CN105107018A

CN105107018A - 一种无菌可注射材料的制备方法

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Publication number: CN105107018A
Application number: CN201510512623.1A
Authority: CN
Inventors: 李媚
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN105107018B

Abstract

本发明涉及一种无菌可注射材料的制备方法，主要包括以下几步骤：1）、提供交联透明质酸凝胶，将高分子透明质酸和低分子透明质酸干粉溶解形成水溶液，用交联剂进行交联；2）、将1）产物低温均质；3）将高分子透明质酸干粉溶解形成水溶液，然后添加水溶性维生素等成分，与2）产物在不剪切透明质酸分子链的机械力作用下混匀；4）将3）形成的混合物灭菌。该方法制备的无菌可注射材料降解周期长、可塑性强、稳定性好且柔软度高，可用于皮下组织填充或皮肤修复、手术防粘连以及关节腔润滑等。

Description

一种无菌可注射材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种无菌可注射材料的制备方法，特别涉及无菌可注射透明质酸凝胶的制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronicacid)是一种是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高分子粘多糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连，双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。商品化透明质酸一般为其钠盐，即透明质酸钠(SodiumHyaluronate)，简称HA，习惯上仍称为透明质酸。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，尤其具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子(Naturalmoisturizingfactor，NMF)。透明质酸广泛分布于人体各部位，其中皮肤也含有大量的透明质酸。透明质酸被广泛应用于眼科粘弹性保护、骨关节功能改善、外科防粘连、组织填充等医用和整形美容领域。透明质酸被注入真皮或皮下组织中，使皮下组织容积增大，同时透明质酸可以吸收周围组织的水分，使原本松弛、凹陷的皮肤体积增大而恢复饱满的形态。在整形美容领域，透明质酸主要用于填充面部凹陷、除皱、隆鼻、治疗半侧颜面部萎缩等方面。

由于人体透明质酸酶、自由基降解等原因，外援天然的透明质酸在体内维持存在的时间短，限制了透明质酸在皮下组织填充或皮肤修复、手术防粘连以及关节腔润滑等方面的应用。因此，国内外一些公司研究通过改进不同的加工工艺来提高透明质酸在人体内降解周期。

透明质酸在体内的降解周期受到材料本身和体内微环境的影响，而本身主要受到材料组成和加工工艺影响。最近一些年，国外一些公司使用交联剂，例如1,4-丁二醇缩水甘油醚(BDDE)，制造的交联透明质酸被应用于软组织填充，在体内降解周期只有达到6到12个月的时间，整形美容患者需要连续注射两次才可以达到预期效果。很显然，这样快的降解周期满足不了人们对于更长降解周期透明质酸产品的需求。

大家知道，透明质酸注射前必须灭菌，透明质酸凝胶在110℃以上加热处理或者辐照处理后，稳定性不好，灭菌后的弹性模量G’显著降低，降解加快，会影响其被植入体内后填充效果。一些专利讲到透明质酸与维生素C或其衍生物的应用，专利WO2012/104419提示可以通过添加一定量的维生素C及其衍生物到含有镇静剂的透明质酸，可以提高透明质酸的热稳定性，使得灭菌后弹性模量G’的变化不大。但是，该专利又指出单独添加维生素C及其衍生物对透明质酸材料的稳定性没有作用或者作用不显著。专利US2014/0088037也显示添加维生素C磷酸酯镁(MAP)HA的弹性模量G’灭菌后保持不变或者提高5-400Pa。但专利的产品存在大小不一的透明质酸颗粒，通过增大颗粒来维持降解周期的。透明质酸颗粒较大时，虽然对稳定有帮助，但是大颗粒常常不柔软，植入时非常困难，而且植入人体后往往伴有胀痛和不舒适感的产生。瑞典公司Q-MEDAB公司生产透明质酸产品—瑞蓝2被临床应用多年，将近150万人次使用过，显示安全、有效。但是，临床也反映，由于该产品含有大小不均一的凝胶颗粒，柔软度不高，植入体后会有胀痛等不舒适感而且体内降解周期太短，半年内往往需要二次注射。美国专利No.2011/0171286提到，添加维生素B、维生素C、微生素E中至少一个的交联透明质酸凝胶表现出比不含添加物的交联透明质酸凝胶有更大的稳定性。该专利产品成凝胶状态，虽然延展性好，但是可塑形较差，影响了在整形方面应用。

