CN117368371A - 同时测定5-(2-氟苯基)-1h-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种同时测定5‑(2‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲醛三种同分异构体杂质的方法。所述测定方法利用三重四级‑液质联用仪，色谱柱为ALLURE PFPP，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈‑异丙醇混合液，流速为0.4～0.6ml/min，柱温为25～40℃；质谱为电喷雾电离源，采用MRM模式；以标准曲线法分析5‑(2‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲醛、5‑(3‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲醛和5‑(4‑氟苯基)‑1H‑吡咯‑3‑甲醛三种同分异构体的含量。本发明克服了三种基因毒性杂质性质相近、分离困难的难点，且节约了检测时间，检测方法高效、准确。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法。
背景技术
伏诺拉生是一种新型的抑制酸药，主要用于治疗相关胃肠道疾病，如胃溃疡、胃食管反流症。目前，伏诺拉生的合成技术已经非常成熟，例如专利CN116003383A中公开了一种伏诺拉生的制备方法，该方法首先将5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-磺酰基)-1H-吡咯-3-甲酸乙酯在碱性条件下水解得到5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-磺酰基)-1H-吡咯-3-甲酸，再与甲胺盐酸盐在醋酸锌等催化剂催化下经苯硅烷等还原剂还原胺化得到伏诺拉生。
但是，在伏诺拉生的合成过程中，因原料的因素可能会引入5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种基因毒性杂质，从而对用药安全性造成影响。而5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种杂质互为同分异构体，结构相似、性质相近且碎片离子一样，其分离和测定难度较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，克服了5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种基因毒性杂质性质相近、分离困难的难点，且节约了检测时间，检测方法高效、准确。
本发明所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，利用三重四级-液质联用仪，其色谱条件包括：色谱柱为ALLURE PFPP，流动相A为0.1wt.％甲酸水溶液，流动相B为体积比60:40的乙腈-异丙醇混合液，流速为0.4～0.6ml/min，柱温为25～40℃；质谱为电喷雾电离源，采用MRM模式；以标准曲线法分析5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体的含量。
具体地，所述同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，包括以下步骤：
(1)设置三重四级-液质联用仪的液相色谱及质谱的参数条件；
(2)将配制好的对照品和供试品溶液置于液相小瓶中，采用直接进样，采集数据，然后进行分析测试；
(3)分析结束之后，利用标准曲线，根据供试品溶液中测得峰面积计算溶液中三种同分异构体的浓度，进行定量分析。
所述液相色谱的参数条件为：
色谱柱为ALLURE PFPP，2.1mm×100mm，5μm；
流动相A为0.1wt.％甲酸水溶液，流动相B为体积比60:40的乙腈-异丙醇混合液；
流速为0.4ml/min；
柱温为35℃；
进样量为2μl。
所述质谱的参数条件为：
采用MRM模式，离子对为189.7>161.6；
离子源温度为550℃；
离子喷雾电压为5500eV；
去簇电压为64eV；
碰撞能量为11eV。
所述标准曲线是通过配制线性标准溶液，依次注入液质联用仪，以各线性溶液浓度对峰面积作回归标准曲线。
作为一种优选方案，标准曲线可以采用以下方法制作：
(1)以0.1wt.％甲酸甲醇为溶剂，配制三种同分异构体的混标贮备液，浓度为1500ng/ml；
(2)分别精密量取1500ng/ml的混标贮备液适量，用0.1wt.％甲酸甲醇稀释制得30ng/ml、75ng/ml、150ng/ml、225ng/ml、300ng/ml的线性溶液；
(3)设置液相色谱及质谱的参数条件，然后依次分析线性溶液，以各线性溶液浓度对峰面积分别作回归标准曲线。
三种同分异构体的回归标准曲线方程如下：
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：y＝1.96e4x+1.75e4，r＝1.0000；
5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：y＝1.37e4x+1.12e3，r＝1.0000；
5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：：y＝1.64e4x-1.06e4，r＝1.0000。
所述供试品溶液的制备方法为：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
将配制好的供试品溶液置于液相小瓶中，采集数据，然后根据峰面积计算溶液中三种同分异构体的浓度，以标准曲线法分析三种同分异构体的含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的检测分析方法无需提取、浓缩、净化、衍生等前处理工作，供试品前处理工作较简单，仅一步即可；
(2)本发明的检测分析方法采用超高柱效、五氟苯基色谱柱，可同时测定三种同分异构体，方便快捷，效率高，有效解决了分离困难的问题；
(3)本发明的检测分析方法质谱检测器离子源污染程度减轻，维护工作相对简单。
附图说明
图1为5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛标准曲线图；
图2为5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛标准曲线图；
