CN117431172A - 一种直投式纳豆菌发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直投式纳豆菌发酵剂及其制备方法和应用，属于微生物发酵技术领域。利用薏仁米糖化液浸泡黄豆，经纳豆菌发酵，冻干、粉碎即为所述直投式纳豆菌发酵剂。本发明使用薏仁米浸泡的黄豆可以简单高效的实现纳豆菌的高密度发酵，纳豆菌的活菌数达1013以上，是薏仁米、纳豆其它处理方式发酵所得活菌数的100倍以上。使用薏仁米制备糖化液代替水进行纳豆发酵中黄豆的浸泡，有效改善纳豆的风味，并增加产品的营养价值。本发明制备的直投式纳豆菌发酵剂，其发酵纳豆的性能与非冻干剂的种子液所得的纳豆性能无显著差异。使用黄豆作为菌株载体制备直投式发酵剂，使发酵剂在实际生产中的运用更加便捷，有助于其产业化推广。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种直投式纳豆菌发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
纳豆是一种传统的发酵大豆产品，大豆经过清洗、浸泡、灭菌、冷却，由枯草芽孢杆菌发酵大豆制成。最初，制作纳豆的方法是用稻草将煮熟的大豆包裹起来，放在湿度较高的地方，纳豆表面具有白色粘液物质、平淡或微酸的气味和味道、浅黄色柔软粘稠的质地，即发酵完成。
20世纪初，Dr.Chicun分离纯化了纳豆菌，实现纯纳豆菌的发酵，并规范了生产过程中纯菌株的发酵。纳豆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，于1905年被发现并命名纳豆菌。1984年，纳豆菌作为一个新的菌种被正式命名为属细菌科、芽孢杆菌属，是好氧型革兰氏阳性菌。须见洋行教授在人工血栓中加入纳豆提取物，发现纳豆提取物溶解血栓的速度是尿激酶的6倍，历史上称为“2:30pm”实验，发现纳豆激酶。后来，纳豆行业标准出台，纳豆的生产也比较合理。相比之下，纳豆在中国的发展起步较晚，且现有纳豆菌直投式发酵剂多是通过液态发酵优化再经过干燥制备，制备工艺复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种直投式纳豆菌发酵剂及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种直投式纳豆菌发酵剂的制备方法，利用薏仁米糖化液浸泡黄豆，经纳豆菌发酵，冻干、粉碎即为所述直投式纳豆菌发酵剂。
优选的是，所述薏仁米糖化液的制备方法为：将薏仁米浸泡、打浆，随后经糊化、液化、糖化，即为所述薏仁米糖化液。
优选的是，所述薏仁米浸泡具体为：将薏仁米清洗、沥干，再置于蒸馏水中浸泡10-14h。
优选的是，所述打浆具体为按薏仁米与水的质量比为1：(10-14)进行打浆。更优选的是，所述打浆具体为按薏仁米与水的质量比为1：12进行打浆。
优选的是，所述糊化为将打浆后的浆汁加热至糊化状态。
优选的是，所述加热为小火加热20-40min。
优选的是，所述液化为利用淀粉酶进行酶解。
优选的是，所述淀粉酶为高温α-淀粉酶，用量为200U/g。
优选的是，所述液化温度为80-90℃，液化时间为40-60min。
优选的是，所述糖化为利用糖化酶进行酶解；所述糖化之后还包括灭酶的步骤。
优选的是，所述糖化酶的用量为300U/g；所述糖化温度为60-70℃，糖化时间40-60min。
优选的是，所述灭酶具体为大火高温加热5min灭酶。
优选的是，所述利用薏仁米糖化液浸泡黄豆具体为：用制备好的薏仁米糖化液浸泡黄豆12-14h，黄豆与薏仁米糖化液的重量比为1：(2-3)。
优选的是，浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
优选的是，所述纳豆菌发酵的条件为：纳豆菌接种量为3-5％，温度为35-38℃，发酵时间为24-30h。更优选的是，纳豆菌接种量为4％，温度为37℃，发酵时间为25-28h。进一步优选的是，所述纳豆菌为纳豆菌GUTU09。
优选的是，所述冻干为将纳豆菌发酵后的黄豆与冻干保护液混合冻干。
优选的是，所述冻干保护液包括以下重量份数的组分：去离子水100份、脱脂乳粉16份、抗坏血酸1.2份、麦芽糊精8份、蔗糖8份。
优选的是，所述纳豆菌发酵后的黄豆与冻干保护液的质量体积比为4g：1mL。
优选的是，所述冻干具体为：先于-20℃预冻24h，随后真空冷冻干燥40h。
本发明还提供所述制备方法得到的直投式纳豆菌发酵剂。
