CN117338762A - 曲恩汀将铜递送到缺血组织的用途 - Google Patents

曲恩汀将铜递送到缺血组织的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及通过使用包含四胺(例如曲恩汀(trientine))的组合物来进行缺血组织修复和再生。本发明通过施用包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物促进铜的组织再分布和再利用来进行缺血组织修复和再生的方法。用于在个体中提高缺血组织的细胞内铜水平和/或诱导缺血组织的修复的方法和组合物。缺血组织中的铜水平提高可以促进铜依赖性HIF‑1转录活性和组织修复。

Description

曲恩汀将铜递送到缺血组织的用途
本申请要求于2015年09月24日提交世界知识产权组织国际局、申请号为PCT/CN2015/090528、发明名称为“USE OF TRIENTINE TO DELIVER COPPER TO ISCHEMICTISSUE”的专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本申请是国际申请日为2016年09月23日、国际申请号为：PCT/CN2016/099852、进入中国国家阶段日期为2018年03月26日、国家申请号为：201680056122.X、发明名称为“曲恩汀将铜递送到缺血组织的用途”的发明的分案申请。
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及通过使用包含四胺(例如曲恩汀(trientine))的组合物来进行缺血组织修复和再生。
背景技术
缺氧可诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的激活是人体对缺氧性或缺血性损伤的初始且主要的分子响应。HIF-1转录因子属于HIF家族，并且控制参与针对缺氧和/或缺血的多种细胞适应性响应(包括血管生成)的多种基因(例如VEGF)的表达。HIF-1包含两个亚基，即HIF-1α和HIF-1β。在缺氧/缺血状况下，HIF-1α在细胞核中积累而与HIF-1β形成异二聚体，其起始下游基因的转录。
然而，在慢性心肌缺血状况下，受损心肌的特征通常在于毛细管密度减小和血管生成降低。防御机制(例如在急性缺血损伤下由积累的HIF-1α诱导的那些)由于长期缺血触发远离心肌的铜动员而在慢性缺血状况下不发挥功能。先前已表明，HIF-1转录活性需要微量元素铜的参与。在患有慢性缺血性心肌病的患者中，尽管HIF-1α水平在缺血心肌组织中持续提高，但是HIF-1调节的基因(例如VEGF)的表达降低。心脏铜的损失阻断积累的HIF-1α的激活，并且心脏铜的损耗与这样的患者中心脏功能障碍的程度充分相关。此外，在患有心肌缺血性疾病的患者中，心脏铜含量降低伴随着高血铜水平。因此，认为铜以不能够被缺血心肌再利用的形式从心肌释放到血液循环中。心肌铜以不可利用形式向循环中的这一显著流出被认为是伴随长期心肌缺血的HIF-1α转录活性降低的主要原因。因此，由于可利用铜的损失而在患有慢性缺血性心肌病的患者中可能不能发生HIF-1控制基因的上调(用于组织修复和再生的重要步骤)。因此，促进铜的适当组织分布可以用作治疗各种缺血性疾病和病症的有效策略。
曲恩汀是一种公知的铜螯合剂，其可用于使铜解毒。曲恩汀二盐酸盐是曲恩汀的一种可药用盐，其已被广泛用于结合并去除体内过量的铜以治疗威尔逊病(Wilson’sdisease)，特别是在不耐受青霉胺的患者中。Cooper等已描述了曲恩汀和其他铜拮抗剂化合物用于治疗各种病症的用途，所述病症包括糖尿病和并发症(例如糖尿病性心肌病)、心血管疾病、神经变性和线粒体相关性疾病。参见，例如，美国专利No.7,459,446、美国专利No.7,928,094、国际申请公开No.WO2003077901 A1、国际申请公开No.WO2005058294 A1和国际申请公开No.WO2007055598 A1。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请的公开内容都在此通过引用整体并入本文。
发明内容
本申请提供了用于通过施用包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物来在个体中提高缺血组织的细胞内铜水平或诱导缺血组织的组织修复的方法。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的药物中的用途，以及用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中将铜特异性地递送到缺血组织的细胞内的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体中将铜特异性地递送到缺血组织的细胞内的药物中的用途，以及用于在具有缺血性组织损伤的个体中将铜特异性地递送到缺血组织的细胞内的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少两个组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的组合物。还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少两个组织修复事件的药物中的用途，以及用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少两个组织修复事件的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导干细胞向缺血组织迁移的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的组合物。还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体中诱导干细胞向缺血组织迁移的药物中的用途，以及用于在具有缺血性组织损伤的个体中诱导干细胞向缺血组织迁移的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的组合物。还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的药物中的用途，以及用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的组合物。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，个体具有受损的组织修复系统。在一些实施方案中，个体不具有受损的组织修复系统。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血肢体组织
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，其中可螯合铜的四胺是曲恩汀。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺与铜离子的络合物是结晶的。在一些实施方案中，组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，该方法还包含向个体施用有效量的铜离子。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，组合物经口施用。在一些实施方案中，组合物的有效量包含每天约80mg至约450mg(包括例如约80mg至约150mg、约80mg至约200mg、约200mg至约300mg、约80mg至约300mg、约80mg、约100mg、约125mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、或约400mg中的任一个)的可螯合铜的四胺。在一些实施方案中，组合物每天施用至少两次(包括例如约每天两次、三次或四次中的任一个)。在一些实施方案中，组合物施用至少约一个月(包括例如约1、2、3、4、5、6、8、10、12个或更多个月中的任一种)。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，组合物的施用使得血液中的可螯合铜的四胺为至少约0.005mg/L(包括例如至少约0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5mg/L中的任一个)。在一些实施方案中，组合物的施用使得至少约1周中(包括例如至少约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、12个月或更久中的任一种)所述血液中的所述可螯合铜的四胺为至少约0.005mg/L。
在根据上述任一种方法的一些实施方案中，该方法还包含监测个体中的细胞内铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含基于个体中的细胞内铜水平来调整组合物的给药(包括例如有效量、施用频率、及其组合)。
在本申请的另一个方面，提供了药物组合物，其包含可螯合铜的四胺和铜离子。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。
在根据上述任一种药物组合物的一些实施方案中，药物组合物被配制成片剂、胶囊剂或丸剂。
还提供了可用于本文所述的方法的组合物、药盒和制品。
应理解，本文所述的本发明方面和实施方案包括“由这些方面和实施方案组成”和/或“基本由这些方面和实施方案组成”。
提及“约/大约”时，本文中的数值或参数包括(并且描述了)针对该数值或参数本身的变化。例如，提及“约/大约X”的描述包括对“X”的描述。
本文使用的术语“约X至Y”与“约X至约Y”具有相同的含义。
除非上下文另外明确指出，否则本文以及所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和/或更多个/种。
对本领域技术人员而言显而易见的是，针对治疗评估、选择和/或接受治疗的个体是需要这样的活性的个体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示出了进一步与两个氯离子和水分子缔合的曲恩汀与铜离子的络合物的晶体结构，未标记的原子是氢原子；
图2列出了图1中晶体结构的键长、键角和扭转角的示例性组；
图3列出了图1中示例性晶体的晶体和结构细化数据；
图4A至4C列出了图3中细化晶体结构中原子的原子坐标和各向异性参数；图4A列出了非氢原子的分数原子坐标和等效各向同性位移参数；图4B列出了非氢原子的各向异性位移参数；图4C列出了氢原子的原子坐标和各向同性位移参数；
图5示出了实施例2的实验操作的流程图；
图6示出了实施例2的不同实验组中初级新生大鼠心肌细胞的细胞内铜浓度；
图7示出了实施例3的实验操作的流程图；
图8A示出了具有或不具有曲恩汀处理的升主动脉缩窄(ascending aorticconstriction，AAC)和假手术组中大鼠的通过心回波描记术检测到的室间隔深度(interventricular septum depth，IVSD)的形态变化；
图8B示出了具有或不具有曲恩汀处理的AAC和假手术组中大鼠的通过心回波描记术检测到的左心室后壁深度(leftventricularposteriorwall depth，IVPWD)的形态变化；
图9A示出了具有或不具有曲恩汀处理的AAC和假手术组中大鼠的通过心回波描记术检测到的左心室射血分数(ejection fraction，EF)的功能变化；
图9B示出了具有或不具有曲恩汀处理的AAC和假手术组的通过心回波描记术检测到的左心室缩短分数(shortening fraction，FS)的功能变化；
图10A示出了假手术对照组以及未经处理和经曲恩汀处理的ACC组中大鼠的心脏组织中的平均铜浓度；
图10B示出了假手术对照组以及未经处理和经曲恩汀处理的ACC组中大鼠的血浆中的平均铜浓度；在高剂量曲恩汀处理组(ACC-Tr(H))和低剂量曲恩汀处理组(ACC-Tr(L))中，曲恩汀处理均能降低AAC大鼠中血浆铜浓度的初始高水平；
图11示出了实施例4的实验操作的流程图；
图12示出了未处理组和曲恩汀处理组中患有心力衰竭的恒河猴(Rhesus monkey)的通过心回波描记术检测到的左心室射血分数(EF)变化；
图13示出了未处理组和曲恩汀处理组中患有心力衰竭的恒河猴的不同组织样品中的铜浓度；
图14示出了实施例5的实验操作的流程图；
图15示出了未处理组和曲恩汀处理组中患有心肌梗死的小鼠的通过心回波描记术检测到的左心室射血分数(LVEF)变化；
图16示出了未处理组和曲恩汀处理组中患有心肌梗死的小鼠的不同组织样品中的铜浓度。
具体实施方式
本发明公开了曲恩汀将铜递送到缺血组织的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本申请提供了用于通过促进铜的组织再分布和再利用来进行缺血组织修复和再生的方法和组合物。特别地，描述了通过施用包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的四胺组合物和任选地包含铜离子的促铜组合物来在具有缺血性组织损伤的个体中的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法。本文所述的发明基于以下令人惊讶的发现：先前用于去除铜离子并降低铜水平的可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)当根据本申请的任一种方法使用时可以促进铜在缺血心肌和血液循环之间的再分布。例如，曲恩汀可以特异性结合于缺血组织并用于将铜装载到缺血组织的细胞中。因此，曲恩汀和其他具有类似特性的可螯合铜的四胺可用于提高缺血心肌中的细胞内铜水平，由此恢复铜依赖性HIF-1转录活性，促进组织修复并逆转心肌缺血性梗死。因此，本文所述的方法和组合物可用于治疗不同的缺血性疾病和病症。
提高细胞内铜水平的方法
本申请在一方面提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物(在下文也称为“四胺组合物”)。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，促铜组合物可以改变细胞器中铜的分布。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了将铜离子递送到具有缺血性组织损伤的个体中缺血组织的细胞中的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了将铜离子递送到具有缺血性组织损伤的个体中缺血组织的细胞中的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了将铜离子递送到具有缺血性组织损伤的个体中缺血组织的细胞中的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了将铜离子递送到具有缺血性组织损伤的个体中缺血组织的细胞中的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了将铜离子递送到具有缺血性组织损伤的个体中缺血组织的细胞中的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中促进铜的组织再分布和再利用的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中促进铜的组织再分布和再利用的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中促进铜的组织再分布和再利用的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物并向个体施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中促进铜的组织再分布和再利用的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄入、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中促进铜的组织再分布和再利用的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物的有效量提高个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，与在治疗之前个体的缺血组织的细胞内铜水平相比，在该个体的缺血组织中细胞内铜水平提高超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多中的任一个。在一些实施方案中，与在治疗之前个体的缺血组织的铜水平相比，该个体的缺血组织的铜水平(例如总铜水平)提高超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多中的任一个。在一些实施方案中，该方法不降低个体中的细胞外铜水平(例如血清中的铜水平)。在一些实施方案中，与在治疗之前个体的细胞外铜水平相比，该方法不会使个体中的细胞外铜水平(例如血清中的铜水平)降低超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多中的任一个。在一些实施方案中，该方法不降低个体中的总铜水平。在一些实施方案中，与在治疗之前个体的总铜水平相比，该方法不会使个体中的总铜水平降低超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多中的任一个。在一些实施方案中，在施用四胺组合物之后，个体具有健康个体的血清中平均总铜水平的至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。
上述任何方法还可以包含监测(包括测量和确定)个体的铜水平，并基于铜水平来调整治疗计划。在一些实施方案中，铜水平是缺血组织的细胞外铜水平。在一些实施方案中，铜水平是个体的血清铜水平。在一些实施方案中，铜水平是缺血组织的细胞内铜水平。在一些实施方案中，铜水平是总铜水平，包括Cu1+和Cu2+水平二者，和/或细胞内和细胞外铜水平二者。在一些实施方案中，铜水平是Cu2+水平。在一些实施方案中，铜水平是Cu1+水平。在一些实施方案中，铜水平是游离(即未结合)铜水平。在一些实施方案中，铜水平包含游离铜水平和蛋白质结合铜水平二者。在一些实施方案中，该方法还包含监测个体中的细胞内铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含基于个体中的细胞内铜水平来调整四胺组合物的给药(包括例如有效量、施用频率、及其组合)。
可以在每个施用步骤之前和/或之后单独或组合监测不同铜水平，并且可以比较施用四胺组合物之前和之后的对应铜水平以确定通过当前的治疗计划是否提高或降低铜水平。在一些实施方案中，将施用四胺组合物之后测量的铜水平与预先确定的铜水平进行比较以确定是否需要进一步提高铜水平。预先确定的铜水平可以是促进铜依赖性HIF转录活性和/或诱导一个或更多个缺血组织修复事件所必需的最低铜水平(例如细胞内铜水平或细胞外铜水平)。可以基于以下任一种来调整治疗计划(包括例如是否施用促铜组合物；四胺组合物和任选地促铜组合物的剂量、频率和持续时间，等等)：缺血组织的细胞外铜水平、个体的血清铜水平、缺血组织的细胞内铜水平、个体的其他铜水平、及其组合。此外，可以监测缺血组织损伤的修复程度以评估治疗计划。用于监测缺血组织损伤的修复的方法在“诱导组织修复的方法”部分中进行描述，其可以包括但不限于与缺血性组织损伤相关的病理学、组织学或分子标志物的评价。
在根据本文所述任一种方法(包括“诱导组织修复的方法”部分中的方法)的一些实施方案中，该方法还包含监测个体中的细胞内铜水平。在一些实施方案中，如果细胞内铜水平比预先确定的细胞内铜水平低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个，则需要在施用四胺组合物之后进一步提高个体的细胞内铜水平。在其中需要进一步提高细胞内铜水平的一些实施方案中，通过以下任一种或以下的组合来调整个体的治疗计划：(a)继续施用四胺组合物；(b)以更高的剂量施用四胺组合物；或(c)以更高的给药频率施用四胺组合物。在一些实施方案中，该方法还包含基于个体中的细胞内铜水平来调整四胺组合物的给药(包括例如有效量、施用频率、及其组合)。在一些实施方案中，该方法还包含监测个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，如果在施用四胺组合物之后个体的细胞外铜水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个，或者如果个体的细胞外铜水平比预先确定的细胞外铜水平低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个，则需要提高个体的细胞外铜水平。在其中需要提高个体的细胞外铜水平的一些实施方案中，还通过以下任一种或以下的组合来调整个体的治疗计划：(a)施用包含铜离子的四胺组合物，其中当前治疗计划的四胺组合物不包含铜离子；(b)施用促铜组合物，其中当前治疗计划不包括施用促铜组合物；(c)增加促铜组合物的剂量；(d)提高促铜组合物的剂量频率；(e)施用不同的促铜组合物；或(f)停止向个体施用四胺组合物。
可以使用本领域已知的任何方法来确定和/或监测铜水平。例如，可以通过原子吸收分光光度法、通过感应耦合等离子体质谱(inductively coupledplasmamassspectrometry，ICPMS)或通过蛋白质诱导x射线发射显微术(protein inducedx-rayemissionmicroscopy，PIXE)来定量确定铜水平。参见例如Cooper G.J.S.等Diabetes(2004)53:2501-2508；Lu J.等DrugMetabolism andDisposition(2007)35(2):221-227；和美国专利公开No.