因此，本发明提供一种制备降解周期更长、可塑性强、稳定性好且柔软度高的无菌可注射材料的方法，来解决上述存在的问题。

发明内容

本发明提供了一种无菌可注射材料制备方法。

透明质酸凝胶是指由交联透明质酸凝胶和自由透明质酸组成的混合物。交联透明质酸凝胶是指用交联剂交联透明质酸形成的凝胶。自由透明质酸溶液是指透明质酸干粉溶解于中性生理性等渗磷酸缓冲液或水中形成的溶液，不含交联剂。中性生理性等渗磷酸缓冲液是指由Na2HPO4、NaH2PO4和NaCl组成或Na2HPO4、KH2PO4和NaCl组成构成的pH值为6.5-7.5、渗透压为280-320mOsmol/L溶液。交联度是指透明质酸双糖单体结合一个交联剂分子的百分比，用透明质酸单体与交联剂的摩尔比计算。

将平均分子量在1.0MDa-4.0MDa的称为高分子量透明质酸，将0.2MDa-0.99MDa的称为低分子量透明质酸。高分子量透明质酸对延长交联透明质酸凝胶降解周期很重要，低分子量对交联透明质酸凝胶柔软度很重要，选择合适的比例，对于产品的长效性、柔软度很关键。

一种制备无菌可注射材料的方法，步骤包括：

第一步，提供交联透明质酸凝胶：将高分子量透明质酸和低分子量透明质酸干粉至少3:1(W/W)的比例溶解形成水溶液，碱性条件下渐进添加双功能或多功能的交联剂，添加总浓度范围是0.005-0.05mol/L。然后外力作用下使透明质酸分子垂直方向、水平方向间歇交错交联，隔一段时间交错进行一次。接着低温自由平衡溶胀分离除去多余的自由交联剂残，交联透明质酸凝胶中自由交联剂的残留量小于1ppm。交联透明质酸凝胶的交联度是2.5％-15％，也可以是3％-12％，或者5％-10％，当然，其他适宜的交联度只要满足要求也是可以的。双功能或多功能的交联剂，比如可以是1,4-丁二醇缩水甘油醚、乙二醇而缩水甘油醚、1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)-碳二亚胺、二乙烯基砜、聚乙二醇、1,3-二环氧丁烷、N-羟基琥珀酰亚胺、1,2,7,8-二环氧辛烷其中的一种或多种。

第二步，将第一步形成的交联透明质酸凝胶低温均质，形成均一微粒。所谓的低温范围是不高于8℃。可以是液氮温度，也可以在-20-10℃或者-12-8℃，也可以是-4-6℃或者0-4℃。低温条件可以保证交联透明质酸凝胶和透明质酸分子在均质过程没有受到或者受到的热所引起不利影响非常小，同时也可以改变其形态。低温后可以采用研磨均质、粉碎均质、切割均质，或者其他适宜的低温均质方式得到均一的交联透明质酸凝胶微粒，当然，均质的方式不局限以上几种，其他适宜的均质方式只要满足要求也是可以的。根据需要，可以将交联透明质酸凝胶均质成能通过27G-32G的注射针的均一颗粒，粒径大小的范围是40-300μm，也可以是60-200μm或者80-120μm。这样的粒径，可以保证注射时阻力小且柔软度高，又可以保证可塑性强，易于塑形，且能保证合适的降解周期。

