CN117362477A - 不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 - Google Patents
不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117362477A CN117362477A CN202311247382.3A CN202311247382A CN117362477A CN 117362477 A CN117362477 A CN 117362477A CN 202311247382 A CN202311247382 A CN 202311247382A CN 117362477 A CN117362477 A CN 117362477A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sodium
- dalteparin
- reaction
- feed liquid
- degradation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012535 impurity Substances 0.000 title claims abstract description 18
- XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N nitrous amide Chemical compound ON=N XKLJHFLUAHKGGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 10
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 title description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 title description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 title description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 229940018872 dalteparin sodium Drugs 0.000 claims abstract description 42
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 27
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 claims abstract description 20
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Chemical compound [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 claims abstract description 17
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000010288 sodium nitrite Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims abstract description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 14
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 8
- 238000012691 depolymerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 6
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 230000001858 anti-Xa Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 3
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- -1 nitrosyl groups Chemical group 0.000 description 3
- MGWGWNFMUOTEHG-UHFFFAOYSA-N 4-(3,5-dimethylphenyl)-1,3-thiazol-2-amine Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C=2N=C(N)SC=2)=C1 MGWGWNFMUOTEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical group O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003333 secondary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007539 photo-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法。该制备方法为：以肝素钠为原料，将原料溶解后，利用醋酸和盐酸等比例混合调节料液pH至2.0‑2.5，加入亚硝酸钠进行降解30‑60min，降解完成后加入硼氢化钠进行还原；然后采用乙醇进行沉淀；过氧化氢氧化料液，紫外照射工艺同步进行照射去除杂质；冷冻干燥制得达肝素钠。本发明在亚硝酸解聚过程中采用盐酸与醋酸的混合液调节液，使得生产工序更加简单可控，易于实现工业化，并且本发明方法制得的达肝素钠不含N‑NO基团，产品质量得到保证和提升。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法。
背景技术
达肝素钠，是一种低分子量肝素钠，重均分子量5600～6400，抗Ⅹa因子活性与抗Ⅱa因子活性比值为1.9～3.2。达肝素钠主要通过抗凝血酶(AT)而增强其对凝血因子Xa和凝血酶的抑制，从而发挥其抗血栓形成的作用。达肝素钠增强抑制凝血因子Xa的能力，相对高于其延长血浆凝血时间(APPT)的能力。由于达肝素钠对血小板功能和血小板粘附性的影响比肝素小，所以对初级阶段止血只有很小的影响，在常规剂量下不引起总的凝血方面的明显变化。现有研究表明，达肝素钠疗效高于普通肝素，且使用方便，安全性更高。与普通肝素相比，达肝素钠生物利用度高，作用时间长，具有稳定的抗血栓形成作用。
达肝素钠的制备工艺已相对成熟，通常由普通肝素解聚而获得。然而目前的制备方法多具有如下几点缺陷：
1)目前常用的降解工艺为亚硝酸钠解聚，该解聚反应在酸性条件下进行，反应过程中pH极不稳定。例如，公开号为CN113004436A、CN112321752A、CN105884934A、CN104045744A、CN104045743A的中国发明专利均单一采用醋酸或者盐酸来调节pH。但是单独使用盐酸的缺点在于在反应过程中pH波动明显，强酸无缓冲性，导致反应过程不稳定。单独使用醋酸虽可保证解聚反应中pH波动小，但为达到pH2.0-2.5，需加入大量的醋酸，由于降解还原过程中需反复将pH调至酸性、碱性、中性，在大量弱酸存在的情况下使得酸碱用量极大，使得料液体积增大，料液浓度减小，最终会降低收率，且因为有弱酸存在调酸调碱耗费大量时间。
由于达肝素钠解聚工艺的难以控制，导致解聚后的分子量难以控制在一个稳定的值，只能通过添加后续工序(如：超滤、多次乙醇沉淀等)去除部分大分子或小分子才能使产品符合质量标准。且因每次解聚后分子量不确定，超滤及乙醇沉淀工序的工艺参数每次生产无法按照一致的参数进行，导致生产工序繁琐、效率低。
2)现有的达肝素生产工艺中对于达肝素钠的精制纯化多为超滤或超滤结合乙醇沉淀，如公开号为CN104045743A、CN112321752A、CN115304688A、CN105884934A、CN115304688A的中国发明专利均采用超滤工艺来去除部分大分子或小分子组分来调节分子量；公开号为CN113004436A的中国发明专利则采用多次乙醇沉淀从而使得产品分子量及分布符合EP药典质量标准。“多次乙醇沉淀”存在生产效率低下、步骤繁琐等的问题，不利于大规模生产。而超滤虽然可精准的去除大分子或小分子组分，从而使得达肝素钠的分子量及分布符合EP药典质量标准。但由于多糖类物质天然的特性，导致超滤设备的清洗往往是一大难题，每次生产完成后超滤设备的清洗会耗费大量的时间，且设备过滤效率随着使用次数的增多逐渐下降，为保证产能工厂又需要不断的增加膜设备，增大了生产成本。
3)达肝素钠在解聚过程中会产生N-NO基团，此杂质为DNA反应性杂质。常见的去除该杂质的工艺为紫外照射，然而现有技术中，如CN104045743A、CN112321752A、CN115304688A、CN105884934A、CN115304688A、CN113004436A等中国发明专利制得的达肝素钠均含有N-NO基团，难以实现N-NO基团的完全去除。并且工艺不稳定，无法保证N-NO基团总是合格。