本发明还提供所述直投式纳豆菌发酵剂在制备发酵产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明使用薏仁米浸泡的黄豆可以简单高效的实现纳豆菌的高密度发酵，纳豆菌的活菌数达1013以上，是薏仁米、纳豆其它处理方式发酵所得活菌数的100倍以上。使用薏仁米制备糖化液代替水进行纳豆发酵中黄豆的浸泡，有效改善纳豆的风味，并增加产品的营养价值。本发明制备的直投式纳豆菌发酵剂，其发酵纳豆的性能与非冻干剂的种子液所得的纳豆性能无显著差异。使用黄豆作为菌株载体制备直投式发酵剂，使发酵剂在实际生产中的运用更加便捷，有助于其产业化推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为薏仁米、黄豆前处理方式对其固态发酵纳豆菌B9的活菌数影响；
图2为发酵时间对薏仁米糖化液浸泡黄豆(A)、蔗糖液浸泡黄豆发酵的纳豆菌(B)的活菌数影响；
图3为对照组和添加冻干保护剂对存活率的影响；
图4为纳豆菌直投式发酵剂生产纳豆。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto GUTU09)，保藏编号：CCTCC NO：2021641，2021年6月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，也即纳豆菌GUTU09为从贵州传统发酵食品中筛选得到，简称B9；黄豆、薏仁米市售。
本发明培养基包括：
(1)B9种子培养液：10g/L葡萄糖，5g/L酵母膏，10g/L牛肉膏，5g/L NaCl，pH 7.0～7.5，121℃灭菌20min；
(2)B9平板培养基：B9种子培养基加20g/L琼脂，121℃灭菌20min。
实施例1直投式纳豆菌发酵剂的制备
1.菌种制备
将枯草芽孢杆菌B9接种到种子培养基，温度设定为37℃中培养18小时，离心收集菌体，并重悬于无菌生理盐水中(菌种浓度为1.0×108CFU/mL)，备用。
2.薏仁米和黄豆原料的不同浸泡方式对其固态发酵纳豆菌的影响
(1)薏仁米糖化液浸泡黄豆
1)薏仁米浸泡：将挑选好的薏仁米置于装有清水的盆中清洗，再将薏仁米沥干，放置于含有蒸馏水的盆中，浸泡12h。
2)打浆：将已浸泡好的薏仁米沥干，再置于蒸馏水中，按质量比薏仁米：水＝1：12进行打浆；
3)糊化、液化、糖化、灭酶：将浆汁用小火加热30min至糊化状态；糊化完全后加酶进行酶解，高温α-淀粉酶用量200U/g，液化温度85℃，液化时间50min；糖化酶用量300U/g，糖化温度65℃，糖化时间50min；最后置于大火高温加热5min灭酶。
4)黄豆清洗过后用制备好的薏仁米糖化液浸泡12-14h，黄豆和糖化液的质量比为1：2.5。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(2)薏仁米、黄豆一起浸泡
将挑选好的薏仁米、黄豆置于装有清水的盆中清洗，沥干，再混匀(薏仁米黄豆质量比1：5)，浸泡12-14h。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(3)蔗糖溶液浸泡
用4.5％蔗糖溶液替代蒸馏水浸泡薏仁米或黄豆。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(4)固态发酵
将灭菌冷却后的薏仁米浸泡的黄豆、薏仁米和黄豆简单混和浸泡物、蔗糖溶液浸泡的薏仁米或黄豆，分别按4％的接种量B9，发酵24-30小时，发酵温度37℃。
薏仁米、黄豆预处理方式对其固态发酵纳豆菌活菌数的影响如图1所示，薏仁米、黄豆前处理方式对其固态发酵纳豆菌B9的活菌数有显著的影响：蔗糖浸泡黄豆、蔗糖浸泡薏仁米、蔗糖浸泡薏仁米黄豆、薏仁米糖化液浸泡黄豆(这里浸泡液糖浓度相同)后接种相同浓度的纳豆菌B9发酵30小时后，纳豆菌活菌数分别是：11.13、10.92、11.04和13.53，薏仁米糖化液浸泡黄豆发酵的活菌数高于其它前处理方式活菌数100余倍，最高达407倍。说明薏仁米和黄豆组合可以实现纳豆菌B9的高密度发酵。同时也说明薏仁米糖化液浸泡黄豆，可实现薏仁米与黄豆的融合，实现薏仁米与黄豆的营养互补，才能实现薏仁米和黄豆的高值作用：大幅度提高活菌数，用简单的方法获得高密度发酵的效果。
发酵时间对薏仁米糖化液浸泡黄豆、蔗糖液浸泡黄豆发酵的纳豆菌的活菌数影响如图2所示，纳豆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆和蔗糖溶液浸泡的黄豆这两种条件下的生长曲线。可以明显看出，纳豆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆上生长在整个30小时内都处于快速生长期，而且趋势上看如果进一步延长生长时间，依然会快速生长繁殖。而纳豆菌在蔗糖溶液浸泡的黄豆上在生长到12小时生长就变缓慢，然后到24小时就到达稳定期。纳豆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆上生长而获得的活菌数比蔗糖溶液浸泡的黄豆上高出百倍以上。说明薏仁米糖化液浸泡的黄豆激发了纳豆菌的生长潜能，用薏仁米糖化液浸泡的黄豆来培养高浓度纳豆菌是一种简单有效的方法，这对于薏仁米和黄豆的高值化利用也都具有重要意义。