第三步是将高分子量透明质酸干粉溶解于中性生理性等渗磷酸缓冲液中形成自由透明质酸溶液，然后添加水溶性维生素，比如水溶性维生素B、维生素C或维生素E的衍生物中的一种或多种，添加浓度是0.01-50mg/ml，也可以是0.1-30mg/ml或者0.5-20mg/ml。维生素B的衍生物可以硫是辛酸。维生素C衍生物可以是维生素C糖苷(Ascorbyl-2-glucoside)，比如选用AA2G^TM。维生素C衍生物可以是维生素C磷酸酯盐，比如维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠、维生素C磷酸酯钙。水溶性维生素E衍生物可以是TPGS，一种叫做天然水溶性维生素E。水溶性维生素的添加，不仅可以提高透明质酸对热或者辐照的稳定性，如弹性模量G’提高10-300Pa，而且还能起到美白、清除自由基等其他功效，但是水溶性维生素浓度太高反而会产生其他不利结果。因此，本步骤必须衡量一个平衡点，将预期想要的和预期避免的结果保留在一个可接受的范围，而且这个范围符合相关安全要求。将制备的自由透明质酸溶液以1:49-3:7(W/W)比例添加至第二步获得的产物中，比例还可以是1:24-2:8(W/W)，其他适宜的比例满足要求也是可以的。接着，在不剪切透明质酸分子链的机械力作用下混匀，可以使用设备混匀或者用手进行混匀。

本步骤中，还可以添加右旋糖酐和/或利多卡因。右旋糖酐对植入部位的血液微循环起到一定的帮助作用，对减少后遗症会产生有利的帮助，右旋糖酐可以是高分子量右旋糖酐、中分子量右旋糖酐、低分子量右旋糖酐、小分子量右旋糖酐中的一种或几种，浓度为1％-10％(W/W)之间。利多卡因的添加，可以在透明质酸产品植入后一段时间提高使用者的舒适度，减少疼痛感等症状。本发明推荐的利多卡因添加浓度为0.1％-3％(W/W)，也可以是0.3％-1％(W/W)，或其他适宜的浓度范围。

第四步是将第三步形成的产物进行灭菌。灭菌方式可以是湿热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐照灭菌其中一种或多种组合。湿热灭菌可以是115-130℃、4-30min高压灭菌。辐照可以是χ射线、β射线或γ射线辐照灭菌。无论哪一种灭菌方式均不能影响可注射材料的理化性能，例如降解周期、弹性模量G’、推挤力等性能。

本发明提供的无菌可注射材料，浓度为15-35mg/ml，或者为18-30mg/ml，也可以是20-27mg/ml或者22-25mg/ml，当然，其他适宜的浓度满足要求也是可以的。

本方法制备的无菌注射材料，体内降解周期至少在18个月以上，常常能保持24-36个月，有的甚至36个月以上。无菌注射材料稳定性好，可以在高温加热、辐照或者环氧乙烷处理后，弹性模量G’有良好的维持效果。此外，无菌注射材料有优良的可塑性与柔软度，制备工艺简单、易于产业化。

本发明提供的无菌注射材料，可应用于软组织填充、修复以及外科手术医疗等。例如，可以用于非医疗的提高皮肤的美观度、填充或去除皱纹、隆鼻、隆胸，也可以用于医疗外科手术用的防粘连和骨科关节的润滑。

实施例

实施例一：制备交联透明质酸凝胶

取3g高分子量透明质酸(1.0MDa)和1g低分子量透明质酸(0.4MDa)干粉溶解于50ml、pH8.5水溶液，分两次添加1,4-丁二醇缩水甘油醚进行交联，1,4-丁二醇缩水甘油醚终浓度0.001M。交联过程有两次向下压力、两次左右水平的力各作用10分钟。接着中性生理性等渗磷酸缓冲液在4-8℃条件下溶胀至pH值为7.2除去未交联的交联剂，交联产物的交联度是2.5％。在4-8℃均质化，形成均一的交联透明质酸凝胶微粒，然后分成四等份。

实施例二：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.2g高分子量透明质酸(1.6MDa)溶解于5ml中性生理性等渗磷酸缓冲液形成自由透明质酸溶液，添加250mg维生素C磷酸酯镁(MAP)。将制得溶液以1:49的比例添加至实施例一产物的一份中，然后手动搅拌混匀。130℃、4min湿热灭菌。实施例二制得的透明质酸凝胶性能参数见表1，其中推挤力是通过一次性注射器带30G的针头、在推挤速度10.5mm/min条件下测定的。

表1.

实施例三：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.1g高分子量透明质酸(4.0MDa)加入15ml中性生理性等渗磷酸缓冲液，添加15mg硫辛酸。将制得溶液以3:7的比例添加至实施例一产物的一份中，再添加1％比例的右旋糖酐，然后手动搅拌混匀。130℃、4min湿热灭菌。实施例三制得的透明质酸凝胶，性能参数见表2，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表2.

