CN117357700A - 一种透明质酸凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种透明质酸凝胶及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：（1）调节无菌透明质酸溶液的pH，得到无菌混合液；（2）将步骤（1）得到的混合液进行冷冻后，解冻，并循环冷冻‑解冻n次，得到凝胶，其中，n为≥1的整数；（3）将步骤（2）得到的凝胶置于阻菌透析容器中，调节pH，得到所述透明质酸凝胶。本发明中通过对透明质酸凝胶的制备方法进行设计，制备得到了灭菌水平达到SAL=10‑6，且符合无菌植入性医疗器械要求的透明质酸凝胶。
Description
技术领域
本发明属于医学材料技术领域，具体涉及一种透明质酸凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸是人体皮肤、软骨组织和关节润滑液的重要成分，它为一链状聚合物，由（1-β-4）D-葡萄糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位重复连接而成。得益于其无种属差异性、无免疫源性等优点，天然透明质酸被广泛应用于医学填充美容、骨关节炎的治疗以及眼部手术中。
例如在医学填充美容领域，透明质酸注射类项目因操作时间短、恢复速度快、效果显著备受青睐，在医美用户中的渗透率不断提升。
国内上市的透明质酸类产品较多，截止到2023年6月注册产品50多个，按是否进行了交联反应，可分为两大类，非交联透明质和化学交联透明质酸。非交联透明质酸代表性产品爱美客的嗨体(Hearty)系列，其专利CN106215244A，产品组分为以透明质酸钠、L-肌肽、氨基酸和水溶性维生素为主要成分的复方溶液，具有抗体内自由基功效；该类产品缺点是其在体内降解快，维持时间短（约1个月）。化学交联透明质酸代表性产品艾尔建的乔雅登®系列，其专利PCT/FR2004/000870，采用了大小分子透明质酸原料以1,4-丁二醇二乙醚（BDDE）作为交联剂进行了化学交联，该类产品体内降解时间慢，维持时间长（约6-12个月）；该类产品不足之处是化学交联剂具有明显的副作用，在体内积累到一定程度可诱发迟发性炎症反应，如淤斑、水肿、迁移、结节、肉芽肿、感染、组织坏死等。
为避免化学交联剂的带来的副作用，专利CN114652896A以化学修饰后的多肽作为交联剂，该交联剂结构上与细胞外基质中纤维连接蛋白结构相近，但多肽修饰成本高、产量有限、生产过程使用了大量的有机溶剂，后期交联工艺复杂；经研究发现，采用物理冻融技术，不添加任何交联剂，在酸性体系下，对透明质酸溶液进行反复冷冻、解冻，即可获具有三维结构的透明质酸凝胶，但是由此制备得到的透明质酸凝胶的三维结构主要依赖氢键作用来维持，由于氢键作用力弱，致使其结构稳定性差，难以耐受常规灭菌的冲击，至今未能解决工业化灭菌难题。
因此，如何解决冻融透明质酸凝胶的灭菌问题，提供一种新的透明质酸凝胶的制备方法，使冻融透明质酸可以达到无菌植入性医疗器械的要求，灭菌水平达到SAL=10-6，已成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸凝胶及其制备方法和应用。本发明中通过对透明质酸凝胶的制备方法进行设计，进一步通过对无菌透明质酸溶液调节pH后，进行冷冻-解冻，得到凝胶，再在特定的阻菌透析容器中调节凝胶的pH，最终制备得到灭菌水平达到SAL=10-6，且符合无菌植入性医疗器械要求的透明质酸凝胶，及适用作术后防粘连材料、骨关节治疗材料或伤口愈合材料的交联透明质酸。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种透明质酸凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
（1）调节无菌透明质酸溶液的pH，得到无菌混合液；
（2）将步骤（1）得到的混合液进行冷冻后，解冻，并循环冷冻-解冻n次，得到凝胶，其中，n为≥1的整数；
（3）将步骤（2）得到的凝胶置于阻菌透析容器中，调节pH，得到所述透明质酸凝胶。
本发明通过对透明质酸凝胶的制备方法进行设计，进一步通过对无菌透明质酸溶液调节pH后，进行冷冻-解冻，得到凝胶，再在特定的阻菌透析容器中调节凝胶的pH，最终制备得到灭菌水平达到SAL=10-6，达到无菌植入性医疗器械要求的透明质酸凝胶，及适用作术后防粘连材料、骨关节治疗材料或伤口愈合材料的交联透明质酸。
本发明中通过采用冻融技术制备得到了具有三维结构的透明质酸凝胶，避免了化学交联剂的使用，制备得到了对人体更安全、具有抗透明质酸酶酶解性能、在体内维持时间更久的透明质酸凝胶。
本发明中，通过将冻融后的具有三维结构的凝胶置于特定的阻菌透析容器中，调节其pH为中性，避免了在调节冻融凝胶pH过程中，微生物的混入，解决冻融透明质酸凝胶工业化灭菌问题的技术，使冻融后的透明质酸凝胶产品达到无菌植入性医疗器械的灭菌水平（SAL=10-6）。需要说明的是，本发明步骤（1）中，调节无菌透明质酸溶液进行湿热灭菌后，调节的pH时，需要在控菌条件下进行，以得到无菌混合液。
以下作为本发明的优选技术方案，但不作为对本发明提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。
作为本发明的优选技术方案，所述无菌透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为0.1%~10%（例如可以是0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、等），优选为0.5%~5%，更优选为1.0%~3%。
本发明中，通过控制无菌透明质酸溶液的质量浓度在特定的范围内，可制备得到性能优异的、具有三维网络结构的透明质酸凝胶。若无菌透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度过低，在冻融过程（冷冻-解冻过程）中，氢键浓度过低，难以得到具有三维结构的凝胶；若无菌透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度过高，透明质酸难以完全溶解，难以得到均一的透明质酸溶液，不利于获得三维网络结构的透明质酸凝胶。
优选地，所述透明质酸溶液的溶剂包括注射用水、无菌注射用水。
需要说明的是，无菌注射用水即为灭菌注射用水。
优选地，所述透明质酸溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少百级层流下，将无菌透明质酸分散于无菌注射用水中，得到无菌透明质酸溶液；
