JP2000191703A - ヒアルロン酸ゲル及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒアルロン酸自体が本来持っている優れた生
体適合性の特徴を最大限生かすために、なんら化学的架
橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、またカチオン
性の高分子と複合体化することなく、生体適合材料とし
て使用可能な、生体内滞留時間が長いヒアルロン酸ゲル
を提供すること。 【解決手段】 ヒアルロン酸溶液を延伸することで得ら
れるヒアルロン酸ゲルを構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なヒアルロン
酸ゲル及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒアルロン酸は、β−Ｄ−Ｎ−アセチル
グルコサミンとβ−Ｄ−グルクロン酸が交互に結合した
直鎖状の高分子多糖である。ヒアルロン酸は哺乳動物の
結合組織に分布するほか、ニワトリのとさか、連鎖球菌
の夾膜などにも存在が知られている。ニワトリのとさ
か、臍帯等が抽出材料として用いられているほか、連鎖
球菌の培養物からも精製物が調製されている。天然産の
ヒアルロン酸は、分子量について多分散性であるが、種
及び臓器特異性をもたず、生体に移植または注入した場
合であっても優れた生体適合性示すことが知られてい
る。さらに、生体に適用する場合のヒアルロン酸自体の
易水溶性に由来する短所、例えば、生体内滞留時間が比
較的短いことなどから、多種多様なヒアルロン酸の化学
修飾物も提案されている。

【０００３】これらの代表的なものとしては、ジビニル
スルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二
官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架
橋ヒアルロン酸ゲルを挙げることができる（米国特許第
４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号
公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３
０６０１号公報参照）。

【０００４】また、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモ
ニウム塩がジメチルスルフォキシド等の有機溶媒に溶解
する特徴を利用したヒアルロン酸の化学的修飾方法が開
示されている（特開平３−１０５００３号）。また、ヒ
アルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩をジメチルス
ルフォキシド中で、トリエチルアミンとヨウ化２−クロ
ロ−１−メチルピリジニウムを加え反応させ、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基と水酸基間でエステル結合を形成
させる方法も開示されている（欧州特許０３４１７４５
Ａ１）。

【０００５】また、共有結合を形成する化学的試薬を使
用することなく、ヒアルロン酸を水に不溶化する方法と
して、ヒアルロン酸とアミノ基あるいはイミノ基を有す
る高分子化合物とを、ヒアルロン酸のカルボキシル基と
高分子化合物のアミノ基あるいはイミノ基をイオン複合
体として結合させてヒアルロン酸高分子複合体を調製す
る方法が開示されている（特開平６−７３１０３号公報
参照）。

【０００６】ヒアルロン酸水溶液を酸性、例えばｐＨ
２．０〜２．７の範囲に調整するとパティーゲルと呼ば
れるジェリー状に固化した状態のゲルを形成することは
知られているが、ｐＨ２．０未満では、パティーゲルは
形成されない。そして、このパティーゲルは、中性水溶
液中に投入すると速やかに溶解するので、本発明でいう
ヒアルロン酸ゲルとは異なる。

【０００７】また、ヒアルロン酸水溶液を、ｐＨ２．０
〜３．８、２０〜８０重量％水溶性有機溶剤存在下にお
くことを特徴とするヒアルロン酸ゲルの製造方法も開示
されている（特開平５−５８８８１号公報参照）。しか
しながら、この製造方法で得られたヒアルロン酸ゲル
は、コーティング等を施さない場合には、水中に投入す
ると溶解することが該公報に記載されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ヒアルロン酸自体が本
来持っている優れた生体適合性の特徴を最大限生かすた
めに、なんら化学的架橋剤や化学的修飾剤を使用するこ
となく、またカチオン性の高分子と複合体化することな
く、水中での溶解速度が極めて遅いヒアルロン酸ゲルは
有用である。本発明者らは、ヒアルロン酸自体の物理化
学的性質を鋭意検討してきた結果、ヒアルロン酸溶液を
延伸することによりヒアルロン酸ゲルが得られることを
見出した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、（１）
ヒアルロン酸溶液を延伸することで得られるヒアルロン
酸ゲル、（２）ヒアルロン酸溶液を延伸することを特徴
とするヒアルロン酸ゲルの製造方法、（３）ヒアルロン
酸濃度５重量％以上でヒアルロン酸のカルボキシル基と
等モル以上の酸成分を含むヒアルロン酸酸性水溶液を延
伸することを特徴とするヒアルロン酸ゲルの製造方法で
ある。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出
したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源
を問うことなく使用できる。発酵法で使用する菌株は自
然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロ
ン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３
９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−１００（微工研菌寄第9027号）、特開平２−２３４６
８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ
−３００（微工研菌寄第2319号）のような高収率で安定
にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変
異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。

