CN117384815A - 一种提高质粒发酵产量的发酵方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高质粒发酵产量的发酵方法及其应用。方法包括：冷冻保存的含有目的质粒的菌种常温复苏后接种至培养基中，37℃培养至OD600为2.5~3，得到活化后的种子液；将发酵培养基加入发酵罐内，将第一补料培养基和第二补料培养基加入补料瓶内；将活化后的种子液接种至发酵罐内；设定初始发酵培养条件，在初始发酵培养条件下发酵至对数生长期后，降低发酵温度继续发酵的同时使用第一补料培养基进行间歇补料；发酵至对数生长中后期提高发酵温度、通入氧气的同时将第一补料培养基更换为第二补料培养基继续发酵，至发酵菌体OD值不再提高后结束发酵。实现了质粒产量的有效提升。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种提高质粒发酵产量的发酵方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
质粒DNA在细胞和基因治疗领域起着关键性作用。近年来，随着生物制品的不断发展，质粒DNA在DNA疫苗、基因替代载体和病毒包装等方面应用越来越多。因而对大规模高纯度、高质量质粒DNA的需求也越来越大。
大肠杆菌发酵是目前生产质粒DNA主要方式，大肠杆菌的高密度培养能够显著提高菌体发酵密度和产物的比率，但大肠杆菌发酵生产质粒时，质粒特别是大的质粒，会对菌体自身生长造成较大负荷，因此发酵过程菌体的光密度（Optical Density，OD）值很难提高，导致质粒产量不高，导致无法实现工业化大规模高纯度、高质量质粒的生产。因而，如何提高大肠杆菌发酵OD值及发酵质粒的产量已成为亟需解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种提高质粒发酵产量的发酵方法。本发明通过使用不同的补料策略及发酵方式，有效提高菌体生长OD600和质粒DNA产量。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
本发明的第一方面，提供一种提高质粒发酵产量的发酵方法，所述方法包括：
（1）将冷冻保存的含有目的质粒的菌种常温复苏后接种至培养基中，37℃培养至OD600为2.5~3，得到活化后的种子液；
（2）配制发酵培养基、第一补料培养基和第二补料培养基，将发酵培养基加入发酵罐内，将第一补料培养基和第二补料培养基加入补料瓶内；
（3）将所述活化后的种子液接种至发酵罐内；
（4）设定初始发酵培养条件为：温度37℃、pH7.0，溶氧设定在40%，溶氧偶联转速设定为400~800rpm；压缩空气通气量3 lpm升/分钟，在初始发酵培养条件下发酵至对数生长期后，降低发酵温度继续发酵的同时使用所述第一补料培养基进行间歇补料；发酵至对数生长中后期提高发酵温度、通入氧气的同时将所述第一补料培养基更换为第二补料培养基继续发酵，至发酵菌体OD值不再提高后结束发酵。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述目的质粒为pLP1质粒。
在一种具体的实施方式中，步骤（1）中所述含有目的质粒的菌种为含有目的质粒的大肠杆菌细胞；优选的，所述大肠杆菌细胞选自DH5α、JM109、Stbl3。
在一种具体的实施方式中，步骤（2）中所述发酵培养基的组成为：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸二氢钾3.8 g/L，磷酸氢二钾16.38 g/L，磷酸氢二钠6g/L，MgSO4.7H2O0.5 g/L，甘油6.3 g/L，硫酸铵6 g/L。
所述第一补料培养基（200mL）的组成为：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.45 g。
所述第二补料培养基（200mL）的组成为：甘油100 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.34 g。
所述葡萄糖母液的组成为：一水葡萄糖55 g，加水定容至100 mL。
在一种具体的实施方式中，步骤（3）中发酵罐接种比例为1：10。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中发酵初始补加所述葡萄糖母液至发葡萄糖的浓度达到10 g/L。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述发酵至对数生长期后使用所述第一补料培养基补料，包括：使用所述第一补料培养基补料，其中所述第一补料培养基的用量为10~20 ml。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述降低发酵温度继续发酵，包括：降低发酵温度至32~35℃继续发酵。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）中所述发酵至对数生长中后期提高发酵温度，包括：发酵至对数生长中后期提高发酵温度至38~40℃。
在一种具体的实施方式中，步骤（4）之后还包括：发酵结束后，通过离心收集菌体，将所述菌体-80℃保存。
在一种具体的实施方式中，所述发酵菌体OD值通过紫外分光光度计进行检测。
本发明的方法将含有目的质粒的菌种接种活化后培养至一定体积和密度，然后转接至发酵罐内进行发酵培养，培养至指数生长期后开始补料培养，优化发酵过程温度、溶氧参数、补料策略，至发酵菌体OD600稳定后终止发酵，收获菌体用于下游纯化。
在本发明的第二方面，提供一种第一方面所述提高质粒发酵产量的发酵方法在质粒制备中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种可以显著提高质粒发酵产量的发酵方法。通过优化发酵过程参数，最终发酵菌体OD600和质粒DNA产量均有显著提升，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中的提高质粒发酵产量的发酵方法的菌体OD600和质粒产量变化图；
图2为本发明实施例1-4中的提高质粒发酵产量的发酵方法的菌体OD600和质粒产量对比图；
