物中に提供され、この二糖は、図３７のＨＤ００２標準物質の溶出時間に対応する２０．５分で溶出するＨＤ００２に対応する。エピマー化反応生成物は、ＨＤ００２標準とほぼ同一の溶出時間で鋭いピークを有し、式ＶＩＩの構造を有するＮ，２Ｏ－ＨＳ生成物が反応の結果として形成されたことを示している。
実施例１０：Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の調製
実施例９のエピマー化Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物をスルホ受容体多糖として使用し、配列番号１０４のアミノ酸配列を有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼを酵素として使用したことを除いて、実施例９の手順を用いて、式ＩＸの構造を有するＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を合成するために本開示の態様に従って試験を行った。
硫酸化多糖生成物及び市販の二糖の混合物の代表的なクロマトグラムを図３９に示す。市販の混合物のクロマトグラムは、約２３．７分でピークを示し、これは、２－Ｏ硫酸化ウロン酸及びＮ－、６－Ｏ硫酸化グルコサミンの二糖からなる二糖ＨＤ００１（Iduron）と相関する一方、反応生成物は、２３．４分で同様のピークを示し、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物が反応の結果として形成されたことを示す。Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物内に存在する他のピークには、未消化多糖（２．５分）、非置換ウロン酸及びＮ－アセチルグルコサミン（５．５分）、並びに非置換ウロン酸及びＮ－、６－Ｏ硫酸化グルコサミンが含まれる。
実施例１１：Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の調製
実施例１０の化学合成したＮ－、２－Ｏ、６－Ｏ硫酸化多糖をスルホ受容体多糖として使用し、配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する改変型３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をスルホトランスフェラーゼとして使用することを除いて、実施例９の手順を用いて、式Ｉの構造を有し、Ｎ－、６－Ｏ、３－Ｏ硫酸化グルコサミン及び２－Ｏ硫酸化ヘキスロン酸残基を有する硫酸化多糖生成物を合成するために、本開示の態様に従って試験を行う。硫酸化多糖生成物を、ＳＡＸを使用して実施例９の手順に従って消化し、分析する。Ｎ－、６－Ｏ、３－Ｏ硫酸化グルコサミン残基を含む消化された市販の四糖と比較すると、反応の結果として硫酸化多糖生成物が３－Ｏ硫酸化されていると決定されることが予想される。
実施例１２：Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の抗凝固活性の確認
アンチトロンビンに対する結合親和性を有すると予想される本明細書に記載のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを使用して、実施例６又は実施例７の手順に従って生成したＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を決定するために、本開示の態様に従って試験を行う（Meneghetti, G., et al. (2017) Org. Biomol. Chem. 15: 6792-6799を参照のこと）。ＵＳＰ参照標準（ＣＡＳ番号９０４１－０８－１）などのアンチトロンビンとの活性を有することが知られている市販のＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物を含む対照反応物。ヒトアンチトロンビン（ＡＴ）（１ｍｇ／ｍＬ）を、ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ（商標）色素（Invitrogen）などの色素の存在下で異なる基質とインキュベートする。色素を水（１単位のＳｙｐｒｏ：５０単位の水（ｖ／ｖ））で希釈し、希釈した色素３．５μＬをＰＢＳ緩衝液中の混合物反応に添加する。ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ（商標）色素は、３００ｎｍ又は４７０ｎｍの励起波長を有し、疎水性残基に結合すると５７０ｎｍで発光する。２５μｇのＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物が各反応混合物に含まれる。反応物を３１℃で２分間インキュベートした後、０．５℃段階で３２～８５℃まで段階的な温度勾配に供する。各温度段階の間に、試料の平衡を確実にするために５秒間のインキュベート期間をとることができる。反応はリアルタイムＰＣＲシステムを使用して開発することができる。ＵＳＰ参照標準並びに合成したＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物との対照反応の融解曲線は、それぞれ色素及びＡＴのみを含む標準よりも高い温度にシフトすることが予想され、これは、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物が式Ｉの構造を有する少なくとも１つのＡＴ認識配列を有するので、ＡＴがＮ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物に結合することができることを示している。
実施例１３：他のＥＣ２．８．２．８酵素の改変型硫酸アリール依存性変異体の決定
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上述のように、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１５のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスＥＣ２．８．２．８のメンバーであるヒトグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃのエントリｓｐ｜Ｐ５２８４８｜ＮＤＳＴ＿１＿ＨＵＭＡＮを参照）のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの変異体とするように操作する。ＥＣ２．８．２．８内の他のグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素の１つ以上のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列、並びに配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を有する、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型ＥＣ２．８．２．８酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ヒトグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型２．８．２．８酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列を選択すると、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
非限定的な例として、ブタグルコサミニルＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｃの配列アラインメントに示すように、エントリｔｒ｜Ｍ３Ｖ８４１｜Ｍ３Ｖ８４１＿ＰＩＧ）のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインをコードするアミノ酸配列を、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５のアミノ酸配列と整列させる。配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５に存在するアミノ酸変異は、それぞれ、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５の変異体アミノ酸配列を生成するために、ブタＮ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素のＮ－スルホトランスフェラーゼドメインのアミノ酸配列内のそれらの同等の位置に操作される。それぞれ配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５のアミノ酸配列を有する酵素は、以下の実施例１４及び実施例１５で利用する。しかしながら、ＥＣ２．８．２．８酵素クラス内の他のグルコサミニル野生型Ｎ－デアセチラーゼ／Ｎ－スルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかに関して、同じ手順を適用してＮ－スルホトランスフェラーゼドメインの変異体又は酵素全体を生成することができ、これらは明確にするために省略されていることを、当業者は理解するであろう。