【００１１】ゲルとは、新版高分子辞典（朝倉書店 昭
和６３年）によれば、「あらゆる溶媒に不溶の三次元網
目構造をもつ高分子及びその膨潤体」と定義されてい
る。理化学辞典（岩波書店 第４版 昭和６２年）によ
れば、「ゾル（コロイド溶液）がジェリー状に固化した
もの」と定義されている。本発明で言うヒアルロン酸ゲ
ルとは、特に中性水溶液に少なくとも１日は難溶性であ
ることを特徴とし、このヒアルロン酸ゲルを中性水溶液
中に投入すると、ゲル化していないヒアルロン酸と比較
して１日後に有意に難溶性を示すことを好ましい態様と
するものである。難溶性は、中性の２５℃の水溶液中で
のゲルの溶解率で規定する。ここで、中性水溶液とは、
ｐＨ７に調整された緩衝能を有する生理的食塩水であ
る。

【００１２】本発明で得られるヒアルロン酸ゲルは、ヒ
アルロン酸単独で得られることが特に好ましい。ここで
いうヒアルロン酸単独とは、ヒアルロン酸以外に化学的
架橋剤や化学的修飾剤等を使用しないこと、また、カチ
オン性の高分子と複合体化しないことを意味するもので
ある。

【００１３】ヒアルロン酸の化学的架橋剤は、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応
して共有結合を形成する多価化合物であり、ポリグリシ
ジルエーテル等の多価エポキシ化合物、ジビニルスルホ
ン、ホルムアルデヒド、オキシ塩化リン、カルボジイミ
ド化合物とアミノ酸エステルの併用、カルボジイミド化
合物とジヒドラジド化合物の併用を例として挙げること
ができる。ヒアルロン酸と化学的架橋剤との反応により
三次元網目構造が形成される。

【００１４】ヒアルロン酸の化学的修飾剤は、ヒアルロ
ン酸のカルボキシル基、水酸基、アセトアミド基と反応
して共有結合を形成する化合物であり、無水酢酸と濃硫
酸の併用、無水トリフルオロ酢酸と有機酸の併用、ヨウ
化アルキル化合物を例として挙げることができる。ヒア
ルロン酸の親水性基を疎水化し、ヒアルロン酸の水溶性
が減少する。

【００１５】ヒアルロン酸と複合体化するカチオン性の
高分子は、ヒアルロン酸のカルボキシル基と高分子化合
物のアミノ基あるいはイミノ基の間でイオン複合体を形
成する高分子であり、キトサン、ポリリジン、ポリビニ
ルピリジン、ポリエチレンイミン、ポリジメチルアミノ
エチルメタクリレートを例として挙げることができる。
ヒアルロン酸とカチオン性の高分子は複合体化すること
により、水に不溶化する。

【００１６】一方、ヒアルロン酸への架橋構造の導入や
ヒアルロン酸の不溶化、難溶化に直接関係しない物質
を、本発明でいうヒアルロン酸ゲルを形成させる際に添
加することはできる。ヒアルロン酸と同様に生体適合性
に優れる材料、例えば、コンドロイチン硫酸、カルボキ
シメチルセルロース等を混合、複合化してヒアルロン酸
ゲルを形成させることができるものであり、何ら制限さ
れないものである。また、ヒアルロン酸ゲルを形成させ
る際に、薬学的又は生理学的に活性な物質を添加して、
これらを含有するヒアルロン酸ゲルを形成させることも
できるものであり、何ら制限されないものである。