或者，在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用水中，湿热灭菌，得到无菌透明质酸溶液。
优选地，所述透明质酸的重均分子量为1万~350万，例如可以是1万、5万、10万、40万、70万、100万、150万、200万、250万、280万、320万或350万。
本发明中，通过控制透明质酸的重均分子量在特定的范围内，可制备得到性能优异的凝胶。透明质酸的重均分子量越高，冻融过程物理缠绕程度越大，形成的凝胶力学性能越好。
需要说明的是，本发明中，透明质酸溶液可由一种透明质酸分散于注射用水中制备得到，也可由不同重均分子量的透明质酸分散于注射用水制备得到。
优选地，所述分散的方法包括搅拌、均质分散、超声分散。
作为本发明的优选技术方案，所述湿热灭菌的温度为110~121℃，例如可以是110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、116℃、117℃、118℃、119℃或121℃等。
优选地，所述湿热灭菌的时间为15 min ~30 min，例如可以是15 min、17 min、18min、20 min、22 min、24 min、25 min、27 min或30 min等。
本发明中，通过控制湿热灭菌的温度和时间在特定的范围内，可对透明质酸溶液进行灭菌，取到较好的灭菌效果，以便后续制备得到达到灭菌为SAL=10-6的透明质酸凝胶。
优选地，所述湿热灭菌在灭菌柜中进行。
优选地于，步骤（1）调节无菌透明质酸溶液的pH的方法包括：将盐酸溶液经滤膜注入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0（例如可以是1.5、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8或3.0等）；
或者，在百级层流保护下，将盐酸溶液加入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0（例如可以是1.0、1.2、1.5、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8或3.0等）。
需要说明的是，本发明对于盐酸溶液的质量浓度没有任何特殊要求，本领域常用的质量浓度均适用，只需要使用盐酸溶液将透明质酸溶液的pH调制≤3.0即可。
需要说明的是，若步骤（1）调节无菌透明质酸溶液的pH的过程是在百级层流保护下进行，则可以敞开容器，常规加入盐酸溶液即可，加入盐酸溶液的方法包括倒入、分批加入、滴加等。
本发明中，通过控制调节无菌透明质酸溶液的pH的方法，可避免在调节pH的过程中，微生物进入透明质酸溶液，进而制备得到无菌混合液。优选地，所述滤膜的孔径≤0.22μm，例如可以是0.15 μm、0.18 μm、0.20 μm或0.22 μm等。
作为本发明的优选技术方案，步骤（2）所述冷冻的温度为-200℃~ -2℃（例如可以是-200℃、-180℃、-150℃、-120℃、-100℃、-80℃、-60℃、-40℃、-20℃、-10℃、-8℃、-6℃、-4℃或-2℃等），优选为-80℃~ -8℃，进一步优选为-40℃~ -10℃。
需要说明的是，本发明中冷冻过程可以是在同一温度下进行冷冻，也可选用梯度冷冻的方式，即在不同温度下进行冷冻，采用梯度冷冻，其温度可以由高至低，也可以由低至高。透明质酸溶液的降温速率越慢，透明质酸之间形成的氢键时间窗口越长，冷冻效果越好；降温速率越快，可以实现快速冷冻，缩短冷冻周期。
优选地，步骤（2）所述冷冻的时间为1 h~21天（例如可以是1 h、12 h、1天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天或21天等），进一步优选为4 h~14天，更进一步优选为12 h~7天。
优选地，步骤（2）所述解冻为：在20~40℃（例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃等）下进行解冻，至冰冻全部溶解。
优选地，步骤（2）所述n为1~9的整数（例如可以是1、2、3、4、5、6、7、8或9），进一步优选为2~7的整数，更进一步优选为3、4或5。
本发明中，通过重复冷冻-解冻1~9次，可制备得到具有三维结构、具有较好抗透明质酸酶酶解性能、在体内维持时间更久的透明质酸凝胶。若冷冻-解冻的次数过少，则制备得到的透明质酸凝胶力学较差；若冷冻-解冻的次数过多，则需要较长的生产周期、较高的生产成本。
作为本发明的优选技术方案，步骤（3）所述阻菌透析容器截留分子量≤1000 KD（例如可以是50 KD、100 KD、200 KD、300 KD、400 KD、500 KD、600 KD、700 KD、800 KD、900KD或1000 KD等），优选为≤300 KD，进一步优选为≤50 KD。
阻菌透析容器可阻止微生物进入，避免污染，而且小分子物质溶液可自由扩散，实现调节pH目的。阻菌透析容器材质可以是纤维、高分子塑料、金属等。
优选地，步骤（3）所述阻菌透析容器包括阻菌透析袋或滤芯，进一步优选为阻菌透析袋。
滤芯与透析液接触面积小（软管连接），透析时间长；透析袋与透析液接触面积大（浸泡在透析液中），透析时间短。
优选地，所述滤芯包括圆筒式滤芯、囊式滤芯和平板式滤芯。
优选地，所述阻菌透析袋的孔径≤0.22 μm，例如可以是3 nm、14 nm、0.1 μm、0.12μm、0.14 μm、0.16 μm、0.18 μm、0.20 μm或0.22 μm等。
优选地，步骤（3）所述调节pH的方法包括如下步骤：
在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于阻菌透析容器中，将其置于pH为6.8~8.0（例如可以是6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8或8.0等）的磷酸盐缓冲溶液进行浸泡8 h~24 h（例如可以是8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h或24 h等），更换磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡m次，直至阻菌透析容器中凝胶的pH在6.8~7.6之间（例如可以是6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6等）。
需要说明的是，步骤（3）中使用的磷酸盐缓冲溶液为无菌磷酸盐缓冲溶液。
其中，m为≥1的整数。
优选地，所述后处理的方法包括：制粒，得到透明质酸凝胶颗粒由透明质酸凝胶小块制粒得到。
需要说明的是，透明质酸凝胶剂制粒后处理在百级层流手套箱中进行。
所述透明质酸凝胶颗粒的制备方法包括如下步骤：