因此，针对现有达肝素钠制备工艺解聚后分子量不稳定、N-NO基团含量高、精制纯化工序依赖超滤设备且工序繁琐、生产效率低等不足，有必要研究出一种新的方案来解决等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种不含亚硝胺杂质的达肝素钠的制备方法，本发明将紫外照射工艺与氧化脱色工艺同时进行，实现了N-NO基团的完全去除；同时本发明采用醋酸和盐酸的混合溶液作为pH调节剂，成功解决了达肝素钠制备工艺解聚后分子量不稳定的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
不含亚硝胺杂质的达肝素钠的制备方法，以肝素钠为原料，通过降解、还原、两次乙醇沉淀、光照氧化、一次乙醇沉淀，制得所述达肝素钠；所述光照氧化为同时进行紫外照射和过氧化氢氧化。
进一步，所述降解中，采用醋酸和盐酸的混合溶液作为pH调节剂；所述醋酸和所述盐酸的体积比为1:1.5-1.8。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)降解：以肝素钠为原料，采用醋酸和盐酸的混合溶液调节pH，然后加入亚硝酸钠进行降解，获得反应液A；
(2)还原：步骤(1)所得反应液A采用硼氢化钠进行还原，得反应液B；
(3)乙醇沉淀：利用氯化钠和乙醇对步骤(2)所得反应液B进行两次沉淀，得到沉淀物；
(4)光照氧化：步骤(3)所得沉淀物利用过氧化氢溶液进行氧化，同时采用紫外灯进行照射，获得反应液C；
(5)步骤(4)所得反应液C进行一次乙醇沉淀，干燥制得所述达肝素钠。
进一步，所述肝素钠原料需先利用纯化水进行溶解，再调pH。
进一步，所述纯化水与所述肝素钠的重量比为15-25：1。
进一步，步骤(1)中，所述亚硝酸钠与所述肝素钠的重量比为1％-2％：1。
进一步，步骤(1)中，调节pH为2.0-2.5，降解反应温度为15℃-22℃，反应时间为100min-180min。
进一步，步骤(2)中，所述反应液A先采用氢氧化钠调节pH为8.5-10.0，再加入硼氢化钠反应，再用氢氧化钠调pH至中性，得到反应液B。
进一步，步骤(2)中，还原反应时间为8h-12h。
进一步，步骤(2)中，所述硼氢化钠与所述肝素钠的重量比为0.5％-0.8％：1。
进一步，步骤(3)，第一次乙醇沉淀氯化钠加入量为料液体积的3％-4％，乙醇加入量为料液体积的2.0-3.0倍，静置时间为4h-8h；第二次乙醇沉淀氯化钠加入量为料液体积的0.5％-0.9％，乙醇加入量为料液体积的1.4-1.8倍，静置时间为8h-12h。
更进一步，步骤(3)具体为：
1)一次醇沉：向所述反应液B中加入料液体积3％-4％重量的氯化钠，搅拌至完全溶解，再加入2.0-3.0倍体积的乙醇，室温静置4-8h，弃掉醇沉上清得到的第一次乙醇沉淀的沉淀物；
2)二次醇沉：一次醇沉所得沉淀物加入纯化水溶解至料液浓度为6-10％，加入料液体积0.5％-0.9％倍重量的氯化钠搅拌至溶解，再加入料液体积1.4-1.8倍的乙醇体积的乙醇，静置8h-12h，弃上清液，得到二次醇沉后的沉淀物。
进一步，所述步骤(4)具体为：
步骤(3)所得沉淀物加入纯化水溶解至料液浓度为6％-10％，调节料液pH为8-10，加入过氧化氢溶液进行氧化，在氧化过程中用紫外灯对料液进行照射去除降解过程中产生的N-NO基团杂质。
进一步，步骤(4)中，紫外灯波长为185nm；照射时间为30min-60min。
进一步，氧化时间根据溶液颜色是否达到EP药典标准决定。
进一步，步骤(5)具体为：将步骤(4)所得反应液C调pH至中性后，采用2.0-3.0倍的乙醇沉淀4h-8h；弃掉上清，沉淀固体复溶后采用冻干机进行干燥，获得所述达肝素钠。
本发明的目的之二在于提供一种采用前述制备方法制得的达肝素钠。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
采用前述制备方法制得的达肝素钠，所述达肝素钠的重均分子量为6000～6300Da，小于3000Da所占比例为9.0％～12.0％，大于8000Da所占比例为19.0％～23.0％；所述达肝素钠中未检出N-NO基团。
本发明的目的之三在于提供一种提升达肝素钠解聚反应稳定性的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提升达肝素钠解聚反应稳定性的方法，采用醋酸和盐酸的混合溶液作为解聚反应中的pH调节剂；所述pH调节剂中，盐酸和醋酸的体积比为1：1.5-1.8。
本发明的有益效果在于：
1.本发明采用盐酸和醋酸的混合溶液作为亚硝酸解聚过程中的pH调节剂，保证了反应过程pH的稳定；同时也减少醋酸的加入量，生产工艺更加简单可控。
2.本发明经过大量试验及实例研究得到通过一次乙醇沉淀得到分子量及分布符合药典质量标准的产品，无需使用超滤设备，大大的简化了生产工艺步骤，使生产效率进一步提升，同时减少设备设备投入，降低生产成本。