【００１７】本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量
は、所望の溶解速度により適宜選択されるが、約１×１
０⁵ 〜約１×１０⁷ ダルトンの範囲内のものが好まし
い。また、上記範囲内の分子量をもつものであれば、よ
り高分子量のものから、加水分解処理等を介して得られ
た低分子量のものも同様に使用できる。なお、本発明に
いうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属、例えば、ナト
リウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使
用される。

【００１８】本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５重
量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液とは、ヒアルロン酸
のカルボキシル基が充分な割合でプロトン化されるよう
に調製された水溶液を意味している。酸性に調製するた
めの用いる酸成分の量は、ヒアルロン酸塩の対イオンの
種類、ヒアルロン酸の分子量、ヒアルロン酸濃度、並び
に生成するゲルの強さ等の諸特性により適宜決められる
が、一般にはヒアルロン酸のカルボキシル基と等モル以
上の酸成分の量が好ましい。酸成分は、ヒアルロン酸よ
り強い酸であれば、いずれの酸も使用することができ
る。酸の使用量を低減するために、好ましくは強酸、例
えば、塩酸、硝酸、硫酸等を使用することが望ましい。

【００１９】本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５重
量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液の調製方法は問わな
いが、固体ヒアルロン酸と酸性水溶液を混合する方法、
低濃度で調製したヒアルロン酸酸性水溶液を所定の濃度
に濃縮する方法や、高濃度のヒアルロン酸水溶液に酸成
分を加える方法などが挙げられる。

【００２０】本発明に用いられるヒアルロン酸濃度５重
量％以上のヒアルロン酸酸性水溶液の延伸方法は問わな
いが、例えばフィルムの両端を固定し延伸する方法や紡
糸のように紐状に加工すると同時に延伸する方法等が挙
げられる。延伸時の温度、時間や延伸速度は、ヒアルロ
ン酸性水溶液のヒアルロン酸塩の対イオンの種類、ヒア
ルロン酸の分子量、ヒアルロン酸濃度、並びに生成する
ゲルの強さ等の諸特性により適宜決められるが、温度に
ついては、ヒアルロン酸酸性水溶液が凍結しないため
に、そして、ヒアルロン酸の酸による分解を抑えるため
に、好ましくは０℃以上３０℃以下で行うことが望まし
い。

【００２１】本発明で得られたヒアルロン酸ゲルは、ヒ
アルロン酸の酸加水分解を避けるために、カルボキシル
基がプロトン化された酸型のヒアルロン酸や酸性に調整
するために用いた酸等の成分を中和する必要がある。中
和は、通常水性溶媒によって行う。ヒアルロン酸ゲルの
機能を損なわないものであれば特に制限はないが、例え
ば、リン酸緩衝液、水酸化ナトリウム水溶液等が用いら
れる。

【００２２】また、中和方法は、特に制限はないが、通
常は、バッチ法、濾過法、カラム等に充填して通液する
方法等が用いられる。これらの中和条件は、中和液量、
回数等を含めて、酸型のヒアルロン酸や酸性に調整する
ために用いた酸等の成分を中和できる条件であればよ
く、ヒアルロン酸ゲルの形態や用途により適宜選択する
ことが可能である。

【００２３】本発明で得られるヒアルロン酸ゲルは、そ
の使用目的に応じて、溶媒中に浸漬した状態、溶媒を含
ませた湿潤状態、通風乾燥、減圧乾燥あるいは凍結乾燥
等の処理を経た乾燥状態で供される。

【００２４】ヒアルロン酸ゲルの成形加工等の処理は、
延伸時のヒアルロン酸酸性水溶液の形態によるが、シー
ト状、フィルム状、及び繊維状等の所望の形態のヒアル
ロン酸ゲルの作製が可能である。また、ヒアルロン酸ゲ
ルの作製後の加工としては、機械的粉砕による微細な破
砕状や凍結、解凍によるスポンジ状、圧延によるフィル
ム化、紡糸等が例示される。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
する。なお、本発明はこれにより限定されるものではな
い。