图3为本发明对比例1中的发酵方法的发酵菌体OD600和质粒产量变化图；
图4为本发明对比例2-4中的发酵方法的发酵菌体OD600和质粒产量变化图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种大肠杆菌发酵提高质粒发酵产量的发酵方法：
1、发酵准备：
（1）发酵培养基每升配方：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸二氢钾3.8 g/L，磷酸氢二钾16.38 g/L，磷酸氢二钠6g/L，MgSO4.7H2O 0.5 g/L，甘油6.3 g/L，硫酸铵6 g/L。配制体积为1.2 L。发酵培养基配制完成后加入发酵罐内，随发酵罐一同高温高压灭菌。
（2）第一补料培养基组分（200mL）：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.45 g。各组分配制母液并分别进行高温高压灭菌处理。
（3）第二补料培养基组分（200mL）：甘油100 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.34 g。各组分配制母液并分别进行高温高压灭菌处理。
（4）葡萄糖母液配制（500 g/L）：一水葡萄糖55g，加水定容至100 mL，于115℃、30min条件下灭菌。
（5）碱液：使用25%氨水调节pH值，250 mL补料瓶，装液量为200 mL，于115℃、30min条件下灭菌。
（6）酸液：使用25%磷酸溶液调节pH值，250 mL补料瓶，装液量为200 mL，于115℃、30 min条件下灭菌。
（7）消泡剂：使用聚醚类消泡剂，稀释倍数为3倍，装液量为100 mL，于115℃、30min条件下灭菌。
2、发酵罐准备：
（1）设备清洗。清洗发酵罐、补料瓶、管路和配件，用无水乙醇擦拭消毒，发酵罐连接所有配件。
（2）电极极化和校准。控制器启动，连接pH电极、溶氧电极，极化8 h以上。极化8 h后，采用pH缓冲液对pH电极进行校准，溶氧电极校准零点和百分点。
（3）将发酵培养基和补料培养基配好后分别装入发酵罐和补料瓶。确保各取样口和通气口的封闭完全。将发酵罐和补料瓶进行灭菌处理。
（4）灭菌结束之后，待发酵罐冷却至室温，然后连接冷却水、进排气管路、pH电极、溶氧电极以及温度电极。
3、摇瓶接种：从-80℃冰箱中取出保存的工作种子（DH5α-pLP1），室温下复苏之后，接种至120 mL的带有卡那抗性的LB摇瓶中，培养10小时至OD600达到2.5，得到活化后的种子液，准备接种发酵罐。
4、发酵培养：将活化后的种子液接种发酵罐，设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为400rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖母液至葡萄糖含量为10 g/L。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始使用第一补料培养基补料（10~20 ml，视菌体OD值增长快慢决定添加量），降低发酵温度至32℃。发酵至对数生产中后期，更换第二补料培养基进行补料，同时通入纯氧升高发酵温度至38℃，继续发酵培养。
5、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
6、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集。
7、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量754.25 mg/L。
实施例2
一种大肠杆菌发酵提高质粒发酵产量的发酵方法：
1、发酵准备、发酵罐准备均与实施例1相同。
2、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为2.8，得到活化后的种子液；然后将活化后的种子液接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为500 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖母液至葡萄糖含量为10 g/L。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始使用第一补料培养基补料（10~20 ml，视菌体OD值增长快慢决定添加量），降低发酵温度至33℃。发酵至对数生产中后期，更换第二补料培养基进行补料，同时通入纯氧升高发酵温度至39℃，继续发酵培养。
3、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
4、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集。
5、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量740.62 mg/L。
实施例3
一种大肠杆菌发酵提高质粒发酵产量的发酵方法：
1、发酵准备、发酵罐准备均与实施例1相同。
2、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为2.9，得到活化后的种子液；然后将活化后的种子液接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为600 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖母液至葡萄糖含量为10 g/L。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始使用第一补料培养基补料（10~20 ml，视菌体OD值增长快慢决定添加量），降低发酵温度至34℃。发酵至对数生产中后期，更换第二补料培养基进行补料，同时通入纯氧升高发酵温度至40℃，继续发酵培养。
3、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
4、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集。