実施例１４：改変型硫酸アリール依存性ＥＣ２．８．２．８変異体の発現及び精製
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例１の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、コドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例１５：ＥＣ２．８．２．８変異体のスルホトランスフェラーゼ活性
実施例３の手順を用いて、それぞれ配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。ＳＡＸ試験により、Ｎ－脱アセチル化ヘパロサン及びアリール硫酸化合物を、それぞれ配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、又は配列番号２５の配列を有する改変型酵素の各々と反応させた結果形成される、Ｎ－硫酸化多糖生成物の存在が確認されると予想される。
実施例１６：ＥＣ２．８．２．－の他のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の改変型硫酸アリール依存性変異体の決定
さらなる硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素は、酵素クラスＥＣ２．８．２．－のメンバーであるニワトリＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄのエントリｓｐ｜Ｑ７６ＫＢ１｜ＨＳ２ＳＴ＿ＣＨＩＣＫを参照）の変異体となるように操作されている。ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の他のＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号６３及び／又は配列番号６５のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を有する、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ニワトリＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型ＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号６３及び／又は配列番号６５のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができる追加の変異体を形成することができる。
非限定的な例として、ヒトＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、及び図１７Ｄの配列アラインメントに示すように、エントリｓｐ｜Ｑ７ＬＧＡ３｜ＨＳ２ＳＴ＿ＨＵＭＡＮ）をコードするアミノ酸配列は、配列番号６３及び配列番号６５のアミノ酸配列と整列される。配列番号６３及び配列番号６５に存在するアミノ酸変異は、それぞれ配列番号６８又は配列番号６９の変異アミノ酸配列を生成するために、ヒトＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列内のそれらの同等の位置に操作される。配列番号６８又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する酵素はそれぞれ、以下の実施例１７及び実施例１８で利用する。しかしながら、ＥＣ２．８．２．－酵素クラス内のＨＳヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかに関して、同じ手順を適用して硫酸アリール依存性変異体を生成することができ、これらは明確にするために省略されていることを、当業者は理解するであろう。
実施例１７：ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有するＥＣ２．８．２．－変異体の発現及び精製
配列番号６８又は配列番号６９のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例１の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号６８又は配列番号６９のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、コドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号６８又は配列番号６９のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例１８：ＥＣ２．８．２．－変異体のヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性
実施例４の手順を用いて、それぞれ配列番号６８又は配列番号６９の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。ＭＳ試験により、それぞれ配列番号６８及び配列番号６９の配列を有する各改変型酵素と、Ｎ－硫酸化ヘパロサン系多糖及びアリール硫酸化合物とを反応させた結果形成された、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ生成物の存在が確認されると予想される。両方の酵素が、式ＩＶ又は式Ｖのいずれか又は両方をするヘパロサン系多糖類で活性であることも予想される。
実施例１９：ＥＣ２．８．２．－の他のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の改変型硫酸アリール依存性変異体の決定
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号１０４、配列番号１０６、又は配列番号１０８のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスＥＣ２．８．２．－のメンバーであるマウスＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１ＣのエントリＱ９ＱＹＫ５｜Ｈ６ＳＴ１＿ＭＯＵＳＥを参照）のアイソフォーム１の変異体とするように操作する。ＥＣ２．８．２．－内の１つ以上の他のＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号１０４、配列番号１０６、及び／又は配列番号１０８のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の両方を含む、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。マウスＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型ＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号１０４、配列番号１０６、及び／又は配列番号１０８のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
非限定的な例として、ブタＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃの配列アラインメントに示されているような、エントリＩ３ＬＡＭ６｜Ｉ３ＬＡＭ６＿ＰＩＧ）をコードするアミノ酸配列は、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列と整列される。配列番号１０４、配列番号１０６及び配列番号１０８に存在するアミノ酸変異は、変異アミノ酸配列を生成するために、ブタＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列内のそれらの同等の位置に操作される。上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃに示すように、ブタＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の残基６７～３７７に対応する生成した変異アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１４、配列番号１１５、及び配列番号１１６として開示する。ブタＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃには示されず）の全長アミノ酸配列に対応する生成した変異アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１１７、配列番号１１８、及び配列番号１１９として開示する。