图3为5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的标准曲线图；
图4为专属性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例中所用到的仪器设备如下：
三重四级-液质联用仪，质谱为美国AB SCEIEX三重四级杆；液相为岛津LC-20A。
实施例中所用到的试剂、溶液如下：
以0.1wt.％甲酸甲醇为溶剂配制的1500ng/ml的三种同分异构体混标贮备液。
实施例中的分析条件参数如下：
液相色谱的参数条件为：色谱柱为ALLURE PFPP，4.6mm×150mm，2.7μm，流动相流动相A为0.1wt.％甲酸水溶液，流动相B为体积比60:40的乙腈-异丙醇混合液，流速为0.4ml/min，柱温为35℃，进样量为2μl。
质谱的参数条件为：采用MRM模式，离子对为189.7>161.6，离子源温度为550℃，离子喷雾电压为5500eV，去簇电压为64eV，碰撞能量为11eV。
实施例1
线性、线性范围分析：
步骤如下：
分别精密量取1500g/ml的混标贮备液适量，用0.1wt.％甲酸水溶液稀释制得30ng/ml、75ng/ml、150ng/ml、225ng/ml、300ng/ml的线性溶液；进样检测，然后依次分析线性溶液，以各线性溶液浓度对峰面积分别作回归曲线。
结果讨论：
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛标准曲线如图1所示，y＝1.96e4x+1.75e4，相关系数r＝1.0000，大于0.995；
5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛标准曲线如图2所示，y＝1.37e4x+1.12e3，相关系数r＝1.0000，大于0.995；
5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛标准曲线如图3所示，y＝1.64e4x-1.06e4，相关系数r＝1.0000，大于0.995；
三种同分异构体在30～300ng/ml之间呈良好线性关系。
实施例2
精密度分析：
步骤如下：
100％加标供试品溶液：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加混标贮备液1000μl，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，同法配制6份。
精密量取上述溶液各2μl，依次注入液质联用仪，记录目标峰保留时间并计算RSD，以标准曲线法计算加入量及RSD。
结果讨论：
三种同分异构体的精密度考察结果分别如表1-3所示。
表1 5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的精密度考察结果
| 名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 测得浓度(ng/ml) |
| 1 | 18.8 | 3030000 | 153.60 |
| 2 | 18.9 | 3080000 | 156.30 |
| 3 | 18.9 | 3050000 | 154.50 |
| 4 | 18.8 | 3020000 | 153.30 |
| 5 | 18.8 | 3080000 | 156.40 |
| 6 | 18.8 | 2990000 | 151.50 |
| RSD(％) | 0.3 | — | 1.3 |
表2 5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的精密度考察结果
表3 5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的精密度考察结果
| 名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 测得浓度(ng/ml) |
| 1 | 21.6 | 2470000 | 151.30 |
| 2 | 21.6 | 2490000 | 152.50 |
| 3 | 21.6 | 2360000 | 144.70 |
| 4 | 21.5 | 2450000 | 150.30 |
| 5 | 21.6 | 2520000 | 154.60 |
| 6 | 21.5 | 2450000 | 150.00 |
| RSD(％) | 0.3 | — | 2.3 |
实施例3
准确度分析：
步骤如下：
(1)空白供试品溶液(5.3mg/ml)：取供试品约53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法配制3份。
(2)LOQ加标供试品溶液：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加混标贮备液200μl，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，同法配制3份。
(3)100％加标供试品溶液：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加混标贮备液1000μl，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得同法配制3份。
(4)150％加标供试品溶液：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加混标贮备液1500μl，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得，同法配制3份。
精密量取上述溶液各2μl，依次注入液质联用仪，记录色谱图，以空白供试品溶液校正各加标供试品溶液，并计算9份加标供试品溶液中各杂质的回收率及回收率的RSD。
结果讨论：
三种同分异构体的准确度分析结果分别如表4-6所示。
表4 5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的准确度分析结果
表5 5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的准确度分析结果
表6 5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛的准确度分析结果
