CN117388496B - 一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品和饲料检测技术领域，具体涉及一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用，方法包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；步骤四、对样品进行前处理；步骤五、将样品、亲和磁珠、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。本试剂盒可实现样品即时检测，操作方法简单，不需要洗涤，样品和试剂混合即可出结果，而且同时可以检测三种真菌毒素残留，实现了检测的集约化，自动化，本试剂盒极大的减少了检测人员的工作量和时间，检测结果准确可靠，检测效率高，重复性，精密性和稳定性好。

Description

一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于食品和饲料检测技术领域，具体涉及一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
食品和饲料的毒素滋生和污染时有发生，严重威胁人类和动物的健康安全。目前市面上已有的检测方法操作复杂，耗时长，很多还需要大型仪器，不利于现场检测和大规模推广。
发明内容
鉴于此，本发明提供一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用，以解决技术背景中记载的上述问题。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种毒素三联化学发光检测方法，包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；步骤四、对样品进行前处理；步骤五、将已处理样品、亲和磁珠、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤一具体包括黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联、玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联和呕吐毒素与BHQ2的偶联；其中黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联或玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联的步骤为：S11、称取20mg黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮标准品，加入5ml吡啶溶解；S12、称取羧甲基羟胺半盐酸盐40mg，并加入4ml吡啶溶解；S13、将4ml配好的羧甲基羟胺半盐酸盐加入到5ml黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮溶液中，避光室温搅拌反应22小时；反应完毕后，放入真空干燥机，25℃温度下抽干；S14、加入5ml无水甲醇，震荡溶解，然后放入真空干燥机，25℃温度下抽干，然后再重复一次此步骤；S15、加配好的pH8.0的水溶液5ml，震荡溶解，然后加5ml二氯甲烷，震荡3min，8000rpm离心2min，然后去掉二氯甲烷层，然后再重复一次此步骤；S16、下层水层加6mol/L的HCl调pH至3.0，会有沉淀析出，然后加5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；S17、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；S18、称取23mg的N-hydroxysuccinimide，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；吸取2ml二甲基甲酰胺把吹干的物质溶解，然后再加入1200ul 100umol/LN-hydroxysucc inimide和1200ul 100umol/L DCC，25℃过夜搅拌22h；S19、称取64mgBHQ-1amine加入10mlCB(0.05M pH9.6)溶解，将反应好的半抗原按10ul每次慢慢加入BHQ-1溶液中，然后放置于4℃环境搅拌过夜；S110、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述呕吐毒素与BHQ2的偶联的具体步骤为：S21、称取5g无水硫酸钠，加入20ml吡啶震荡1min，然后静置10min，抽取上层吡啶备用；S22、称取20mg呕吐毒素标准品，加入5ml吡啶溶解；S23、称取70mg丁基硼酸加入2ml无水吡啶，溶解后，加入到溶解好的呕吐毒素中，震荡混匀，密封避光25℃静置18h；S24、称取140mg琥珀酸酐加入到2ml无水吡啶中溶解，溶解完毕后，加入到已反应18h的呕吐毒素中，震荡混匀，抽真空，抽完真空后把瓶子密封，然后沸水浴120min；沸水浴完后，抽真空干燥，随后加入2ml氯仿震荡溶解，再加入2ml纯水剧烈震荡2min，吸出上层水相；重复此步骤四次，把吸出的水相进行合并，然后真空抽干；抽干后水相用2ml纯化水震荡溶解，然后用呕吐毒素亲和柱做亲和纯化，纯化后真空抽干；S25、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；S26、称取23mg N-hydroxysucc inimide,加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；吸取3ml二甲基甲酰胺把抽干的呕吐毒素溶解，然后再加入1200ul(100umol)N-hydroxysucc inimide和1200ul(100umol)DCC，25℃过夜搅拌22h；S27、称取70mgBHQ-2amine加入10mlCB(0.05M pH9.6)溶解，将反应好的半抗原按10ul每次慢慢加入BHQ-2溶液中，然后放置4℃搅拌过夜；S28、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次(加5ml乙酸乙酯，震荡2min，8000rpm离心2min，取上层乙酸乙酯到另外一个离心管，重复此步骤5次)，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；S29、把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存备用。