別の非限定的な例では、マウスＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（エントリＱ９ＱＹＫ４｜Ｈ６ＨＳ３＿ＭＯＵＳＥ、これについては上記の図２１Ａ、図２１Ｂ、及び図２１Ｃにおける配列アラインメントに例示されている切り捨てられた配列）のアイソフォーム３をコードする全長アミノ酸配列を、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８のアミノ酸配列と整列させる。配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８に存在するアミノ酸変異は、変異アミノ酸配列を生成するために、マウスＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアイソフォーム３のアミノ酸配列内のそれらの同等の位置に操作される。生成した全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２として開示する。配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１又は配列番号１２２のアミノ酸配列を有する酵素はそれぞれ、以下の実施例２０及び実施例２１で利用する。しかしながら、ＥＣ２．８．２．－酵素クラス内のＨＳグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかに関して、同じ手順を適用して硫酸アリール依存性変異体を生成することができ、これらは明確にするために省略されていることを、当業者は理解するであろう。
実施例２０：グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有するＥＣ２．８．２．－変異体の発現及び精製
配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例１の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２のアミノ酸配列を有する酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を、それぞれ、所望の発現宿主に基づいて決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２のアミノ酸配列の各々をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例２１：ＥＣ２．８．２．－変異体のグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性
実施例５の手順を用いて、それぞれ配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２を含む変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。ＭＳ試験により、Ｎ，２Ｏ－ＨＳ多糖類及びアリール硫酸化合物を、それぞれ配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２の配列を有する改変型酵素のそれぞれと反応させた結果形成される、Ｎ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の存在が確認されると予想される。
実施例２２：ＥＣ２．８．２．２３内の他のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素の改変型硫酸アリール依存性変異体の決定
さらなる硫酸アリール依存性グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を操作するために、本開示の態様に従って試験を行う。上記のように、配列番号１４７、配列番号１４９又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素を、酵素クラスＥＣ２．８．２．２３のメンバーであるヒトＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃのエントリｓｐ｜Ｏ１４７９２｜ＨＳ３Ｓ１＿ＨＵＭＡＮを参照）のアイソフォーム１の変異体とするように操作する。ＥＣ２．８．２．２３内の１つ以上の他のＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列、並びに配列番号１４７、配列番号１４９及び／又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する硫酸アリール依存性ＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の両方を含む、多重配列アラインメントを生成及び分析することによって、改変型ＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列における変異を、同じアラインメント内の野生型ＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と比較して観察することができる。ヒトＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素ではない野生型ＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列を選択すると、配列番号１４７、配列番号１４９、及び／又は配列番号１５１のアミノ酸配列内に存在する変異を野生型配列に操作して、硫酸アリール依存性スルホトランスフェラーゼ活性を有することができるさらなる変異体を形成することができる。
非限定的な例として、ブタＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃの配列アラインメントに示すように、エントリｔｒ｜Ｉ３ＬＨＨ５｜Ｉ３ＬＨＨ５＿ＰＩＧ）のアイソフォーム１をコードするアミノ酸配列は、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列と整列される。配列番号１４７、配列番号１４９、又は配列番号１５１に存在するアミノ酸変異は、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５６、又は配列番号１５７の変異アミノ酸配列を生成するために、ブタＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列内のそれらの等価な位置に操作される。
別の非限定的な例では、マウスＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素（上記の図２６Ａ、図２６Ｂ、及び図２６Ｃには示されず）のアイソフォーム５をコードする全長アミノ酸配列を、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１のアミノ酸配列と整列させる。配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１に存在するアミノ酸変異は、変異アミノ酸配列を生成するために、マウスＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアイソフォーム５のアミノ酸配列内のそれらの同等の位置に操作される。生成した全長アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０として開示する。
配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する酵素はそれぞれ、以下の実施例２３及び実施例２４で利用する。しかしながら、ＥＣ２．８．２．２３酵素クラス内のＨＳグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかに関して、同じ手順を適用して硫酸アリール依存性変異体を生成することができ、これらは明確にするために省略されていることを、当業者は理解するであろう。
実施例２３：グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を有するＥＣ２．８．２．２３変異体の発現及び精製