3.冻干制备
将B9发酵好薏仁米糖化液浸泡的黄豆所得100g纳豆与25mL冻干保护液(用100mL去离子水然后以这个为基数加脱脂乳粉添加量16％，抗坏血酸添加量1.2％，麦芽糊精添加量为8％，蔗糖添加量8％配成保护剂溶液)混合均匀，于-20℃冰箱预冻24h，真空冷冻干燥40h，取出后于37℃、180r/min摇床复水16h后取样用B9平板培养基培养16h，检测其活菌数，计算存活率。同时不加冻干保护剂的做为对照组。冻干后粉碎得直投式纳豆菌发酵剂。
存活率＝(冷冻干燥前的活菌数/冷冻干燥后的活菌数)×100％
存活率结果如图3所示，使用冻干保护剂得到的存活率为85.6％，而不用抗冻保护剂直接进行冻干的存活率为78.2％。这说明薏仁米浸泡的黄豆本身就具有较好的抗冻功能。
4.直投式发酵剂发酵黄豆制备纳豆
将直投式发酵剂B9配成1×108cfu/mL的种子液，接种发酵薏仁米浸泡的黄豆，分别按4％的接种量B9，发酵24小时，发酵温度37℃。
4.1发酵完成后，并对其进行感官评价(评分标准见表1)和测其纳豆激酶活力。同时利用非直投式发酵剂得到的相同浓度种子液进行对比发酵，作为对照组。
表1纳豆感官评分标准
4.2纳豆激酶的测定
将纳豆提取液稀释一定倍数，向试管中加入1.4mL Tris-HCl(50mM，pH 7.8)缓冲液和0.4mL纤维蛋白原溶液(7.2mg/mL)，37℃温育5min后加入0.1mL凝血酶(20U/mL)，再37℃温育10min形成人工血栓，加入0.1mL的待测样品，37℃温育60min，加入2mL三氯乙酸(0.2moL/L)溶液静置20min终止反应，11,000×g离心10min，取上清液于275nm波长处测定吸光度。酶活定义：每分钟275nm处吸光度增加0.01所需要的酶活定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力。
利用纳豆菌直投式发酵剂和直接培养种子液都调成相同的浓度发酵黄豆制备纳豆，测其纳豆激酶活力并进行感官评定，结果见图4。直投式发酵剂发酵的薏仁米糖化液浸泡的黄豆所得纳豆的纳豆激酶活力(高于150FU/g)和感官评分(高于81)都没有显著差异，说明效果基本相同。这说明用纳豆菌直投式发酵剂可生产高品质纳豆，说明直投式发酵剂制备是成功的，可以进行应用以简化生产。直投式发酵剂可以作为大健康食品，因为纳豆菌具有很好的益生作用，而且由于是芽孢菌，具有很好的耐胃肠道环境能力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种直投式纳豆菌发酵剂的制备方法，其特征在于，利用薏仁米糖化液浸泡黄豆，经纳豆菌发酵，冻干、粉碎即为所述直投式纳豆菌发酵剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述薏仁米糖化液的制备方法为：将薏仁米浸泡、打浆，随后经糊化、液化、糖化，即为所述薏仁米糖化液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述打浆具体为按薏仁米与水的质量比为1：(10-14)进行打浆。
4.根据权利要求2-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述糊化为将打浆后的浆汁加热至糊化状态。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述液化为利用淀粉酶进行酶解。
6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述糖化为利用糖化酶进行酶解；所述糖化之后还包括灭酶的步骤。
7.根据权利要去2-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述利用薏仁米糖化液浸泡黄豆具体为：用制备好的薏仁米糖化液浸泡黄豆12-14h，黄豆与薏仁米糖化液的重量比为1：(2-3)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳豆菌发酵的条件为：纳豆菌接种量为3-5％，温度为35-38℃，发酵时间为24-30h。
9.如权利要求1-8任一项所述制备方法得到的直投式纳豆菌发酵剂。
10.如权利要求9所述直投式纳豆菌发酵剂在制备发酵产品中的应用。
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