CN117356221B - 利用土壤促生菌提高垂穗披碱草种子萌发的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用土壤促生菌促进垂穗披碱草种子萌发的方法，属于种子育苗技术领域。本发明的技术方案是：1）消毒处理：垂穗披碱草种子，经消毒和清洗；2）浸种处理：采用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和发根根瘤菌菌悬液对消毒处理后的种子浸种；3）萌发培养。通过促生菌对垂穗披碱草种子浸种可以显著提高垂穗披碱草种子的萌发率、发芽整齐度，并提高垂穗披碱草种子的耐盐水平。
Description
技术领域
本发明属于种子育苗技术领域，具体涉及一种利用土壤促生菌促进垂穗披碱草种子萌发的方法。
背景技术
垂穗披碱草（Elymus nutans）隶属于禾本科（Gramineae）小麦族（Triticeae）披碱草属（Elymus），是多年生根茎疏丛型上繁草本植物，基于其在生态系统和植物群落中的优良特征，利用其进行退化草地恢复和人工草地建植，是西藏自治区高原野生牧草中的优势种之一，具有重要研究价值及经济价值。然而在实际生产中，垂穗披碱草种子存在出苗不整齐、萌发率低等问题，给垂穗披碱草的栽培和利用带来较大困难。因此，提高垂穗披碱草种子萌发率和幼苗整齐度成为限制垂穗披碱草推广利用的主要难题。
目前一些研究，如文献1研究发现垂穗披碱草的适宜发芽温度范围为15-25℃；变温可显著提高种子发芽率和发芽整齐度，最佳变温组合为20℃/10℃，发芽率和发芽势分别较20℃恒温条件提高20.2％；垂穗披碱草种子萌发对光照条件反应不敏感。
文献2研究水引发不同处理时长对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明，以水引发时长20～30min处理显著高于其它处理，为有效解决实际生产中垂穗披碱草种子萌发率低、出苗不齐等问题提供理论依据和技术支撑。
同时，西藏自治区沙化土地面积中达到中重度沙化区域超过90％。“一江两河”流域附近有大量土地盐碱化，超过了农田总面积的十分之一。低浓度的盐胁迫有助于植物生长，但在高盐环境下，会出现种子发芽率降低、幼苗根长及芽长的生长变缓等情况。盐胁迫同样可以降低垂穗披碱草种子发芽率，并延迟垂穗披碱草种子发芽时间等。目前已有减缓盐胁迫对垂穗披碱草的伤害并且增强垂穗披碱草的抗盐性的研究。如文献3研究表明在西藏自治区有盐渍土的地区可以用适宜浓度的外源GB来提高垂穗披碱草的耐盐性。
文献4研究发现缓解中度及轻度干旱胁迫对砂培垂穗披碱草抑制作用，促进垂穗披碱草种子萌发等的GA最适宜浓度。
本申请的研究人员则尝试通过使用促生菌对垂穗披碱草种子浸种处理，来提高其发芽效果，同时可以提高垂穗披碱草种子的耐盐性。
文献1:《温度对垂穗披碱草种子萌发的影响》
文献2:《水引发对垂穗披碱草种子萌发及幼苗生长的影响》
文献3:《外源甜菜碱对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子萌发的影响》
文献4:《干旱胁迫及SA、GA浸种对砂培西藏野生垂穗披碱草种子萌发的影响》
发明内容
本发明目的是提供一种萌发率高、发芽整齐、高耐盐的垂穗披碱草种子处理方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种利用土壤促生菌促进垂穗披碱草种子萌发的方法，包括：
1）消毒处理：垂穗披碱草种子，经消毒和清洗；
2）浸种处理：采用地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和发根根瘤菌菌悬液对消毒处理后的种子浸种。
3）萌发培养。
进一步，所述步骤1）中消毒步骤使用次氯酸钠液消毒。所述消毒液优选包含1-15%次氯酸钠，优选5-15％；优选8-12％；优选10％
所述消毒浸泡时间为1-10min；优选2-8min；优选2-6min；优选2-5min；优选3min。
进一步，所述步骤2）浸种处理：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和发根根瘤菌菌悬液的浓度为1×107-5×109（CFU/mL）；优选5×107-5×109（CFU/mL）；优选1×108-5×109（CFU/mL）；优选5×108-5×109（CFU/mL）。
进一步，所述步骤2）浸种时间12-48h，优选16-36h；优选18-30h；优选18-28h；优选20-28h；优选20-26h；优选24h.
