CN117757691A - 一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法，步骤为：使用基础培养基对质粒生产菌株进行第一阶段培养；载入补料培养基，进行第二阶段培养；提高发酵温度至35℃以上，进行第三阶段培养，培养结束后收获mRNA模板质粒。本发明通过接种时提高接种量来减少发酵时分裂次数，减少质粒丢失的风险；发酵前期和中后期分别通过降低发酵温度和控制补料速度，来控制细菌的生长速率进一步降低质粒丢失的风险；再综合优化发酵的pH和中后期发酵温度等工艺参数，是细菌生长更稳定，质粒含量得到大幅提升。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，尤其涉及一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法。
背景技术
mRNA模板质粒是mRNA药物制备中的重要一环，mRNA的体外转录合成都是以线性化后的质粒为模板。现有的文献资料中，鲜有对mRNA模板质粒高密度发酵的工艺介绍。在发酵过程中，质粒的稳定性对于质粒最终产量影响十分巨大。导致质粒稳定性差的主要原因：
1.传代次数过多，质粒在细菌分裂中逐渐丢失；
2.已丢失质粒的细菌生长速率与含有质粒的细菌生长速率不同，导致无质粒细菌占有优势。大肠杆菌的生长速率主要受培养温度、pH、补料速度、培养基组成等影响。
mRNA模板质粒含有较多的相同重复序列，现有发酵工艺未针对mRNA模板质粒puc57-mini用质粒进行多参数的工艺开发，导致质粒的表达量不高，细菌生长不稳定，质粒易丢失。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种提高mRNA模板质粒的发酵产量的方法，用于解决现有技术中目前mRNA模板质粒发酵中的表达量不高，细菌生长不稳定的问题。本发明通过接种时提高接种量来减少发酵时分裂次数，减少质粒丢失的风险；发酵前期和中后期分别通过降低发酵温度和控制补料速度，来控制细菌的生长速率进一步降低质粒丢失的风险；再综合优化发酵的pH和中后期发酵温度等工艺参数，是细菌生长更稳定，质粒含量得到大幅提升。
为了实现上述目的，本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、使用基础培养基对质粒生产菌株进行第一阶段培养；
S2、载入补料培养基，进行第二阶段培养；
S3、提高发酵温度，进行第三阶段培养，培养结束后收获mRNA模板质粒；
所述基础培养基的成分包括：2～8g/L酵母浸粉、10～40g/L甘油、2～5g/L硫酸铵、6～13g/L磷酸氢二钾、2～8g/L磷酸二氢钾、1～4g/L硫酸镁、1～4g/L氯化钠和体积分数为0.01％～0.02％的消泡剂；
所述补料培养基包括50～200g/L酵母浸粉、600～900g/L甘油、2～5g/L硫酸镁、50～200g/L硫酸铵、10～30ml/L微量元素溶液。
上述的方法，进一步的，所述质粒生产菌株为大肠杆菌。所述大肠杆菌选自：DH5α、BL21、BL21 pLys、JM109、TOP10、HB101、SCS110、DH10B、DH11S、DM1、JM83、TB1、Y1088、JM107、TM110或Stbl3中的一种或多种。
上述的方法，进一步的，所述腺病毒包装质粒为puc57-mini质粒。
上述的方法，进一步的，所述微量元素溶液包括：4～8g/L七水合硫酸亚铁、1～3g/L二水合氯化钙、1～3g/L四水合氯化锰、1～3g/L七水合硫酸锌、0.1～1g/L六水合氯化钴、1～4g/L五水硫酸铜、0.1～1g/L二水合钼酸钠、0.1～1g/L硼酸和0.3～0.6mmol/L硫酸。
上述的方法，进一步的，所述S1中所述第一阶段培养中：通过调节转速为50～700rpm，使罐体中相对溶氧量大于等于20％。
上述的方法，进一步的，所述S1中第一阶段培养发酵温度为28～33℃，pH为6～8，培养时间为11～15小时。
上述的方法，进一步的，所述S1中初始OD600为1.5～3.0。
上述的方法，进一步的，所述S2中所述第二阶段培养时间为：28～30小时。
上述的方法，进一步的，所述S2中，载入所述补料培养基的流速为3～9ml·h-1L-1。
上述的方法，进一步的，所述S2中，载入所述补料培养基的体积为3000～6000ml。