20100160428A1。例如，缺血组织样品中的总铜水平可以使用缺血组织的均化样品(例如用硝酸均化的缺血组织)来测量，所述样品包括缺血组织的细胞内内容物和细胞外内容物二者。缺血组织样品中的细胞内铜水平可以使用从缺血组织样品分离的细胞来测量，其中在分析之前将细胞进一步裂解以释放细胞内内容物。个体中的细胞外铜水平可以使用体液样品来测量，所述体液样品包括但不限于血清、血浆、脑脊液、淋巴液和黏液。在一些实施方案中，使用血清来监测细胞外铜水平。在一些实施方案中，使用肝活检来确定个体中的代谢铜水平。例如，可以使用电子顺磁共振光谱来检测样品中铜的氧化态(Cu1+相对于Cu2 +)，并提供样品中铜的每种氧化态的百分比。因此，可以使用样品中Cu2+的百分比以及包括Cu1+和Cu2+二者的总铜水平来计算Cu2+水平。类似地，可以使用样品中Cu1+的百分比以及包括Cu1+和Cu2+的总铜水平来计算Cu1+水平。在一些实施方案中，例如使用基于抗体的方法(例如Western印迹、ELISA等)来测量血清血浆铜蓝蛋白和/或血清白蛋白浓度以监测可用于缺血组织摄取和/或再利用的铜的水平。在一些实施方案中，可以使用缺血组织样品的截面切片来使用X射线荧光成像(X-ray fluorescence imaging，XRF)方法测量细胞内铜水平和细胞外铜水平二者。
本文所述的方法通常适用于在各种缺血组织中使铜再分布(包括例如提高细胞内铜水平和/或将铜递送至细胞)。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。
诱导组织修复的方法
本申请在一方面提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少一个(包括例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少一个(包括例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少一个(包括例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少一个(包括例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导至少一个(包括例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在根据上述诱导组织修复的任一种方法的一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包含诱导干细胞向缺血组织迁移，包括但不限于间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcell，BMSC)、多能干细胞、诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stem cell，iPS)或各种组织衍生干细胞。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包含诱导干细胞在缺血组织中分化。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包括在缺血组织中诱导组织再生。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包括逆转缺血组织中的损伤。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包含在缺血组织中重建神经原纤维细胞和神经分泌细胞的微环境。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包含诱导触发组织再生的信号传导分子。在一些实施方案中，至少一个组织修复事件(例如至少两个组织修复事件)包含在缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性。
本文所述的方法可以用于在不同类型的缺血组织中诱导组织修复事件(包括例如促进铜依赖性HIF-1转录活性和/或诱导干细胞向缺血组织迁移)。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞向具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织迁移(即，归巢)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞向具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织迁移(即，归巢)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞向具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织迁移(即，归巢)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞向具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织迁移(即，归巢)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞向具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织迁移(即，归巢)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞(MSC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、多能干细胞、诱导性多潜能干细胞(iPS)或组织衍生干细胞。在一些实施方案中，组织衍生干细胞是脂肪组织衍生干细胞、心脏组织衍生干细胞或脐带组织衍生干细胞。在另一些实施方案中，干细胞是成体干细胞。在一些具体方面，成体干细胞是造血干细胞，乳腺干细胞，肠干细胞，胎盘、脂肪组织、肺、骨髓、血液、脐带的沃顿胶质或牙(例如牙髓和牙周韧带的血管周围生态位)中的间充质干细胞，内皮干细胞，神经干细胞，嗅成体干细胞，神经嵴干细胞，或种系干细胞(例如，睾丸中的干细胞)。
在一些实施方案中，干细胞在体内从具有缺血性组织损伤之个体的一个器官或组织隔室向其另一器官或组织隔室的缺血性损伤部位迁移。例如，MSC可以从骨髓(bonemarrow，BM)、脐带血(umbilical cordblood，UCB)、脐带间质(沃顿胶质)、胎盘和脂肪组织(adipose tissue，AT)迁移。在另一些实施方案中，可以从器官或组织隔室分离MSC，将其在体外富集和/或处理，然后用于在体内向组织或器官损伤部位迁移。
本文可以使用的用于测量细胞迁移的测定包括但不限于体内生物标志物、生物发光、荧光、正电子发射断层显象(positron emission tomography，PET)/CT和核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)。可以用其他方法例如对组织切片进行IHC来验证和证实体内测定。
用于测定干细胞迁移的体内非侵入性成像技术包括对装入MSC中的金色右旋糖酐包被颗粒进行成像，其可以使用X-射线、拉曼光谱、计算机化断层显象(computedtomography，CT)或超声(US)方式来可视化。在一些实施方案中，向干细胞(例如MSC)中装入具有能够通过X-射线、CT、US、PET或MRI来实现细胞可视化的特性的生物相容性纳米颗粒构建体、示踪物或超顺磁性颗粒。在一些实施方案中，可以使用例如盲肠结扎和穿刺(cecal ligation andpuncture，CLP)的技术来测定干细胞的迁移。例如，对GFP嵌合小鼠进行CLP允许在腹部脓毒症的环境下观察BMSC的表现。可以使用FACS、流式细胞术和免疫组织化学来追踪BMSC到外周血、肺、肝、皮肤伤口和缺血性损伤的原发部位中的迁移。BMSC表现可以与损伤时间以及细胞因子和趋化因子的局部(使用RT-PCR)和全身水平相关。追踪干细胞的迁移可以有助于解释BMSC在缺血性组织损伤后对本地和远端器官和组织修复以及再生的贡献。
在一些实施方案中，可以利用向个体施用经标记的细胞来监测干细胞的迁移。使用例如同位素标记和染色的方法来标记干细胞。在一些实施方案中，标记方法包含：向雌性动物注射雄性动物的干细胞，因此Y染色体可以是追踪物；将A物种的干细胞注射于B物种，因此A物种的特定基因可以是细胞追踪物；用pKH26、BrdU或其他染料标记干细胞，因此可以通过染料或针对追踪物的特定酶促反应来追踪干细胞。
在一些实施方案中，使用同位素标记来在体内追踪干细胞。可以通过标记细胞的同位素来追踪干细胞，但是值得注意的是，必须考虑安全性问题和放射性半衰期。其他的干细胞体内追踪方法包括但不限于：通过细胞染料例如DID进行细胞染色；通过双光子激发荧光显微术对体表细胞进行实况成像(live imaging)；通过双光子激发荧光显微术对转基因动物的特定体表细胞进行实况成像；用SPIO标记细胞并通过MRI追踪追踪物，等等。可以通过多种荧光染料标记干细胞，然后将其注射到动物中。在追踪实验之前不久，可以将靶器官冷冻，切片并在共焦激光扫描显微术下直接观察。这种追踪方法不需要太多的标记细胞(10^6个细胞/兔)，因此在器官和组织的天然背景下可以追踪自体细胞。
干细胞的标记可以例如通过一种单独的追踪物如pKH26来实现。pKH26是一种脂溶性染料，并且标记不会使pKH26渗透细胞膜。因此，pKH26适合实况成像。本文所述的追踪方法可以涉及通过2或3种染料进行多次标记。在一些实施方案中，使用细胞核追踪物(DAPI,Hoechst)加膜追踪物来进行多次标记。细胞核追踪物确定细胞的核，并同时附和膜追踪物pKH26。在一些实施方案中，使用2种膜追踪物(例如Dio(3)&pKH26)进行多重标记。这些追踪物通过类似的机制标记细胞，但是具有不同的激发和发射波长，从而允许同时由2种不同的荧光信号确定干细胞(例如BMSC)的迁移(即归巢)。在这种追踪方法中，仅认为不同波长的重叠信号(例如红色和绿色信号)为归巢信号。
很多种动物组织是自发荧光的，并且天然组织中的最常见自发荧光是绿色荧光。心脏细胞具有相对较低的荧光，但是其荧光足够强以致干扰观察。切片的切割边缘往往是荧光最强的。为了解决干扰，可只识别绿色和红色重叠信号作为追踪信号。红色荧光更适合用针对其特异性的IOD值进行统计学分析(除红色荧光信号中的明显不精确之外)。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞在缺血组织中分化的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，干细胞能够分化成间充质细胞类型，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、肠细胞、骨细胞、神经细胞、肝细胞、肾细胞、肌细胞(骨骼肌和平滑肌)、和心肌细胞。在另一些实施方案中，干细胞能够分化成非中胚层来源的细胞，包括β细胞、肝细胞和神经元。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
可以使用本领域已知的测定来阐明干细胞分化的过程和分化干细胞(例如MSC，例如BMSC)的表型，所述测定包括但不限于针对成骨细胞的碱性磷酸酶和茜素红S染色，针对脂肪细胞的油红O染色，以及针对软骨发生的爱茜蓝染色。还可以通过基因表达谱绘制来测定干细胞(例如MSC)向多种细胞类型的分化。例如，转录谱绘制已鉴定出参与成骨分化(FHL2、ITGA5、Fgf18)、软骨发生(FOXO1A)和腱发生(tenogenesis)(Smad8)的特定基因。在一些实施方案中，MSC可以通过大规模扩增产生高细胞数目。
在一些实施方案中，提供了诱导组织再生的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在缺血组织中诱导细胞增殖。在一些实施方案中，该方法在缺血组织中诱导血管生成。在一些实施方案中，该方法在缺血组织中诱导血管成熟。在一些实施方案中，该方法产生上述两种或更多种效果。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
可以在例如其中一部分组织受损或被去除的生物体中测定本文中公开的组织再生。然后，将本文所述的四胺组合物施用于该生物体，并确定组织再生的速率。将该组织再生速率与当向生物体施用对照或不进行处理时所观察到的速率进行比较。可以在组织再生测定期间确定的其他参数包括但不限于例如疼痛或疼痛标志的症状或结果，炎症的体征或症状，最终再生程度，和再生质量。在一些实施方案中，本文的组织再生测定包含评估一个或更多个器官功能性参数，例如一种或更多种心脏功能性标志物、一种或更多种肾功能性标志物以及一种或更多种脑功能性标志物。
在一些实施方案中，可以在分析心脏再生和修复中使用以下一个或更多个参数来评价本文所述的方法：(1)重构组织的量或心肌质量和冠状动脉血管；(2)恢复肌细胞和血管的数量和大小；(3)新形成的肌细胞和血管与周围心肌的整合；和(4)再生心肌结构的来源。在一个方面，可以进行核磁共振成像(MRI)来研究瘢痕面积、整体左心室功能、区域性功能(室壁运动和增厚)和区域性心室灌注。在另一个方面，使用MRI来检测和/或确定改善心室功能的新血管、组织或细胞的存在。在又一个方面，可以进行组织病理学来确定瘢痕面积以及c-kit阳性心脏干细胞的鉴别和量化。组织病理学还提供了关于新血管和心肌细胞的分布、大小和密度的数据。组织病理学允许在组织和细胞水平记录修复过程。例如，进行测试以评价梗死部分内的微血管密度(vWF阳性血管/mm2)、BrdU阳性细胞和c-kit阳性细胞。使用冯.维勒布兰德因子(vonWillebrand factor，vWF)来量化微血管密度允许确定梗死区中生成的新血管的量。BrdU阳性细胞代表包括心脏细胞在内的细胞的增殖。c-kit阳性细胞测试显示所选定梗死部分内干细胞的量。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中逆转损伤的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
组织损伤的逆转可以通过任何合适的方法进行测定，所述方法例如检测正常组织稳态和/或持续组织损伤的细胞标志物(例如，通过免疫组织化学或者测量DNA和转录本水平)，测量损伤面积或损伤体积，或者评估任何临床上相关的指示物。例如，可以通过量化细胞数目(例如肌细胞、成纤维细胞的数目)或瘢痕形成的量，或者用针对心脏功能输出或结构方面的功能性测定来测量梗死组织的心脏组织损伤的逆转，所述心脏功能输出或结构方面包括LVEDP、LVDP、max dp/dt、min dp/dt、LV重量(LV Weight)、室体积(Chamber Volume)和舒张期室壁应力(Diastolic Wall Stress)。一般来说，如果在任何这样的临床评估或其任意组合中本文公开的方法均产生显著变化(例如，至少2倍变化)，则认为其逆转缺血组织中的损伤。在一些实施方案中，该方法逆转缺血组织中的纤维化。纤维化是纤维组织的异常累积，其可以作为受损组织中伤口愈合过程的一部分发生。这样的组织损伤可以由物理损伤、炎症、感染、暴露于毒素以及其他原因引起。
高血压、高血压性心脏病、动脉粥样硬化和心肌梗死的结果是在心脏和血管中积累纤维化组织。高血压或血压过高可以由多种因素引起并且常常导致发生高血压性心脏病(Hypertensive Heart Disease，HHD)并发展至心脏停搏和心肌梗死。类似地，动脉粥样硬化以及其他缺血性心脏病常常也导致心脏停搏。这些心血管疾病全部表现出细胞外基质累积或纤维化沉积，其导致血管变硬以及心脏组织自身变硬。纤维化物质的这种沉积是针对由高血压和/或硬化状态引起的损伤的响应，并且这一响应的效应还对血管和心脏变硬以及心室扩大产生不利影响应响。在一些情况下，心血管疾病中的心脏纤维化增多干扰或改变通过心脏的组织支架传递至心肌细胞的信号，进一步导致有效心脏功能被破坏并促进心脏停搏和心肌梗死。
根据本公开内容，可以使用在组织损伤期间差异调节的基因的表达谱来评估本文公开的治疗方法中的组织损伤逆转。例如，基于微阵列的基因表达分析可以基于对经受导致细胞外胶原累积和增殖发生改变(纤维化的标志)之选定刺激的人细胞(例如成纤维细胞和心肌细胞)的分析。可以对该刺激进行选择以模拟组织特异性纤维化过程中的那些。然后，可以使用与纤维化(例如，肝纤维化、肺纤维化、心脏组织纤维化、糖尿病性肾病和肾纤维化)相关的基因表达谱来测定纤维化和对组织的纤维化损伤的逆转。在另一些实施方案中，可以使用与纤维化逆转(例如，在已知至少部分地逆转纤维化的治疗下)相关的基因表达谱来测定纤维化和对组织的纤维化损伤的逆转。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中重建神经原纤维细胞和神经分泌细胞的微环境的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
微环境是结构和炎性细胞二者、细胞因子、蛋白质和生长因子的复杂网络。在与心脏纤维化疾病或病症相关的缺血的情况下，心脏包含驻留结构细胞例如心肌细胞、上皮细胞、成纤维细胞，以及驻留心肌细胞祖细胞和细胞因子分泌细胞。在纤维化发病期间，这些细胞与纤维化因子相互作用。在某些方面，成纤维细胞和成肌纤维细胞在产生纤维化环境中发挥重要作用，因为他们分泌过量的胶原和基质材料，这导致不可逆的瘢痕形成。细胞间黏附分子和细胞外基质配体是纤维化微环境中的重要因子，并且促进纤维化和成纤维细胞分化。在一些实施方案中，在组织微环境中对黏附介导的信号传导进行测定。例如，细胞分化和迁移响应于来自微环境的机制提示(例如，周围基质的硬度)而发生。在一个方面，对组织的弹性或间充质干细胞(MSC)的培养基质进行测定和调节以促进干细胞向缺血受损组织归巢、在缺血性损伤部位的干细胞分化、组织修复和/或组织损伤逆转。在一个实施方案中，软基质导致MSC分化为神经元样细胞，而硬基质导致MSC分化为肌原性细胞。在一个方面，对缺血性损伤部位的细胞外基质及其组分进行测定以指示该微环境是否促进干细胞向该部位迁移、在缺血性损伤部位的干细胞分化、组织修复和/或组织损伤逆转。
在一些实施方案中，对细胞在其自然环境背景下的变化进行测量以指示本文中公开的治疗方法的效力和/或毒性。在一些实施方案中，对供体组织或器官(例如骨髓)和缺血性损伤部位的干细胞微环境进行测定和/或调节以促进干细胞向该部位迁移、在缺血性损伤部位的干细胞分化、组织修复和/或组织损伤逆转。局部组织微环境可以通过蛋白质染色(IHC和IF)以及用显色或荧光ISH进行RNA染色来测定。例如，缺氧微环境可以通过缺氧标志物染色、内皮细胞标志物染色、微血管密度分析和邻近分析来指示。还可以如Benbrook,2006,DrugDiscovery Today:Disease Models,3(2):143–148中所公开的使用器官培养物或器官型培养物来研究组织微环境。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中诱导触发组织再生的信号传导分子的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
本文所述的合适信号传导分子包括但不限于HIF-1、VEGF、SDF-1、CXCR4、CXCL12(也称为SDF-1α)、MMP、HGF/c-met、TGF-β1、IL-1β、TNF-α、CCR1、CCR4、CCR7、CCR10、CCR9、CXCR5、CXCR6、CD44、CD54、CD56、CD106、E-钙黏附蛋白、P-选择素、整合素(例如整合素-β1和CD49a、b、c、e、f(整合素a1、2、3、4、6)以及整合素配体(例如VCAM和ICAM)。
SDF-1/CXCR4轴是干细胞归巢最重要的机制之一。属于CXC-趋化因子家族的SDF-1(基质细胞衍生因子1或CXCL12)是一种小分子分泌性蛋白质。SDF-1的表达由HIF-1(缺氧可诱导因子-1)调节。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β/ARNT(芳基烃核转位因子，ARNT)构成。HIF-1β在细胞质中稳定，因此HIF-1α的表达和积累决定HIF-1的活性。在常氧下，HIF-1α蛋白被合成并通过泛素-蛋白酶体系统迅速降解。脯氨酰羟化酶(PHD)使HIF-1α羟基化，而经羟基化的HIF-1α被von Hippel–Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)识别，所述蛋白质构成靶向HIF-1α进行蛋白质降解的泛素-蛋白质连接酶。在缺血性组织损伤之后，受伤区域缺氧，这抑制PHD的活性，使得HIF-1α能够积累并转位到细胞核中，在此HIF-1α与HIF-1β二聚化而形成HIF-1，与其他因子组合并引发靶基因转录。受损的组织表达高水平的SDF-1并将SDF-1释放到循环中，从而建立从受损区域到循环远端的浓度梯度。该梯度由此将CXCR4表达的干细胞(包括BMSC)吸引至受损组织。
当心脏处于慢性缺氧下时，冠状动脉中的血液不能满足心肌的需求。因此，慢性缺血可以诱导心肌纤维化，减小微动脉的密度，影响血泵并最终导致缺血性心脏梗死。在慢性缺血下，HIF-1的活性受到限制，从而导致由HIF-1调节的血管生成因子的表达被抑制。因此，不能恢复血液供应并且将发生梗死。
通常来说，缺血受损组织中的HIF-1活性暂时受到限制。动物实验和临床试验都已证明：在心脏缺血下，在受到损伤之后受损组织中的HIF-1α立即积累，但是此后逐渐减少。HIF-1的活性甚至比HIF-1的水平降低得更快，从而导致HIF-1调节的因子(例如VEGF和SDF-1)的表达在短暂提高之后降低。由于HIF-1的调节，SDF-1的表达在心脏梗死后的第一天或第二天达到峰值。然后，SDF-1表达逐渐降低，并且在约一个月内下降至基线水平。由于SDF-1是干细胞归巢动员物之一，因此SDF-1水平的降低导致干细胞归巢减弱并且甚至消失。
重要的是，与在长时间缺血状况下相比，如在急性缺血状况下激活的由HIF-1α诱导的防御机制作用不同。在长期缺血状况下，缺血心肌中的HIF蛋白水平提高，而由HIF调节的基因(例如VEGF)受到抑制，这导致血管重建降低并且再生受损。铜缺乏降低HIF-1α与靶基因的HRE序列以及与P300(HIF-1转录复合物的组分)结合。此外，在长时间缺血之后，铜从心肌显著地动员至血液。冠状动脉流中的这种铜动员敏感地发生在长时间心脏缺血而非短期心脏缺血之后。心肌铜的损失与心脏功能的丧失程度相关。因此，即使在HIF蛋白水平升高的状况下，由于心肌铜损失而仍不会发生HIF控制基因的上调。微量元素(例如铜)可以导致HIF-1的活化，包括HIF-1α合成、稳定化、从细胞溶胶转位到细胞核、与靶基因的HRE序列结合以及HIF-1转录复合物形成。因此，铜依赖性HIF-1转录活性(包括HIF-1的靶基因的铜依赖性诱导或HIF-1的靶基因的铜依赖性阻遏)可以在缺血组织的修复中发挥重要作用。本文所述的方法可用于诱导一种或更多种信号传导分子，例如HIF-1α和铜依赖性HIF-1(例如HIF-1α)靶基因。