【００２６】実施例１ 分子量が２×１０⁶ ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム
粉末に蒸留水を添加し、ヒアルロン酸濃度にして１５重
量％のヒアルロン酸溶液にする。この溶液をガラス板に
挟み、厚さ１ｍｍのヒアルロン酸溶液のシートにする。
このシートを、１ＮＨＣｌを含むエタノール対水が１対
１の割合の混合溶媒に投入した後、５℃に設定した冷蔵
庫に２４時間静置してヒアルロン酸酸性溶液のシートを
得た。このシートを５ｍｍ×３０ｍｍの短冊状に切り出
し、島津製作所製引張試験機を用いて、速度１００％／
ｍｉｎ．で延伸した結果、ヒアルロン酸ゲルが得られ
た。

【００２７】実施例２ 実施例１に於いて、速度を２００％／ｍｉｎ．で延伸し
た結果、ヒアルロン酸ゲルが得られた。

【００２８】実施例３ 分子量が２×１０⁶ ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム
粉末に蒸留水を添加し、ヒアルロン酸濃度にして１５重
量％のヒアルロン酸溶液にする。この溶液をガラス板に
挟み、厚さ１ｍｍのヒアルロン酸溶液のシートにする。
このシートを、塩化水素ガスの雰囲気下であるデシケー
ター中に投入した後、５℃に設定した冷蔵庫に２４時間
静置してヒアルロン酸酸性溶液のシートを得た。このシ
ートを５ｍｍ×３０ｍｍの短冊状に切り出し、島津製作
所製引張試験機を用いて、速度１００％／ｍｉｎ．で延
伸した結果、ヒアルロン酸ゲルが得られた。

【００２９】実施例４ 分子量が２×１０⁶ ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム
の粉末１００ｍｇを３００ｋｇｆ／ｃｍ²で３分間加圧
し、３０ｍｍ×５ｍｍ×１ｍｍの直方体の成型物を得
た。この成型物を、スチロール製の角型容器に入れ、１
Ｎの塩酸を９００ｍｇ、ヒアルロン酸濃度にして１０重
量％になるように含浸させ容器を密閉した後、５℃に設
定した冷蔵庫に２４時間静置して、短冊状のヒアルロン
酸酸性溶液を得た。そして、実施例１と同様の操作を行
った。その結果、ヒアルロン酸ゲルが得られた。

【００３０】比較例１ 分子量が２×１０⁶ ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム
の粉末を、ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験に用いた。

【００３１】比較例２ 実施例１に於いて、得られたヒアルロン酸溶液を、１Ｎ
ＨＣｌを含むエタノール対水が１対１の割合の混合溶媒
に投入することはせずに、そのまま同様の操作により延
伸を行った。その結果、延伸倍率５０％以下で破断し
た。また、該ヒアルロン酸溶液をヒアルロン酸ゲルの溶
解性試験に用いた。

【００３２】比較例３ 実施例１に於いて、得られたヒアルロン酸酸性溶液を、
延伸は行わず、そのままヒアルロン酸ゲルの溶解性試験
に用いた。

【００３３】実施例５ ヒアルロン酸ゲルの溶解性試験 生理的食塩水に５０ｍＭ濃度でリン酸緩衝成分を加え、
ｐＨ７のリン酸緩衝生理的食塩水を調製した。上記の実
施例で得られたヒアルロン酸ゲルを、乾燥重量で１０ｍ
ｇのヒアルロン酸を含むヒアルロン酸ゲルに対して、５
０ｍｌのリン酸緩衝生理的食塩水の割合で、リン酸緩衝
生理的食塩水中に浸漬した。また、比較例の各形態のヒ
アルロン酸も、乾燥重量で１０ｍｇを５０ｍｌのリン酸
緩衝生理的食塩水中に浸漬した。そして、２５℃で撹拌
下のリン酸緩衝生理的食塩水中に溶出するヒアルロン酸
の割合を、リン酸緩衝生理的食塩水中のヒアルロン酸濃
度から求めた。従って、中性の２５℃の水溶液中でのヒ
アルロン酸ゲルの溶解性は、上記試験により規定される
ものである。