进一步，所述步骤2）浸种处理：优选采用地衣芽孢杆菌菌菌悬液进行浸种。
进一步，所述步骤3）萌发培养，采用变温培养或恒温培养，温度范围15-30℃。
进一步，所述步骤3）萌发培养温度优选18-30℃；优选22-28℃；优选23-26℃；优选25℃。
有益效果
发明人基于现有技术结合大量实验总结出一种萌发率高、发芽整齐和耐盐性高的垂穗披碱草种子处理方法。
1）促生菌（PGPB）通过合成生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、乙烯（ETH）和脱落酸（ABA）等植物激素来影响细胞分裂、伸长、分化和植物发芽、生根等生理过程。分泌的物质含有植物激素如GA和IAA等，可能影响发芽相关生理生化过程，如促进种子内源植物激素的分泌及提高淀粉酶活性等，来加速种子代谢，恢复种子萌发能力，从而显著提高垂穗披碱草种子发芽率。申请人通过实验筛选出促生菌地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和发根根瘤菌均能够提高垂穗披碱草种子的发芽率和发芽势，其中地衣芽孢杆菌的促进作用显著。同时，菌浓度也能显著影响种子活力和发芽率，可能是因为其中的功效成分含量不同导致。
2）本申请的处理方法还能够提高垂穗披碱草种子耐盐的能力，改善和提高垂穗披碱草的萌发效果，从而可以扩大垂穗披碱草在西藏地区的种植范围，为包括西藏在内的我国广大盐碱地的改良和优良牧草的引种研究提供借鉴。
附图说明
附图1为不同种类促生菌对垂穗披碱草种子发芽率的影响；
附图2为不同种类促生菌对垂穗披碱草种子发芽势的影响；
附图3为不同浓度的地衣芽孢杆菌菌悬液对垂穗披碱草种子发芽率的影响；
附图4为不同浓度的地衣芽孢杆菌菌悬液对垂穗披碱草种子发芽势的影响；
附图5为不同浓度的地衣芽孢杆菌菌悬液对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子发芽率的影响；
附图6为不同浓度的地衣芽孢杆菌菌悬液对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子发芽势的影响
实施方式
本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本申请的其他优点与功效，显然，所描述的实施方式仅仅是本申请一部分实施方式，而不是全部的实施方式。本申请还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本申请的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施方式及实施例方式的特征可以相互组合。
在以下描述中，提供具体细节是为了便于透彻理解实例。然而，所属领域的技术人员将理解，可在没有这些特定细节的情况下实践。
实施例1
促生菌菌悬液的制备
所用促生菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，BNCC168439），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BNCC109047），苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，BNCC336646），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens，BNCC336388），蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，BNCC336744），发根根瘤菌（Rhizobium rhizogenes，BNCC336898），假单胞菌（Pseudomonas sp.，BNCC354297），植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum，BNCC185392），北京北纳创联生物技术研究院。
按照常规方法分别用液体培养基活化，将活化好的菌株在28℃、200rpm震荡摇晃培养24h，以4℃、8000r/min离心8min后，倒掉上清液并收集菌体，用无菌水将菌体重悬至浓度为1×108（CFU/mL）。
种子处理
挑选大小均匀、籽粒饱满且无霉变破损的同一批次垂穗披碱草种子，用10%次氯酸钠溶液消毒3min，后用蒸馏水反复冲洗，直至将消毒液清洗干净。
在室温下，分别采用上述地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、发根根瘤菌、假单胞菌、植物乳杆菌菌悬液，浸种24ｈ，灭菌蒸馏水浸种作为对照（CK），然后将种子捞出，晾干后备用。