在本申请的一个方面，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中诱导至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中阻遏至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，至少一种铜依赖性HIF-1靶基因选自VEGF、GAPDH、GLUT1、PGK1和BNIP3。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中诱导至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中阻遏至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，至少一种铜依赖性HIF-1靶基因选自VEGF、GAPDH、GLUT1、PGK1和BNIP3。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中诱导至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中阻遏至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，至少一种铜依赖性HIF-1靶基因选自VEGF、GAPDH、GLUT1、PGK1和BNIP3。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中诱导至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中阻遏至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，至少一种铜依赖性HIF-1靶基因选自VEGF、GAPDH、GLUT1、PGK1和BNIP3。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中促进铜依赖性HIF-1转录活性的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中诱导至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，该方法在个体的缺血组织中阻遏至少一种铜依赖性HIF-1靶基因的表达。在一些实施方案中，至少一种铜依赖性HIF-1靶基因选自VEGF、GAPDH、GLUT1、PGK1和BNIP3。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
HIF-1靶基因在本领域中已经描述。参见例如BenitaY.等,(2009)NucleicAcidsResearch,37(14):4587-4602；Shen C.等,(2008)J.Biol.Chem.,280:20580-20588；Elvidge G.P.等,(2006)J.Biol.Chem.,281:15215-15266；Manalo DJ.等,(2005)Blood,105:659-669；参考文献中描述的HIF-1靶基因通过引用并入本文。HIF-1靶基因的亚组通过HIF-1的转录调节取决于铜，并且将HIF-1靶基因的亚组在本文中称为铜依赖性HIF-1靶基因。通过HIF-1的一些HIF-1靶基因通过HIF-1的转录调节与铜无关。参见例如Zhang Z等,(2014)Metallomics6(10):1889-93。示例性的铜依赖性HIF-1靶基因包括但不限于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、葡萄糖转运蛋白1(glucosetransporter 1，GLUT1)、磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)和BCL2/腺病毒E1B 19kDa蛋白相互作用蛋白3(BNIP3)。
本申请考虑的铜依赖性HIF-1转录活性包括缺血组织中铜依赖性HIF-1靶基因的表达的诱导或阻遏(即转录调节)。在一些实施方案中，与对照水平相比，在接受治疗之前个体的缺血组织中的铜依赖性HIF-1转录活性(例如铜依赖性HIF-1靶基因的诱导或阻遏的倍数)降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。在一些实施方案中，在个体接受治疗之后，个体的缺血组织中的铜依赖性HIF-1转录活性(例如铜依赖性HIF-1靶基因的诱导或阻遏的倍数)恢复至对照水平的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。铜依赖性HIF-1转录活性的对照水平可以基于相对于正常(例如，未受损或常氧)状况在急性缺血状况下或在相当水平的缺氧状况下健康组织中HIF-1靶基因的诱导或阻遏的倍数。铜依赖性HIF-1转录活性可以通过将缺血组织中铜依赖性HIF-1靶基因的表达水平(例如RNA水平和/或蛋白质水平)与健康组织中该铜依赖性HIF靶基因的表达水平进行比较来确定。RNA表达水平可以使用本领域的任何已知方法来测量，包括但不限于逆转录PCR(RT-PCR)、定量RT-PCR、微阵列和RNA测序方法。蛋白质表达水平可以使用本领域的任何已知方法来测量，包括但不限于基于抗体的方法(例如Western印迹和ELISA)和定量蛋白质组学方法(例如定量质谱)。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导至少两个(包括例如至少3、4、5、6、7个或更多个中的任一种)组织修复事件的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中至少两个组织修复事件选自：诱导干细胞(例如骨髓间充质干细胞)向缺血组织迁移、诱导干细胞在缺血组织中分化、在缺血组织中诱导组织再生、诱导触发组织再生的信号传导分子、逆转缺血组织中的损伤、在缺血组织中重建神经原纤维细胞和神经分泌细胞的微环境和促进铜依赖性HIF-1转录活性。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了诱导干细胞(例如MSC，例如BMSC)向缺血组织迁移并诱导干细胞在缺血组织中分化的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，提供了诱导干细胞(例如MSC，例如BMSC)向缺血组织迁移并在缺血组织中诱导组织再生的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，提供了诱导干细胞(例如MSC，例如BMSC)向缺血组织迁移，诱导干细胞在缺血组织中分化并在缺血组织中诱导组织再生的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导缺血组织修复(或改善缺血组织的功能)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导缺血组织修复(或改善缺血组织的功能)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导缺血组织修复(或改善缺血组织的功能)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物和有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，四胺组合物和促铜组合物依次施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导缺血组织修复(或改善缺血组织的功能)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导缺血组织修复(或改善缺血组织的功能)的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物，其中该个体预先已经施用有效量包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，在施用四胺组合物前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周或更久中的任一个，个体已经施用促铜组合物。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
还提供了使用本文所述的任何方法来治疗与缺血性组织损伤相关的疾病或病症的方法。
在一些实施方案中，提供了在个体中治疗缺血性心力衰竭的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的四胺组合物。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。在一些实施方案中，施用四胺组合物至少约1个月(例如至少约3个月或至少约6个月)。在一些实施方案中，个体在基线时具有不超过约35％的左心室射血功能(LVEF)。在一些实施方案中，个体患有II类或III类心力衰竭(基于纽约心脏协会(New YorkHeart Association)或NYHA功能分类(NYHAFunctional classification))。
可以用本文所述的方法治疗具有缺血性来源的任何分类或分期的心力衰竭(即，缺血性心力衰竭)。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA I类心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA II类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA III类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA IV类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA A类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA B类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA C类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体患有缺血性来源的NYHA D类缺血性心力衰竭。在一些实施方案中，个体具有缺血性心力衰竭的一种或更多种症状，例如疲劳、心悸、呼吸困难或身体活动受限。在一些实施方案中，个体具有心血管疾病的一种或更多种症状。在一些实施方案中，个体已经住院至少约1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30天或更多天中的任一个。
可以另外地通过评估缺血组织的修复程度来确定本文所述的任一种方法的效力。组织修复可以通过例如损伤面积或损伤体积来评估。可以使用任何临床上相关的标准来评估患者中受损组织的修复。例如，可以通过量化细胞数目(例如肌细胞、成纤维细胞的数目)或瘢痕形成的量，或者用针对心脏功能输出或结构方面的功能性测定来测量梗死组织的修复，所述心脏功能输出或结构方面包括LVEDP、LVDP、max dp/dt、min dp/dt、LV重量、室体积和舒张期室壁应力。一般来说，如果在任何这样的临床评估或其任意组合中本文公开的方法均产生显著变化(例如，至少2倍变化)，则认为其修复受损组织。
可以进行任何合适的方法来测定组织修复。例如，可以进行评估组织愈合、评估经修复组织的功能性和评估组织中的细胞生长的方法。为了确定组织愈合的程度，可以进行组织学和细胞染色以检测接种细胞的增殖和/或改善的组织学外观。在一些情况下，可以收集组织部分并用固定剂(例如，如中性缓冲福尔马林)处理。可以将这些组织部分脱水，包埋在石蜡中并用切片机切片以进行组织学分析。可以将切片用苏木精和伊红(H&E)染色，然后固定在玻璃载玻片上以用于对形态和细胞构成进行显微术评价。在一些情况下，可以进行生理学测试以评估在根据本文提供的方法和材料的治疗之后的组织运动和功能性。例如，可以进行体外机械测定以测量经修复腱组织或经修复关节的弯曲功(workofflexion，WOF)或弯曲角度。体内测定可以包含器官的功能性评价、症状评估或成像技术。
在一些实施方案中，可以通过以下任意一种或更多种方法来评估在施用本文公开的治疗方法之前、期间或之后的组织和/或器官功能：通过例如流式细胞术、免疫荧光、ELISA、磷光体标记、杂交、核酸扩增或Western印迹的方法来对指示组织功能得到改善的至少一种生物标志物进行生物化学分析；细胞功能测定，例如细胞凋亡测定、坏死测定和细胞生存力测定，包括通过免疫荧光或流式细胞术进行膜联蛋白V染色、检测半胱天冬酶活性、缺氧测定、TUNEL测定、细胞DNA分梯(laddering)、响应于H2O2的棒状细胞的数目、对基因表达进行qPCR评估和通过H&E染色测量坏死面积；瘢痕形成测定，包括测量受损或梗死区中成纤维细胞的数目、测量胶原沉积和与瘢痕形成相关的其他基质蛋白的水平；干细胞或祖细胞向受损区域中的迁移；以及任何其他临床上相关的器官功能测试。
在一些实施方案中，可以通过以下任意一个或更多个参数来评估心脏功能：肌细胞机械学和细胞融合，例如肌细胞大小的分布频率、峰值缩短、缩短和重新伸长的速度，以及细胞融合的评估(X染色体的数目)；心脏功能的输出或结构方面，包括LVEDP、LVDP、+dp/dT、LV重量、室体积、舒张期室壁应力、以及对MI治疗和MI未治疗对象的比较；心肌再生，例如再生心肌的构成、评估经治疗对象相对于未经治疗对象中梗死区中的BrdU阳性细胞、以及经治疗对象相对于未经治疗对象中梗死区中的肌球蛋白阳性细胞；心脏结构，例如梗死尺寸、纤维化量和心肌细胞肥大。在某些实施方案中，本文公开的方法还包括测量心脏功能的一个或更多个标志，其中心脏功能的所述标志是相比较于对照的胸心输出量(cardiacoutput，CO)、心指数(cardiac index，CI)、肺动脉楔压(pulmonary artery wedgepressure，PAWP)、心指数(CI)、％缩短分数(％fractional shortening，％FS)、射血分数(EF)、左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张期末内径(left ventricular enddiastolicdiameter，LVEDD)、左心室收缩期末内径(leftventricular end systolic diameter，LVESD)、收缩性(dP/dt)、心房或心室功能的降低、泵送效率的提高、泵送效率损失速率的降低、血液动力学功能损失的降低，或与心肌病相关之并发症的减轻。
在一些实施方案中，可以如下评估在施用本文公开的治疗方法之前、期间或之后的脑功能：通过神经学测试，或者在电生理学方面(例如通过降低的信噪比)，或者在生化方面(例如通过分析指示中枢或外周神经系统的器官功能、组织功能和/或细胞功能的至少一种生物标志物)。示例性的电生理学技术包括脑电描记术(electroencephalography，EEG)、心电描记术(electrocardiography，EKG)、肌电描记术(electromyography，EMG)、事件相关电位(event-relatedpotential，ERP)、诱发电位(evokedpotential，EP)、脑磁描记术(magnetoencephalography，MEG)和神经传导研究(nerve conduction study，NCS)。在另一些实施方案中，可以通过以下任意一种或更多种方法或者任意一个或更多个参数来评估脑功能：一般智力功能，例如韦克斯勒简短智力量表(WechslerAbbreviated Scale ofIntelligence)和韦克斯勒成人智力量表-III(WechslerAdult Intelligent Scale-III)；基本注意，例如来自韦克斯勒记忆量表-III(WechslerMemory Scale-III)的数字广度、空间广度分测试；复杂注意(工作记忆)，例如来自韦克斯勒成人智力量表-III的数字广度、字母数字顺序和算术分测试；执行功能，例如威斯康辛卡片分类测试(Wisconsin CardSorting Test)、连线测试B(Trail Making Test B)、斯特鲁普测试(Stroop Test)、伦敦塔测试(Tower of London Test)、赌博测试(Gambling Test)、额叶系统行为量表(FrontalSystem Behavior Scale)和爱荷华额叶功能量表(Iowa Scale ofFrontal LobeFunction)；记忆(视觉和言语)，例如韦克斯勒记忆量表-III、Rey听觉(Rey Auditory)、言语学习测试(Verbal Learning Test)、加利福尼亚言语(CaliforniaVerbal)、学习测试-II(Learning Test-II)、修订版简短视觉记忆测试(BriefVisual Memory Test Revised)；情感调节，例如明尼苏达多相人格调查表-2(MinnesotaMultiphasic PersonalityInventory-2)、情感斯特鲁普测试(Affective Stroop Test)、额叶系统行为量表和爱荷华额叶功能量表；情绪刺激的解读，例如DANVA(诊断性非言语行为分析，DiagnosticAnalysis ofNonverbal Behavior)；处理速度，例如来自韦克斯勒成人智力量表-III、连线测试B和符号数字模式测试(Symbol Digit Modalities Test)的处理速度指数(符号搜索，译码)；语言，例如波士顿命名测试(BostonNaming Test)；受控口头语联想测试(ControlledOral WordAssociation Test)；语义词流畅性测试(Semantic WordFluencyTest)；和多语言失语症检查(Multilingual Aphasia Examination)；视觉结构测试(visuo-constructional test)，例如来自韦克斯勒成人智力量表-III的Rey-Osterrieth复杂图形测试(Rey-Osterrieth Complex Figure Test)、区组设计(BlockDesign)和物体组装分测试(Object Assembly subtest)；以及视觉-空间测试，例如来自WAIS-III的矩阵推理(Matrix Reasoning)，和线性方向判断测试(Judgment ofLine Orientation Test)。
在一些实施方案中，对在施用本文公开的治疗方法之前、期间或之后的骨骼肌健康进行测试。在一些实施方案中，骨骼肌健康包括肌疼痛、肌损伤、针对运动的代谢变化和细胞骨架重组。骨骼肌功能可以是肌肉强度、肌肉耐力、训练适应、将允许关节运动的正常肌肉状态，或者健康哺乳动物中骨骼肌的标准生理代谢和功能。可以测量骨骼肌的任何功能变量，包括肌肉强度(在特定运动中产生的最大力)、肌肉耐力(在设定频率和力下可以进行的最大收缩数)和肌肉功率(力/时间，肌肉产生的最大效果)。尽管并非穷举，但是典型的肌肉特异性功能包含成肌细胞分化、成肌细胞决定、肌发育、肌收缩、肌节变化、成肌细胞融合、体肌发育和肌发生。
在一些实施方案中，对患者的骨骼肌纤维化进行评估。许多方法可用于确定骨骼肌纤维化的状况，包含获得来自该患者之肌肉组织的活检物，并用对检测纤维化组织存在灵敏的组织化学或免疫组织化学染料对活检物进行评价。组织化学染料的实例包括例如，苏木精和伊红(H&E)，三色和ATP酶(例如在pH4.3、4.65和10.4下)。可以用于标记肌纤维以进行免疫组织化学染色的代表性抗体包括例如肌球蛋白、IV型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白和抗肌萎缩蛋白。或者，可以采用确定纤维化渗透患者骨骼肌的程度的功能性方法。该功能性方法涉及对患者进行成套测试和身体测量中的一项或更多项。这样的测试和测量通常包括神经强度测试、肌肉强度、平衡、步态、姿势、感官协调评价和肺功能测试(例如肺活量和用力呼气容量)，其全部可以通过本领域中已知的方法来进行。在一些实施方案中，可以基于本文所述的一种或更多种信号传导分子的表达水平来评估组织修复。作为组织修复指示物的合适生物标志物包括但不限于DNA损伤生物标志物、炎性应答生物标志物、组织损伤生物标志物、组织损伤修复生物标志物或血液学替代标志物，例如p53、p21、GADD45a、ATM、磷酸化H2AX组蛋白、IL-6、CRP、SAA、IL-1、IL-5、IL-10、KC/GRO、IFN、IL-2、IL-4、TNF-α、IL-12、IL-3、IL-7、IL-6、唾液β-淀粉酶、瓜氨酸蛋白(citrulinatedprotein)、S100B、SP-D、BPI、TSP、CA15-3、CDBB、CKMB、CKMM、FABP2、GFAP、NSE、CD5、CD-16b、CD20、CD177、CD26、CD27、CD40、CD45、Flt-3L、G-CSF、KFG、EPO、TPO、GM-CSF或SDF-1α。
铜(包括铜离子)是参与组织损伤修复和/或组织再生的一种或更多种因子(例如转录因子)的调节物，并且因此可以通过评估这些因子中的任意一种或更多种来评估组织修复。铜调节性因子包括但不限于：Cu稳态蛋白，例如Ctr 1、Ctr 3、DMT1、Atox 1、ATP7A/7B、Cox 17、CCS、Sco 1/2、Cox 11、谷氨酸能N-甲基D-天冬氨酸受体(Glutamatergic N-methyl D-aspartate receptor，NMDAR)、淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)、铜代谢基因MURR1结构域(Coppermetabolism geneMURR1 domain，COMMD1)、X连锁的细胞凋亡抑制剂(X-linked inhibitor ofapoptosis，XIAP)、高半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、细胞色素c氧化酶的亚基II(COX II)、细胞色素c氧化酶的亚基I(COX I)、FGF-1、VEGF、血管生成素(例如ANG1或ANG2)、纤连蛋白、胶原酶、MMP-TIMP、弹性蛋白、PDGF和eNOS；细胞内Cu结合蛋白，例如细胞色素C氧化酶(CytochromeC oxidase，CCO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、金属硫蛋白(Metallothionein，MT)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、多巴胺-β-单加氧酶(Dopamine-β-monooxygenase，DBH)、肽基甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶(Peptidylglycine-α-amidatingmonooxygenase，PAM)、酪氨酸酶、苯丙氨酸羟化酶、二胺氧化酶、Hephaestin和软骨基质糖蛋白；细胞外Cu结合蛋白，例如铜兰蛋白(Ceruloplasmin，CP)、赖氨酰氧化酶(Lysyloxidase，LOX)、白蛋白(Albumin，ALB)、运铜蛋白(Transcuprein)、胺氧化酶、凝血因子V和VIII、铁氧化酶II、细胞外超氧化物歧化酶以及细胞外金属硫蛋白。铜调节性因子在Zheng等,Role ofcopper inregression ofcardiac hypertrophy,Pharmacol.Ther.