在百级层流手套箱中，将透明质酸凝胶转移至无菌袋中，挤压成1~3 cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径1 nm ~ 100 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶颗粒。
作为本发明的优选技术方案，所述透明质酸凝胶的制备方法具体包括如下步骤：
（1）在至少百级层流下，将无菌透明质酸分散于无菌注射用水中，得到质量浓度为0.1~10%的无菌透明质酸溶液，或者，在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用水中，湿热灭菌，得到质量浓度为0.1~10%的无菌透明质酸溶液；
将盐酸溶液经滤膜注入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0，得到混合液；
或者，在百级层流保护下，将盐酸溶液加入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0，得到混合液；
（2）在万级净化车间，在-200℃~ -2℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1 h~21天后，在20~40℃下进行解冻，至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻n次，得到凝胶，其中，n为≥1的整数；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径≤0.22 μm的阻菌透析袋中，将其置于pH为6.8~8.0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡8~24 h，更换磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡m次，直至阻菌透析袋中凝胶的pH在6.8~7.6之间，得到所述透明质酸凝胶，其中，m为≥1的整数。
需要说明的是，上述透明质酸凝胶的制备方法中，步骤（1）和步骤（2）均为万级净化车间中进行。
第二方面，本发明提供一种透明质酸凝胶，所述透明质酸凝胶由如第一方面所述的透明质酸凝胶的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的透明质酸凝胶的应用，所述透明质酸凝胶用于制备透明质酸干膜；
优选地，所述透明质酸干膜由所述透明质酸凝胶冷冻干燥得到。
需要说明的是，透明质酸干膜直接由透明质酸凝胶制备得到，无需进行制粒后处理过程。
优选地，所述透明质酸凝胶用作美容填充材料、术后防粘连材料、骨关节治疗材料或伤口愈合材料。
第四方面，本发明提供一种透明质酸凝胶注射剂，所述透明质酸凝胶注射剂包括如第二方面所述的透明质酸凝胶和透明质酸溶液。
优选地，所述透明质酸凝胶注射剂中，所述透明质酸凝胶和所述透明质酸溶液的质量比为(0.3~9):1，例如可以是0.3:1、0.7:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1等。
优选地，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为0.1~3%，例如可以是0.05%、0.07%、0.1%、0.3%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%或3%等。
优选地，所述透明质酸溶液的溶剂包括注射用磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲液）。
优选地，所述透明质酸溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用磷酸盐缓冲溶液中后，进行湿热灭菌，得到透明质酸溶液。
优选地，所述透明质酸溶液中透明质酸的重均分子量为5千~280万，例如可以是5千、1万、5万、10万、40万、70万、100万、150万、200万、250万或280万等。
优选地，所述湿热灭菌的温度为110~121℃，例如可以是110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、116℃、117℃、118℃、119℃或121℃等。
优选地，所述湿热灭菌的时间为15 min ~30 min，例如可以是15 min、17 min、18min、20 min、22 min、24 min、25 min、27 min或30 min等。
优选地，所述透明质酸凝胶注射剂中还包括功能组分溶液。
优选地，所述功能组分溶液中功能组分选自维生素、氨基酸、多肽、辅酶、核酸、矿物质、外泌体、镇痛剂或血管收缩剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述功能组分包括L-肌肽、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、维生素B2或利多卡因中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述功能组分溶液的溶剂包括注射用磷酸盐缓冲溶液。
优选地，所述功能组分溶液中功能组分的质量浓度为0.005~8%（例如可以是0.005%、0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%或8%等），进一步优选为0.02~5%，更进一步优选为0.05~3%。
优选地，所述功能组分溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少万级净化车间，将功能组分分散于注射用磷酸盐缓冲溶液后，过滤除菌，得到功能组分溶液。
优选地，所述透明质酸凝胶注射剂中，所述透明质酸凝胶和所述功能组分溶液的质量比为(0.01~99):1（例如可以是0.01:1、0.1:1、0.3:1、0.5:1、1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或99:1等），进一步优选为(0.5~10):1，更进一步优选为(1~5):1。
第五方面，本发明提供一种如第四方面所述的透明质酸凝胶注射剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
在百级层流下，将透明质酸凝胶、所述透明质酸溶液和任选的所述功能组分溶液混合、除泡、灌装，得到所述透明质酸凝胶注射剂。
优选地，所述灌装为无菌灌装。
优选地，所述灌装后还包括后处理过程，所述后处理包括检验，确保产品合格，如灯检确保每个产品无可见异物，无菌检验确保该批产品达到无菌水平。