浸种后的种子置于灭菌且铺有两张滤纸的培养皿中，每皿放置种子100粒，每处理重复3次。种子置于恒温培养箱培养，温度为（25±1）℃，加入蒸馏水，直至滤纸表面形成一层水膜。使用称重法，根据发芽皿内蒸发量每天早、晚补充蒸馏水。以胚根伸长至种子长度的1/2 作为萌发标准，统计发芽率和发芽势。
种子萌发相关指标的测定和计算公式如下：
发芽率/％＝（萌发种子数/供试种子数）×100％；
发芽势/％＝（发芽试验前7d的正常发芽种子数/供试种子数）×100％。
结果如附图1和2显示，地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和发根根瘤菌均能够提高垂穗披碱草种子的发芽率和发芽势，其中地衣芽孢杆菌的促进效果最显著，达到88.33%的发芽率和70.67%的发芽势。
实施例2
不同浓度的地衣芽孢杆菌悬液对垂穗披碱草种子发芽的影响
通过调节OD值和连续稀释调节地衣芽孢杆菌浓度为1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109（CFU/mL），备用。分别使用不同浓度的菌悬液浸种24ｈ，然后将种子捞出，晾干后备用。
浸种后的种子置于灭菌且铺有两张滤纸的培养皿中，每皿放置种子100粒，每处理重复3次。种子置于恒温培养箱培养，温度为（25±1）℃，加入蒸馏水，直至滤纸表面形成一层水膜。使用称重法，根据发芽皿内蒸发量每天早、晚补充蒸馏水。以胚根伸长至种子长度的1/2 作为萌发标准，统计发芽率和发芽势。
结果如附图3和4显示，不同浓度的地衣芽孢杆菌菌悬液促进垂穗披碱草种子萌发的效果不同，进一步提高菌悬液的浓度到5×108（CFU/mL）可以进一步提高垂穗披碱草种子的发芽率（94%）和发芽势（75%），增加地衣芽孢杆菌菌悬液浓度，垂穗披碱草种子的发芽率和发芽势则不再提高。
实施例3
验证地衣芽孢杆菌对NaCl胁迫下垂穗披碱草种子的萌发的影响
试验采用100mmol/L NaCl溶液作为盐胁迫处理，此胁迫程度为中度盐胁迫。
分别使用地衣芽孢杆菌浓度为1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109（CFU/mL）的菌悬液浸种24ｈ，然后将种子捞出，晾干后备用。浸种后的种子置于灭菌且铺有两张滤纸的培养皿中，每皿放置种子100粒，每处理重复3次。种子置于恒温培养箱培养，温度为（25±1）℃，在铺有两张滤纸的培养皿，加入等量100mmol/L NaCl溶液，直至滤纸表面形成一层水膜。使用称重法，根据发芽皿内蒸发量每天早、晚补充蒸馏水。CK1（蒸馏水）。CK2（100mmol/L NaCl）。以胚根伸长至种子长度的1/2 作为萌发标准，统计发芽率和发芽势。
结果如图5和6显示，与CK1（蒸馏水）相比，NaCl胁迫（100mmol/L,CK2）显著抑制了垂穗披碱草的萌发，发芽率由74%降低到48.67%，发芽势由48.67%降低到30.67%。而地衣芽孢杆菌菌悬液浸种则可以缓解中度干旱胁迫对垂穗披碱草种子萌发的抑制作用，促进垂穗披碱草种子萌发，其中5×108-5×109（CFU/mL）浓度下的发芽率和发芽势同样可以达到较高的水平,发芽率87%左右，发芽势70%左右。
Claims (6)
1.一种利用土壤促生菌促进垂穗披碱草种子萌发的方法，其特征在于，所述土壤促生菌为地衣芽孢杆菌，所述方法包括：
1）消毒处理：垂穗披碱草种子经消毒和清洗；
2）浸种处理：采用地衣芽孢杆菌菌悬液对消毒处理后的种子浸种；所述菌悬液的浓度为5×108-1×109（CFU/mL）；
3）萌发培养；
所述步骤2）浸种时间12-36h；
所述地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，编号BNCC168439，北京北纳创联生物技术研究院。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）所述消毒采用5-15%次氯酸钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）消毒的消毒液浸泡时间为1-10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）萌发培养温度为20-30℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）萌发培养温度为23-26℃。
6.权利要求1所述的利用土壤促生菌促进垂穗披碱草种子萌发的方法在垂穗披碱草种子的盐碱地种植中的应用。
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