doi:10.1016/j.pharmthera.2014.11.014(2014)中进行了公开，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，铜或铜离子调节HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1中一种或更多种的转录活性，以及由这些转录因子调节的信号传导网络。
在一些实施方案中，在用本文公开的治疗性或预防性组合物进行治疗之后在个体中分析本文公开的由铜调节的一种或更多种因子的水平和/或活性。在一些实施方案中，确定HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1中一种或更多种的水平和/或活性，然后使其与个体针对该治疗性或预防性组合物的响应相关联。在一些实施方案中，如下检测响应：测量正常组织稳态和/或持续缺血性组织损伤的细胞标志物(例如，通过免疫组织化学或者测量DNA和转录本水平)、测量损伤面积或损伤体积，或者评估任何临床上相关的指示物。因此，在某些方面，可以使用一种或更多种铜调节性因子(例如HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1)的水平和/或活性作为个体针对本文所公开治疗或预防方案的响应的终点生物标志。
在一些实施方案中，本文公开的由铜调节的一种或更多种因子可以用于预后测试中以分析和预测针对本文公开的四胺组合物或治疗或预防方法的响应。例如，HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1中一种或更多种的水平和/或活性可以指示个体将对本文公开的治疗或预防性组合物作出阳性响应，可以向该个体施用治疗或预防性组合物的可能性。反之，如果HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1中一种或更多种的水平和/或活性指示个体可能不对治疗或预防性组合物作出响应或者对其作出阴性响应，则可以开处方替代的治疗过程。阴性响应可以定义为不存在有效响应或者存在毒性副作用。可以在其中对以下任意群体中的对象进行基因分型的背景研究中预测针对治疗性或预防性治疗的响应：对治疗方案作出有利响应的群体、对治疗方案无显著响应的群体和对治疗方案具有不良响应(例如表现出一种或更多种副作用)的群体。这些群体作为实例提供，并且可以对另一些群体和亚群进行分析。基于这些分析的结果，对个体进行基因分型以预测其是否将对治疗方案作出有利响应、对治疗方案无显著响应或者对治疗方案具有不良响应。因此，在一些实施方案中，HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1中一种或更多种的水平和/或活性可以用作个体针对本文公开的治疗或预防方案的响应指示。可以在施用治疗或预防方案之前、期间和/或之后对响应指示物进行评估。例如，可以在连续施用的数个剂量之间的间隔期间对一种或更多种响应指示物进行评估以评价个体是否可从连续治疗受益或者需要替代治疗。
上述预后测试还适用于临床试验。可以使用本文所述的方法来鉴定一种或更多种响应指示物(例如，HIF-1、SP1、MT、Atox 1、CCS和COMMD1)。此后，可以对包含可螯合铜的四胺之四胺组合物和任选地包含铜离子之促铜组合物的临床试验中的潜在参与者进行筛选以鉴定最可能对四胺组合物作出有利响应的那些个体并排除可能经历副作用的那些个体。以此方式，可以在对四胺组合物作出阳性响应的个体中测量治疗的有效性，而不会由于研究中包括不可能作出阳性响应的个体而降低测量结果并且不会承受不期望安全性问题的风险。
在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导组织修复而不提高注射部位的VEGF表达的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，提供了在个体中诱导血管朝向缺血性损伤部位生长的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，提供了在个体中诱导血管朝向缺血性损伤部位生长而不提高注射部位的VEGF表达的方法，其包含向个体施用有效量包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，预先向个体施用可以提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可以提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg、或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
组织内血管的形成和生长可以通过血管生成和/或血管发生来进行。在一些实施方案中，血管包括毛细血管样结构，其是全功能的以支持血液的运输。在一些实施方案中，血管生成包括涉及从之前已有的血管生成新血管的过程：出芽式血管生成(sprouting
angiogenesis)(通过使已有的血管出芽来形成新血管)或分裂式血管生成(splitting
angiogenesis)(套叠)(通过使已有的血管分裂来形成新血管)。在一些实施方案中，血管发生包括涉及通过使内皮干细胞增殖来从头产生新血管的过程，例如在不存在之前已有的血管时形成新血管。
在一些实施方案中，血管形成和生长需要来自直接控制该过程的生长因子及其他蛋白质的信号，所述生长因子及其他蛋白质例如血管生成素(如Ang-1和Ang-2)、蝶素(Eph)、血管内皮生长因子(如VEGF-A和VEGF-C)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(如FGF-1和FGF-2)、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、白介素(IL)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)(也称为CCL-2)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、转化生长因子-β(如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和TGF-β4)、内皮抑素、血管抑制蛋白、趋化因子、凝血细胞反应素(thrombospondin)、血管抑素(angiostatin)、血管细胞黏附分子(如VCAM-1)、基质金属蛋白酶(如MMP-2和MPP-9)、整合素、钙黏附蛋白、纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂。
在一些实施方案中，通过测量内皮细胞增殖来测定血管生长，内皮细胞增殖是完整动物中生成毛细血管所需要的。在一些实施方案中，可以通过直接细胞计数、DNA合成和/或代谢活性来评估施用包含可螯合铜的四胺的四胺组合物对内皮细胞增殖的作用。例如，可以在用包含可螯合铜的四胺的四胺组合物治疗之后从缺血性损伤部位分离内皮细胞并测定其增殖速率。在另一些实施方案中，可以通过标记细胞并原位测量细胞计数、DNA合成和/或代谢活性来监测缺血性损伤部位的内皮细胞增殖。在另一些实施方案中，可以向个体施用经标记的内皮细胞，并且可以原位监测经标记内皮细胞在缺血性损伤部位的增殖。在一些实施方案中，用放射性同位素、荧光部分或可以通过例如抗体特异性检测的标志物来标记内皮细胞。在一些具体实施方案中，用[3H]胸苷或溴脱氧尿苷(BrdU)标记细胞。
在一些实施方案中，通过测量内皮细胞的迁移来测定血管生长，内皮细胞降解基底膜并沿由促血管生成生长因子建立的化学梯度迁移，例如在出芽式血管生成期间。在某些实施方案中，对缺血性损伤部位的内皮细胞进行标记并体内监测细胞迁移。在另一些方面，向对象施用经标记的内皮细胞，并体内监测其朝向缺血性损伤部位的迁移。在另一些方面，可以分离缺血性损伤部位的内皮细胞并且可以通过多种体外测定来测定其迁移特性，所述体外测定包括Boyden室测定、琼脂糖不足测定(under-agarose assay)、伤口愈合测定、Teflon栅栏测定(Teflon fence assay)、噬动轨迹测定(phagokinetic track assay)以及类似测定。
在一些实施方案中，通过测量形成具有引导血流的腔的管(即，管发生)的内皮细胞来测定血管生长。在一些实施方案中，通过主动脉环测定来测定血管生长。用于测定血管生长的主动脉环测定公开于Li等,“Copperpromotion ofangiogenesis in isolatedrataortic ring:role ofvascular endothelial growth factor,”Journal ofNutritionalBiochemistry 25(2014)44-49中，其公开内容通过引用以其整体并入本文。来自主动脉环的出芽微血管以模拟完整动物中血管生成的顺序序列与驻留巨噬细胞、周细胞和成纤维细胞密切相互作用。在一些实施方案中，内皮细胞尚未通过传代进行预先选择，并且因此处于与完整动物类似的静息状态。结合血管生成功能(例如基质降解、迁移、增殖、管形成)的其他血管生成测定包括胚状体测定、小鼠跖骨测定以及类似测定。
在一些实施方案中，使用体内测定来测量施用包含可螯合铜的四胺的四胺组合物后的血管生长。这些测定包括但不限于角膜血管生成测定、鸡尿囊绒膜测定和基质胶栓测定(Matrigel plug assay)。例如，角膜是机体中唯一既无血管又透明的组织，使得其理想地用于观察血管生成。在一些实施方案中，可以将包含促血管生成分子(例如本文公开的包含可螯合铜的四胺的四胺组合物)的颗粒或海绵植入到通过外科手术产生的间质口袋(stromalpocket)中。可以每日监测新血管从外周角膜缘血管系统的向内生长，从而允许确定血管生成的速率。在基质胶栓测定中，将包含本文公开的四胺组合物(具有或不具有铜离子)的基质胶植入在个体中的缺血性损伤部位处或其附近，并稍后移出基质胶栓以使血管可视化。在一些实施方案中，用一种或更多种标志物来标记内皮细胞，并例如使用合适的成像技术在体内测定其在缺血性损伤部位的增殖、迁移、管发生、血管形成和/或血管生长。
联合治疗
上述四胺组合物以及任选地与促铜组合物组合可用作单一药剂或作为与干细胞或干细胞诱导物的联合治疗的一部分，以诱导缺血组织的修复。在一些实施方案中，提供了在具有缺血性组织损伤的个体中诱导组织修复(或改善组织功能)的方法，其包括：a)向个体施用有效量的包含可螯合铜的四胺的四胺组合物；以及b)向个体施用有效量的干细胞(例如间充质干细胞(MSC)，如骨髓间充质干细胞(BMSC))或干细胞诱导物。在一些实施方案中，所述方法包含向个体施用有效量的干细胞(例如MSC，如BMSC)。在一些实施方案中，所述方法包含向个体施用有效量的干细胞诱导物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，所述方法还包含向个体施用可提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，向个体预先施用可提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg，或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，本文公开的干细胞是间充质干细胞(MSC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、多能干细胞、诱导性多潜能干细胞(iPS)或组织衍生干细胞。在一些实施方案中，组织衍生干细胞是脂肪组织衍生干细胞、心脏组织衍生干细胞或脐带组织衍生干细胞。在一些实施方案中，干细胞是成体干细胞的诱导物。在一些实施方案中，成体干细胞是造血干细胞，乳腺干细胞，肠干细胞，胎盘、脂肪组织、肺、骨髓、血液、脐带的沃顿胶质或牙(例如牙髓和牙周韧带的血管周围生态位)中的间充质干细胞，内皮干细胞，神经干细胞，嗅成体干细胞，神经嵴干细胞，或种系干细胞(例如，睾丸中的干细胞)。
在一些实施方案中，本文公开的干细胞诱导物是间充质干细胞(MSC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、多能干细胞、诱导性多潜能干细胞(iPS)或组织衍生干细胞如脂肪组织衍生干细胞、心脏组织衍生干细胞或脐带组织衍生干细胞的诱导物。在一些实施方案中，干细胞诱导物是成体干细胞的诱导物，成体干细胞为例如造血干细胞，乳腺干细胞，肠干细胞，胎盘、脂肪组织、肺、骨髓、血液、脐带的沃顿胶质或牙(例如牙髓和牙周韧带的血管周围生态位)中的间充质干细胞，内皮干细胞，神经干细胞，嗅成体干细胞，神经嵴干细胞，或种系干细胞(例如，睾丸中的干细胞)。
在一些实施方案中，干细胞或干细胞诱导物全身施用。在一些实施方案中，干细胞或干细胞诱导物局部施用至缺血组织。在一些实施方案中，干细胞或干细胞诱导物局部施用于缺血性损伤部位以外的部位。
在一些实施方案中，干细胞(或干细胞诱导物)、四胺组合物(具有或不具有铜离子)和任选的促铜组合物同时施用。在一些实施方案中，本文公开的干细胞(或干细胞诱导物)和四胺组合物(具有或不具有铜离子)和任选的促铜组合物以任何合适的顺序依次施用。
一旦向哺乳动物(例如人)施用了本文所述的干细胞(或干细胞诱导物)、四胺组合物(具有或不具有铜离子)和任选的促铜组合物，在一些实施方案中通过许多已知方法中的任一种来监测细胞的存在和/或生物学活性。在一些实施方案中，细胞在体内从个体的缺血组织迁移，并且监测和/或调节到达组织损伤部位的途中细胞的存在和/或生物学活性。
尽管本文描述的方法通常可应用于组织修复的所有方面，但应理解，联合治疗方法可用于以以下任意一个或更多个目的：诱导骨髓间充质干细胞的迁移到缺血组织，在缺血组织中诱导干细胞分化，在缺血组织中诱导组织再生，诱导触发组织再生的信号分子，促进铜依赖性HIF-1转录活性，逆转缺血性损伤部位的损伤，在缺血性损伤部位重建神经原纤维细胞和神经分泌细胞的微环境。
预防方法和预防用途
本文还提供了预防个体中的缺血性组织损伤的方法，其包含向个体施用有效量的包含可螯合铜的四胺的四胺组合物。在一些实施方案中，缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血骨骼肌组织(例如缺血肢体组织)。在一些实施方案中，缺血组织是缺血心脏组织。在一些实施方案中，缺血组织是缺血脑组织。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物还包含铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子，并且其中结晶络合物还包含两个氯离子和水分子。在一些实施方案中，四胺组合物中的铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，所述方法还包含向个体施用可提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，向个体预先施用可提高个体的细胞外铜水平的促铜组合物。在一些实施方案中，促铜组合物是铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子。在一些实施方案中，促铜组合物可提高铜吸收、降低铜排泄和/或降低锌毒性。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg，或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。
在一些实施方案中，提供了预防个体中的缺血性心力衰竭的方法，其包含向个体施用有效量的包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的四胺组合物。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量不足以降低个体中的细胞外铜水平。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg(例如约80mg至约300mg，或约150mg至约350mg)。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用两次。在一些实施方案中，四胺组合物施用至少约1个月(例如至少约3个月或至少约6个月)。在一些实施方案中，个体在基线时具有不超过约35％的左心室射血功能(LVEF)。在一些实施方案中，个体患有II类或III类心力衰竭(基于纽约心脏协会(New YorkHeart Association)或NYHA功能分类)。在一些实施方案中，个体具有至少约150pg/mL的血浆B型利钠肽(BNP)。在一些实施方案中，个体具有不小于约600pg/mL的NT-proBNP(N端前BNP)。
如本文所用，“预防”包括在可能倾向于疾病但尚未诊断出所述疾病的个体中提供关于疾病的发生或复发的预防。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或减缓疾病(例如组织损伤)的发展。
为了预防或治疗疾病，合适的剂量或施用途径取决于待治疗疾病的类型，疾病的严重程度和病程，是否施用细胞用于预防或治疗目的，先前的治疗，个体的临床病史和对四胺组合物和/或细胞的响应，以及主治医生的判断。在一些实施方案中，四胺组合物、促铜组合物、干细胞和干细胞诱导物一次或在一系列治疗中向个体适当地施用。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗和预防缺血性组织损伤的组合物和方法。在一些实施方案中，在将或可能将在个体中造成组织损伤的治疗之前、期间或之后施用本文公开的四胺组合物、促铜组合物和/或细胞，并且施用预防或降低与治疗(例如癌症放射治疗或化学治疗)相关的缺血性组织损伤。
在一些实施方案中，本文公开的四胺组合物或方法通过诱导干细胞向组织迁移(例如，归巢)来预防缺血性组织损伤或降低缺血性组织损伤的面积、体积或持续时间，甚至在个体的组织已经丧失了自发募集干细胞的固有能力之后。在一些实施方案中，本公开内容的四胺组合物和/或细胞的施用引发一系列其他事件，导致增强了对缺血性组织损伤的抗性，包括例如在组织部位诱导干细胞分化，在组织部位诱导组织再生，诱导触发组织再生的信号分子，促进铜依赖性HIF-1转录活性，在产生额外损伤之前在初始缺血性损伤部位逆转损伤，和/或在缺血部位重建神经原纤维细胞和神经分泌细胞的微环境。
例如，心肌缺血或梗死可能导致功能性心脏组织的不可逆损失，并可能降低泵功能和死亡。冠状血管的闭塞导致依赖性毛细血管系统的血液供应中断。没有营养和氧气，心肌细胞死亡并发生坏死。随着炎性细胞的侵袭和细胞碎片的吞噬，发生周围组织的炎症。发生纤维化瘢痕，受影响的心脏区域失去收缩力。在没有干预的情况下，心肌补偿组织损失的唯一方法是剩余心肌细胞的肥大(细胞内细胞蛋白质和可收缩元素的积累)。内分泌、代谢(醇)或感染(病毒性心肌炎)剂和癌症治疗剂也导致细胞死亡，从而导致心肌功能下降。在一些实施方案中，本文公开的四胺组合物或方法预防缺血性心脏组织损伤或降低缺血性心脏组织损伤的面积、体积或持续时间。在一些实施方案中，本文公开的四胺组合物诱导间充质干细胞(例如，BMSC)向缺血心脏组织的迁移(例如归巢)和/或滞留。在一些实施方案中，在心肌缺血或梗死的情况下，心肌可以通过将干细胞分化成心肌细胞来补偿组织损失，由此避免或减少心脏肥大和进一步的心脏组织损伤。
四胺组合物
本文还提供了包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的四胺组合物(包括药物组合物)，其用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平，将铜递送至细胞，诱导至少一个(例如至少2、3、4、5、6、7个或更多个中的任一个)组织修复事件，诱导干细胞迁移或促进铜依赖性HIF-1转录活性。任选地与促铜组合物和/或干细胞(或干细胞诱导物)组合的任何四胺组合物都可用于上述方法中。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺或其可药用盐的四胺组合物。本文考虑的可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)包括但不限于可螯合铜的四胺化合物本身、其可药用盐、其活性代谢物、其前药和其衍生物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀的类似物，如“铜和可螯合铜的四胺”部分中所述的式(II)的四胺。在一些实施方案中，四胺组合物不包含微量元素，例如铜。在一些实施方案中，组合物可与血液中的铜离子螯合并将铜离子递送至缺血组织的细胞中。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的混合物的四胺组合物。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的混合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的相对比(摩尔比)为约100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50或1:100中的任一个。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的相对摩尔比为约1:1。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的相对比(摩尔比)为约50:1-100:1、20:1-50:1、10:1-20:1、5:1-10:1、4:1-5:1、3:1-4:1、2:1-3:1、1:1-2:1、1:2-1:1、1:3-1:2、1:4-1:3、1:5-1:4、1:10-1:5、1:20-1:10、1:50-1:20、1:100-1:50、1:100-1:10、1:10-1:1、1:1-10:1、10:1-100:1、或1:10-10:1中的任一个。在一些实施方案中，至少一部分铜离子与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，铜离子未与可螯合铜的四胺络合。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的络合物的四胺组合物。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的络合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的化学计量比为约1:1。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的络合物是结晶的。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的结晶络合物是热力学多晶型物。结晶络合物的不同热力学多晶型物可以通过特定组的几何结构、晶胞尺寸、空间群和结构坐标来描述，这可以使用本领域已知的技术如X射线晶体学来确定。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，四胺组合物包含如下所示的式(I)的结晶络合物，