实施例4
检测限分析：
步骤如下：
分别精密量取1500ng/ml的混标贮备液适量，用0.1％甲酸水溶液稀释制得15ng/ml的检测限溶液，进样检测，依次分析。
结果讨论：
三种同分异构体的检测限分析结果分别如表7所示。
表7检测限分析结果
实施例5
供试品分析：
步骤如下：
分别取不同批次的供试品约53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。将配制好的供试品溶液置于液相小瓶中，采集数据，然后根据峰面积计算溶液中三种同分异构体的浓度，以标准曲线法分析三种同分异构体的含量。
结果讨论：
不同批次的供试品中三种同分异构体的含量分析结果如表8所示。
表8供试品中三种同分异构体含量的分析结果
由上述实施例可见，本发明的分析方法可同时测定富马酸伏诺拉生中三种同分异构体的含量，克服了极性相近、分离困难的难点，三种同分异构体之间的分离度良好，专属性强、精密度好，准确度高，检测限低，检测方法高效、准确。
Claims (9)
1.一种同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：利用三重四级-液质联用仪，其色谱条件包括：色谱柱为ALLURE PFPP，流动相A为0.1wt.％甲酸水溶液，流动相B为体积比60:40的乙腈-异丙醇混合液，流速为0.4～0.6ml/min，柱温为25～40℃；质谱为电喷雾电离源，采用MRM模式；以标准曲线法分析5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛、5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛和5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体的含量。
2.根据权利要求1所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设置三重四级-液质联用仪的液相色谱及质谱的参数条件；
(2)将配制好的对照品和供试品溶液置于液相小瓶中，采用直接进样，采集数据，然后进行分析测试；
(3)分析结束之后，利用标准曲线，根据供试品溶液中测得峰面积计算溶液中三种同分异构体的浓度，进行定量分析。
3.根据权利要求1或2所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：所述液相色谱的参数条件为：
色谱柱为ALLURE PFPP，2.1mm×100mm，5μm；
流动相A为0.1wt.％甲酸水溶液，流动相B为体积比60:40的乙腈-异丙醇混合液；
流速为0.4ml/min；
柱温为35℃；
进样量为2μl。
4.根据权利要求1或2所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：所述质谱的参数条件为：
采用MRM模式，离子对为189.7>161.6；
离子源温度为550℃；
离子喷雾电压为5500eV；
去簇电压为64eV；
碰撞能量为11eV。
5.根据权利要求2所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：所述标准曲线是通过配制线性标准溶液，依次注入三重四级-液质联用仪，以各线性溶液浓度对峰面积作回归标准曲线。
6.根据权利要求5所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：标准曲线采用以下方法制作：
(1)以0.1wt.％甲酸甲醇为溶剂，配制三种同分异构体的混标贮备液，浓度为1500ng/ml；
(2)分别精密量取1500ng/ml的混标贮备液适量，用0.1wt.％甲酸甲醇稀释制得30ng/ml、75ng/ml、150ng/ml、225ng/ml、300ng/ml的线性溶液；
(3)设置液相色谱及质谱的参数条件，然后依次分析线性溶液，以各线性溶液浓度对峰面积分别作回归标准曲线。
7.根据权利要求2或5或6所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：三种同分异构体的回归标准曲线方程如下：
5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：y＝1.96e4x+1.75e4，r＝1.0000；
5-(3-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：y＝1.37e4x+1.12e3，r＝1.0000；
5-(4-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛：：y＝1.64e4x-1.06e4，r＝1.0000。
8.根据权利要求2所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：所述供试品溶液的制备方法为：取供试品53mg，精密称定，置10ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
9.根据权利要求2或8所述的同时测定5-(2-氟苯基)-1H-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法，其特征在于：将配制好的供试品溶液置于液相小瓶中，采集数据，然后根据峰面积计算溶液中三种同分异构体的浓度，以标准曲线法分析三种同分异构体的含量。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311488128.2A CN117368371A (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 同时测定5-(2-氟苯基)-1h-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法 |
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|---|---|---|---|
| CN202311488128.2A CN117368371A (zh) | 2023-11-09 | 2023-11-09 | 同时测定5-(2-氟苯基)-1h-吡咯-3-甲醛三种同分异构体杂质的方法 |
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