上述的方法，进一步的，所述S3中第三阶段培养发酵温度为35～40℃。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法，针对mRNA模板质粒puc57-mini质粒菌种的发酵工艺进行培养基种类、接种量、pH、温度实验，最终得到一套puc57-mini质粒菌种成熟的发酵工艺，质粒表达量可达1000ng/ul以上，是未优化的工艺的四倍，提高了生产的产能，而且本发明所使用的物料廉价易得，发酵工艺简便易行，有利于进行的大规模生产，显著降低了生产的成本。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，发酵罐为楚天科技股份有限公司的50L不锈钢发酵罐；
本发明中，采用的发酵质粒为puc57-mini质粒，抗性基因为卡那霉素抗性基因。
实施例1
一种本发明的培养基，成分为：5g/L酵母浸粉、20g/L甘油、4g/L硫酸铵、10g/L磷酸氢二钾、3g/L磷酸二氢钾、2g/L硫酸镁、1g/L氯化钠、20ml/L微量元素和体积分数为0.015％的消泡剂。
补料培养基包括200g/L酵母浸粉、600g/L甘油、2g/L硫酸镁、50g/L硫酸铵、50ml/L微量元素。
微量元素溶液包括：6g/L七水合硫酸亚铁、2g/L二水合氯化钙、2g/L四水合氯化锰、2g/L七水合硫酸锌、0.5g/L六水合氯化钴、2g/L五水硫酸铜、0.6g/L二水合钼酸钠、0.5g/L硼酸和0.5mol/L硫酸。
对比例1
LB培养基，其成分包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。
对比例2
TB培养基，其成分包括：11.8g/L胰蛋白胨，23.6g/L酵母提取物，2.2g/L磷酸二氢钾、9.4g/L磷酸氢二钾，4ml/L甘油。
实施例2
一种puc57-mini质粒菌种的发酵工艺，包括以下步骤：
(1)发酵前准备：
1.1、罐体安装浊度探头、DO电极、pH电极离线校准4.01和7.0后安装至罐体，检查管路连接无误。
1.2、向50L发酵罐内装入20L实施例1的培养基。
1.3、开启罐体的FSIP程序，进行灭菌，121℃，20min灭菌。灭菌结束后，通气20L/min压缩空气，开启罐压控制程序，保持罐内压力在0.5bar。
1.4、打开罐温控制程序设置温度37℃，搅拌50rpm。
1.5、罐体连接灭菌处理好的2000ml 50％氨水补料瓶和10L补料培养基补料瓶，等待发酵。
(2)接种：
2.1、将长至OD600＝15±5的puc57-mini质粒菌种二级种子(种子液接种到发酵罐，发酵罐中发酵液的初始OD600值为1.8)在生物安全柜内把菌液倒入灭菌过的补料瓶中。
2.2、设置发酵罐参数：将溶氧量与转速关联控制，通过调节转速来维持溶解氧在20％以上，转速调节范围为50rpm～700rpm；温度32.0±1℃，通气量20L/min；pH7.0±0.2。
2.3、参数稳定后，即可进行溶氧100％校准。
2.4、随后将puc57-mini质粒菌种二级种子液通过管路补入罐内进行接种，接种量为体积分数为15％，以基础培养基的总体积为基准；随后录入发酵批号，开始计时发酵。
(3)发酵过程培养：
3.1、发酵计时到13±1h时开始补料，补料培养基开始的流速为60ml/h(即3ml·h- 1L-1)，以后每小时递增8％，直到发酵计时到25±1h时停止递增，发酵计时到20h±2h，升温到37±1℃，按照最大的流速一直补料，补料4900ml。
3.2、补料结束，共计培养47h～49h。
3.3、发酵过程中定点取样，用小提质粒试剂盒提取质粒检测质粒含量。
实验一：考察不同的培养基对最终细菌OD600和质粒产量的影响。
考察实施例1，对比例1和对比例2的最终细菌OD600和质粒产量数据。考察结果参见表1。
表1：细菌OD600和质粒产量表
从表1的结果可知：采用实施例1的基础培养基条件下发酵结束可收获质粒1019ng/μl，远高于LB培养基和TB培养基。
实验二：考察接种后不同的起始OD对最终细菌OD600和质粒产量的影响。
按照实施例2的方法，接种后起始OD(种子液接种到发酵罐后，发酵罐中发酵液的OD600值)分别为0.2、1、1.8、2.6，其余条件与实施例2一致，最终细菌OD600和质粒产量数据参见表2。
表2：细菌OD600和质粒产量表