本发明采用三段式（前段采用湿热灭菌，过程使用阻菌透析容器袋阻菌，后端采用无菌灌装）的无菌措施以保障工业化生产出无菌冻融透明质酸凝胶。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明通过对透明质酸凝胶的制备方法进行设计，进一步通过调节无菌透明质酸的pH，然后进行冷冻-解冻，得到凝胶，再在特定孔径的阻菌透析容器中调节凝胶的pH为中性，最终制备得到了具有三维结构的同时，灭菌水平达到SAL=10-6，且符合无菌植入性医疗器械要求的透明质酸凝胶。
（2）本发明中通过采用冻融技术制备得到了具有三维结构的透明质酸凝胶，避免了化学交联剂的使用，制备得到了对人体更安全、具有抗透明质酸酶酶解性能、在体内维持时间更久的透明质酸凝胶。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的透明质酸凝胶的制备流程示意图；
图2是本发明实施例1和对比例4-5提供的透明质酸凝胶的吸光度值随时间的变化曲线。
图3是本发明应用例2提供的透明质酸凝胶注射剂的制备流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例和对比例中部分组分来源如下所述：
透明质酸1：重均分子量为200万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸2：重均分子量为40万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸3：重均分子量为280万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸4：重均分子量为60万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸5：重均分子量为160万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸6：重均分子量为120万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸7：重均分子量为100万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-EP1；
透明质酸8：重均分子量为1万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-TLM；
透明质酸9：重均分子量为5万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-TLM；
透明质酸10：重均分子量为20万，购自华熙生物科技股份有限公司，牌号HA-TLM；
实施例1
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A1）及其制备方法，所述透明质酸凝胶的制备方法如下，其制备流程示意图如图1所示：
（1）在万级净化车间，将重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）搅拌分散溶解于注射用水（900 mL）中，得到透明质酸溶液；
将透明质酸溶液置于灭菌柜中，在121℃下，对透明质酸溶液进行湿热灭菌20 min后，将盐酸溶液（1 mol/L，60 mL）经孔径为0.22 μm的水系醋酸纤维素滤膜注入透明质酸溶液中，并向其中加入注射用水至其体积为1000 mL，混合均匀，得到pH为1.5的混合液；
（2）在万级净化车间，在-20℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻2天后，在30℃下解冻，至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻3次，得到凝胶；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）中，将其置于pH为7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液进行浸泡12 h，更换无菌磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡4次，使阻菌透析袋中凝胶的pH为7.2±0.2；
在百级层流手套箱中，将上述凝胶转移至阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）中，挤压成1~3cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径20~400 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶A1，其中透明质酸的质量含量约为2%。
实施例2
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A2）及其制备方法，所述透明质酸凝胶的制备方法如下：
（1）在万级净化车间，将重均分子量为280万的透明质酸3（15 g）和重均分子量为60万的透明质酸4（5 g）搅拌分散于注射用水（900 mL）中，得到透明质酸溶液；
将透明质酸溶液置于灭菌柜中，在121℃下，对透明质酸溶液进行湿热灭菌20 min后，将盐酸溶液（1mol/L，60 mL）经孔径为0.22 μm的水系醋酸纤维素滤膜注入透明质酸溶液中，并向其中加入注射用水至其体积为1000 mL，混合均匀，得到pH为1.5的混合液；
（2）在万级净化车间，在-8℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1天后，降温至-20℃，继续冷冻1天，再降温至-40℃，继续冷冻1天，然后在30℃下解冻，至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻3次，得到凝胶；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径为3 nm的阻菌透析袋（截留分子量为50 KD）中，将阻菌透析袋置于pH为7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液进行浸泡12h，更换无菌磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡5次，使阻菌透析袋中凝胶的pH为7.2±0.2；