其中Cu是铜离子，虚线表示氢键。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中结晶络合物具有如图1所示的晶体结构。在一些实施方案中，晶体结构具有如图2所列的键长、键角和扭转角。在一些实施方案中，结晶络合物包含具有如图3中所列的空间群和参数的晶体。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中结晶络合物的晶体结构由图4A-4C中列出的原子坐标限定。
在一些实施方案中，四胺组合物包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的络合物，其中所述络合物不是结晶的。在一些实施方案中，四胺组合物还包含未与可螯合铜的四胺络合的铜离子。在一些实施方案中，未与可螯合铜的四胺络合的铜离子与络合物的相对比(摩尔比)为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50或1:100中的任一个。在一些实施方案中，未与可螯合铜的四胺络合的铜离子与络合物的相对比(摩尔比)为约1:2-1:1、1:3-1:2、1:4-1:3、1:5-1:4、1:10-1:5、1:20-1:10、1:50-1:20、1:100-1:50、1:100-1:10、或1:10-1:1中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中与可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)络合的总铜的百分比为约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中与可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)络合的总铜的百分比为约1％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1％-10％、10％-50％、50％-80％或80％-100％中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中与铜离子络合的总可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的百分比为至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中与铜离子络合的总可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的百分比为约1％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、1％-10％、10％-50％、50％-80％或80％-100％中的任一个。在一些实施方案中，未与可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)络合的铜离子以盐的形式存在，例如硫酸铜、氯化铜、氧化铜、硝酸铜、乙酸铜、甲酸铜、葡萄糖酸铜、铜氨基酸螯合物等。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的四胺组合物，其中铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，四胺组合物包含曲恩汀和铜离子，其中铜离子未与曲恩汀络合。在一些实施方案中，铜离子以盐存在，例如硫酸铜、氯化铜、氧化铜、葡萄糖酸铜、铜氨基酸螯合物等。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的相对比(摩尔比)为约100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:20、1:50或1:100中的任一个。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的相对比率(摩尔)为约50:1-100:1、20:1-50:1、10:1-20:1、5:1-10:1、4:1-5:1、3:1-4:1、2:1-3:1、1:1-2:1、1:2-1:1、1:3-1:2、1:4-1:3、1:5-1:4、1:10-1:5、1:20-1:10、1:50-1:20、1:100-1:50、1:100-1:10、1:10-1:1、1:1-10:1、10:1-100:1或1:10-10:1中的任一个。
四胺组合物的许多因素，包括但不限于可螯合铜的四胺的化学结构、四胺组合物中可螯合铜的四胺与铜的比例、铜离子与可螯合铜的四胺的相互作用(例如是否为络合物，络合物是否为结晶等)可影响四胺组合物在缺血组织中的细胞内递送(例如卸载)铜的能力。例如，可螯合铜的四胺可具有促进铜离子的可逆结合的构象(包括螯合齿合度、供体结合基团和腔尺寸)。在一些实施方案中，四胺组合物包含可螯合铜的四胺，所述可螯合铜的四胺在缺血组织的细胞内对铜离子具有足够低的亲和力，其中四胺组合物在细胞内解离和卸载铜离子。在一些实施方案中，四胺组合物包含增强在缺血组织的细胞内卸载铜离子的另外的化合物和/或试剂。
还提供了用于本文所述方法的药物组合物，其包含本文所述的任何四胺组合物和一种或更多种本领域已知的可药用载体、赋形剂、稳定剂、稀释剂和/或其他试剂。
因此，在本申请的一个方面中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含曲恩汀与铜离子的药物组合物。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的络合物的药物组合物。在一些实施方案中，提供了包含曲恩汀与铜离子的络合物的药物组合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的络合物是结晶的。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的结晶络合物是热力学多晶型物。在一些实施方案中，药物组合物包含曲恩汀与铜离子的结晶络合物，其中铜离子被曲恩汀的四个胺基团螯合而采用方形平面几何结构，并且其中所述结晶络合物还包含两个氯离子和一个水分子。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)与铜离子的络合物不是结晶的。
在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的药物组合物，其中至少一部分(例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个)铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，提供了包含曲恩汀与铜离子的药物组合物，其中至少一部分(例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个)铜离子未与曲恩汀络合。在一些实施方案中，提供了包含可螯合铜的四胺与铜离子的药物组合物，其中铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，提供了包含曲恩汀与铜离子的药物组合物，其中铜离子未与可螯合铜的四胺络合。在一些实施方案中，未与可螯合铜的四胺络合的铜离子作为盐存在，例如硫酸铜、氯化铜、氧化铜、硝酸铜、乙酸铜、甲酸铜、葡萄糖酸铜、铜氨基酸螯合物等。
本文所述的任何药物组合物可用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平，诱导至少两个(例如至少2、3、4、5、6、7或更多个中的任一个)组织修复事件，促进铜依赖性HIF-1转录活性和/或治疗(包括预防)与缺血性组织损伤相关的任何疾病或病症。
本文所述的药物组合物可以根据本领域已知用于制备各种剂型的常规方法配制成合适的药物溶剂或载体中的溶液剂、乳剂、混悬剂、分散剂或包合络合物(inclusioncomplex)(例如环糊精)，或者与固体载体一起配制成丸剂、片剂、锭剂、栓剂、小药囊、糖锭剂、颗粒剂、粉剂、重构用粉剂或胶囊剂。实施方案的药物组合物可以通过合适的递送途径施用，例如经口、肠胃外、直肠、鼻、表面或眼途径，或通过吸入。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于经口施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于胃肠外施用(parental administration)(例如静脉内施用)。
对于经口施用，药物组合物可以以固体形式如片剂或胶囊剂，或以溶液剂、乳剂或混悬剂提供。在一些实施方案中，药物组合物被配制成片剂、胶囊剂或丸剂。经口片剂可包含与相容的可药用赋形剂如稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂混合的活性成分。合适的惰性填料包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。示例性的液体经口赋形剂包括乙醇、甘油、水等。淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟基乙酸淀粉钠、微晶纤维素和海藻酸是示例性崩解剂。结合剂可包括淀粉和明胶。如果存在的话，润滑剂可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，片剂可以涂覆有诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料以延迟在胃肠道中的吸收，或者可涂覆有肠溶衣。经口制剂可以以离散单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性成分；作为粉剂或颗粒剂；作为水性液体或非水性液体中的溶液剂或悬浮剂；或者作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分也可以以大丸剂(bolus)、药糖剂或糊剂呈现。
片剂可通过压制或模制来制备，任选地具有一种或更多种辅助成分。压制片剂可通过在合适的机器中压制自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒来制备，所述活性成分任选地与粘合剂(例如，聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。片剂可以任选地包衣或刻痕，并且可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素来配制以提供其中活性成分的缓慢或受控释放，以提供期望的释放特征。
用于经口施用的胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊。为了制备硬明胶胶囊，可将活性成分与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊可通过将活性成分与水、诸如花生油或橄榄油的油、液体石蜡、短链脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物、聚乙二醇400或丙二醇混合来制备。胶囊还可包含明胶、氧化铁、硬脂酸和二氧化钛作为非活性成分。
用于经口施用的液体可以是混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂的形式，或者可以冻干或作为干燥产品提供，用于在使用前用水或其他合适的载体重建。这样的液体组合物可以任选地包含：可药用赋形剂，例如助悬剂(例如山梨糖醇、甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶等)；非水性载体，例如油(例如杏仁油或分馏的椰子油)、丙二醇、乙醇或水；防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；润湿剂，例如卵磷脂；以及如果需要时的调味剂或着色剂。
对于肠胃外使用，包括静脉内、肌内、腹膜内、鼻内或皮下途径，四胺组合物可以在缓冲至适当pH和等渗性的无菌水溶液或悬浮液中提供，或者在胃肠外可接受的油中提供。合适的水性载体包括林格液和等渗氯化钠。这样的形式可以以单位剂型如安瓿或一次性注射装置，多剂型如可以从中抽取适当剂量的小瓶，或可用于制备可注射制剂的固体形式或预浓缩物存在。适合于肠胃外(包括静脉内)施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液剂，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在临时用前添加无菌液体载体如注射用水。即时注射溶液剂和混悬剂可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
剂量和施用方法
当在体内用于本文所述的任何一种治疗方法时，将四胺组合物(包括药物组合物)和任选的促铜组合物和/或干细胞(或干细胞诱导物)以有效量向个体施用。“有效量”至少是实现与缺血性组织损伤有关的疾病或病症的可测量的改善或预防所需的最小浓度。本文中的有效量可以根据诸如以下的因素而变化：个体中缺血损伤的程度，所使用的特定四胺组合物、铜离子和/或干细胞(或干细胞诱导物)的特征(例如其治疗指数)，个体(例如年龄、性别、体重和病史)。有效量还是治疗有益作用超过治疗的任何毒性或有害作用的量。对于预防用途，有益的或期望的结果包括诸如以下的结果：对于疾病或病症，包括疾病或病症的生物化学、组织学和/或行为症状，并发症以及疾病或病症发展过程中出现的中间病理表型，消除或降低其风险，减轻其严重程度或延迟其发作。对于治疗用途，有益的或期望的结果包括诸如以下的临床结果：减轻由疾病或病症引起的一种或更多种症状，改善患有该疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，增强另一种药物的作用，例如通过靶向、延迟疾病的进展和/或延长生存。
在一些实施方案中，与治疗前个体的缺血组织的细胞内铜水平相比，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时有效地导致个体的缺血组织的细胞内铜水平提高超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高中的任一个。在一些实施方案中，与治疗前个体中缺血组织的总铜水平相比，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时有效地导致个体中缺血组织的总铜水平提高超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更高中的任一个。在一些实施方案中，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时不降低个体中的细胞外铜水平(例如血液中的铜水平)。在一些实施方案中，与治疗前个体的细胞外铜水平相比，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时不使个体中的细胞外铜水平(例如血液中的铜水平)降低超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多中的任一个。在一些实施方案中，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时不降低个体中的总铜水平。在一些实施方案中，与治疗前个体中的总铜水平相比，有效量的四胺组合物(例如药物组合物)以及任选地与有效量的促铜组合物组合时不使个体中的总铜水平(例如血液中的铜水平)降低超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多中的任一个。
有效量可以在一个或更多个施用中施用。如在临床背景中理解的，与另一种药物、化合物或药物组合物结合时，可以实现或不实现药物、化合物或药物组合物的有效量。因此，在施用一种或更多种治疗剂的情况下可以考虑“有效量”，并且如果与一种或更多种其他药剂结合时可以实现或实现了期望结果，则可以认为单一药剂是以有效量给予。
单独地或者与促铜组合物(例如铜离子)和/或干细胞(或干细胞诱导物)组合的四胺组合物的有效量、剂量和给药方案可以在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医生熟悉的方法确定。在一些实施方案中，四胺组合物中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的有效量小于约0.5mg、5mg、10mg、25mg、50mg、80mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg或1200mg中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的有效量为约0.5mg至约5mg、约5mg至约10mg、约10mg至约25mg、约25mg至约50mg、约50mg至约75mg、约75mg至约100mg、约100mg至约125mg、约125mg至约150mg、约150mg至约175mg、约175mg至约200mg、约200mg至约225mg、约225mg至约250mg、约250mg至约275mg、约275mg至约300mg、约300mg至约350mg、约350mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约600mg、约600mg至约1200mg、约1200mg至约2400mg、约0.5mg至约50mg、约50mg至约100mg、约10mg至约125mg、约80mg至约200mg、约150mg至约300mg、约200mg至约300mg、约300mg至约600mg、约0.5mg至约200mg、约80mg至约300mg、或约80mg至约400mg、或约80mg至约450mg中的任一个。在一些实施方案中，对于人患者，四胺组合物的有效量为每天约80mg至约450mg可螯合铜的四胺(例如以二氯化物盐的形式)。
在一些实施方案中，四胺组合物(例如药物组合物)中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的有效量包括至少约1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或20mg/kg中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物(例如药物组合物)中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的有效量包括小于约35mg/kg、30mg/kg、25mg/kg、20mg/kg、18mg/kg、15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物中可螯合铜的四胺的有效量为每天约1mg/kg至约10mg/kg、约10mg/kg至约15mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约20mg/kg至约25mg/kg、约25mg/kg至约30mg/kg、约30mg/kg至约40mg/kg、约1mg/kg至约100mg/kg、约10mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约50mg/kg、约15mg/kg至约40mg/kg、或约20mg/kg至约35mg/kg中的任一个。在一些实施方案中，对于恒河猴，四胺组合物的有效量不大于每天约20mg/kg，例如每天约18mg/kg。在一些实施方案中，对于小鼠，四胺组合物的有效量不大于每天约15mg/kg至约35mg/kg。
在一些实施方案中，药物组合物(例如，单位剂型)中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的有效量为约5mg至约300mg，例如约80mg至约150mg、约80mg至约200mg、约200mg至约300mg或约80mg至约300mg。在一些实施方案中，药物组合物中可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)的浓度是稀释的(约0.1mg/ml)或浓缩的(约100mg/ml)，包括例如约0.1至约50mg/ml，约0.1至约20mg/ml或约1至约10mg/ml中的任一个。
示例性的给药频率包括但不限于每天四次、每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次或每周一次中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物(例如药物组合物)以每周至少约1x、2x、3x、4x、5x、6x或7x(即，每日)中的任一个来施用。在一些实施方案中，每次施用之间的间隔小于约7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、12小时、6小时、4小时或3小时中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用至少两次。在一些实施方案中，四胺组合物每天施用至少一次，包括例如至少2x、3x或4x中任一个。
在一些实施方案中，四胺组合物的有效量与给药频率的组合足以维持个体(例如血液或缺血组织)中高浓度的四胺(例如曲恩汀)。在一些实施方案中，高浓度的四胺是促进铜依赖性HIF-1转录活性或诱导至少一个(包括至少2、3、4、5、6、7或更多个)组织修复事件的浓度。在一些实施方案中，四胺组合物(例如药物组合物)的施用导致血液中至少约0.005mg/L(包括例如，至少约0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/mL、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5.0mg/L中的任一个)的可螯合铜的四胺。可以使用本领域已知的方法如荧光光谱法、质谱法或色谱法或者通过测量标记的四胺的水平来确定生物样品(例如血液或缺血组织的活检)中四胺的浓度。
在一些实施方案中，四胺组合物的有效量与给药频率的组合足以在个体中维持高浓度的四胺(例如曲恩汀)至少约4、5、6、7、8、9、10或更多小时中的任一个。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量与给药频率的组合足以在个体中维持高浓度的四胺(例如曲恩汀)至少约8小时。