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素B1单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.5mg 6-FAM NHS Ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉B1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-FAM NHS Ester和盐类小分子,得到标记的6FAM-AFB1单抗发光物。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取3mg Atto Rho6G NHS ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的Atto Rho6G NHS ester和盐类小分子，得到Atto Rho6G-ZEN单抗发光物。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取2.8mg/ml的DON单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.6mg Cy5 NHS ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到DON单抗溶液中,一边加一边搅拌,，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的Cy5 NHS ester和盐类小分子,得到Cy5-DON单抗发光物。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤三亲和磁珠的制备，包括：S31、使用涡旋混匀器将羧基磁性微球充分混匀悬浮，取30mg到离心管中；将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；加入3mL的pH6.0MES偶联缓冲液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；再加入3mL的pH6.0 MES偶联缓冲液；重复此洗涤步骤4次；S32称取20mg N-hydroxysuccinimide,加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，称取20mg EDC加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，然后在磁珠溶液中加入EDC溶液0.3mL和Sulfo-NHS溶液0.6mL，补加偶联缓冲液至总体积为3mL，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件活化反应30min后按照S31洗涤2次。S33将洗涤后活化磁珠用3mlpH6.0 MES偶联缓冲液复溶，平均分成3管，每管1ml，然后分别加入500μg AFB1抗体、500μg ZEN抗体、500μg DON抗体，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件下反应6h后按照S31洗涤2次；S34分别向各管加入1mL封闭液，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温或25℃条件下反应2h，按照S31洗涤2次；S35分别向各管加入1mL保存液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液，重复此步骤3次；最后分别再向各管加入1mL保存液，涡旋混匀，得到浓度为10mg/mL的磁性微球混悬液，4℃下保存。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤四中样品前处理，包括一般检测样品前处理和特殊检测样品前处理。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤五已处理样品、亲和磁珠、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物混合放入设备检测，具体为：将校准品和洗脱后毒素样品200μL分别加入到对应的微孔中，随即加入单抗发光物50μL/孔和毒素淬灭剂偶联物50μL/孔，轻轻振荡混匀，放入化学发光分析仪，5min后读数。
一种毒素三联化学发光检测方法的应用，毒素三联化学发光检测方法应用于食品和饲料的真菌毒素的检测。
本发明提供一种毒素三联化学发光检测方法及应用，具有如下有益效果：
本发明的毒素三联化学发光检测方法及应用，具有如下技术效果：本试剂盒可实现样品即时检测，操作方法简单，不需要洗涤，样品和试剂混合即可出结果，而且同时可以检测三种真菌毒素残留，实现了检测的集约化，自动化，本试剂盒极大的减少了检测人员的工作量和时间，检测结果准确可靠，检测效率高，重复性，精密性和稳定性好。本试剂盒适用于食品生产企业，饲料企业，养殖集团，监管机构样品检验，现场检查和产品质量控制。
附图说明
图1为本发明的校准曲线图；
图2为本发明的测试曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合具体情况说明本发明的示例性实施例：
实施例1：
本发明提供一种毒素三联化学发光检测方法，包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物。
具体包括黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联、玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联和呕吐毒素与BHQ2的偶联；其中黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联或玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联的步骤为：