5、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量801.72 mg/L。
实施例4
一种大肠杆菌发酵提高质粒发酵产量的发酵方法：
1、发酵准备、发酵罐准备均与实施例1相同。
2、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为3，得到活化后的种子液；然后将活化后的种子液接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为800 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖母液至葡萄糖含量为10 g/L。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始使用第一补料培养基补料（10~20 ml，视菌体OD值增长快慢决定添加量），降低发酵温度至34℃。发酵至对数生产中后期，更换第二补料培养基进行补料，同时通入纯氧升高发酵温度至38℃，继续发酵培养。
3、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
4、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集。
5、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量732.52 mg/L。
对比例1
大肠杆菌常规条件发酵表达质粒DNA步骤如下：
1、发酵准备：
（1）基础发酵培养基每升配方：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸二氢钾3.8 g/L，磷酸氢二钾16.38 g/L，磷酸氢二钠6g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，甘油6.3 g/L，硫酸铵6 g/L。配制体积为1.2 L。培养基配制完成后加入发酵罐内，随发酵罐一同高温高压灭菌。
（2）基础补料培养基每升配方：D(+)-葡萄糖，一水110 g，加水定容至200 mL。配制完成后加入250 mL补料瓶，连接至发酵罐，用止水夹夹紧管路，于115℃、30 min条件下灭菌。
（3）酸液、碱液、消泡剂配制同实施例1，配制完成后于115℃、30 min条件下灭菌。
2、发酵罐准备与实施例1相同。
3、摇瓶接种：从-80℃冰箱中取出保存的工作种子（DH5α-pLP1），室温下复苏之后，接种至120 mL的带有卡那抗性的LB摇瓶中，培养10小时至OD600达到3准备接种发酵罐。
4、发酵过程调控方法：设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为400 rpm，压缩空气通气量3 lpm。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始补料，间隔2 h补加补料培养基。溶氧、pH、消泡等设置为自动模式，根据对应参数的变化进行通气、pH、消泡的调整。
5、取样要求间隔2 h取样，采用发酵罐配备的取样器和20 mL一次性注射器进行取样，首次取出量为8-10 mL，弃掉；然后取样4-6 mL收集进入15 mL离心管，标注取样时间、发酵时间。
6、菌体收集：发酵结束后，通过8000g离心10min收集菌体，菌体置于-80度冰箱保存。
7、质粒产量检测：使用试剂盒提取方式对各阶段收集菌体进行质粒提取。经检测质粒DNA最大产量为329.7 mg/L。
对比例2
大肠杆菌发酵温度优化，提高质粒发酵产量的方法：
1、发酵准备与比对例1相同。
2、发酵罐准备与实施例1相同。
3、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为3左右，然后将种子接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为400 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖至10 g/L。转速于4 h左右升高维持溶氧40%波动，此时菌株开始进入对数期；6 h左右转速达到设定最大值800rpm，菌株对数期生长，溶氧开始下降，此时降低温度至34℃。发酵8 h溶氧骤升，开始补加葡萄糖至终浓度15 g/L。继续发酵，至下一次溶氧骤升后开始下一轮补料。发酵至OD增速放缓，升高发酵温度至38℃，继续发酵。
4、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
5、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升且补料后不再降低即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集，离心前称量离心瓶重量，8000g离 心15 min后弃离心上清，称量菌体和离心瓶总重量，计算菌体湿重。
6、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量375.3 mg/L。
对比例3
大肠杆菌发酵溶氧策略优化，提高质粒发酵产量的方法：
1、发酵准备与比对例1相同。
2、发酵罐准备与实施例1相同。
3、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为3，然后将种子接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为400 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖至10 g/L。转速于4 h左右升高维持溶氧40%波动，此时菌株开始进入对数期；当转速达到设定最大值800 rpm，菌株对数期生长，溶氧开始下降，当溶解氧小于20%时通入纯氧，补加葡萄糖至终浓度15g/L，继续发酵，此后每隔2 h补料20 ml。
4、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