在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为约至少1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、12mg/kg/天、15mg/kg/天、18mg/kg/天、20mg/kg/天、30mg/kg/天、40mg/kg/天、50mg/kg/天或更多中的任一个的四胺组合物中的曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为不大于1mg/kg/天、2mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、12mg/kg/天、15mg/kg/天、18mg/kg/天、30mg/kg/天、40mg/kg/天或50mg/kg/天中的任一个的四胺组合物中的曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为约1mg/kg/天至约2mg/kg/天、约2mg/kg/天至约5mg/kg/天、约5mg/kg/天至约10mg/kg/天、约10mg/kg/天至约15mg/kg/天、约15mg/kg/天至约20mg/kg/天、约20mg/kg/天至约30mg/kg/天、约30mg/kg/天至约50mg/kg/天、约1mg/kg/天至约5mg/kg/天、约5mg/kg/天至约15mg/kg/天、约1mg/kg/天至约10mg/kg/天、或约1mg/kg/天至约18mg/kg/天中的任一个的四胺组合物中的曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物中有效量为约18mg/kg/天的四胺组合物中的曲恩汀。在一些实施方案中，四胺组合物的有效量为约1mg/kg/天至约10mg/kg/天的四胺组合物中的曲恩汀。
四胺组合物(例如药物组合物)的施用可在延长一段时间，例如从约一周到约几年中的任一个。在一些实施方案中，施用四胺组合物(例如药物组合物)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36、48、60、72或84个月或更久中的任一个的时间。在一些实施方案中，施用四胺组合物(例如药物组合物)至少约一个月，包括例如1、2、3、4、5、6、8、10、12或更多个月中的任一个。在一些实施方案中，施用四胺组合物(例如药物组合物)至少约一个月，并且其中每天施用四胺组合物至少一次(例如两次、三次或四次)。在一些实施方案中，四胺组合物(包括药物组合物)的施用导致至少约1周中(包括例如，至少约2周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、12个月或更久中的任一个)血液中的可螯合铜的四胺为至少约0.005mg/L(包括例如，至少约0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/mL、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L或5.0mg/L中的任一个)。
本文所述的任何四胺组合物(例如药物组合物)可以通过多种途径向个体(例如人)施用，所述途径包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肺内、经口、吸入、囊内、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、经粘膜、经皮、肿瘤内、直接注射到血管壁、颅内或腔内。在一些实施方案中，可以使用四胺组合物(例如药物组合物)的持续连续释放制剂。在一些实施方案中，四胺组合物胃肠外施用。在一些实施方案中，四胺组合物经口施用。在一些实施方案中，将四胺组合物直接施用至缺血组织(例如使用下述直接递送方法)。在一些实施方案中，四胺组合物通过干预方法如血管成形术施用。
在一些实施方案中，四胺组合物(例如药物组合物)可与第二治疗化合物和/或第二治疗一起施用。四胺组合物(例如药物组合物)和第二化合物的剂量和给药频率可根据给药医生的判断在治疗过程中进行调整。在一些实施方案中，第一治疗和第二治疗同时施用、依次施用或并行施用。如本文所用，“同时施用(simultaneous administration)”可以指联合治疗中的第一治疗和第二治疗以不超过约15分钟，例如不超过约10、5或1分钟中的任一个的时间间隔施用。当第一治疗和第二治疗同时施用时，第一治疗和第二治疗可包含在相同的组合物(例如包含第一治疗和第二治疗两者的组合物)中或者分开的组合物(例如，一种组合物中的第一治疗，并且第二治疗包含在另一组合物中)。“依次施用(Sequentialadministration)”可以指联合治疗中的第一治疗和第二治疗以大于约15分钟，例如大于约20、30、40、50、60或更多分钟中的任一个的时间间隔施用。第一治疗或第二治疗可以先施用。第一治疗和第二治疗包含在分开的组合物中，所述组合物可包含在相同或不同的包装或药盒中。并行施用(Concurrent administration)可以指联合治疗中的第一治疗的施用和第二治疗的施用彼此重叠。当分开施用时，药物组合物和第二化合物可以以不同的给药频率或间隔施用。例如，四胺组合物(例如药物组合物)可以每天施用，而第二化合物可以以更多或更少的频繁施用。在一些实施方案中，可以使用四胺组合物和/或第二化合物的持续连续释放制剂。用于实现持续释放的多种制剂和装置是本领域已知的。可以使用本文所述的施用配置的组合。在一些实施方案中，第二化合物是铜离子(例如铜盐或螯合铜)。在一些实施方案中，第二治疗包含干细胞或干细胞诱导物。
在一些实施方案中，还向个体施用有效量的包含铜离子的促铜组合物。在一些实施方案中，与治疗前个体的细胞外铜水平相比，向个体施用的促铜组合物的有效量足以使个体的细胞外铜水平提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更多中的任一个。在一些实施方案中，与治疗前个体的缺血组织的总铜水平相比，向个体施用的促铜组合物的有效量足以使个体的缺血组织的总铜水平提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或中的任一个。
在一些实施方案中，与治疗前个体的细胞外铜水平相比，向个体施用的促铜组合物的有效量足以使个体的细胞外铜水平提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或中的任一个。在一些实施方案中，与治疗前个体的缺血组织的总铜水平相比，向个体施用的促铜组合物的有效量足以使个体的缺血组织的总铜水平提高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或中的任一个。在一些实施方案中，可以使用不包含铜离子的促铜组合物来提高胞外铜水平。例如，促铜组合物可提高铜摄取、降低铜排泄和/或降低锌毒性。
在一些实施方案中，包含铜离子的促铜组合物中的铜离子的有效量包括在以下任何范围内：约0.01mg至约0.1mg、约0.1mg至约0.5mg、约0.5mg至约1mg、约1mg至约2mg、约2mg至约3mg、约3mg至约4mg、约4mg至约5mg、约5mg至约8mg、约8mg至约10mg、约0.01mg至约1mg、或约0.1mg至约2.5mg。在一些实施方案中，向个体施用的促铜组合物中的铜离子的有效量包括至少约5mcg/kg、10mcg/kg、20mcg/kg、30mcg/kg、50mcg/kg、100mcg/kg、200mcg/kg、300mcg/kg、400mcg/kg、500mcg/kg、600mcg/kg、700mcg/kg、800mcg/kg、900mcg/kg或1000mcg/kg中的任一个。在一些实施方案中，向个体施用的促铜组合物中的铜离子的有效量包括小于约1000mcg/kg、900mcg/kg、800mcg/kg、700mcg/kg、600mcg/kg、500mcg/kg、400mcg/kg、300mcg/kg、200mcg/kg、100mcg/kg、50mcg/kg、30mcg/kg、20mcg/kg、10mcg/kg或5mcg/kg中的任一个一个。
在一些实施方案中，促铜组合物每天或每天两次施用。在一些实施方案中，促铜组合物以与四胺组合物相同的给药频率和持续时间施用。在一些实施方案中，促铜组合物以与四胺组合物不同的给药频率和/或持续时间施用。在一些实施方案中，促铜组合物经口施用。促铜组合物的有效量和给药频率可以在临床前试验和临床试验期间通过医生和临床医生熟悉的方法来确定。
一旦发生了患者疾病的改善，就可以调整剂量以用于预防或维持治疗。例如，可以将剂量或施用频率或其两者作为症状的函数降低至维持期望的治疗或预防效果的水平。当然，如果症状已经减轻至适当的水平，则可以停止治疗。但是，对于任何症状的复发，患者可能需要长期的间歇治疗。患者也可能需要长期的长期治疗。
多种直接递送方法是本领域已知的，并且可用于施用四胺组合物(例如药物组合物)和/或促铜组合物。
在一些实施方案中，通过微泡递送四胺组合物和/或促铜组合物。在一些实施方案中，通过包含铜的基于肽的纳米颗粒递送铜离子。在一些实施方案中，通过纳米颗粒(或微球)通过诱导向缺血组织进行释放或递送的物理作用将四胺组合物和/或促铜组合物被动地递送或靶向至缺血组织。
在一些实施方案中，通过将四胺组合物和/或促铜组合物直接施用至缺血组织来递送四胺组合物和/或促铜组合物。在一些实施方案中，将本文公开的四胺组合物和/或促铜组合物经口施用至缺血性组织损伤部位。在一些实施方案中，通过消化道吸收四胺组合物和/或促铜组合物。在一个方面，将吸收的组合物和/或铜离子靶向(通过主动靶向或被动靶向)至缺血性损伤部位，并在缺血性损伤部位局部释放，以提供四胺组合物和/或促铜组合物的有效局部浓度用于组织修复。在一些实施方案中，经口递送的铜离子与蛋白质、肽、氨基酸或单糖、二糖或多糖形成化合物或络合物。在一些实施方案中，铜离子与一种或更多种聚合物形成化合物或络合物。在其他实施方案中，铜离子在有机金属化合物中，例如小分子有机金属化合物中。
在一些实施方案中，本文公开的持续递送组合物包含含有四胺组合物和/或铜组合物的长效可注射剂(例如，基于油的注射剂、可注射混悬剂、可注射微球和可注射原位系统)，用于贮库注射的聚合物，市售贮库注射剂和可注射持续释放递送系统。在某些实施方案中，本文公开的持续递送组合物包含聚合物基质，药剂通过扩散和/或聚合物基质的降解从中释放。因此，药剂的释放模式主要由聚合物基质以及负载百分比和制造方法决定。在一些实施方案中，持续释放制剂使用生物可降解聚合物。在这种情况下，持续释放制剂不需要从对象中手术取出制剂。通常，这样的制剂缓慢降解并被患者身体吸收，并最终与其他可溶性代谢废物一起处置。
在一些实施方案中，聚合物可注射储库系统用于在缺血性损伤部位递送包含四胺组合物和/或铜组合物的原位形成植入物。原位形成植入物系统通常由生物可降解产品制成，其可通过注射器注射到体内，并且一旦注射，就凝固形成固体生物可降解植入物。在一些实施方案中，植入物由热塑性糊剂、原位交联聚合物、原位聚合物沉淀、热诱导胶凝化或原位固化有机凝胶形成。热塑性糊剂的贮库形成机制是在以熔融形式注射到体内后，在冷却至体温后形成半固体。可以以多种方式原位实现交联聚合物网络，形成固体聚合物系统或凝胶。原位交联系统的方法包括自由基反应，通常由热或光子的吸收或小阳离子和聚合物阴离子之间的离子相互作用引发。原位形成可以通过引起聚合物从溶液中沉淀来产生。使不溶于水且生物可降解的聚合物溶解在添加有药物的生物相容性有机溶剂中，混合后形成溶液或悬浮液。当将这种制剂注入体内时，水混溶性有机溶剂消散并且水渗透到有机相中。这导致相分离和聚合物沉淀，在注射部位形成储库。热诱导胶凝化系统显示出热可逆性溶胶/凝胶转变并且具有较低的临界溶解温度。其在室温下是液体，并且在临界溶液下限温度或更高时产生凝胶。原位固化有机凝胶包含不溶于水的两亲脂质，其在水中溶胀并形成多种类型的溶致液晶。
在一些实施方案中，例如通过直接经皮穿刺，通过介入导管或通过椎骨内注射将四胺组合物和/或促铜组合物注射到缺血性损伤部位。在一些实施方案中，通过使用涂覆的植入物、支架或板或者用四胺组合物和/或促铜组合物浸渍的植入物，将四胺组合物和/或促铜组合物直接递送至缺血性损伤部位。在一些实施方案中，通过从附着有四胺组合物和/或促铜组合物的血管内支架缓慢释放四胺组合物和/或促铜组合物将四胺组合物和/或促铜组合物直接递送至缺血性损伤部位。在一些实施方案中，通过阳性靶向脂质体或受体-供体复合物将四胺组合物和/或促铜组合物递送至缺血性损伤部位。在一些实施方案中，使用物理治疗、超声波、离子导入、超声渗透增强、电穿孔和/或海绵应用将四胺组合物和/或促铜组合物递送至缺血性损伤部位。将四胺组合物和/或细胞施用至缺血性损伤部位可以是表面的(例如通过皮肤)，可以是在身体表面内部的受伤组织处的一些位置，或者其两者。例如，可将四胺组合物和/或促铜组合物用穿过血管、内皮细胞层或其他内部组织的离子导入递送至缺血性损伤部位，以提供四胺组合物和/或促铜组合物的有效局部浓度用于组织修复。
在一些实施方案中，本文公开的持续释放组合物包含用于控释递送四胺组合物和/或促铜组合物的生物可降解聚合物。合适的生物可降解聚合物通常包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)、聚ε-己内酯(PCL)、聚葡萄糖酸酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚(二氧杂环己酮)和聚氰基丙烯酸烷基酯。在一些实施方案中，持续释放组合物包含可注射的生物可降解微球，例如PLGA微球、PCL微球、聚酸酐微球、聚原酸酯微球和聚氰基丙烯酸烷基酯微球。
在一些特定实施方案中，可以使用多种类型的含铜化合物将促铜组合物局部递送至缺血性损伤部位。合适的包含铜离子的溶液的实例是氯化铜(I)、氯化铜(II)、乙酸铜和硫酸铜溶液。在一些实施方案中，铜与蛋白质、肽、氨基酸、单糖、二糖或多糖、一种或更多种聚合物或小分子形成化合物或络合物，并且所述化合物或络合物用于在缺血性损伤部位直接局部递送。在一些实施方案中，使用含有铜离子的有机金属化合物在缺血性损伤部位直接局部递送。
在一些实施方案中，用于向损伤部位直接局部递送的促铜组合物中的铜离子浓度为约5μM至约10μM、约10μM至约20μM、约20μM至约40μM、约40μM至约60μM、约60μM至约80μM、约80μM至约100μM、约100μM至约200μM、约200μM至约400μM、约400μM至约600μM、约600μM至约800μM、约800μM至约1mM、约1mM至约5mM、约5mM至约10mM、约10mM至约20mM、约20mM至约40mM、或约40mM至约60mM。铜离子的浓度可以在临床前试验和临床试验中通过医生和临床医生熟悉的方法来确定。
铜和可螯合铜的四胺
术语“铜”、“铜离子”和“铜元素”在本文中可互换使用。在生物系统中，铜离子通常以一价铜(Cu1+、Cu(I)或还原的)状态和二价铜(Cu2+、Cu(II)或氧化的)状态两种氧化态存在。在一些实施方案中，铜包括一价铜状态和二价铜状态两者。在一些实施方案中，铜是二价铜状态(Cu2+)。在一些实施方案中，铜是一价铜状态(Cu1+)。在一些实施方案中，铜是游离离子，即未与另一种分子如蛋白质或小有机分子结合或复合。在一些实施方案中，铜为盐形式。在一些实施方案中，铜以选自硫酸铜、氯化铜、氧化铜、葡萄糖酸铜和氨基酸铜螯合物的盐的形式存在。在一些实施方案中，铜以络离子存在。在一些实施方案中，铜在有机金属化合物中如小分子有机金属化合物中。在一些实施方案中，铜在与可螯合铜的四胺的络合物中。在一些实施方案中，铜是络离子，其包括根据本公开内容将铜引入细胞、组织或生物体而产生的各种离子种类。在一些实施方案中，铜与蛋白质、肽、氨基酸或单糖、二糖或多糖形成化合物或络合物。在生物系统中发现的重要的铜结合蛋白包括但不限于细胞色素c氧化酶(CcO)、铜-锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、多巴胺-β-羟化酶(DBH)、朊病毒蛋白(PrP)、酪氨酸酶、X连锁凋亡蛋白抑制剂(XIAP)、赖氨酰氧化酶、金属硫蛋白(MT)和血浆铜蓝蛋白。在一些实施方案中，铜为不能被缺血组织摄取或使用的形式，例如在与血浆铜蓝蛋白的络合物中。在一些实施方案中，铜为缺血组织可摄取或使用的形式。在一些实施方案中，本文公开的铜是HIF-1转录活性的诱导物。
包含上述任何铜离子种类的促铜组合物可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，促铜组合物包含Cu2+。在一些实施方案中，促铜组合物包含Cu1+。在一些实施方案中，促铜组合物包含盐形式的铜离子(例如选自硫酸铜、氯化铜、氧化铜、葡萄糖酸铜和铜氨基酸螯合物的任一种或组合)。在一些实施方案中，促铜组合物包含有机金属化合物。在一些实施方案中，促铜组合物不包含铜离子或铜化合物。
本文所述的任何方法提到的“铜水平”可以指上述铜物质(例如，Cu2+、Cu1+)中的任一种的浓度，或总铜(例如Cu1+和Cu2+，和/或游离或结合铜)的浓度。在一些实施方案中，铜水平是指二价铜状态的水平。在一些实施方案中，铜水平是指缺血组织可摄取或使用的形式的铜的水平。
“可螯合铜的四胺”是指铜结合或螯合四胺化合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺与Cu2+结合。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺与Cu1+结合。在一些实施方案中，相对于Cu1+，可螯合铜的四胺是Cu2+特异性的(即，具有更高亲和力)。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺以方形平面、扭曲方形平面、三角椎体、方形椎体或扭曲八面体构象与铜离子形成络合物。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺改变细胞或生物体中Cu1+和Cu2+之间的平衡。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可以改变(例如降低)个体中的铜水平(例如总铜水平)。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可以改变(例如降低)个体的血液中的铜水平(例如总铜水平)。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可以提高细胞内铜水平(例如总铜或二价铜水平)。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可提高个体中缺血组织可用形式的铜的浓度。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可以重定向铜的细胞内运输和/或组织间或器官间运输。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺特被缺血组织如缺血心脏组织特异性结合和/或摄取。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(包括其与铜的络合物)可透过膜。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺(包括其与铜的络合物)是脂溶性的。在一些实施方案中，络合物中可螯合铜的四胺与铜的化学计量比为约1:1。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺可逆地结合铜离子。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺在缺血组织的细胞内以足够低的亲和力与铜离子结合，从而允许铜离子的卸载或解离。
可以提高细胞内铜水平的任何可螯合铜的四胺都可用于本文所述的方法中。可螯合铜的四胺可以指化合物本身，其可药用盐、活性代谢物、衍生物和前药，以及适用的立体异构体、对映异构体、外消旋混合物等。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是线性的。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是分支的。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是环状的。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺选自三亚乙基四胺(2,2,2-四胺)、2,3,2-四胺和3,3,3-四胺。
在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是曲恩汀。“曲恩汀”也被称为三亚乙基四胺、2,2,2-四胺、N,N’-双(2-氨基乙基)-1,2-乙二胺、1,8-二氨基-3,6-二氮杂辛烷、3,6-二氮杂辛烷-1,8-二胺、1,4,7,10-四氮杂癸烷、三乙四胺、TETA、TECZA、N,N'-双(氨基乙基)乙二胺、N,N'-双(2-氨基乙基)乙二胺和N,N'-双(2-氨基乙基)-乙二胺。在一些实施方案中，曲恩汀是式NH2(CH2)2NH(CH2)2NH(CH2)2NH2的化合物或其可药用盐。
具有类似铜螯合性质的其他可螯合铜的四胺可包括但不限于式(II)的化合物及其可药用盐：
在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是式(II)的无环化合物，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H，CH3，C2-C10直链或支链烷基，C3-C10环烷基，C1-C6烷基C3-C10环烷基，芳基，单、二、三、四和五取代的芳基，杂芳基，稠合芳基，C1-C6烷基芳基，C1-C6烷基单、二、三、四和五取代的芳基，C1-C5烷基杂芳基、C1-C6烷基稠合芳基、CH2COOH、CH2SO3H、CH2PO(OH)2、CH2P(CH3)O(OH)；n1、n2和n3独立地选择为2或3；并且R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自H，CH3，C2-C10直链或支链烷基，C3-C10环烷基，C1-C6烷基C3-C10环烷基，芳基，单、二、三、四和五取代的芳基，杂芳基，稠合芳基，C1-C6烷基芳基，C1-C6烷基单、二、三、四和五取代的芳基，C1-C5烷基杂芳基、C1-C6烷基稠合芳基。另外、R1、R2、R3、R4、R5或R6中的一个或多个可以官能化以连接例如肽、蛋白质、聚乙二醇和其他这样的化学实体以改变构建体的总体药代动力学、递送能力和/或半衰期。这样的官能化的实例包括但不限于C1-C10烷基-CO-肽、C1-C10烷基-CO-蛋白质、C1-C10烷基-CO-PEG、C1-C10烷基-NH-肽、C1-C10烷基-NH-蛋白质、C1-C10烷基-NH-CO-PEG、C1-C10烷基-S-肽、C1-C10烷基-S-蛋白质。此外、R7、R8、R9、R10、R11或R12中的一个或多个可以官能化以连接例如肽、蛋白质、聚乙二醇和其他这样的化学实体以改变构建体的总体药代动力学、递送能力和/或半衰期。这样的官能化的实例包括但不限于C1-C10烷基-CO-肽、C1-C10烷基-CO-蛋白质、C1-C10烷基-CO-PEG、C1-C10烷基-NH-肽、C1-C10烷基-NH-蛋白质、C1-C10烷基-NH-CO-PEG、C1-C10烷基-S-肽、C1-C10烷基-S-蛋白质。