S11、称取20mg黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮标准品，加入5ml吡啶溶解；
S12、称取羧甲基羟胺半盐酸盐40mg，并加入4ml吡啶溶解；
S13、将4ml配好的羧甲基羟胺半盐酸盐加入到5ml黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮溶液中，避光室温搅拌反应22小时；反应完毕后，放入真空干燥机，25℃温度下抽干；
S14、加入5ml无水甲醇，震荡溶解，然后放入真空干燥机，25℃温度下抽干，然后再重复一次此步骤；
S15、加配好的pH8.0的水溶液5ml，震荡溶解，然后加5ml二氯甲烷，震荡3min，8000rpm离心2min，然后去掉二氯甲烷层，然后再重复一次此步骤；
S16、下层水层加6mol/L的HCl调pH至3.0，会有沉淀析出，然后加5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；
S17、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；
S18、称取23mg的N-hydroxysuccinimide，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；吸取2ml二甲基甲酰胺把吹干的物质溶解，然后再加入1200ul100umol/L N-hydroxysuccinimide和1200ul 100umol/L DCC，25℃过夜搅拌22h；
S19、称取64mgBHQ-1amine加入10mlCB(0.05M pH9.6)溶解，将反应好的半抗原按10ul每次慢慢加入BHQ-1溶液中，然后放置于4℃环境搅拌过夜；
S110、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存。
呕吐毒素与BHQ2的偶联的具体步骤为：
S21、称取5g无水硫酸钠，加入20ml吡啶震荡1min，然后静置10min，抽取上层吡啶备用；
S22、称取20mg呕吐毒素标准品，加入5ml吡啶溶解；
S23、称取70mg丁基硼酸加入2ml无水吡啶，溶解后，加入到溶解好的呕吐毒素中，震荡混匀，密封避光25℃静置18h；
S24、称取140mg琥珀酸酐加入到2ml无水吡啶中溶解，溶解完毕后，加入到已反应18h的呕吐毒素中，震荡混匀，抽真空，抽完真空后把瓶子密封，然后沸水浴120min；沸水浴完后，抽真空干燥，随后加入2ml氯仿震荡溶解，再加入2ml纯水剧烈震荡2min，吸出上层水相；重复此步骤四次，把吸出的水相进行合并，然后真空抽干；抽干后水相用2ml纯化水震荡溶解，然后用呕吐毒素亲和柱做亲和纯化，纯化后真空抽干；
S25、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；
S26、称取23mg N-hydroxysucc inimide,加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100umol/L；吸取3ml二甲基甲酰胺把抽干的呕吐毒素溶解，然后再加入1200ul(100umol)N-hydroxysucc inimide和1200ul(100umol)DCC，25℃过夜搅拌22h；
S27、称取70mgBHQ-2amine加入10mlCB(0.05M pH9.6)溶解，将反应好的半抗原按10ul每次慢慢加入BHQ-2溶液中，然后放置4℃搅拌过夜；
S28、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次(加5ml乙酸乙酯，震荡2min，8000rpm离心2min，取上层乙酸乙酯到另外一个离心管，重复此步骤5次)，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；
S29、把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存备用。
步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素B1单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.5mg 6-FAM NHS Ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉B1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-FAM NHS Ester和盐类小分子,得到标记的6FAM-AFB1单抗发光物。根据标记率公式:F/P＝2.8×(OD280 nm-0.35×OD495 nm)/OD495 nm计算标记率(F/P在1～2之间为充分标记)。将标记单抗发光物真空冻干，4℃保存备用。
步骤二中，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取3mgAtto Rho6G NHS ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的Atto Rho6G NHS ester和盐类小分子，得到Atto Rho6G-ZEN单抗发光物。根据标记率公式:F/P＝2.8×(OD280 nm-0.35×OD530nm)/OD530 nm计算标记率(F/P在1～2之间为充分标记)。将标记单抗发光物真空冻干，4℃保存备用。
在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤二包括，量取2.8mg/ml的DON单抗5ml，用分子量10万Mi ll ipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL；称取2.6mg Cy5 NHS ester，加入200ulN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到DON单抗溶液中,一边加一边搅拌,，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量量10万Mi ll ipore超滤管超滤4次，除去未标记的Cy5 NHS ester和盐类小分子,得到Cy5-DON单抗发光物。根据标记率公式F/P＝[Cy5]/[ant ibody]＝{0.68×A650}/{A280-(0.05×A650)}计算标记率。将标记单抗发光物真空冻干，4℃保存备用。