5、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集，离心前称量离心瓶重量，8000g离心15min后弃离心上清，称量菌体和离心瓶总重量，计算菌体湿重。
6、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量287.9mg/L。
对比例4
大肠杆菌发酵补料策略优化，提高质粒发酵产量的方法：
1、发酵准备与实施例1相同。
2、发酵罐准备与实施例1相同。
3、发酵培养：使用摇瓶进行菌种（DH5α-pLP1）复苏后扩增培养至OD600为3，然后将种子接种发酵罐。设定初始发酵培养条件培养温度37℃、pH7.0，溶氧设定40%，溶氧偶联转速设定为400 rpm，压缩空气通气量3 lpm。发酵初始补加葡萄糖至10g/L。培养至对数生长期（即DO出现骤然升高）后开始使用补料培养基1补料（10-20ml，视菌体OD值增长快慢决定添加量），间隔2 h补加补料培养基。发酵至对数生产中后期，更换补料培养基2进行补料，继续发酵培养。
4、取样检测：每隔2小时从发酵罐取菌液进行OD600测定，同时离心收集菌体用于质粒提取。
5、发酵放罐：当发酵菌体OD600不再增加，溶氧骤升即可结束发酵。发酵菌体采用离心方法进行收集，离心前称量离心瓶重量，8000 g离心15 min后弃离心上清，称量菌体和离心瓶总重量，计算菌体湿重。
6、质粒产量检测：对发酵各时间段取样菌体的进行质粒提取测定质粒产量。最终发酵质粒DNA产量485.61 mg/L。
实验结果
使用实施例1中所述发酵方式进行发酵批次稳定性验证，连续进行3个批次的发酵验证（即实施例2-4），并设置了对比例1-4，实施例1-4和对比例1-4的质粒产量结果见表1：
表1实施例1-4和对比例1-4的质粒产量结果
| 发酵批次 | 菌体OD600 | 质粒产量mg/L |
| 实施例1 | 87.8 | 754.25 |
| 实施例2 | 81.23 | 740.62 |
| 实施例3 | 90.64 | 801.72 |
| 实施例4 | 85.61 | 732.52 |
| 对比例1 | 40.7 | 329.7 |
| 对比例2 | 45.2 | 375.3 |
| 对比例3 | 39.6 | 287.9 |
| 对比例4 | 55.3 | 485.61 |
图1为本发明实施例1中的提高质粒发酵产量的发酵方法的菌体OD600和质粒产量变化图；图2为本发明实施例1-4中的提高质粒发酵产量的发酵方法的菌体OD600和质粒产量对比图；图3为本发明对比例1中的发酵方法的发酵菌体OD600和质粒产量变化图；图4为本发明对比例2-4中的发酵方法的发酵菌体OD600和质粒产量变化图。
从图1和图2可以看出本发明实施例1-4的在不同发酵批次之间菌体生长OD600和质粒产量稳定性、重复性较好，可用于工艺放大生产。从图3和图4可以看出，当本发明的发酵方法发生变化时，对比例1-4中的质粒产量大规模下降。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高质粒发酵产量的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：
（1）将冷冻保存的含有目的质粒的菌种常温复苏后接种至培养基中，37℃培养至OD600为2.5~3，得到活化后的种子液；
（2）配制发酵培养基、第一补料培养基和第二补料培养基，将发酵培养基加入发酵罐内，将第一补料培养基和第二补料培养基加入补料瓶内；
（3）将所述活化后的种子液接种至发酵罐内；
（4）设定初始发酵培养条件为：温度37℃、pH7.0，溶氧控制40%，溶氧偶联转速设定为400~800 rpm，压缩空气通气量3 lpm升/分钟，在初始发酵培养条件下发酵至对数生长期后，降低发酵温度继续发酵的同时使用所述第一补料培养基进行间歇补料；发酵至对数生长中后期提高发酵温度、通入氧气的同时将所述第一补料培养基更换为第二补料培养基继续发酵，至发酵菌体OD值不再提高后结束发酵。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述目的质粒为pLP1质粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述含有目的质粒的菌种为含有目的质粒的大肠杆菌细胞；优选的，所述大肠杆菌细胞选自DH5α、JM109、Stbl3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述发酵培养基的组成为：酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，磷酸二氢钾3.8 g/L，磷酸氢二钾16.38 g/L，磷酸氢二钠6g/L，MgSO4.7H2O 0.5 g/L，甘油6.3 g/L，硫酸铵6 g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第一补料培养基（200mL）的组成为：一水葡萄糖110 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.45 g。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述第二补料培养基（200mL）的组成为：甘油100 g，七水硫酸镁2 g，胰蛋白胨4.34 g。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述发酵至对数生长期后使用所述第一补料培养基补料，包括：使用所述第一补料培养基补料，其中所述第一补料培养基的用量为10~20 ml。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述降低发酵温度继续发酵，包括：降低发酵温度至32~35℃继续发酵。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述发酵至对数生长中后期提高发酵温度，包括：发酵至对数生长中后期提高发酵温度至38~40℃。
10.权利要求1~9任一项所述的提高质粒发酵产量的发酵方法在质粒制备中的应用。
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