在一些实施方案中，可螯合铜的四胺是式(II)的环状化合物，其中R1和R6连接在一起形成桥连基团((CR13R14)n4，并且其中R2、R3、R4和R5独立地选自H，CH3，C2-C10直链或支链烷基，C3-C10环烷基，C1-C6烷基C3-C10环烷基，芳基，单、二、三、四和五取代的芳基，杂芳基，稠合芳基，C1-C6烷基芳基，C1-C6烷基单、二、三、四和五取代的芳基，C1-C5烷基杂芳基、C1-C6烷基稠合芳基、CH2COOH、CH2SO3H、CH2PO(OH)2、CH2P(CH3)O(OH)；n1、n2和n3独立地选择为2或3；并且R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自H，CH3，C2-C10直链或支链烷基，C3-C10环烷基，C1-C6烷基C3-C10环烷基，芳基，单、二、三、四和五取代的芳基，杂芳基，稠合芳基，C1-C6烷基芳基，C1-C6烷基单、二、三、四和五取代的芳基，C1-C5烷基杂芳基、C1-C6烷基稠合芳基。另外、R2、R3、R4或R5中的一个或多个可以官能化以连接例如肽、蛋白质、聚乙二醇和其他这样的化学实体以改变构建体的总体药代动力学、递送能力和/或半衰期。这样的官能化的实例包括但不限于C1-C10烷基-CO-肽、C1-C10烷基-CO-蛋白质、C1-C10烷基-CO-PEG、C1-C10烷基-NH-肽、C1-C10烷基-NH-蛋白质、C1-C10烷基-NH-CO-PEG、C1-C10烷基-S-肽、C1-C10烷基-S-蛋白质。此外、R7、R8、R9、R10、R11或R12中的一个或多个可以官能化以连接例如肽、蛋白质、聚乙二醇和其他这样的化学实体以改变构建体的总体药代动力学、递送能力和/或半衰期。这样的官能化的实例包括但不限于C1-C10烷基-CO-肽、C1-C10烷基-CO-蛋白质、C1-C10烷基-CO-PEG、C1-C10烷基-NH-肽、C1-C10烷基-NH-蛋白质、C1-C10烷基-NH-CO-PEG、C1-C10烷基-S-肽、C1-C10烷基-S-蛋白质。
“可药用盐”是指由可药用无毒碱或酸(包括无机或有机碱以及无机或有机酸等)制备的盐。当化合物是碱性时，例如，盐可以由可药用无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。这样的酸包括例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。在一些实施方案中，可螯合铜的四胺的可药用盐选自盐酸盐(例如，三亚乙基四胺二盐酸盐)、琥珀酸盐(例如三亚乙基四胺二琥珀酸盐)、马来酸盐(例如三亚乙基四胺四马来酸盐)和富马酸盐(例如三亚乙基四胺四富马酸盐)。可螯合铜的四胺如曲恩汀也可以是季铵盐的形式，其中氮原子带有合适的有机基团如烷基、烯基、炔基或芳烷基部分。可螯合铜的四胺的代谢物可以包括但不限于乙酰化代谢物，例如N-乙酰基三亚乙基四胺(例如单乙酰基-三亚乙基四胺)。可螯合铜的四胺的衍生物可以包括但不限于PEG-修饰的四胺(例如曲恩汀-PEG)。
包括曲恩汀的可螯合铜的四胺可以使用本领域已知的多种化学合成、分离和纯化方法中的任一个来制备。例如，参见美国专利No.4,806,517、美国专利No.4,550,209、美国专利No.5,225,599、美国专利No.4,766,247、欧洲专利No.EP262562、美国专利No.8,394,992和美国专利公开No.US20130108709 A1。
具有缺血性组织损伤的个体
本文所述的“缺血性组织损伤”是指组织(包括例如心血管、肝脏、脑、骨骼肌等)的损伤，其导致组织的血液供应受限，造成组织中细胞代谢所需的氧气和葡萄糖缺乏。损伤可涉及导致干扰血流的若干病理状态或由外力造成的创伤中的任一种。在一些实施方案中，缺血性组织损伤是心血管缺血。在一些实施方案中，缺血性组织损伤是脑缺血或缺血性卒中。在一些实施方案中，缺血性组织损伤是肢体缺血，如下肢缺血。在一些实施方案中，缺血性组织损伤是肠缺血，例如缺血性结肠炎或肠系膜缺血。在一些实施方案中，缺血性组织损伤是皮肤缺血。在一些实施方案中，缺血性组织损伤与以下相关：栓塞、血栓形成、动脉瘤、创伤、心肌梗死、二尖瓣疾病、慢性心房纤颤、心肌病、假体、胸廓出口综合征、动脉粥样硬化、低血糖、心动过速、低血压、肿瘤压迫血管、镰状细胞病(Sickel cell disease)、冻伤、动静脉畸形、外周动脉闭塞性疾病、重要血管破裂、贫血、糖尿病、糖尿病性足溃疡、坏死性小肠结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病(Crohn's disease)、炎性肠病、再狭窄(血管成形术或支架植入后)或胰腺炎。在一些实施方案中，缺血性组织损伤与心肌病有关。在一些实施方案中，缺血性组织损伤与心肌梗死有关。在一些实施方案中，缺血性组织损伤与糖尿病有关。
因此，本文描述的方法通常适用于涉及缺血性组织损伤的许多疾病。包括但不限于：心肌梗死、心肌病、动脉瘤、心绞痛、主动脉瓣狭窄、主动脉炎、心律不齐、动脉硬化、动脉炎、不对称性室间隔肥大(ASH)、动脉粥样硬化、心房纤颤和扑动、细菌性心内膜炎、巴洛综合征(Barlow’s Syndrome)(二尖瓣脱垂)、心动过缓、伯格氏病(Buerger’s Disease)(血栓闭塞性血管炎)、心脏肥大、心脏炎、颈动脉疾病、主动脉缩窄、先天性心脏缺陷、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、艾森曼格综合征(Eisenmenger’s Syndrome)、栓塞、心内膜炎、红斑性肢痛、纤颤、纤维肌性发育不良、心脏传导阻滞、心脏杂音、高血压、低血压、特发性婴儿动脉钙化、川崎病(Kawasaki Disease)(皮肤粘膜淋巴结综合征、皮肤粘膜淋巴结病、婴儿型多动脉炎)、代谢综合征、微血管性心绞痛、心肌炎、阵发性房性心动过速(PAT)、结节性多动脉炎(多动脉炎、结节性多动脉炎)、心包炎、外周血管疾病、严重肢体缺血、静脉炎、肺动脉瓣狭窄(肺狭窄)、雷诺病(Raynaud’s Disease)、肾动脉狭窄、肾血管性高血压、风湿性心脏病、糖尿病性血管病变、中隔缺陷、无症状性缺血、X综合征、心动过速、高安氏动脉炎(Takayasu’s Arteritis)、法洛四联症(Tetralogy ofFallot)、大血管错位、三尖瓣闭锁、动脉干、心脏瓣膜病、静脉曲张性溃疡、静脉曲张、血管炎、室间隔缺损、Wolff-Parkinson-White综合征、心内膜垫缺陷、急性风湿热、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、慢性风湿性心脏病、二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、风湿性二尖瓣关闭不全、主动脉瓣疾病、其他心内膜结构疾病、缺血性心脏病(急性和亚急性)、心绞痛、急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病、脊柱后侧凸性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、心内膜弹力纤维增生症、房室传导阻滞、心脏节律失常、心肌变性、脑血管疾病，动脉、小动脉和毛细血管疾病，或者静脉和淋巴管疾病；获得性脑损伤、创伤性脑损伤、卒中(包括缺血、脑出血性、蛛网膜下出血)、缺氧性损伤、代谢性疾病，脑炎以及感染引起的脑损伤。在某些实施方案中，涉及缺血性组织损伤的疾病包括系统性结节病、皮肤疾病或病症、综合征、肺部疾病或病症、心脏疾病或病症、眼部疾病或病症、肝脏疾病或病症、肌肉骨骼疾病或病症，以及肾脏疾病或病症。因此，本申请还包括使用本文所述的方法治疗任何疾病。
本文所述的“个体”、“对象”或“患者”是指哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、牛、公牛、绵羊、山羊、马、猴和其他非人灵长类动物，以及人，脊椎动物如鱼，以及鸟类如鸡。哺乳动物可以包括农场动物、运动动物、啮齿类动物和宠物。在一些实施方案中，个体是人。
本文所述的方法适用于具有一种或更多种缺血性组织损伤的个体，所述缺血性组织损伤包括但不限于：缺血性心肌损伤、缺血性脑损伤、缺血性脊髓损伤、缺血性肌肉损伤、缺血性骨骼损伤、急性肾小管坏死、缺血性肠损伤、缺血性肺损伤、缺血性肝损伤、缺血性肾损伤、缺血性皮肤损伤、疝、血管吻合、动脉粥样硬化斑块、血管瘤以及钝性或穿透性创伤性损伤之后。
在根据本文所述的任何方法的一些实施方案中，个体不具有受限的组织修复系统。在一些实施方案中，个体具有受限的组织修复系统。具有受限的组织修复系统的个体可以具有以下特征中的一个或多个：(a)老年(例如至少约60岁，包括例如至少约65、70、75、80、85、90岁或更老)；(b)慢性组织损伤(如具有组织损伤至少约6、7、8、9、10、11、12、18或24个月或更久中的任一个的个体)；(c)干细胞缺陷；(d)干细胞迁移(即归巢)缺陷；(e)缺陷的组织修复系统；(f)以下症状或病症中的一种或更多种：记忆力减退、低或降低的运动能力(包括但不限于力量能力、速度耐力、柔韧性和关节可动性)、感觉减退、肌肉无力、听力丧失和慢性应变。
在一些实施方案中，个体是至少约20、30、40、50、60、70、80岁或更老中的任一个。在一些实施方案中，个体小于约20、30、40、50、60、70、80岁中的任一个。在一些实施方案中，个体患有慢性缺血。在一些实施方案中，个体具有铜从缺血组织(例如缺血心肌)流出到血液循环中。在一些实施方案中，个体在缺血组织中具有降低的铜水平(小于约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一个)。在一些实施方案中，缺血组织中降低的铜水平由慢性缺血性病症引起。在一些实施方案中，个体具有抑制的HIF-1转录活性。
在一些实施方案中，基于他或她的铜水平，例如细胞内铜水平、细胞外铜水平、总铜水平和血清(即血液)中的铜水平来选择个体进行治疗。处于慢性缺血性病症下的个体在缺血组织中通常具有低的细胞内铜水平，例如小于健康个体中相应组织的平均细胞内铜水平的约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更低中的任一个。对于处于慢性缺血性病症下的个体，血清中的铜水平，例如血清中的总铜水平、血清中的蛋白质(例如，血浆铜蓝蛋白)结合铜的水平或血清中游离(即未结合)铜的水平通常比健康个体的血清中的平均铜水平高(例如，约1.2倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍或更高中的任一个)。在一些实施方案中，在施用四胺组合物之前，个体血清中的总铜水平为至少约60μg/dL、70μg/dL、80μg/dL、90μg/dL、100μg/dL、110μg/dL、120μg/dL、130μg/dL、140μg/dL、150μg/dL、175μg/dL、200μg/dL、250μg/dL、300μg/dL或更多中的任一个。在一些实施方案中，在施用四胺组合物之前，个体具有健康个体的血清中平均总铜水平的不大于约1倍、1.2倍、1.5倍、1.75倍或2倍中的任一个。在一些实施方案中，在施用四胺组合物之前，个体血清中的总铜水平不大于约60μg/dL、70μg/dL、80μg/dL、90μg/dL、100μg/dL、110μg/dL、120μg/dL、130μg/dL、140μg/dL、150μg/dL、175μg/dL、200μg/dL、250μg/dL、300μg/dL中的任一个。在一些实施方案中，在施用四胺组合物后，个体具有健康个体血清中平均总铜水平的至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一个。在一些实施方案中，在施用四胺组合物后，个体血清中的总铜水平为至少约60μg/dL、70μg/dL、80μg/dL、90μg/dL、100μg/dL、110μg/dL、120μg/dL、130μg/dL、140μg/dL或150μg/dL中的任一个。
在一些实施方案中，基于他或她的HIF-1活性水平选择个体进行治疗。在一些实施方案中，个体在缺血组织中具有抑制的HIF-1靶基因转录活性。在一些实施方案中，个体在缺血组织中具有高的HIF-1α水平(例如蛋白质或RNA水平)，但是缺血组织中抑制的HIF-1靶基因转录活性。在一些实施方案中，个体具有导致抑制的HIF-1活性的慢性缺血。
药盒(kit)和制品
本申请还提供用于本文描述的任何方法的药盒、药物、组合物和单位剂型。
本文提供的药盒包括一个或更多个容器，所述容器包含本文所述的任一种四胺组合物(包括药物组合物)和/或其他试剂，并且在一些实施方案中，还包含根据本文所述的任何方法的使用说明书。药盒可以还包括对适于治疗的个体的选择的描述。在本发明的药盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如包括在药盒中的纸张)上的书写说明，但是机器可读指令(例如，在磁性或光存储盘上承载的指令)也是可以接受的。
例如，在一些实施方案中，药盒包含a)包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)或其可药用盐的四胺组合物和可药用载体；以及任选的b)用于施用四胺组合物来治疗与缺血性组织损伤有关的疾病或病症的说明书。
在一些实施方案中，药盒包含a)包含可螯合铜的四胺(例如曲恩汀)或其可药用盐的四胺组合物和可药用载体；b)包含铜离子(例如CuSO4或CuCl2)的促铜组合物和可药用载体；以及任选地c)用于施用四胺组合物来治疗与缺血性组织损伤有关的疾病或病症的说明书。
本发明的药盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、软包装(例如密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。药盒可以任选地提供额外的部件，如缓冲剂和解释性信息。因此，本申请还提供了制品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。
在一些实施方案中，药盒包含有助于将四胺组合物、促铜组合物和/或另外的治疗剂递送至个体的一个或更多个部件。例如，在一些实施方案中，药盒包含有助于将四胺组合物和/或促铜组合物病灶内递送至个体的部件。在一些实施方案中，药盒包含例如适于将细胞递送至个体的注射器和针等。在这样的实施方案中，四胺组合物和/或促铜组合物可以在袋中或一个或多个小瓶中包含在药盒中。在一些实施方案中，药盒包含有助于将四胺组合物和/或促铜组合物静脉内或动脉内递送至个体的部件。在一些实施方案中，四胺组合物和/或促铜组合物可包含在例如瓶或袋(例如，能够容纳多至1.5L包含细胞的溶液的血袋或类似袋)内，并且药盒还包括适合于将四胺组合物和/或促铜组合物递送至个体的管和针。
与组合物的使用有关的说明书通常包括用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可以提供包含足够剂量的本文所公开的可螯合铜的四胺的药盒，以提供对个体的延长时期的有效治疗，例如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月或更久中的任一个。药盒还可以包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，并且包装的量足以在药房，例如医院药房和配药药房中储存和使用。
还提供了可用于本文所述方法的药物、组合物和单位剂型。
以下非限制性实施例进一步说明了本发明的组合物和方法。本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有多个实施方案。现在将参考以下非限制性实施例来更详细地描述本发明。以下实施例来进一步说明本发明，但是当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
实施方案1：曲恩汀与铜离子的络合物的晶体结构
将包含曲恩汀二氯化物、铜离子和水的络合物结晶。选择合适的单晶(150116_s2_lzh_m)，并使用该单晶在Xcalibur Eos衍射仪上收集X射线衍射数据。在数据收集期间晶体保持在143.00-143.10K。使用Olex2(Dolomanov等,(2009)J.Appl.Cryst.42:339-341)，使用Charge Flipping利用Superflip(Palatinus等,(2008)J.Appl.Cryst.41:975-984；Palatinus等,(2012)J.Appl.Cryst.45:575-580)结构解析程序对结构进行解析，并使用最小二乘最小化算法(Least Squares minimization algorithm)利用ShelXL(SheldrickG.M.(2008)Acta Cryst.A64:112-122)细化包进行细化。每个晶胞中络合物的经验式确定为C6H20Cl2CuN4O。细化晶体结构及其参数示出在图1-3和4A-4C中。
实施方案2：通过曲恩汀和曲恩汀-铜络合物将铜细胞内递送至心肌细胞
本实施例描述了通过曲恩汀和曲恩汀-铜络合物的向心肌细胞的体外铜递送测定。实验程序的流程图示出在图5中。
将新生大鼠心肌细胞的初级培养物在补充有10％胎牛血清(FBS)的无血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中在37℃、10％CO2下培养48小时。然后将细胞转移到无血清DMEM中并在37℃、10％CO2下培养12小时，然后将细胞分成5个实验组(一个对照组和四个处理组)。在对照组中，细胞在无血清DMEM中在37℃、10％CO2下再培养6小时。在四个处理组中，将细胞分别用单独CuCl2、单独曲恩汀、曲恩汀-铜络合物以及曲恩汀和CuCl2的混合物在37℃、10％CO2下孵育6小时，各自在10μM曲恩汀和/或10μM铜的终浓度下进行。曲恩汀-铜络合物内部合成，并通过质谱和X射线衍射(XRD)表征。曲恩汀-铜络合物具有如实施例1所述的组成和结构。曲恩汀和铜的混合物通过将等摩尔的曲奈汀和CuCl2以10μM的终浓度在37℃下添加到无血清DMEM中24小时来制备，之后将混合物用于处理新生大鼠心肌细胞。
处理后，通过细胞刮器收集细胞，用含有10mM EDTA(Sigma,USA)的冰冷的PBS洗涤三次以确保完全除去细胞外铜，并以3000rpm离心5分钟。使用1％SDS溶液(Beyotime,CN)裂解细胞沉淀。将裂解物分成两份。一份用浓硝酸在50℃下消化72小时，并用石墨炉原子吸收分光光度计进行分析以评估细胞内铜浓度。另一份用于通过双金鸡宁酸(BCA)蛋白测定法(Bio-Rad,USA)测定总蛋白质浓度。将每个处理组的细胞内铜浓度相对于总蛋白质浓度进行归一化。
图6示出了五个实验组的归一化细胞内铜浓度。所有数据均表示为平均值±标准差(SD)。使用单因素方差分析进行初始分析，使用Student-Newman-Keuls进行多个组之间的比较。在P<0.05时认为实验组之间的差异是显著的。如图6所示，曲恩汀-铜络合物(即Cu-曲恩汀)处理组和利用曲恩汀和CuCl2的混合物(即Cu+曲恩汀)的处理组的细胞内铜浓度与对照组相比显著增加，与单独CuCl2处理相比这两组的细胞内铜浓度的增加更显著。值得注意的是，在所有测试条件下，曲恩汀和CuCl2的混合物(即Cu+曲恩汀)导致细胞内铜浓度的最大增加，表明曲恩汀可以将铜从具有高铜水平的细胞环境运输到心肌细胞中。
实施例3.病理性心脏肥大的大鼠模型中的曲恩汀治疗
本实施例描述了用于在具有病理性心脏肥大的Sprague-Dawley大鼠中评估曲恩汀治疗的效力的体内实验。通过升主动脉缩窄手术建立大鼠病理性心脏肥大模型。图7示出了实验程序的流程图。
1.1大鼠中病理性心脏肥大的建立
在手术程序之前，所有对象接受10％水合氯醛(0.35mg/kg)的腹膜内注射以诱导镇静。完全剃除覆盖左侧胸部的毛用于手术。引入气管插管用于通气。进行辅助呼吸以实现1.2mL至1.5mL的潮气量。呼吸频率为约80次/分钟，吸气/呼气比为1:1。
在手术过程中，将大鼠的体位调整到右侧卧位，并将大鼠置于立体显微镜下。以无菌方式隔离手术区域。用一块一次性无菌盖布进行隔离。
手术区域在左侧第二肋间隙线的中间轻轻切开，并从胸骨柄(presternum)的左侧向外切出1-1.5cm的横向切口。将皮下组织和肌肉平面向下切开至胸膜，进入胸膜腔。插入棉签清扫胸膜腔，并将肺推离手术区域以避免肺损伤，然后用牵开器扩大肋间切口以打开胸腔并暴露出胸腺和脂肪。
在拉开胸腺和脂肪之后，暴露出左心耳上部的主要血管。将主动脉的升部在右侧与动脉干切离。缩窄部位位于升主动脉上主动脉瓣和无名动脉之间。
将升主动脉用20号针(O.D.0.9mm)缩窄。将升主动脉和针用一根6-0外科线绑在一起。然后立即取出针以提供具有狭窄主动脉的内腔。缩窄后，左心室和左耳廓肿胀。
在闭合胸部之前，取出胸部牵开器，并将胸腺和脂肪移回到其正常位置。通过用两根3–0龙缝合线将第二根肋骨和第三根肋骨缝合在一起来闭合胸腔。为避免大出血和气胸，在肋骨缝合过程中小心免刺破扩张的心脏和损伤肺。在闭合肋间切口的时候，通过使用手指关闭呼吸机的外流1-2秒来使肺再膨胀，使得可将空气从胸膜腔排出。在闭合肋间切口后，用5-0丝线缝合线逐层闭合肌肉和皮肤切口，并以无菌方式进行清洁。在自主呼吸恢复之后，收回气管导管。为了减轻手术后的疼痛，每天一次肌内给予镇痛地佐辛(0.8mg/kg)，持续2天。
1.2心回波描记术
将大鼠通过腹膜内注射10％水合氯醛(0.35mg/kg)镇静用于心回波描记术测量。在主动脉缩窄手术后4个月，以及曲恩汀处理后1、3和5周时，使用11.5-MHz换能器(Vivid7Dimension,GE)进行一系列心回波描记术。使用二维模型通过测量短轴横截面积和左心室长度获得室间隔深度(IVSD)和左心室后壁深度(LVPWD)。
用辛普森单面方法(Simpson's single-plane method)评估左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)。直接记录左心室舒张末期容积(LVEDV)、收缩末期容积(LVESV)、舒张末期内径(LVIDd)和收缩末期内径(LVIDs)。EF和FS根据以下公式计算：EF＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100％,FS＝(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100％。
1.3曲恩汀处理
在手术后4个月，观察到左心室向心性肥大和心肌间质纤维化。通过心脏形态和功能的超声评估来确认病理性心脏肥大模型的建立。在确认病理性心脏肥大状态后开始曲恩汀处理。主动脉升部缩窄(AAC)组分为三个组：对照组(NS组)和两个曲恩汀处理组(Tr(H)组和Tr(L)组)。除了主动脉升部缩窄的步骤以外，假手术组大鼠进行同样的手术。假手术组大鼠也分为三个组：对照组(NS组)和两个曲恩汀处理组(Tr(H)组和Tr(L)组)。对照组中的大鼠用盐水溶液处理。在曲恩汀处理组中每天经口施用曲恩汀两次。施用两种剂量的曲恩汀(基于曲恩汀二盐酸盐计算的剂量)，45mg/kg/天(Tr(H)组)和90mg/kg/天(Tr(L)组)。处理持续6周。
本实施例以下部分中的实验程序和结果集中在用基本上由曲恩汀二盐酸盐组成的曲恩汀组合物进行的处理。使用相同的实验方案来评估其他曲恩汀组合物在大鼠模型中治疗心脏肥大的效力。例如，在一个实验中，除了曲恩汀处理之外，曲恩汀处理组中的ACC大鼠还用经口铜补充剂(例如氯化铜)每天以54mg/kg的剂量处理6周。在另一个实验中，使用实施例1的曲恩碱-铜络合物以120mg/kg/天的剂量经口施用6周来处理曲恩汀处理组的ACC大鼠。
1.4心脏形态和功能评估