将标记单抗样品和非标记单抗进行变性蛋白电泳，标记单抗和非标记单抗的上样量为100μg。电泳结束后,分别在495nm，530nm和650nm下观测荧光条带,再经考马斯亮蓝染色观察蛋白条带,依据荧光条带及蛋白条带与marker条带的相对位置确定被标记单抗发光物的分子量。
步骤三中制备纯化毒素的亲和磁珠，包括：S31、使用涡旋混匀器将羧基磁性微球充分混匀悬浮，取30mg到离心管中；将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；加入3mL的pH6.0 MES偶联缓冲液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；再加入3mL的pH6.0 MES偶联缓冲液；重复此洗涤步骤4次；
S32称取20mg N-hydroxysuccinimide,加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，称取20mg EDC加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，然后在磁珠溶液中加入EDC溶液0.3mL和Sulfo-NHS溶液0.6mL，补加偶联缓冲液至总体积为3mL，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件活化反应30min后按照S31洗涤2次。
S33将洗涤后活化磁珠用3mlpH6.0 MES偶联缓冲液复溶，平均分成3管，每管1ml，然后分别加入500μg AFB1抗体、500μg ZEN抗体、500μg DON抗体，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件下反应6h后按照S31洗涤2次；
S34分别向各管加入1mL封闭液，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温或25℃条件下反应2h，按照S31洗涤2次；
S35分别向各管加入1mL保存液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液，重复此步骤3次；最后分别再向各管加入1mL保存液，涡旋混匀，得到浓度为10mg/mL的磁性微球混悬液，4℃下保存。
步骤四、对样品进行前处理；
一般饲料及原料，包括谷物、玉米粉、豆粕、花生饼、小麦、棉籽、青贮、麦麸、配合饲料、奶牛精料等。
①用均质器均质饲料样品；②称取5.0±0.05g研碎的样品至100mL具塞三角瓶中，加入25mL70％甲醇水(7+3)溶液，用振荡器充分振荡5min。③将振荡后的样品，放入离心机，6000r/min离心5min，或用定量分析滤纸过滤。④用样品稀释液按1:5比例稀释(例：200μL上清液+1000μL样品稀释液)。⑤取稀释后液体加入三合一混合亲和磁珠1ml，震荡混匀10min。⑥用磁分离器富集磁珠，并用样品稀释液洗涤2遍。
将洗涤好的磁珠加入0.5ml甲醇震荡30s，然后用磁分离器富集磁珠，吸出甲醇，用Pbs稀释10倍。
特殊饲料包括DDGS、高粱、玉米胚芽粕、喷浆玉米皮，玉米纤维等；
称取10.0g样品于100mL具塞三角瓶中，加入50g氯化钠，准确加入50.0mL70％甲醇水溶液，震荡15min，过滤，收集滤液。
用样品稀释液按1:5比例稀释(例：200μL上清液+1000μL样品稀释液)。取稀释后液体取稀释后液体加入三合一混合亲和磁珠1ml，震荡混匀10min。
用磁分离器富集磁珠，并用样品稀释液洗涤2遍。
将洗涤好的磁珠加入0.5ml甲醇震荡30s，然后用磁分离器富集磁珠，吸出甲醇，用Pbs稀释10倍
步骤五、将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。；在上述毒素三联化学发光检测方法中，作为优选的方案，所述步骤五将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。具体为：将校准品和洗脱后毒素样品200μL分别加入到对应的微孔中，随即加入单抗发光物50μL/孔和毒素淬灭剂偶联物50μL/孔，轻轻振荡混匀，放入化学发光分析仪，5min后读数。
百分吸光率的计算，校准品或样品的百分吸光率等于校准品或样品的发光值的平均值(双孔)除以第一个校准品(0ppb校准品)的发光值，再乘以100％，即：
B—校准品或样品的平均发光值
B0—0ppb校准品的平均发光值
校准曲线的绘制与计算
以校准品百分吸光率为纵坐标，以校准品浓度(ppb)的半对数为横坐标，绘制校准曲线图。将样品的百分吸光率代入校准曲线中，从校准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中毒素的实际含量。
本化学发光仪自带软件，可将检测结果直接做出曲线，进行结果分析。
测试曲线和样本数据
AFB1
标准品浓度 发光值
0ppb 86251
0.05ppb 77192
0.5ppb 47866
5ppb 15196
50ppb 2543
500ppb 326
一种毒素三联化学发光检测方法的应用，毒素三联化学发光检测方法应用于粮食和饲料的检测。
检测粮食和饲料中黄曲霉毒素B1的实验应用液相色谱质谱法和毒素三联化学发光对比
1、检测项目：使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱和毒素三联化学发光检测试剂盒检测粮食和饲料中黄曲霉毒素B1
2、实验背景：
对样本库中已处理粮食和饲料样本进行液质定值，并与毒素三联化学发光检测试剂盒测试结果进行对比。
3、实验流程：
①样品预处理：样本库中样本进行粉粹混匀。
②称样：每种样品按产品说明书及已建立的液质检测方法的标准规范称取所需要求量，并做好编号标记。
③样品前处理：将称取好的样品按对应产品的说明书与“LC-MSMS测定饲料中的黄曲霉毒素B1的含量的标准操作规程”进行前处理。