实施例四：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.1g高分子量透明质酸(1.8MDa)加入10ml中性生理性等渗磷酸缓冲液，添加1mgAA2G^TM。将制得溶液以2:8的比例添加至实施例一产物的一份中，再添加10％(W/W)比例的右旋糖酐和0.1％(W/W)利多卡因，然后手动搅拌混匀。121℃、15min湿热灭菌。实施例四制得的透明质酸凝胶，性能参数见表3，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表3.

实施例五：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.1g高分子量透明质酸(3.5MDa)加入5ml中性生理性等渗磷酸缓冲液，添加1mgTPGS。将制得溶液以1:24的比例添加至实施例一产物的一份中，再添加3％(W/W)利多卡因，然后手动搅拌混匀。121℃、15min湿热灭菌。实施例五制得的透明质酸凝胶，性能参数见表4，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表4.

实施例六：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取1g高分子量透明质酸(1.2MDa)和0.1g低分子量透明质酸(0.4MDa)干粉溶解于50ml、pH9.0的水溶液，添加二乙烯基砜交联，采取垂直水平方向交错交联。接着用中性生理性等渗磷酸缓冲液溶胀至pH值为7.2除去未交联的交联剂，交联产物的交联度是5％。在8℃均质化，然后放置在4-12℃直至形成均一的交联透明质酸凝胶，分为两等份。

取0.01g高分子量透明质酸(2.0MDa)溶解于10ml中性生理性等渗磷酸缓冲液，添加10mgAA2G^TM。将制得溶液以3:7的比例添加至前步制备的一份交联透明质酸凝胶中，然后手动搅拌混匀。130℃、4min湿热灭菌。实施例六制得的透明质酸凝胶，性能参数见表5，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表5.

实施例七：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.1g高分子量透明质酸(2.0MDa)加入20ml中性生理性等渗磷酸缓冲液，添加1mgAA2G^TM和10mgTPGS。将制得溶液以3:7的比例添加至实施例六制备的另一份交联透明质酸凝胶中，再添加3％(W/W)利多卡因，然后手动搅拌混匀。121℃、20min湿热灭菌。实施例七制得的透明质酸凝胶，性能参数见表6，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表6.

实施例八：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.3g高分子量透明质酸(2.3MDa)和0.02g低分子量透明质酸(0.5MDa)干粉溶解于10ml、pH8.5的水溶液，分别添加BDDE与二乙烯基砜交联，使交联产物的交联度是15％。接着用pH7.2中性生理性等渗磷酸缓冲液溶胀中和至pH值为7.1。在液氮处理后粉碎均质化，形成均一的交联透明质酸凝胶微粒，分成两等份。

取0.01g高分子量透明质酸(1.2MDa)加入1ml中性生理性等渗磷酸缓冲，添加0.5mgTPGS。将制得溶液添加至前步制备的一份交联透明质酸凝胶中，然后手动搅拌混匀。121℃、15min湿热灭菌。实施例八制得的透明质酸凝胶，性能参数见表7，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表7.

实施例九：制备无菌可注射透明质酸凝胶

取0.01g高分子量透明质酸(2.2MDa)加入1ml中性生理性等渗磷酸缓冲，添加1mgTPGS。将制得溶液添加至实施例八制备的另一份交联透明质酸凝胶中，再添加0.3％(W/W)利多卡因，然后手动搅拌混匀。121℃、15min湿热灭菌。实施例九制得的透明质酸凝胶，性能参数见表8，其中推挤力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的。

表8.

实施例十：不同灭菌方式的无菌可注射透明质酸凝胶流变性能和推挤力

在本实验中，对比了不同灭菌方式的透明质酸凝胶和瑞蓝2的流变性能和推挤力。10-1至10-5所有样品，交联剂是1,4-丁二醇缩水甘油醚，交联度为5％，透明质酸浓度时22mg/ml，样品的pH值为7.3。推进力是通过一次性注射器带27G的针头、在推挤速度12.5mm/min条件下测定的，测试是在23℃环境下进行，具体数据见表9。

表9.