配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０のアミノ酸配列をそれぞれ有する改変型グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換することができるかどうか、及びそれらのアミノ酸配列の各々を含む酵素が、その後、上記の実施例１の手順に従って発現、単離及び精製することができるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。所望の発現宿主に基づいて、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９又は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する酵素をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を決定する。適切な発現ベクター内でこれらの遺伝子を合成又は挿入すると、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９及び配列番号１６０のアミノ酸配列のそれぞれをコードする遺伝子が宿主細胞に形質転換され、その後、それらの配列を有する酵素が、硫酸アリール依存性グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性を決定するのに充分な量及び純度で発現、単離、及び精製されることが予想される。
実施例２４：ＥＣ２．８．２．２３変異体のグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性
実施例６及び／又は実施例７の手順を用いて、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、又は配列番号１６０の配列を有する変異型酵素が活性スルホトランスフェラーゼであるかどうかを決定するために、本開示の態様に従って試験を行う。ＭＳ及び／又はＮＭＲ試験は、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０の配列を有する改変型酵素の各々とＮ，２Ｏ，６Ｏ－ＨＳ多糖類及びアリール硫酸化合物を反応させた結果形成される、Ｎ，２Ｏ，３Ｏ，６Ｏ－ＨＳ生成物の存在を確認すると予想される。

Claims (49)

  1. スルホ基供与体、あらゆるアリール硫酸化合物からなる該スルホ基供与体からヘパロサン系多糖へとスルホ基を触媒的に転移させる生物活性を有する、改変型生物活性スルホトランスフェラーゼ酵素であって、
    前記アリール硫酸化合物は、ｐ－ニトロフェニル硫酸、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２－ナフチル硫酸、及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から好ましくは選択され、より好ましくはｐ－ニトロフェニル硫酸又は４－ニトロカテコール硫酸であり、
    前記スルホトランスフェラーゼ酵素の前記生物活性は、グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ活性、ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性、及びグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される、改変型生物活性スルホトランスフェラーゼ酵素。
  2. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、好ましくは下記式ＩＩ（式中、ｎは整数であり、Ｒは水素原子又はスルホ基のいずれか、好ましくは水素原子である）の構造を有するヘパロサン系多糖類を有するグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ生物活性を有する請求項１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
    Figure 2022523638000036
  3. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、酵素クラス（ＥＣ）２．８．２．８内のいずれかの前記天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項２に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  4. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  5. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  6. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、好ましくは下記式Ｖの構造を有するヘパロサン系多糖類を有するヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ生物活性を有する請求項１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
    Figure 2022523638000037
  7. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．－内のいずれかの前記天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項６に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  8. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号６３及び配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項７に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  9. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項７に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  10. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、好ましくは下記式ＶＩＩＩ（式中、Ｘが式ＶＩＩＩ中のヘキスロン酸残基のいずれかから選択することができる）の構造を有するヘパロサン系多糖類を有するグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ生物活性を有する請求項１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
    Figure 2022523638000038
  11. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．－内のいずれかの前記天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１０に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  12. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  13. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  14. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、好ましくは下記式Ｘ（式中、Ｘはスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙはスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである）の構造を有するヘパロサン系多糖類を有するグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ生物活性を有する請求項１に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
    Figure 2022523638000039
  15. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．２３内のいずれかの前記天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１４に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  16. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１５に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  17. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１５に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  18. 前記アリール硫酸化合物がｐ－ニトロフェニル硫酸である請求項１～１７のいずれか一項に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  19. 前記アリール硫酸化合物が４－ニトロカテコール硫酸である請求項１～１８のいずれか一項に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素。