④检测：将前处理好的样品待测液按使用对应的产品及使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱进行一一检测。
注：
饲料基质中AFB1的LCMS检测方法的方法检出限均为0.4μg/kg，定量限为2μg/kg；当上样液浓度低于0.4μg/L时，视为未检出；当给出的样本含量数据低于2μg/kg时，该数据为估计值仅为参考。
对粮食和饲料中的玉米赤霉烯酮检测的应用
1、检测项目：用高效液相色谱串联质谱法测定各种饲料中玉米赤霉烯酮的含量
2、实验背景：对样本库中已处理饲料样本进行液质定值，并与毒素三联化学发光检测试剂盒测试结果进行对比。
3、实验流程：
①样品预处理：样本库中样本进行粉粹混匀。
②称样：每种样品按产品说明书及已建立的液质检测方法的标准规范称取所需要求量，并做好编号标记。
③样品前处理：将称取好的样品按对应产品的说明书与“LC-MSMS测定饲料中的玉米赤霉烯酮的含量的标准操作规程”进行前处理。
④检测：使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱对样品待测液进行一一检测。
注：
饲料中玉米赤霉烯酮的LCMS检测方法的方法检出限均为0.8μg/kg，定量限为4μg/kg；当上样液浓度低于0.8μg/L时，视为未检出，标记“<LOD”；当给出的样本含量数据低于4μg/kg时，该数据为估计值仅为参考。
高效液相色谱串联三重四级杆质谱、快速检测试纸条和酶联免疫试剂盒检测粮食和饲料中DON的应用
1、检测项目：使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测饲料中呕吐毒素2、实验背景：
对样本库中已处理饲料样本进行液质定值，并与毒素三联化学发光检测试剂盒测试结果进行对比。
六、实验流程：
①样品预处理：样本库中样本进行粉粹混匀。
②称样：每种样品按产品说明书及已建立的液质检测方法的标准规范称取所需要求量，并做好编号标记。
③样品前处理：将称取好的样品按对应产品的说明书与已建立的液质检测方法进行前处理。
④检测：将前处理好的样品待测液按使用对应的产品及使用高效液相色谱串联三重四级杆质谱进行一一检测。
注：
饲料中呕吐毒素的LCMS检测方法的方法检出限均为5μg/kg，定量限为25μg/kg；当上样液浓度低于5μg/L时，视为未检出，标记“<LOD”；当给出的样本含量数据低于25μg/kg时，该数据为估计值仅为参考。
最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (2)

1.一种毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；
步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；
步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；
步骤四、对样品进行前处理；
步骤五、将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测；
其中，所述步骤三亲和磁珠的制备，包括：
S31、使用涡旋混匀器将羧基磁性微球充分混匀悬浮，取30 mg到离心管中；将离心管放置在磁力架上5 min，移除上清液；加入3mL 的pH6.0 MES偶联缓冲液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5 min，移除上清液；再加入3mL 的pH6.0 MES偶联缓冲液；重复此洗涤步骤 4 次；
S32称取20 mg的NHS,加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，称取 20 mg EDC加入1mlpH6.0 MES偶联缓冲液溶解，然后在磁珠溶液中加入 EDC 溶液 0.3 mL和 NHS 溶液0.6mL，补加偶联缓冲液至总体积为 3 mL，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件活化反应 30min 后按照S31洗涤2次；
S33将洗涤后活化磁珠用3mlpH6.0 MES偶联缓冲液复溶，平均分成3管，每管1ml，然后分别加入 500μg AFB1 抗体、500μg ZEN 抗体、 500μg DON抗体，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件下反应 6h 后按照S31洗涤2次；
S34分别向各管加入 1 mL 封闭液，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温或 25℃条件下 反应2h，按照S31洗涤2次；
S35分别向各管加入1mL保存液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液，重复此步骤3次；最后分别再向各管加入1mL保存液，涡旋混匀，得到浓度为 10mg/mL 的磁性微球混悬液，4 ℃下保存；
所述步骤一具体包括黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联、玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联和呕吐毒素与BHQ2的偶联；其中黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联和玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联的步骤为：
S11、称取20mg黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮标准品，加入5ml吡啶溶解；
S12、称取羧甲基羟胺半盐酸盐40mg，并加入4ml吡啶溶解；
S13、将4ml配好的羧甲基羟胺半盐酸盐加入到5ml黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮溶液中，避光室温搅拌反应22小时；反应完毕后，放入真空干燥机，25℃温度下抽干；
S14、加入5ml无水甲醇，震荡溶解，然后放入真空干燥机，25℃温度下抽干，然后再重复一次此步骤；