3.本发明利用紫外光致消去原理和过氧化氢产生的羟基自由基的氧化性来彻底清除基因毒性杂质N-NO基团，成功解决了传统亚硝酸钠降解工艺制备低分子肝素存在亚硝胺杂质的风险，所得产品的效价稳定。
4.本发明提出的达肝素钠的制备方法具有解聚工艺稳定，无膜过滤设备，生产工艺简单，杂质含量极低，产品质量高的特点。
附图说明
图1为本发明的不含亚硝胺杂质的达肝素钠原料药制备流程图；
图2为实施例1自制样品的分子量及分布检测图谱；
图3为实施例2自制样品的分子量及分布检测图谱；
图4为实施例1自制样品的N-NO基团检测图谱；
图5为实施例2自制样品的N-NO基团检测图谱。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，表1和表2中“现有专利工艺”指的是公开号为CN104045743A、CN112321752A、CN115304688A、CN105884934A等中国发明专利。
本发明实施例中，抗Xa(IU/mg)效价采用酶标仪进行检测。检测原理为：测定抗IIa和抗Xa活性的方法是基于抗凝酶III(AT-III)和肝素所形成的复合物，中和活化的Xa/IIa因子的能力来测定肝素的活性。通过加入过量的AT-III,使得AT-III与肝素形成复合物，再加入过量的Xa/IIa形成AT-III-肝素-Xa的复合物，剩余的FXa和人凝血酶FIIa可以催化发色底物,在405nm下测定的吸光度与达肝素活性成反比。检测方法参见EP10.0 2820-2821。
本发明实施例中，分子量及分子量分布采用液相色谱仪进行检测。检测原理为：尺寸排阻色谱法(SEC),色谱柱为合适的多孔硅胶珠，选择示差折光检测器，确保样品、盐峰和溶剂峰完全洗脱。检测方法参见EP10.0 2819。
本发明实施例中，N-NO基团采用热能分析仪进行检测。检测原理为：含有待测物质的化合物通过气相色谱进入一个发光接触反应加热器或热解器,经过高温分解,释放出亚硝酰基(·NO)。亚硝酰基然后在真空反应室中被仪器内的臭氧发生器产生的臭氧氧化,产生出电子激发态的二氧化氮。被激发的二氧化氮在发射出特征的射线后衰退返回到基态。发射出的谱线强度由灵敏的光电倍增管和相关元器件检测并且谱线的强度和亚硝酰基的含量成一定比例,由此可知释放亚硝酰基的化合物的含量。检测方法EP10.0 3320-3321。
本发明实施例中，实施例1和2的制备流程图如图1所示，本发明以肝素钠为起始原料，经降解还原、乙醇沉淀、光照氧化、冷冻干燥制得不含亚硝胺杂质的达肝素钠。
实施例1
取10kg肝素钠，加入肝素钠重量160kg纯化水搅拌溶解，用醋酸与盐酸混合的pH调节剂将料液pH调为2.3，向料液中加入200g亚硝酸钠，控制温度15℃-18℃，反应180min，用氢氧化钠调pH为9，加入80g硼氢化钠反应10h，调节pH至7.2。料液中加入5.94kg氯化钠，495L乙醇沉淀4h，弃醇沉上清，沉淀固体加纯化水至料液浓度为8％，加入960g氯化钠搅拌至溶解，再加180L乙醇沉淀10h。弃掉醇沉上清，沉淀固体加纯化水溶解至料液浓度为8％，，氢氧化钠调节pH为8.5，加入过氧化氢进行氧化，同时用185nm的紫外灯进行照射35min，氧化12h后溶液颜色合格，调节料液pH至中性，用0.22um滤膜过滤放置于冻干机得到达肝素钠。
对本实施例制得的达肝素钠进行抗Xa(IU/mg)效价、分子量及分子量分布和N-NO基团检测，并与现有专利工艺进行对比。结果如表1、图2、图4所示，本实施例制得的达肝素钠保留时间为17.678min，抗Xa为145IU/mg，重均分子量为6020Da，小于2000Da所占比例为0.9％，小于3000Da所占比例为9.8％，大于8000Da所占比例为20.2％，Mw2000-4000Da所占比例为26.1％，Mw2000-8000Da所占比例为78.9％。现有制备工艺中N-NO基团的含量为0.1-0.3ppm，而本自制样品未检出N-NO基团，明显优于现有制备工艺。并且本发明采用醋酸与盐酸的混合溶液作为pH调节剂，解聚过程中pH变化小，生产工艺更可控，具体参见表3。
表1.实施例1制得样品的检测结果
| 检测项目 | 质量标准(EP) | 法安明(原研) | 本发明样品 | 现有专利工艺 |
| 抗Xa(IU/mg) | 110-210 | 142 | 145 | 100-140 |
| Mw(Da) | 5600-6400 | 6080 | 6020 | 5500-6800 |
| ＜3000(％) | 13 | 9.5 | 9.8 | 15-7.0 |
| ＞8000(％) | 15-25 | 21 | 20.2 | 18-27 |