  20. 請求項１～１９に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子。
  21. 前記単離された核酸分子が、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号６２、配列番号６４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１４８、配列番号１５０、及び配列番号１５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項２０に記載の単離された核酸分子。
  22. 請求項２０に記載の単離された核酸分子のいずれかを有するベクター。
  23. 前記ベクターが、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号６２、配列番号６４、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１４８、配列番号１５０、及び配列番号１５２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求項２２に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、大腸菌由来の前記ｍａｌＥ遺伝子をさらに有する請求項２２又は請求項２３のいずれかに記載のベクター。
  25. 前記ベクターが、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タンパク質をコードする遺伝子、好ましくはＳＵＭＯ１遺伝子をさらに有する請求項２２又は請求項２３のいずれかに記載のベクター。
  26. 請求項２２～２５のいずれか一項に記載のベクターを有する単離された宿主細胞。
  27. 前記単離された宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞からなる群から選択され、好ましくは大腸菌宿主細胞である請求項２６に記載の単離された宿主細胞。
  28. スルホ基をヘパロサン系多糖へと酵素的に転移させて硫酸化多糖生成物を形成する方法であって、
    ｐ－ニトロフェニル硫酸、４－メチルウンベリフェリル硫酸、７－ヒドロキシクマリン硫酸、フェニル硫酸、４－アセチルフェニル硫酸、インドキシル硫酸、１－ナフチル硫酸、２－ナフチル硫酸、及び４－ニトロカテコール硫酸からなる群から選択されるアリール硫酸化合物を提供する工程；
    請求項１～１９に記載のスルホトランスフェラーゼ酵素のいずれかを提供する工程；
    ヘパロサン系多糖を提供する工程；
    前記アリール硫酸化合物、前記スルホトランスフェラーゼ酵素、及び前記ヘパロサン系多糖を反応混合物へと組み合わせる工程；及び
    前記スルホトランスフェラーゼ酵素を用いて前記アリール硫酸化合物から前記ヘパロサン系多糖へと前記スルホ基を転移させることによって、前記硫酸化多糖生成物を形成する工程；を有する、上記方法。
  29. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式ＩＩの構造を有する請求項２８に記載の方法。
  30. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．８内のいずれかの前記天然グルコサミニルＮ－スルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項２９に記載の方法。
  31. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の方法。
  32. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の方法。
  33. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式ＩＶ及び／又は式Ｖの構造を有する請求項２８に記載の方法。
  34. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．－内のいずれかの前記天然ヘキスロニル２－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項３３に記載の方法。
  35. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号６３及び配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３４に記載の方法。
  36. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号６８及び配列番号６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３４に記載の方法。
  37. 前記方法が、グルクロニルＣ５－エピメラーゼ、好ましくは配列番号６７のアミノ酸配列を有するグルクロニルＣ５－エピメラーゼ、より好ましくは配列番号６７のアミノ酸残基３４～６１７を有するグルクロニルＣ５－エピメラーゼを提供する工程をさらに有する請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式ＶＩＩＩの構造を有する請求項２８に記載の方法。
  39. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．－内のいずれかの前記天然グルコサミニル６－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項３８に記載の方法。
  40. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１０４、配列番号１０６、及び配列番号１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３９に記載の方法。
  41. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、及び配列番号１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３９に記載の方法。
  42. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素がグルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素であり、前記ヘパロサン系多糖が式Ｘの構造を有する請求項２８に記載の方法。
  43. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、ＥＣ２．８．２．２３内のいずれかの前記天然グルコサミニル３－Ｏスルホトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項４２に記載の方法。
  44. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１４７、配列番号１４９、及び配列番号１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４３に記載の方法。
  45. 前記スルホトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、及び配列番号１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項４３に記載の方法。
  46. 前記硫酸化多糖生成物が、下記式Ｉ（式中、Ｘがスルホ基又はアセテート基のいずれかであり、Ｙがスルホ基又はヒドロキシル基のいずれかである）の構造を有する請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
    Figure 2022523638000040
  47. 前記硫酸化多糖生成物が抗凝固活性を有する請求項４６に記載の方法。
  48. 前記アリール硫酸化合物がｐ－ニトロフェニル硫酸である請求項２８～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記アリール硫酸化合物が４－ニトロカテコール硫酸である請求項２８～４７のいずれか一項に記載の方法。
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