S15、加配好的pH8.0的水溶液5ml，震荡溶解，然后加5ml二氯甲烷，震荡3min，8000rpm离心2min，然后去掉二氯甲烷层，然后再重复一次此步骤；
S16、下层水层加6mol/L的HCl调pH至3.0，会有沉淀析出，然后加5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；
S17、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；
S18、称取23mg的NHS，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmol/L；吸取2ml二甲基甲酰胺把抽干的物质溶解，然后再加入1200μl 100μmol/L的 NHS和1200μl 100μmol/L的DCC，25℃过夜搅拌22h；
S19、称取64mgBHQ-1 amine 加入10ml 0.05M pH9.6的CB溶解，将反应好的半抗原按10μl每次慢慢加入BHQ-1溶液中，然后放置于4℃环境搅拌过夜；
S110、15000 rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存；
所述呕吐毒素与BHQ2的偶联的具体步骤为：
S21、称取5g无水硫酸钠，加入20ml 吡啶震荡1min， 然后静置10min，抽取上层吡啶备用；
S22、称取20mg呕吐毒素标准品，加入5ml吡啶溶解；
S23、称取70mg丁基硼酸加入2ml无水吡啶，溶解后，加入到溶解好的呕吐毒素中，震荡混匀，密封避光25℃静置18h；
S24、称取140mg琥珀酸酐加入到2ml无水吡啶中溶解，溶解完毕后，加入到已反应18h的呕吐毒素中，震荡混匀，抽真空，抽完真空后把瓶子密封，然后沸水浴120min；沸水浴完后，抽真空干燥，随后加入2ml氯仿震荡溶解，再加入2ml纯水剧烈震荡2min，吸出上层水相；重复此步骤四次，把吸出的水相进行合并，然后真空抽干；抽干后水相用2ml纯化水震荡溶解，然后用呕吐毒素亲和柱做亲和纯化，纯化后真空抽干；
S25、称取5g无水硫酸钠，加入20ml N-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；
S26、称取23 mg 的NHS, 加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmol/L；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmol/L；吸取3ml二甲基甲酰胺把抽干的呕吐毒素溶解，然后再加入1200μl 100μmol/L的NHS和1200μl 100μmol/L的DCC，25℃过夜搅拌22h；
S27、称取70mgBHQ-2amine 加入10mlCB 0.05M pH9.6的BC溶解， 将反应好的半抗原按10μl每次慢慢加入BHQ-2溶液中，然后放置4℃搅拌过夜；
S28、15000 rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，震荡2min，8000rpm离心2min，取上层乙酸乙酯到另外一个离心管，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；
S29、把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存备用；
所述步骤二包括，量取2.6mg/ml的黄曲霉毒素B1单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS 调整蛋白浓度为 5mg / mL ；称取2.5mg 6-FAM NHS Ester，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉B1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25 ℃ 条件下避光反应1 h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-FAM NHS Ester和盐类小分子, 得到标记的6FAM-AFB1单抗发光物；
所述步骤二还包括，量取3.2mg/ml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS 调整蛋白浓度为 5mg/mL；称取3mg Atto Rho6G NHS ester，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1 h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次 ，除去未标记的Atto Rho6G NHS ester和盐类小分子，得到Atto Rho6G-ZEN单抗发光物；
所述步骤二还包括，量取2.8mg/ml的DON 单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS 调整蛋白浓度为 5mg/mL；称取2.6mg Cy5NHS ester，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到DON单抗溶液中,一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1 h，反应完成后放入分子量量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的Cy5 NHS ester和盐类小分子,得到Cy5-DON 单抗发光物。
2.根据权利要求1所述的毒素三联化学发光检测方法，其特征在于：所述步骤五将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物混合放入设备检测，具体为：将校准品和洗脱后毒素样品200μL分别加入到对应的微孔中，随即加入单抗发光物50μL/孔和毒素淬灭剂偶联物50μL/孔，轻轻振荡混匀，放入化学发光分析仪，5min后读数。
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