通过心回波描记术评估心脏形态和功能，并根据图7所示方案测量血浆铜浓度(即，血液检测)以评估曲恩汀治疗的效力。
另外，在实验结束时处死大鼠后获得心脏组织切片。在组织切片上进行免疫组织化学实验。确定心脏组织切片的毛细血管密度，并检测胶原蛋白含量的变化。测量梗死组织、梗死组织边缘区和远离梗死区域的心脏组织中HIF-1α及其靶标如VEGF和VEGFR-1的mRNA和蛋白质水平。
1.5心脏组织中的铜浓度
将组织样品新鲜冷冻并在冻干之前储存在-80℃。在将组织冻干并用硝酸消化之后，消化物为无色或浅黄色且透明，没有可见的沉淀物或残余物。向每个容器添加超纯水来将HNO3稀释至2％以用于对铜浓度进行后续分析。根据下表1所示的程序，通过石墨炉原子吸收分光光度计(ICE3500,Thermo)测定铜浓度。
表1石墨炉原子吸收分光光度程序
温度(℃) 时间(s) 氩气流速(L/min)
90 20 0.2
120 20 0.2
850 20 0.2
2100 3 0
2500 3 0.2
1.6统计学分析
所有的数据均表示为平均值±SD。使用Levene齐性检验和变异系数(coefficientof variance，CV)在实验组之间比较各个参数的变化。使用SPSS14.0统计软件包(SPSS,Chicago,IL)，并且当P值<0.05时，认为具有显著差异。
2.结果
2.1心脏形态和功能
心回波描记术检查显示，在曲恩汀处理后，在形态学水平发生了病理性心脏肥大的逆转。处理3周后，大鼠的室间隔深度(IVSD)和左心室后壁深度(LVPWD)显著下降。随着处理时间的延长，曲恩汀的治效力果更加明显。当处理AAC大鼠5周时，IVSD和LVPWD与假手术组相比几乎正常。如图8A和图8B所示，根据连续监测结果，处理组显示出随着时间IVSD和LVPWD值显著下降的趋势。相比之下，在对照组中，IVSD和LVPWD随时间稳定增加。
尽管由于补偿效应，所有实验组的心脏功能参数、射血分数(EF)和缩短分数(FS)均在正常范围内，图9A和9B显示曲恩汀处理组的EF和FS没有非常显著的波动。相比之下，未处理组中观察到EF和FS的显著下降趋势。
通过原子吸收光谱测定各处理组大鼠的血浆和心肌中的铜浓度。如图10A所示，当对大鼠进行AAC手术时，肥大心肌中的铜浓度降低。曲恩汀处理6周后，经处理大鼠的心脏组织中的铜浓度升高。图10A中对应于AAC-Tr组的条示出了用高剂量的曲恩汀和低剂量的曲恩汀两者(即，组合的AAC-Tr(H)和AAC-Tr(L)组)处理的AAC大鼠的心脏组织中的平均铜浓度。
由于AAC大鼠的心脏组织的铜的流出，AAC大鼠血浆中的铜浓度高于假手术组大鼠。然而，在曲恩汀处理6周后，根据处理过程中不同时间点(即每两周)的测量结果，AAC大鼠血浆中的高铜浓度随时间显著降低。相比之下，假手术组大鼠的血浆铜浓度在处理过程中保持相当稳定(图10B)。
3.讨论
本研究使用曲恩汀提高大鼠的肥大心脏组织中的铜浓度。结果表明，曲恩汀能够促进铜的组织再分布和再利用，并恢复肥大心脏的形态和功能。由于心脏肥大大鼠中的曲恩汀处理，梗死心脏组织中HIF-1的转录活性和毛细血管密度也可增加。此外，心回波描记术检查显示在整个曲恩汀处理期间维持了正常的心脏功能。本实验的结果提供了强有力的证据，本发明的曲恩汀处理可以有效地将铜递送至缺血心脏组织以治疗心脏肥大。
实施例4.心肌缺血性梗死后恒河猴心力衰竭模型的曲恩汀治疗
本实施例描述了用于在心力衰竭的恒河猴模型中评估曲恩汀治疗的效力的体内实验。在内部结构、电活动、冠状动脉分布、冠状动脉侧支循环以及其在胸腔中的位置和附着方面，恒河猴具有与人类似的更高级的心脏。因此，心力衰竭的恒河猴模型提供了评估用于人中的心力衰竭病症的效力的良好替代品。在本实验中，通过冠状动脉结扎手术建立心肌缺血性梗死。手术后，缺血心肌组织逐渐被胶原纤维所替代，并成为梗死组织。手术1年后，动物中的非梗死心脏组织不能补偿梗死心脏组织的功能损失，因此开发了心力衰竭模型。随后向猴提供曲恩汀处理以治疗心力衰竭。
1.1恒河猴中心力衰竭的建立
在手术程序之前，所有对象接受5mg/kg氯胺酮和0.2mg/kg咪达唑仑的肌内注射以诱导镇静。完全剃除覆盖胸部和四肢的电极附着部位的毛用于手术以及改善心电图(ECG)记录结果。记录标准的双极和单极肢体导联。本研究排除显示异常ECG如心动过速(每分钟超过200次)、心律失常以及ST段明显偏离基线的动物。
不断监测(Dash3000,GE,USA)标准非侵入性测量，包括心电图、缚带血压、脉搏血氧仪和二氧化碳图，并在对象中建立静脉导管。在通过静脉输注芬太尼(10μg/kg)、咪达唑仑(0.2mg/kg)、丙泊酚(1mg/kg)和维库溴铵(0.1mg/kg)诱导麻醉后，将所有进行手术程序的猴首先插管。在压力控制的通气下进行辅助呼吸，以实现35mmHg至40mmHg的呼气末CO2。吸气压力设定在12至20cmH2O的范围内。呼吸频率为40次/分钟，吸气/呼气比为1:2。
为了在手术过程序期间维持麻醉条件，将2mL芬太尼(0.1mg)和10mL丙泊酚(100mg)用盐水溶液稀释至20mL。通过注射泵以5-10mL/小时的速度持续输注混合物。根据麻醉状态和手术的持续时间调整泵速。用留置针将动脉插管插入到股动脉中，并连接压力监测管用于在手术期间进行侵入性血压监测。通常，在髂前上棘和耻骨联合之间的中间触诊股动脉搏动。以无菌方式隔离手术区域。用四块一次性无菌片进行隔离。
手术区域在左侧第四肋间隙线的中间轻轻切开，并从胸骨柄的左侧向外切出4-5cm的横向切口。将单极透热法用于组织切割和凝血目的。将皮下组织和肌肉平面向下切开至胸膜，进入胸膜腔，然后通过打开钳子来扩大切口。插入棉签清扫胸膜腔，将肺推离孔，然后扩大肋间切口以打开胸腔并暴露出心包膜。
通过左侧第四肋间的胸廓切口(4-5cm)暴露出心脏并鉴别顶点和左心耳。将左前降支动脉(LAD)的心外膜端限定为零级；将左心耳下端的LAD起源限定为100级。在LAD的60％处进行结扎。另外，如果对角支动脉的分支点在结扎位点之上，则在一些猴中还将主对角支平行于LAD动脉上的结扎位点进行结扎。
使动脉堵塞1分钟，之后进行5分钟再灌注，并且在最后的结扎之前将该堵塞-再灌注重复3次。在最后的结扎之后，监测左心室壁运动的差异、心室前壁的颜色变化以及心电图和血压的改变以确保结扎成功。在最后的结扎之后，通过1.0mL注射器向左心耳中推注亚甲蓝(1mL)。亚甲蓝的充盈缺损指示结扎的完成以及帮助预测缺血区域。
在闭合胸部之前，对心脏状况集中监测45分钟。输注多巴酚丁胺(3至5μg·kg-1·min-1)以支持心脏功能，并且如有必要的话，使用除颤器(HEARTSTART XL,Philips)。小心避免在闭合心包期间对心脏造成损害。向心包腔内输注透明质酸钠以用于进行抗黏附处理。用4-0聚乙烯缝合线闭合心包和胸膜。用丝线缝合线闭合肋间切口。为了避免气胸，小心避免在肋间闭合期间对肺造成损伤。在闭合肋间切口的时候，使肺再膨胀，使得可将空气从胸膜腔排出。在闭合肋间切口后，向皮下间隙滴落盐水溶液，使肺再次膨胀以确保胸部切口紧密闭合。用#2-0丝线缝合线逐层闭合肌肉和皮肤切口，并以无菌方式进行清洁。在自主呼吸恢复之后，收回气管导管。用无菌的纱布和绷带覆盖切口。肌内注射曲马多(2mg/kg)以减轻疼痛。隔日更换绷带并在手术后一周移除缝合线。
1.2心电图(ECG)监测
使用儿科电极以25mm/s纸速度(paper velocity)和10mm/mV振幅在手术前、手术后立即(整个外科手术程序为约2小时)、手术后4周和8周在每只猴的仰卧位记录12-导联ECG(MAC8000,GE,USA.)。即使使用儿科电极，猴胸壁的宽度仍不足以允许同时进行6个心前区导联。因此，将6个心前区导联分成两组：将V1、V3和V5以一组记录，V2、V4和V6以另一组记录。
1.3心回波描记术
在标准的心尖2-和4-腔视图上进行二维心回波测量，并进行三个连续心动周期。使帧频保持在70fps至100fps。在手术前、手术后4周和8周在左侧位用10.3MHz转换器(P10-4,Siemens ACUSONAntares System,German)对所有猴进行经胸廓心回波评价。
用辛普森单面方法评估左心室射血分数(EF)。直接记录左室舒张末期容积(LVEDV)和收缩末期容积(LVESV)，并且使用以下计算EF：EF＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100％。如下计算左心室的每搏量(Stroke volume，SV)：SV＝LVEDV-LVESV。
1.4曲恩汀处理
在手术后一年，缺血性心脏组织被胶原纤维完全代替，并成为梗死组织。通过心脏功能的超声评估确认了心力衰竭模型的建立。随后进行曲恩汀处理。在曲恩汀处理组中，每天两次向每只猴经口施用曲恩汀。曲恩汀的剂量为18mg/kg/天。处理持续了八周。未处理组(即对照组)中的猴不接受任何处理。根据图11所示的方案表评价心脏功能和形态，以评估曲恩汀的效力。
本实施例以下部分中的实验程序和结果集中在用基本上由曲恩汀二盐酸盐组成的曲恩汀组合物进行的处理。使用相同的实验方案来评估其他曲恩汀组合物在恒河猴模型中治疗心力衰竭的效力。例如，在一个实验中，除了曲恩汀处理之外，曲恩汀处理组中的具有心力衰竭的恒河猴还用经口铜补充剂(例如氯化铜)每天以16.5mg/kg的剂量处理6周。在另一个实验中，使用实施例1的曲恩碱-铜络合物以36.7mg/kg/天的剂量经口施用6周来处理曲恩汀处理组中的具有心力衰竭的恒河猴。
1.5组织病理学检查
通过静脉内注射氯化钾(10％,10mL)将猴处死并进行每只猴的完全尸体解剖。将收获的心脏清洗，大体上检查可看见的病变并固定在10％甲醛溶液中。然后，将心脏沿长轴从顶点到底部切成6块。将每块的厚度固定为0.5cm。确保在切割期间每个切片的表面是光滑且均匀的，并通过具有标记的结扎线来标记切片。将薄切片切割并用Masson和H/E染色以用于显微镜检测。
免疫组织化学
使用免疫组织化学方法检测组织切片以检测HIF-1α、VEGFA和VEGFR1。分别使用以下抗体：小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体(ab16066,Abcam)；小鼠抗人VEGFA单克隆抗体(sc-57496,Santa Cruz)；兔抗人VEGFR1单克隆抗体(1303-12,Epitomics)；小鼠抗人CD31单克隆抗体(Maixinbio-tech company,Fuzhou)。使用EDTA(pH 9.0)通过高压热诱导性抗原恢复来恢复HIF-1α，使用柠檬酸盐缓冲溶液(pH 6.0)通过微波热诱导性抗原恢复来恢复VEGF和VEGFR1，并且使用EDTA通过微波热诱导性抗原恢复来恢复CD31。抗体的工作浓度如下：抗HIF-1α为1:800，抗VEGF为1:100，并且抗VEGFR1为1:100。在免疫组织化学实验中，用PBS替代第一抗体孵育阴性对照。CD31是内皮细胞的标志物。使用共聚焦显微镜通过免疫荧光检查Ki-67标记。
毛细血管密度
如下评估组织切片的毛细血管密度。首先在放大100倍的光学显微镜下测定最大毛细血管分布视野，然后在放大200倍的光学显微镜下收集5个随机视野以确定毛细血管密度。毛细血管定义为官腔直径小于红细胞直径8倍的总和。由两名独立的技术人员进行测量。
半定量蛋白质表达分析
在光学显微镜下观察免疫组织化学切片，拍摄图像，并使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(MediaCybemetics)以半定量方式确定蛋白质表达水平。不同组的幻灯片由两名独立的技术人员进行评估。在放大400倍的光学显微镜下对每个载玻片的梗死的边缘区域和远端区域的5个随机视野拍摄照片。
1.6Western印迹
组织制备
从胸部取出心脏。仔细检查左心室壁并分离来自梗死区、边缘区和远端区的组织样品。梗死区可根据其苍白外观而与非梗死区区分开来。边缘区定义为从梗死区内部1mm到梗死区外部3mm的区域。远端区定义为梗死区域外超过3mm的区域。将样品保存在液氮中以用于进行Western印迹分析。
Western印迹
将每个组织在液氮中研磨并将研磨组织在冰上于包含1％无EDTA的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche,DE)的RIPA裂解缓冲液(Beyotime,CN)中裂解40分钟，之后获得蛋白质提取物。通过Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo SCIENTIFIC,23227,USA)确定蛋白质浓度。将来自每个样品的等量蛋白质(30μg)溶解在5×SDS样品缓冲液并在10％-SDS和8％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。然后，将蛋白质电泳转移至聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad,USA)。将膜在含有5％脱脂奶粉(封闭液)的Tris-缓冲盐水/Tween 20(TBST)(10mM Tris-HCl，pH8.0、150mMNaCl和0.1％Tween 20)中封闭1小时，并根据供应商的建议与用封闭缓冲液稀释的相应的第一抗体一起于4℃下孵育过夜，所述抗体例如抗HIF-1α(Abcam,ab113642,USA)、抗VEGF(Santa Cruz,sc57496,USA)和抗VEFGR-1(Abcam,ab32152,USA)。在用TBST洗涤之后，将膜与合适的第二抗体一起在37℃下孵育1小时。使用化学发光HRP底物(Millipore,USA)来使靶蛋白可视化并使用QUANTITY ONETM通过密度测定术进行分析。
1.7HIF-1靶基因的mRNA水平
为了确定缺血心肌中的HIF-1的转录活性，通过实时PCR(RT-PCR)确定HIF-1α、HIF-1靶基因如VEGF和VEGFR-1(也称为Flt-1)的mRNA水平。
根据制造商的说明，使用(Invitrogen,15596-026,USA)分离来自每个样品的总RNA。使用PRIMESCRIPTTM RT试剂盒(TaKaRa,RR037A,Japan)在37℃下15分钟，然后85℃下5秒以及4℃下5分钟，对1μg的总RNA进行逆转录。使用/>Premix Ex TaqTMII试剂盒(TaKaRa,RR820A,Japan)进行实时RT-PCR反应。为了扩增HIF-1α、VEGF和VEGFR1 cDNA片段，使用BIO-RAD CFX96实时系统利用以下程序处理样品：在95℃下变性30秒，接着进行95℃5秒和60℃30秒的35个循环。分析生长曲线的对数期结果并使用2-ΔCT方法进行相对量化。将HIF-1α、VEGF和VEGFR1的基因表达水平各自相对于每个样品中的肌动蛋白表达水平归一化。每份样品进行至少3次重复实验。引物序列示于表2中。
表2.RT-PCR的引物序列
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1.8心脏中的铜浓度
将组织样品新鲜冷冻并在冻干之前储存于-80℃。在将组织冻干并用硝酸消化之后，消化物为无色或浅黄色且透明，没有可见的沉淀物或残余物。向每个容器添加超纯水来将HNO3稀释至2％以用于对铜浓度进行后续分析。根据实施例3的表1中所示程序通过石墨炉原子吸收分光光度法(ICE3500,Thermo)测定铜浓度。
1.9统计学分析
所有的数据均表示为平均值±SD。使用Levene齐性检验和变异系数(CV)在实验组之间比较各个参数的变化。使用SPSS14.0统计软件包(SPSS,Chicago,IL)，并且当P值<0.05时，认为具有显著差异。
2.结果
2.1心脏功能
心回波描记术检查显示，在曲恩汀处理后，左心室射血分数随时间显著增加。然而，在未处理组中，左心室射血分数随时间降低。参见图12。
2.2梗死心脏中的铜浓度
通过原子吸收光谱测定心肌中的铜浓度。如图13所示，与未处理组相比，在来自处理组的梗死区和边缘区的组织样品中，曲恩汀处理后铜浓度显著增加。相比之下，曲恩汀处理组和未处理组中远端区中组织样品的铜浓度相当。
3.讨论
心肌缺血导致HIF-1α积累和铜消耗。在缺血病症下，由于HIF转录复合物形成以及HIF与靶基因中的HIF响应元件的相互作用需要铜，积累的HIFα不能激活HIF转录。因此，尽管缺血心肌中发生HIF积累，但是铜缺乏阻断HIF调节的参与血管生成的基因的表达，导致心肌血管生成的抑制。这种效应导致心肌梗死，进一步发展为心力衰竭。
本研究使用曲恩汀来提高缺血组织中的铜浓度以用于治疗心肌梗死。结果表明，曲恩汀促进铜的组织再分布和再利用。此外，心回波描记术表明，曲恩汀处理后心脏功能得到改善。在该实验中，曲恩汀的剂量对于恒河猴为每天18mg/kg，其相当于人个体的每天约420mg。与用于降低Wilson病患者的血清铜水平的曲恩汀的通常剂量(对于儿科患者为500-700mg/天至最大值1500mg/天，对于成人患者为750-1250mg/天至最大值2000mg/天)，本实验中使用的剂量低得多。本实验的结果提供了强有力的证据，本文所述的低剂量曲恩汀治疗是体内递送铜以治疗心肌梗死的有效策略。
实施例5.心肌缺血性梗死的小鼠模型中的曲恩汀治疗
在本实验中，通过永久冠状动脉结扎手术建立心肌缺血性梗死的小鼠模型。手术后4周，缺血性心脏组织被胶原纤维替代，并成为梗死组织。如图14所示方案中的描述进行曲恩汀处理。
以每天16.75、33.49、55.94或78.25mg/kg的剂量每天两次通过胃内途径向四组模型小鼠施用曲恩汀处理。这种处理持续4周。未处理组没有接受任何曲恩汀处理。
心回波描记术
通过心回波描记术评估心脏功能以评估曲恩汀的效力。所有小鼠用1MHz换能器(i13L,Vivid7,GE Ultrasound)进行经胸心回波描记术评估。用辛普森单面方法评估左心室射血分数(EF)。直接记录左心室舒张末期容积(LVEDV)和收缩末期容积(LVESV)，EF计算如下：EF＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100％。
心脏中的铜浓度
将组织样品新鲜冷冻并在冻干之前储存于-80℃。在将组织冻干并用硝酸消化之后，消化物为无色或浅黄色且透明，没有可见的沉淀物或残余物。向每个容器添加超纯水来将HNO3稀释至2％以用于对铜浓度进行后续分析。根据实施例3的表1中所示程序通过石墨炉原子吸收分光光度法(ICE3500,Thermo)测定铜浓度。
结果
通过心回波描记术检测的心脏表现显示，在较低剂量的曲恩汀处理时，用曲恩汀处理的小鼠通过左心室射血分数测量的心脏功能得到改善，并且这种改善在更高剂量的曲恩汀处理时降低(参见图15)。每天33.49mg/kg的剂量使得射血分数的改善比达到峰值，然后即使用更高剂量也使得改善降低。该实验表明曲恩汀对于心肌梗死的治疗在窄的低剂量范围内是有效的。如图16所示，响应于曲恩汀处理，梗死区域中的铜浓度显著升高。值得注意的是，在每天33.49mg/kg的剂量的处理组中，梗死区域中的铜含量最高。
讨论
本研究使用一系列递增剂量的曲恩汀来治疗小鼠中的心肌缺血性梗死。结果表明，在每天33.49mg/kg剂量的曲恩汀的处理组中，梗死区中的铜含量在所有实验组中最高，其对应于在该组中观察到的与其他实验组相比射血分数的最高改善。在测试的更高曲恩汀剂量下，没有观察到梗死区域的铜含量或射血分数的进一步改善。
在该实验中测试的每天16.75、33.49、55.94和78.25mg/kg的剂量分别相当于人患者的每天约150、300、500和700mg。相比之下，用于通过降低患者的血清铜水平来治疗Wilson病的曲恩汀的剂量对于儿科患者为500-700mg/天至最大值1500mg/天，对于成人患者为750-1250mg/天至最大值2000mg/天。因此，本实验观察到的在补充缺血心脏组织中的铜含量和恢复心脏功能中具有最高效力的曲恩汀剂量远低于用于治疗Wilson病患者的剂量。该实验的结果提供了强有力的证据，用于心肌梗死的曲恩汀治疗在窄的低剂量范围内是有效的。
不受任何理论或假设的约束，曲恩汀可用作铜递送穿梭物以将铜从高浓度组织或环境(例如缺血后的血清)转移到心脏中缺少铜的缺血组织，从而缓解在缺血组织中的铜消耗并改善心血管疾病。多个出版物描述了患有心血管疾病，尤其是心肌梗死的患者的血清中升高的铜水平。例如，参见例如ES Ford.Am.J.Epidem.151(12):1182(2000)；E.Gomez等.J.Trace Elements Med.Biol.14:65-70(2000)；and SinghMM等.Angiology—Journal ofVascular Diseases,504-506(1985)。
实施例6.心衰患者中的曲恩汀治疗的临床研究
进行临床研究以评估低剂量曲恩汀治疗对患有心力衰竭的患者的临床效果。该研究的主要目的是在之前前和治疗后与安慰剂相比曲恩汀在治疗心衰患者中的效力。
研究是具有降低的射血分数(例如LVEF≤35％)的心力衰竭患者(例如NYHA功能II级和III级)中的随机、双盲、安慰剂对照临床研究。对照组中的患者给予标准护理(SOC)加上每天两次安慰剂。治疗组的患者给予SOC加上每天两次以150mg/剂量经口施用曲恩汀。在筛查、基线(第0周)、治疗过程中和治疗后评估患者。
研究的主要终点可以是存活，与心力衰竭有关的住院，或者与心力衰竭有关的生物标志物的变化。例如，随着时间的循环利钠肽的水平可用于对心力衰竭的风险进行分层，因此可以作为心力衰竭严重程度的生物标志物。
研究的次要终点可包括至治疗结束时心脏结构和功能与基线相比的改变。心脏结构和功能可通过心回波描记术确定。可用作次要终点的示例性度量包括左心室舒张末期容积、左心室射血分数和E/E'比。研究的次要终点还可以包括基于六分钟步行距离测试的功能状态、症状的变化(NYHA分级)和生活质量分数。
血清铜水平和其他生物标志物可作为研究的第三终点来监测。
通过回顾对象报告的自发不良事件(AE)和其他适当的医疗和安全评估，如生命体征、ECG、实验室检查等来评估安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.可螯合铜的四胺在制备具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的药物中的应用；
所述可螯合铜的四胺为曲恩汀。
2.可螯合铜的四胺在制备具有缺血性组织损伤的个体中将铜特异性地递送到缺血组织的细胞内的药物中的应用；
所述可螯合铜的四胺为曲恩汀。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的应用，其中所述缺血组织选自缺血心脏组织、缺血肝组织、缺血脑组织、缺血肺组织、缺血肾组织、缺血皮肤组织、缺血消化道组织和缺血肢体组织。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的应用，其中所述药物经口施用,
每天约80mg至约700mg。
5.包含可螯合铜的四胺的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体的缺血组织中提高细胞内铜水平的药物中的用途；
所述可螯合铜的四胺为曲恩汀。
6.包含可螯合铜的四胺的组合物在制备用于在具有缺血性组织损伤的个体中将铜特异性地递送到缺血组织的细胞内的药物中的用途；
所述可螯合铜的四胺为曲恩汀。
7.一种药盒，其包含含有可螯合铜的四胺或其可药用盐的四胺组合物，所述药盒用于治疗与缺血性组织损伤相关的疾病或病症。
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