【００３４】ヒアルロン酸濃度の測定 リン酸緩衝生理的食塩水中のヒアルロン酸の濃度は、Ｇ
ＰＣを使って、示差屈折率検出器のピーク面積から求め
た。

【００３５】上記に従い、具体的に実施例１〜４及び比
較例１〜３のヒアルロン酸ゲルの溶解性試験を行った。
その結果を表１に示す。例えば、実験Ｎｏ．１の実施例
１で得られたヒアルロン酸ゲルの溶解率を調べると、１
日経過後では７％の溶解率であり、３日経過後では１４
％の溶解率であり、７日経過後では２７％の溶解率であ
り、更に１４日経過後では４６％の溶解率であった。即
ち、１４日経過しても５０％以上のヒアルロン酸ゲルが
残存していた。それに対して、実験Ｎｏ．５の比較例１
でのヒアルロン酸粉末の溶解率は、１日経過後で１００
％の溶解率であり、完全に溶解した。そして、３日経過
後、７日経過後、及び１４日経過後も１００％溶解して
いる状態を維持していた。よって、比較例（実験Ｎｏ．
５〜７）で得られたヒアルロン酸ゲル状の溶液は水中で
の溶解速度が極めて速いのに対して、本願発明の製造方
法で得られたヒアルロン酸ゲル（例えば、実験Ｎｏ．１
〜４）は水中での溶解速度が極めて遅いことが見出され
る。これより、本願発明の製造方法によって、中性水溶
液に難溶性であるヒアルロン酸ゲルが得られることが示
唆される。

【００３６】

【表１】

【００３７】実施例６ ヒアルロン酸ゲルのＸ線回折測定 実施例１〜４で得られたヒアルロン酸ゲルを実施例５記
載のリン酸緩衝生理食塩水に浸漬、洗浄し、次いで蒸留
水で洗浄した。それから、軽く脱水した後、凍結乾燥
し、ヒアルロン酸ゲルの乾燥物を得た。このヒアルロン
酸ゲルの乾燥物をガラスセルに充填し、正確な平面出し
を行った後に、Ｘ線回折測定を行った。測定は、マック
スサイエンス社製ＭＸＰ−１８型Ｘ線回折装置を用い
て、Ｘ線源はＣｕ陰極、ＣｕＫ α線（λ＝１.５４０
５Å）、印可電圧／電流は５０ｋＶ／３００ｍＡ、スキ
ャン方法はＦＴ（２θ／θ）法、測定範囲は２θ＝５〜
４０ｄｅｇ．、０．０２ｄｅｇ．／ｓｔｅｐ、測定時間
は１ｓｅｃ．／ｓｔｅｐで行った。その測定結果は、い
ずれも明確なピークは観測されなかった。このことよ
り、本発明で得られるヒアルロン酸ゲルは結晶化してい
ないことがわかる。

【００３８】

【発明の効果】以上、本発明によれば、特になんら化学
的架橋剤や化学的修飾剤を使用することなく、またカチ
オン性の高分子と複合体化することなく、水中での溶解
速度が制御されたヒアルロン酸ゲルの製造が可能とな
る。そして、得られるヒアルロン酸ゲルは、化学的架橋
剤や化学的修飾剤を使用することに起因する生体適合性
への悪影響が避けられ、生体内滞留時間を制御できるの
で生体適合性材料分野に有用である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸溶液を延伸することで得ら
   れるヒアルロン酸ゲル。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸溶液を延伸することを特徴
   とするヒアルロン酸ゲルの製造方法。
3. 【請求項３】 ヒアルロン酸濃度５重量％以上でヒアル
   ロン酸のカルボキシル基と等モル以上の酸成分を含むヒ
   アルロン酸酸性水溶液を延伸することを特徴とするヒア
   ルロン酸ゲルの製造方法。