在百级层流手套箱中，将上述凝胶转移至无菌袋（贝克曼库尔特有限公司，PE无菌采样袋）中，挤压成1~3cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径20~400 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶A2，其中透明质酸的质量含量约为4%。
实施例3
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A3）及其制备方法，所述透明质酸凝胶的制备方法如下：
（1）在万级净化车间，将重均分子量为160万的透明质酸5（8 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（4 g）搅拌分散于注射用水（900 mL）中，得到透明质酸溶液；
将透明质酸溶液置于灭菌柜中，在121℃下，对透明质酸溶液进行湿热灭菌20 min后，将盐酸溶液（1mol/L，60 mL）经孔径为0.22 μm的水系醋酸纤维素滤膜注入透明质酸溶液中，并向其中加入注射用水至其体积为1000 mL，混合均匀，得到pH为1.5的混合液；
（2）在万级净化车间，在-40℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1天后，降温至-20℃，继续冷冻1天，再降温至-8℃，继续冷冻1天，然后在30℃下解冻，至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻3次，得到凝胶；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径为3 nm的阻菌透析袋（截留分子量为50 KD）中，将其置于pH为7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液进行浸泡12 h，更换无菌磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡3次，使阻菌透析袋中凝胶的pH为7.2±0.2；
在百级层流手套箱中，将上述凝胶转移至无菌袋（贝克曼库尔特有限公司，PE无菌采样袋）中，挤压成1~3cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径1~1000 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶A3，其中透明质酸的质量含量约为24%。
实施例4
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A4）及其制备方法，所述透明质酸凝胶的制备方法如下：
（1）在万级净化车间，将重均分子量为120万的透明质酸6（10 g）搅拌分散于注射用水（900 mL）中，得到透明质酸溶液；
将透明质酸溶液置于灭菌柜中，在121℃下，对透明质酸溶液进行湿热灭菌20 min后，将盐酸溶液（1mol/L，60 mL）经孔径为0.22 μm的水系醋酸纤维素滤膜注入透明质酸溶液中，并向其中加入注射用水至其体积为1000 mL，混合均匀，得到pH为1.5的混合液；
（2）在万级净化车间，在-20℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1天后，在20℃下解冻至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻3次，得到凝胶；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径为3 nm的阻菌透析袋（截留分子量为50 KD）中，将其置于pH为7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液进行浸泡12 h，更换无菌磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡3次，使阻菌透析袋中凝胶的pH为7.2±0.2；
在百级层流手套箱中，将上述凝胶转移至无菌袋（贝克曼库尔特有限公司，PE无菌采样袋）中，挤压成1~3cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径20~400 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶A4，其中透明质酸的质量含量约为4%。
实施例5
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A5）及其制备方法，与实施例4的区别仅在于：
步骤（3）中，在百级层流手套箱中，将上述凝胶转移至无菌袋（贝克曼库尔特有限公司，PE无菌采样袋）中，挤压成1~3cm3的小块，放入可密封的罐体中，以均质机剪切成粒径1 nm~10 μm的颗粒，得到所述透明质酸凝胶A5；
其他条件与实施例4相同。
实施例6
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A6）及其制备方法，所述透明质酸凝胶的制备方法如下：
（1）在万级净化车间，将重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）搅拌分散于注射用水（900 mL）中，得到透明质酸溶液；
将透明质酸溶液置于灭菌柜中，在121℃下，对透明质酸溶液进行湿热灭菌20 min后，将盐酸溶液（1mol/L，60 mL）经孔径为0.22 μm的水系醋酸纤维素滤膜注入透明质酸溶液中，并向其中加入注射用水至其体积为1000 mL，混合均匀，得到pH为1.5的混合液，将其分装到长宽高为20*12*2cm塑料凹槽中；
（2）在万级净化车间，在-20℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1天后，在20℃下解冻至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻3次，得到凝胶；
（3）在百级层流手套箱中，将步骤（2）得到的凝胶置于孔径为3 nm的阻菌透析袋（截留分子量为50 KD）中，将其置于pH为7.2的无菌磷酸盐缓冲溶液进行浸泡12 h，更换无菌磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡3次，使阻菌透析袋中凝胶的pH为7.2±0.2，得到所述透明质酸凝胶。
实施例7
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A7）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（3）中，将孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）替换为孔径为0.22 μm的阻菌透析袋（截留分子量为1000KD）；