从表2的结果可知：接种后起始OD在1.8的条件下发酵结束可收获质粒1097ng/μl，高于0.2、1，和2.6水平相当。
实验三：考察不同的pH条件对最终细菌OD600和质粒产量的影响。
按照实施例2的方法，调整2.2步骤中pH条件分别为：6.5、6.7、7.0、7.3，其余条件与实施例2一致，最终细菌OD600和质粒产量数据参见表3。
表3：细菌OD600和质粒产量表
从表3的结果可知：pH＝7.0条件下发酵结束可收获质粒1112ng/μl，高于6.5、6.7和7.3。
实验四：考察不同的发酵温度对最终细菌OD600和质粒产量的影响。
按照实施例2的方法，调整2.2步骤中温度条件分别为：30℃、33℃、37℃、40℃，其余条件与实施例2一致，最终细菌OD600和质粒产量数据参见表4。
表4：细菌OD600和质粒产量表
从表4的结果可知：37℃条件下发酵结束可收获质粒1061ng/ul，高于30℃、33℃、40℃。
本发明专利针对puc57-mini质粒进行系统的工艺开发及优化，最终筛选出的培养条件为：自制基础培养基中培养，接种后OD为1.8，pH＝7.0，37℃，细菌OD600可达200，质粒表达量达1000ng/ul以上，大大提高了质粒的产量。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种通过大肠杆菌高密度发酵提高mRNA模板质粒产量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、使用基础培养基对质粒生产菌株进行第一阶段培养；
S2、载入补料培养基，进行第二阶段培养；
S3、提高发酵温度至35℃以上，进行第三阶段培养，培养结束后收获mRNA模板质粒；
所述基础培养基的成分包括：2g/L～8g/L酵母浸粉、10g/L～40g/L甘油、2g/L～5g/L硫酸铵、6g/L～13g/L磷酸氢二钾、2g/L～8g/L磷酸二氢钾、1g/L～4g/L硫酸镁、1g/L～4g/L氯化钠和体积分数为0.01％～0.02％的消泡剂；
所述补料培养基包括50g/L～200g/L酵母浸粉、600g/L～900g/L甘油、2g/L～5g/L硫酸镁、50g/L～200g/L硫酸铵、10ml/L～50ml/L微量元素溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒生产菌株为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述mRNA模板质粒为puc57-mini质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量元素溶液包括：4g/L～8g/L七水合硫酸亚铁、1g/L～3g/L二水合氯化钙、1g/L～3g/L四水合氯化锰、1g/L～3g/L七水合硫酸锌、0.1g/L～1g/L六水合氯化钴、1g/L～4g/L五水硫酸铜、0.1g/L～1g/L二水合钼酸钠、0.1g/L～1g/L硼酸和0.3mmol/L～0.6mmol/L硫酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中所述第一阶段培养中：通过调节转速为50rpm～700rpm，使罐体中相对溶氧量大于等于20％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中第一阶段培养发酵温度为28℃～33℃，pH为6～8，培养时间为11～15小时。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1中初始OD600为1.5～3.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中所述第二阶段培养时间为：28～30小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中，载入所述补料培养基的流速为3ml·h-1L-1～9ml·h-1L-1；载入所述补料培养基的体积为3000ml～6000ml。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中第三阶段培养发酵温度为35℃～40℃。
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