表9显示了水溶性维生素对不同灭菌方式后弹性模量G’值的影响，不同灭菌方式后的产品推挤力明显小于瑞蓝2号产品。

实施例十一：不同灭菌方式的无菌可注射透明质酸凝胶的体外降解性能

在本实施例中，对比了不同灭菌方式透明质酸凝胶的体外酶解性能。11-1至11-6样品，交联剂是1,4-丁二醇缩水甘油醚，交联度为2.5％，透明质酸浓度时25mg/ml，MAP添加物的浓度是0.3mg/ml，样品的pH值为7.2。

将1g的样品装入1ml离心管，离心甩平管内液面，然后向各管内加入100μl透明质酸酶溶液，使透明质酸酶的作用浓度是150IU/ml。以不加酶、其他操作保持一致的样品为对照品。37℃恒温16小时。反应后将各管倒立，将液态样品用纸吸收，测定残留在管底部的样品重量。将各试样的试验品以及对照品的样品重量测定结果以理论残留样品百分率(％)的计算，具体数据见表10。

表10.

编号	添加物	灭菌方式	百分比(％)
				11-1	-	-	78
11-2	-	121℃、30min	35
				11-3	MAP	-	81
11-4	MAP	121℃、30min	77
				11-5	MAP	钴60γ射线	47
11-6	MAP	环氧乙烷	79

实施例十二：不同粒径可注射透明质酸凝胶的降解性能

本实施例对比不同粒径的可注射透明质酸凝胶与瑞蓝2的体外降解性能，具体操作步骤同实施例十一。12-1至12-8样品，交联剂是1,4-丁二醇缩水甘油醚，交联度为10％，透明质酸浓度时20mg/ml，水溶性维生素添加浓度是0.4mg/ml，右旋糖酐和利多卡因的浓度分别为6％(W/W)和0.3％(W/W)，湿热灭菌条件为121℃、30min，样品的pH值为7.2。将各试样的试验品以及对照品的样品重量测定结果以理论残留样品百分率(％)的计算，具体数据见表11。

表11.

表11显示了不同粒径的透明质酸凝胶与瑞蓝2号的体外降解对比结果，整体上实施例中的体外降解均明显好于瑞蓝产品，说明实施例的产品降解周期明显优于瑞蓝2号。

Claims

1.一种无菌可注射材料的制备方法，包括以下几步骤：1）、提供交联透明质酸凝胶：将平均分子量为1.0-4.0MDa的高分子透明质酸和平均分子量为0.2-0.99MDa的低分子透明质酸以至少3:1（W/W）的比例溶解，在碱性条件下加入交联剂交联，形成交联度为2.5%-15%的交联透明质酸凝胶；2）、将1）产物低温均质，形成粒径为40-300μm的均一颗粒；3）、将高分子透明质酸干粉溶解于中性生理性等渗磷酸缓冲液中形成自由透明质酸溶液，加入水溶性维生素，接着将自由透明质酸溶液与以1:49-3:7（W/W）比例添加到2）产物中，在不剪切透明质酸分子链的机械力作用下混匀；4）、将3）形成的混合物进行灭菌。

2.根据权利要求1所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述交联剂是1,4-丁二醇缩水甘油醚、乙二醇而缩水甘油醚、1-乙基-3-（3-二甲氨基-丙基)-碳二亚胺、二乙烯基砜、聚乙二醇、1,3-二环氧丁烷、N-羟基琥珀酰亚胺、1,2,7,8-二环氧辛烷的一种或几种。

3.根据权利要求1所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述低温均质可以是不高于8℃下的研磨均质、粉碎均质、切割均质其中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述灭菌是湿热灭菌、环氧乙烷灭菌、辐照灭菌其中的一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：还有添加右旋糖酐、利多卡因其中一种或两种的步骤。

6.根据权利要求1所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：水溶性维生素的添加浓度范围是0.01-50mg/ml。

7.根据权利要求6所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述水溶性维生素为维生素B、维生素C、维生素E的衍生物中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述维生素B衍生物可以是硫辛酸。

9.根据权利要求7所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述维生素C衍生物是AA2G^TM、维生素C磷酸酯镁、维生素C磷酸酯钠、维生素C磷酸酯钙其中的一种或几种。

10.根据权利要求7所述无菌可注射材料的制备方法，其特征在于：所述维生素E衍生物是TPGS。