其他条件与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A8）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（3）中，将孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）替换为孔径为3nm的阻菌透析袋（截留分子量为50 KD）；
其他条件与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A9）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（3）中，将孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）替换为孔径为0.25 μm的阻菌透析袋（截留分子量为约1600KD）；
其他条件与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A10）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为280万的透明质酸3（1 g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A10，其中透明质酸的质量含量约为0.1%。
实施例11
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A11）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为280万的透明质酸3（5g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A11，其中透明质酸的质量含量约为0.5%。
实施例12
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A12）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为200万的透明质酸1（22.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（7.5g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A12，其中透明质酸的质量含量约为3%。
实施例13
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A13）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为100万的透明质酸7（40 g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A13，其中透明质酸的质量含量约为5%。
实施例14
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A14）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为1万的透明质酸8（100 g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A14，其中透明质酸的质量含量约为10 %。
实施例15
本实施例提供一种透明质酸凝胶（记为A15）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
将步骤（1）中的重均分子量为200万的透明质酸1（7.5 g）和重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）替换为重均分子量为1万的透明质酸8（120 g）；
其他条件与实施例1相同，制备得到透明质酸凝胶A15，其中透明质酸的质量含量约为12%。
对比例1
本对比例提供一种透明质酸凝胶（记为B1-1）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（1）中，未对透明质酸溶液进行湿热灭菌；
步骤（3）中，将孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）替换为普通透析袋（上海源叶生物科技有限公司，普通型透析袋（截留分子量为8000-14000））；
其他条件与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种透明质酸凝胶（记为B1-2）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（1）中，未对透明质酸溶液进行湿热灭菌；
其他条件与实施例1相同。
对比例3
本对比例提供一种透明质酸凝胶（记为B1-3）及其制备方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤（3）中，将孔径为14 nm的阻菌透析袋（截留分子量为300 KD）替换为普通透析袋；
其他条件与实施例1相同。
对比例4
本对比例提供一种透明质酸凝胶，所述透明质酸凝胶为乔雅登丰颜®，购自艾尔建（Allergan）。
对比例5
本对比例提供一种透明质酸凝胶，所述透明质酸凝胶为瑞蓝唯瑅，购自科医有限公司Q-Med AB。
常规灭菌方法及灭菌结果分析汇总如下表1所示：
表1
从表1中可知，常规灭菌方法难以满足冻融透明质酸凝胶作为无菌植入性医疗器械的灭菌水平，高热、辐照、电离氧化均会破坏冻融透明质酸凝胶三维结构，采用化学试剂灭菌，又难以去除残留的化学试剂。由上述内容可知，采用上述常规灭菌方法无法得到满足人体植入、无菌水平达到SAL=10-6、还具有三维结构的透明质酸凝胶。
本发明中，通过对灭菌方法进行设计，进一步通过在前端工序采用湿热灭菌的方法对透明质酸原料进行彻底灭菌，过程采用具有特定截留分子量的阻菌透析容器进行阻菌，既可以维持冻融透明质酸凝胶三维结构，又能达到无菌植入器械的无菌水平SAL=10-6。
酶解测试
对实施例1和对比例4、对比例5提供的透明质酸凝胶进行透明质酸酶酶解实验（样品中透明质酸浓度均为20 mg/mL）。
实验试剂：透明质酸酶（购自华熙生物科技股份有限公司、1 mL/支（规格：10000IU/mL）），无菌生理盐水。
透明质酸酶溶液配制：以无菌生理盐水将透明质酸酶稀释成约400U/mL的透明质酸酶溶液。
样品处理：分别称量实施例1和对比例4、对比例5提供的透明质酸凝胶0.5 g作为供试样，分别置于10 mL玻璃瓶中，分别加入8mL 400U/mL的透明质酸酶溶液，涡旋2-5 min溶解，分别得到供试样溶液。