| N-NO基团(ppm) | ≤0.25 | 0.09 | 未检出 | 0.1-0.3 |
实施例2
取10kg肝素钠，加入肝素钠重量210kg纯化水搅拌溶解，用醋酸与盐酸混合的pH调节剂将料液pH调为2.1，向料液中加入180g亚硝酸钠，控制温度16-19℃，反应170min，用氢氧化钠调pH为9.5，加入60g硼氢化钠反应11h，调节pH至7.5。料液中加入7.95kg氯化钠，530L乙醇沉淀4h，弃醇沉上清，沉淀固体加纯化水至料液浓度为10％，加入763g氯化钠搅拌至溶解，再加175L乙醇沉淀10h。弃掉醇沉上清，沉淀固体加纯化水溶解至料液浓度为10％，，氢氧化钠调节pH为9.0，加入过氧化氢进行氧化，同时用185nm的紫外灯进行照射40min，氧化9h后溶液颜色合格，调节料液pH至中性，用0.22um滤膜过滤放置于冻干机得到达肝素钠。
对本实施例制得的达肝素钠进行抗Xa(IU/mg)效价、分子量及分子量分布和N-NO基团检测，并与现有专利工艺进行对比。结果如表2、图3、图5所示，本实施例制得的达肝素钠保留时间为17.682min，抗Xa为144IU/mg，重均分子量为6060Da，小于2000Da所占比例为1.0％，小于3000Da所占比例为10.0％，大于8000Da所占比例为20.7％，Mw2000-4000Da所占比例为25.9％，Mw2000-8000Da所占比例为78.3％。。并且对比现有技术，本自制样品同样未检出N-NO基团；解聚过程中pH变化小。本发明的生产工艺简单、可控，且彻底清除了基因毒性杂质N-NO基团，产品质量更好。
表2.实施例2制得样品的检测结果
| 检测项目 | 质量标准(EP) | 法安明(原研) | 本发明样品 | 现有专利工艺 |
| 抗Xa(IU/mg) | 110-210 | 142 | 144 | 100-140 |
| Mw | 5600-6400 | 6080 | 6060 | 5500-6800 |
| ＜3000 | 13 | 9.2 | 10.0 | 15-7.0 |
| ＞8000 | 15-25 | 21 | 20.7 | 18-27 |
| N-NO基团(ppm) | ≤0.25 | 0.09 | 未检出 | 0.1-0.3 |
表3.本发明与现有技术解聚过程中的pH变化对比
Claims (10)
1.不含亚硝胺杂质的达肝素钠的制备方法，其特征在于，以肝素钠为原料，通过降解、还原、两次乙醇沉淀、光照氧化、一次乙醇沉淀，制得所述达肝素钠；所述光照氧化为同时进行紫外照射和过氧化氢氧化。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述降解中，采用醋酸和盐酸的混合溶液作为pH调节剂；所述醋酸和所述盐酸的体积比为1:1.5-1.8。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)降解：以肝素钠为原料，采用醋酸和盐酸的混合溶液调节pH，然后加入亚硝酸钠进行降解，获得反应液A；
(2)还原：步骤(1)所得反应液A采用硼氢化钠进行还原，得反应液B；
(3)乙醇沉淀：利用氯化钠和乙醇对步骤(2)所得反应液B进行两次沉淀，得到沉淀物；
(4)光照氧化：步骤(3)所得沉淀物利用过氧化氢溶液进行氧化，同时采用紫外灯进行照射，获得反应液C；
(5)步骤(4)所得反应液C进行一次乙醇沉淀，干燥制得所述达肝素钠。
4.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述亚硝酸钠与所述肝素钠的重量比为1％-2％:1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，调节pH为2.0-2.5，降解反应温度为15℃-22℃，反应时间为100min-180min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)，第一次乙醇沉淀氯化钠加入量为料液体积的3％-4％，乙醇加入量为料液体积的2.0-3.0倍，静置时间为4h-8h；第二次乙醇沉淀氯化钠加入量为料液体积的0.5％-0.9％，乙醇加入量为料液体积的1.4-1.8倍，静置时间为8h-12h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，紫外灯波长为185nm；
照射时间为30min-60min。
8.采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的达肝素钠。
9.根据权利要求8所述的达肝素钠，其特征在于，所述达肝素钠的重均分子量为6000～6300Da，小于3000Da所占比例为9.0％～12.0％，大于8000Da所占比例为19.0％～23.0％；