酶解步骤：分别将供试样溶液放入37℃水浴锅，进行酶解。预定时间点（0 min、5min、15 min、35 min、65 min、95 min、125 min、155 min、185 min、215 min）取样0.5 mL于8mL玻璃瓶中，加生理盐水3.5mL，放入95℃水浴中10min，静置冷却至室温后，转移至比色皿中，放置3min以上，在232 nm处测试其吸光度，绘制吸光度值随时间的变化曲线，如图2所示。
由图2可知，本发明提供的透明质酸凝胶（A1-1）具有抗透明质酸酶解的性能。样品A1-1始终对透明质酸酶无响应，而乔雅登丰颜®和瑞蓝唯瑅分别在95 min、65 min基本完全酶解。
根据“《中国药典》四部 通则1101 无菌检查法 直接接种法”对上述实施例和对比例提供的透明质酸凝胶进行无菌检测，测试结果如下表2所示：
表2
注：“–”表示无菌生长，“+”表示有菌生长。
由表2可知，本发明中，通过在前端工序进行湿热灭菌、又在过程中使用适当孔径阻菌透析袋制备得到的透明质酸凝胶可通过无菌检测，且具有批间稳定性。
若在前端工序进行湿热灭菌，步骤（3）中调节凝胶pH为中性过程中使用的阻菌透析袋孔径过大（实施例9），制备得到的透明质酸凝胶经无菌检测后，其无菌结果也是波动的，应是微生物穿过透析袋孔径所致。
若步骤（1）中透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度过大（实施例15），则制备得到的透明质酸凝胶的综合性能较差。
若在前端工序未进行湿热灭菌处理（对比例1-2），制备得到的透明质酸凝胶，无菌检测均未通过。
若在前端工序进行湿热灭菌，步骤（3）中调节凝胶pH为中性过程中未使用阻菌透析袋（对比例3），制备得到的透明质酸凝胶经无菌检测后，其无菌结果是波动的，主要原因可能是透析时间过长，单纯靠百级层流难以保证无菌条件。
应用例1
本应用例提供一种透明质酸注射剂及其制备方法，所述透明质酸注射剂包括实施例2提供的透明质酸凝胶（400 g）和透明质酸溶液（200 g）；
所述透明质酸溶液的制备方法如下：
在万级净化车间，将重均分子量为100万的透明质酸7（5 g）搅拌下分散溶解于500mL注射用磷酸盐缓冲溶液中，得到混合液；
将上述混合液置于灭菌柜中，在121℃下，进行湿热灭菌15min，得到透明质酸溶液。
所述透明质酸注射剂的制备方法如下：
在百级层流下，将实施例2提供的透明质酸凝胶（400 g）和上述透明质酸溶液（200g）搅拌混匀、除泡；
以无菌灌装技术将复配凝胶灌装于一次性无菌注射器中，检验，得到含冻融透明质酸浓度为26.7 mg/mL的透明质酸注射剂。
应用例2
本应用例提供一种透明质酸注射剂及其制备方法，其制备流程图如图3所示，所述透明质酸注射剂包括实施例3提供的透明质酸凝胶（500 g）、透明质酸溶液（400 g）、功能组分溶液（100 g）；
所述透明质酸溶液的制备方法如下：
在万级净化车间，将重均分子量为1万的透明质酸8（1 g）、重均分子量为5万的透明质酸9（1 g）、重均分子量为20万的透明质酸10（1 g）、重均分子量为40万的透明质酸2（2g）、重均分子量为60万的透明质酸4（2 g）、重均分子量为100万的透明质酸7（3 g）搅拌下分散溶解于1000 mL注射用磷酸盐缓冲溶液中，得到混合液；
将上述混合液置于灭菌柜中，在121℃下，进行湿热灭菌15min，得到透明质酸溶液。
所述功能组分溶液的制备方法如下：
在万级净化车间，将L-肌肽（2 g）、甘氨酸（0.1 g）、脯氨酸（0.2 g）、丙氨酸（0.1g）、维生素B2（0.005 g）和利多卡因（3 g）搅拌下分散溶解于100 g注射用磷酸盐缓冲溶液中，得到混合液；
以无菌空气压力为动力，将上述混合液依次经过0.45 μm、0.22 μm的滤芯，过滤除菌，得到功能组分溶液。
所述透明质酸注射剂的制备方法如下：
在百级层流下，将实施例3提供的透明质酸凝胶（500 g）、上述透明质酸溶液（400g）和上述功能组分溶液（100 g）搅拌混匀、除泡；
以无菌灌装技术将复配凝胶灌装于一次性无菌注射器中，检验，得到含冻融透明质酸浓度为12 mg/mL的透明质酸注射剂。
应用例3
本应用例提供一种透明质酸注射剂及其制备方法，所述透明质酸制剂包括实施例4提供的透明质酸凝胶（200 g）和透明质酸溶液（200 g）；
所述透明质酸溶液的制备方法如下：
在万级净化车间，将重均分子量为40万的透明质酸2（2.5 g）搅拌分散溶解于500mL注射用磷酸盐缓冲溶液中，得到混合液；
将上述混合液置于灭菌柜中，在121℃下，进行湿热灭菌15min，得到透明质酸溶液。
所述透明质酸注射剂的制备方法如下：
在百级层流下，将实施例4提供的透明质酸凝胶（200 g）和上述透明质酸溶液（200g）搅拌混匀、除泡；
以无菌灌装技术将复配凝胶灌装于一次性无菌注射器中，检验，得到含冻融透明质酸浓度为10 mg/mL的透明质酸注射剂。
应用例4
本应用例提供一种透明质酸注射剂及其制备方法，与应用例3的区别仅在于：
将应用例3中的实施例4提供的透明质酸凝胶（200 g）替换为实施例5提供的透明质酸凝胶（200 g）；
其他条件与应用例3相同。
本应用例提供的透明质酸注射剂为含有冻融透明质酸细微颗粒的流动性溶液，可以治疗膝关节骨关节炎和退行性膝关节疾病，相对传统的透明质酸注射液（购自山东博士伦福瑞达制药有限公司玻璃酸钠注射液，其降解周期短1周，注射频繁1周1次、连续注射5周），本发明提供的透明质酸制剂，降解时间慢（4-8周），注射次数少（1月1次，连续3个月）。
应用例5
本应用例提供一种透明质酸凝胶干膜，所述透明质酸凝胶干膜的制备方法如下：
将实施例6提供的透明质酸凝胶置于温度为-40℃的冻干机进行冷冻干燥48 h，得到具有三维网络结构的透明质酸干膜。
本实施例提供的透明质酸干膜具有较好的吸水复溶性能，可吸收伤口的渗出液，易于贴附在伤口表面，阻隔微生物侵入，促进伤口的愈合。
由上述内容可知，本发明通过对透明质酸凝胶的制备方法进行设计，进一步通过先对透明质酸溶液进行湿热灭菌，然后进行冷冻-解冻，得到凝胶，再在特定孔径的阻菌透析容器中调节凝胶的pH为中性，最终制备得到灭菌水平达到SAL=10-6，达到无菌植入性医疗器械要求的透明质酸凝胶。本发明中制备得到的透明质酸凝胶具有三维结构，制备得到了对人体更安全、具有抗透明质酸酶酶解性能、在体内维持时间更久的透明质酸凝胶，可用作美容填充材料、术后防粘连材料、骨关节治疗材料或伤口愈合材料。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (13)
1.一种透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）调节无菌透明质酸溶液的pH，得到无菌混合液；
（2）将步骤（1）得到的混合液进行冷冻后，解冻，并循环冷冻-解冻n次，得到凝胶，其中，n为≥1的整数；
（3）将步骤（2）得到的凝胶置于阻菌透析容器中，调节pH，得到所述透明质酸凝胶；
所述无菌透明质酸溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用水中，湿热灭菌，得到无菌透明质酸溶液；
步骤（3）所述阻菌透析容器截留分子量≤1000 KD。
2.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，所述无菌透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为0.1%~10%；
所述无菌透明质酸溶液的溶剂包括注射用水、无菌注射用水；
和/或，所述透明质酸的重均分子量为1万~350万。
3.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，所述湿热灭菌的温度为110℃~121℃；
和/或，所述湿热灭菌的时间为15 min ~30 min。
4.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）调节无菌透明质酸溶液的pH的方法包括：将盐酸溶液经滤膜注入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0，所述滤膜的孔径≤0.22 μm；
或者，在百级层流保护下，将盐酸溶液加入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0。
5.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述冷冻的温度为-200℃~ -2℃；
和/或，步骤（2）所述冷冻的时间为1 h~21天；
和/或，步骤（2）所述解冻为：在20~40℃下进行解冻，至冰冻全部溶解；
和/或，步骤（2）所述n为1~9的整数。
6.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述阻菌透析容器包括阻菌透析袋或滤芯；
和/或，步骤（3）所述阻菌透析容器为阻菌透析袋，所述阻菌透析袋的孔径≤0.22 μm；
和/或，步骤（3）所述调节pH的方法包括如下步骤：
将步骤（2）得到的凝胶置于阻菌透析容器中，将其置于pH为6.8~8.0的磷酸盐缓冲溶液进行浸泡8 h ~24 h，更换磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡m次，至阻菌透析容器中凝胶的pH在6.8~7.6之间；
其中，m为≥1的整数；
和/或，得到所述透明质酸凝胶后还包括后处理的步骤；所述后处理的步骤包括：制粒，得到透明质酸凝胶颗粒。
7.根据权利要求1所述的透明质酸凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）在至少百级净化环境，将无菌透明质酸分散于无菌注射用水中，得到质量浓度为0.1~10%的无菌透明质酸溶液，或者，在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用水中，湿热灭菌，得到质量浓度为0.1~10%的无菌透明质酸溶液；
将盐酸溶液经滤膜注入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0，得到混合液；
或者，在百级层流保护下，将盐酸溶液加入无菌透明质酸溶液中，混合均匀，至pH≤3.0，得到混合液；
（2）在-200℃~ -2℃下，将步骤（1）得到的混合液进行冷冻1 h~21天后，在20~40℃下进行解冻，至冰冻全部溶解，并循环冷冻-解冻n次，得到凝胶，其中，n为≥1的整数；
（3）将步骤（2）得到的凝胶置于孔径≤0.22 μm的阻菌透析袋中，将其置于pH为6.8~8.0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡8~24 h，更换磷酸盐缓冲溶液，再次浸泡，重复浸泡m次，直至阻菌透析袋中凝胶的pH在6.8~7.6之间，得到所述透明质酸凝胶，其中，m为≥1的整数。
8.一种透明质酸凝胶，其特征在于，所述透明质酸凝胶由如权利要求1-7任一项所述的透明质酸凝胶的制备方法制备得到。
9.一种如权利要求8所述的透明质酸凝胶的应用，其特征在于，所述透明质酸凝胶用于制备透明质酸凝胶颗粒或透明质酸干膜；
和/或，所述透明质酸凝胶用作美容填充材料、术后防粘连材料、骨关节治疗材料或伤口愈合材料。
10.一种透明质酸凝胶注射剂，其特征在于，所述透明质酸凝胶注射剂包括如权利要求8所述的透明质酸凝胶和透明质酸溶液。
11.根据权利要求10所述的透明质酸凝胶注射剂，其特征在于，所述透明质酸凝胶注射剂中，所述透明质酸凝胶和所述透明质酸溶液的质量比为(0.3~9):1；
和/或，所述透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度为0.1~3%；
和/或，所述透明质酸溶液的溶剂包括注射用磷酸盐缓冲溶液；
和/或，所述透明质酸溶液中透明质酸的重均分子量为5千~280万；
和/或，所述透明质酸溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少万级净化车间，将透明质酸分散于注射用磷酸盐缓冲溶液中后，进行湿热灭菌，得到透明质酸溶液；
所述湿热灭菌的温度为110~121℃，时间为15 min ~30 min。
12.根据权利要求10所述的透明质酸凝胶注射剂，其特征在于，所述透明质酸凝胶注射剂中还包括功能组分溶液；
所述功能组分溶液中功能组分选自维生素、氨基酸、多肽、辅酶、核酸、矿物质、外泌体、镇痛剂或血管收缩剂中的任意一种或至少两种的组合；
和/或，所述功能组分溶液的溶剂包括注射用磷酸盐缓冲溶液；
和/或，所述功能组分溶液中功能组分的质量浓度为0.005~8%；
和/或，所述透明质酸凝胶注射剂中，所述透明质酸凝胶和所述功能组分溶液的质量比为(0.01~99):1；
和/或，所述功能组分溶液采用如下方法制备得到，所述方法包括如下步骤：
在至少万级净化车间，将功能组分分散于注射用磷酸盐缓冲溶液后，过滤除菌，得到功能组分溶液。
13.一种如权利要求10-12任一项所述的透明质酸凝胶注射剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
在至少百级层流下，将透明质酸凝胶注射剂各组分混合、除泡、灌装，得到所述透明质酸凝胶注射剂。
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