所述达肝素钠中未检出N-NO基团。
10.一种提升达肝素钠解聚反应稳定性的方法，其特征在于，采用醋酸和盐酸的混合溶液作为解聚反应中的pH调节剂；所述pH调节剂中，盐酸和醋酸的体积比为1:1.5-1.8。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311247382.3A CN117362477A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311247382.3A CN117362477A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117362477A true CN117362477A (zh) | 2024-01-09 |
Family
ID=89399357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311247382.3A Pending CN117362477A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117362477A (zh) |
-
2023
- 2023-09-25 CN CN202311247382.3A patent/CN117362477A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100328095B1 (ko) | 정제헤파린,이의제조방법및그를함유하는제약학적조성물 | |
| DK173818B1 (da) | Heparinderivat | |
| CN104098716B (zh) | 一种达肝素钠精品的生产方法 | |
| CN107759712B (zh) | 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 | |
| CN111978427A (zh) | 一种黄精多糖的提取方法 | |
| CN111117821A (zh) | 一种含水溶性大麻二酚的啤酒饮料及其制备方法 | |
| CN111518146B (zh) | 化合物精氨酸果糖苷—af的规模化合成制备新方法 | |
| CN116217745A (zh) | 一种藤茶多糖、制备方法及应用 | |
| CN117362477A (zh) | 不含亚硝胺杂质的达肝素钠及其制备方法 | |
| JP2023178347A (ja) | ダルテパリンナトリウムを調製する改善された方法 | |
| WO2021114941A1 (zh) | 低分子硫酸皮肤素及其精制工艺与应用 | |
| CN105506037B (zh) | 一种抗坏血酸葡萄糖苷结晶粉末及其制造方法 | |
| CN110679996B (zh) | 一种含富硒化多糖的烟叶 | |
| CN110922506A (zh) | 一种高澄清度的肝素钠 | |
| CN111607020B (zh) | 舒更葡糖钠浊度和可见异物的去除方法 | |
| CN114773488B (zh) | 一种高透明度羧甲基纤维素钠的制备方法 | |
| CN113105972A (zh) | 一种红枣发酵酒的澄清方法及其应用 | |
| CN111333067A (zh) | 一种中孔活性炭的制备方法及其在缓解含藻水引起的滤膜污染中的应用 | |
| Shafferman et al. | The effect of aromatic amino acids on the photochemistry of a disulfide: Energy transfer and reaction with hydrated electrons | |
| CN111154012A (zh) | 一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法 | |
| CN115304688A (zh) | 一种达肝素钠的制备方法 | |
| CN114853927B (zh) | 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 | |
| CN112107590B (zh) | 鱼鳔来源肝素类粘多糖在制备血管生成抑制剂中的应用 | |
| CN117362476B (zh) | 一种利用牛肺制备精品肝素的方法及相应的精品肝素 | |
| CN118108872A (zh) | 一种右旋糖酐铁及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |