MXPA05005246A - Procedimiento para la purificacion de proteinas de union al factor de necrosis tumoral, usando cromatografia de afinidad de metales inmovilizados. - Google Patents

Abstract

Se describe un nuevo procedimiento de purificacion para proteinas de union al factor de necrosis tumoral, en particular, este procedimiento se caracteriza por el uso, como paso de captura, de una cromatografia de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) que usa cobre como metal, esto trae ventajas en terminos de rendimiento del procedimiento, pureza del producto final, y aplicacion a escala industrial.

Description

WO 2004/046184 Al ??1????!??????????»??????????????? ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PT, RO, SE, — befare the expiration of the time Urnit for amending the SI, SK, TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, clairns and to be republished in the event of receipt of GN, GQ, GW, ML, R, ??, SN, TD, TG). amendments For two-letter codes and other abbreviations. refer to the "Guid- Published: ance Notes on Codes and Abbreviations" appearing at the begin- PROCEDIMIENTO PARA LA PURIFICACION DE PROTEINAS DE UNION AL FACTOR DE NECROSIS TUMORAL, USANDO CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD DE METALES INMOVILIZADOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere al campo de purificación de polipéptidos. Más específicamente, se refiere a la purificación de proteínas de unión al factor de necrosis tumoral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El factor de necrosis tumoral-alfa (FNT-A), una citocina potente, induce un amplio espectro de respuestas biológicas que son mediadas por unión a un receptor de superficie celular. El receptor para el FNT-alfa humano puede aislarse de una línea de células de linfoma histiocítico humano (véase Stauber et al., J. Biol. Chem., 263, 19098-104, 1988). Mediante el uso de anticuerpos monoclonales, otro grupo obtuvo evidencia de dos proteínas de unión al FNT distintas, las cuales se unen al FNT-alfa y FNT-beta específicamente y con alta afinidad (véase Brockhaus et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 7380-7384, 1990), y aisló el ADNc para uno de estos receptores. El grupo encontró que codifica para una proteína de 455 aminoácidos que se divide en un dominio extracelular de 171 residuos y un dominio citoplásmico de 221 residuos. Después, otro grupo (véase Aggarwal et al. Nature 318: 665-667, 1985) mostró que los factores de necrosis tumoral alfa y beta inician sus efectos sobre la función celular, por unión a receptores de superficie celular comunes. Los receptores de FNT alfa y FNT beta tienen diferentes tamaños, y se expresan diferencialmente en diferentes líneas de células (véase Engelmann et al., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536, 1990). El receptor I del FNT alfa, referido por algunos como FNTR55, es el más pequeño de los dos receptores. Se han clonado moléculas de ADNc para ambos receptores, y se ha determinado su secuencia de aminoácidos (véase Loetscher et al., Cell 61 : 351-359, 1990; Nophar et al., EMBO J. 9: 3269-3278, 1990; Schall et al., Cell 61 : 361-370, 1990, y Smith et al., Science 248: 1019-1023, 1990). Mientras que los dominios extracelulares de los dos receptores son de estructura notablemente similar, sus dominios intracelulares parecen no estar relacionados. El Southern blotting del ADN genómico humano, usando las moléculas de ADNc de los dos receptores como sondas, indicó que cada uno es codificado por un solo gen. Se han intentado varios procedimientos para purificar polipéptidos. La cromatografía es uno de los medios usados más comúnmente, incluyendo cromatografía de afinidad, en la cual la sustancia que se va a purificar es adsorbida primero a un lecho o columna de un soporte adecuado sobre el cual agentes que tienen afinidad por la sustancia determinada son inmovilizados para capturarla, y dejar que los componentes restantes de la mezcla cruda pasen no unidos. La sustancia adsorbida es eluida entonces cambiando condiciones ambientales tales como el pH y/o la concentración de sales, para dar una molécula parcialmente o totalmente purificada. En el campo de cromatografía de afinidad, la técnica conocida como I AC (cromatografía de afinidad de metales inmovilizados) se ha descrito como particularmente eficiente en ciertos casos (véase el artículo de revisión por Arnold, Biotechnology, Vol. 9, págs. 151-156, febrero de 1991). Se describe a la IMAC como una técnica poderosa en la purificación de polipéptidos que tienen grupos funcionales que participan en la unión a metales, tales como las cadenas laterales de Glu, Tyr, Cys, His, Asp y Met, así como los nitrógenos de amida amino-terminales y oxígenos del carbonilo de la estructura de base. Aunque la técnica es poderosa, no siempre tiene el carácter específico requerido. Por ejemplo, se ha indagado que la adsorción sobre una columna cromatográfica que contiene Cu2+ es excelente para polipéptidos que contienen una histidina o de preferencia más histidinas, pero se observó también que aún en presencia de los tres aminoácidos considerados como importantes para la adsorción, a saber, histidina, triptófano y cisteína, puede ocurrir adsorción de proteína, deteriorando de esta manera el carácter específico del paso de purificación. La eficiencia de adsorción, aunque generalmente satisfactoria para propósitos de purificación, puede no ser óptima en particular cuando el polipéptido que se va a purificar es una glucoproteína. En este caso, con mucha frecuencia las cadenas de carbohidratos pueden ocultar los sitios activos por la unión al quelato de metal, y reducir la afinidad por la columna cromatográfica en el paso de adsorción.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha encontrado ahora que proteínas de unión al FNT pueden purificarse eficientemente mediante un procedimiento que incluye un paso de cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC), usando cobre como metal. Condiciones óptimas de pH y salinidad para este paso, son un pH de 2.8 a 3.2, de preferencia pH 3, y una salinidad de 14 a 16 mS, de preferencia de 15 mS. De conformidad con la presente invención, "proteínas de unión al FNT", significan cualquier proteína que tenga una afinidad por el FNT-alfa o el FNT-beta, y/o una proteína que comprenda en el dominio extracelular un fragmento soluble de una proteína que pertenezca a la familia de receptores del FNT, o un fragmento del mismo. Algunos ejemplos de miembros de la familia de receptores del FNT, son los siguientes: Receptor 1 del factor de necrosis tumoral (FNTR1 ), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 1A (FNTRSF1A), o receptor del factor de necrosis tumoral-alfa (FNTAR) o FNTR 55-KD o FNTR 60-KD (véase la descripción en OMIM*191190 http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez query .fcgi?db=OMIM); receptor 2 del factor de necrosis tumoral (FNTR2), denominado también subfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 1B (FNTRSF1B), o receptor del factor de necrosis tumoral-beta (FNTBR) o FNTR 75-KD o FNTR 80-KD (véase la descripción en 0??? 91191); antígeno OX40 (OX40), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 4 (FNTRSF4), o receptor de glucoproteína 1 activada mediante transcripción por Tax (TXGP1 L) o antígeno de activación linfoide ACT35 (ACT35) o CD134 (véase la descripción en OMIM*600315); receptor de CD40L (CD40), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 5 (FNTRSF5) o antígeno de superficie de células B CD40, o CDw40 o Bp50 (véase la descripción en Swiss-Prot, entrada No. P25942); receptor de FASL (FAS), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 6 (FNTRSF6), o antígeno de superficie mediador de apoptosis FAS o antígeno de Apo-1 o CD95 (véase la descripción en Swiss-Prot, entrada No. P25445); receptor de señuelo 3 (DcR3), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 6B (FNTRSF6B) o receptor de señuelo para ligando FAS o M68 (véase la descripción en Swiss- Prot, entrada No. 095407); antígeno CD27 (CD27), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 7 (FNTRSF7) o antígeno de activación de células T S152 (S152) (véase la descripción en O IM*602250); antígeno de activación linfoide CD30 (CD 30), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 8 (FNTRSF8) (véase la descripción en OMIM*153243); receptor inducido por activación de linfocitos (ILA), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 9 (FNTRSF9) o CD137 (véase la descripción en OMlM*602250); receptor de muerte celular 4 (DR4), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 10A (FNTRSF10A), o receptor 1 del ligando inductor de apoptosis relacionado al FNT (TRAILR1 ) o AP02 (véase la descripción en OMIM*603611 ); receptor de muerte celular 5 (DR5), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 10B (FNTRSF10B), o receptor 2 del ligando inductor de apoptosis relacionado al FNT (TRAILR2) o atenuador/DR5 o TRICK2 (véase la descripción en OMIM*603612); receptor de señuelo 1 (DCR1 ), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 10C (FNTRSF10C), o receptor 3 del ligando inductor de apoptosis relacionado al FNT (TRAILR3), o receptor de TRA1L sin un dominio intraceiuiar (TRID) (véase la descripción en OMIM*603613); receptor de señuelo 2 (DCR2), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 10D (FNTRSF10D) o receptor 4 del ligando inductor de apoptosis relacionado al FNT (TRAILR4), o receptor de TRAIL con un dominio de muerte truncado (TRUNDD) (véase la descripción en OMIM*603014); activador del receptor de NF-KAPPA-B (RANK), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 11A (FNTRSF11A), o receptor del factor de diferenciación de osteoclastos (ODFR) o PDB2 o TRANCER (véase la descripción en OMIM*603499); osteoprotegerina (OPG), denominada también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 11B (FNTRSF11B), o factor inhibidor de osteoclastogénesis (OCIF) (véase la descripción en OMIIVP602643); receptor 3 de muerte celular (DR3), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 12 (FNTRSF 2) o AP03, o receptor de muerte celular asociado a linfocitos (LARD) (véase la descripción en OMIM*603366); activador de transmembrana e interaccionador de Caml (TACI), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 13B (FNTRSF 3B) (véase la descripción en OMIM*604907); receptor de BAFF (BAFFR), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 13C (FNTRSF13C), o receptor del factor de activación de células B (véase la descripción en OMIM*606269); mediador de la entrada de virus de herpes (HVEM), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 14 (FNTRSF14), o mediador de la entrada de virus de herpes A (HVEA) o TR2 (véase la descripción en OMIM*602746); receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 16 (FNTRSF16) o p75(NTR) (véase la descripción en 0M1M*162010); factor de maduración de células B (BCMA), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 17 (FNTRSF17) o BCM (véase la descripción en OMIM*109545); gen relacionado al FNTR inducido por glucocorticoides (GITR), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 18 (FNTRSF18), o miembro de la familia del FNTR inducible por activación (AITR) (véase la descripción en OMIM*603905); TRADE, denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 19 (FNTRSF19), o inductor de toxicidad y JNK o TROY o TAJ (véase la descripción en Swiss-Prot, entrada No. Q9NS68); receptor A2 de ectodiplasina enlazada a X (XEDAR), denominado también receptor de EDA-A2 (véase la descripción en Swiss- Prot, entrada No. Q9HAV5); y receptor de muerte celular 6 (DR6), denominado también superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, miembro 21 (FNTRSF21) (véase la descripción en OMIM*605732). De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la proteína de unión al FNT se selecciona de h-TBP-1 recombinante (fragmento recombinante, extracelular y soluble del receptor 1 del FNT humano, que comprende la secuencia de aminoácidos que corresponde al fragmento de 20-180 aminoácidos de Nophar et al.) y h-TBP-2 recombinante (fragmento recombinante, extracelular y soluble del receptor 2 del FNT, que comprende la secuencia de aminoácidos que corresponde a 23-257 de Smith et al.). Más preferiblemente, es hTBP- recombinante (r-hTBP-1). Para las demás proteínas, el dominio extracelular soluble se indica en la entrada de Swiss-Prot correspondiente. De conformidad con otra modalidad preferida de la invención, el procedimiento de purificación de la proteína de unión al FNT, incluye el paso de "IMAC" como el "paso de captura", y comprende además los siguientes pasos, como "pasos intermedios": cromatografía de intercambio iónico (IEC) a un pH ácido (de preferencia entre 3 y 4), seguida de cromatografía de intercambio iónico a un pH básico (de preferencia entre 8 y 10). De conformidad con otra modalidad preferida de la invención, el procedimiento de purificación de la proteína de unión al FNT comprende además, como "paso de refinamiento", cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Más preferiblemente, cada uno de los pasos de cromatografía mencionados anteriormente va seguido de una ultrafiltración. El "paso de captura" de conformidad con la presente invención, significa el paso durante el cual la proteína recombinante de unión al FNT es aislada y concentrada del sobrenadante de cosecha crudo del cultivo de células hospederas recombinantes que lo contienen. Un alto rendimiento al final de este paso inicial, tiene un gran impacto sobre el desempeño y rendimiento general del procedimiento. De conformidad con la presente invención, el paso de captura llevado a cabo en quelato de Cu FF y, de preferencia, con una elución a pH 3.0, da un producto que tiene una pureza mayor de 40% y una recuperación mayor de 80%. Los "pasos intermedios", son los pasos durante los cuales se remueve la mayor parte de las impurezas globales, tales como otras proteínas y ácidos nucleicos, endotoxinas y virus. Los "pasos de refinamiento", son los pasos durante los cuales se remueve cualquier impureza traza restante o sustancias estrechamente relacionadas, para obtener una proteína de alta pureza. La "cromatografía de intercambio iónico", (IEC), es capaz de separar moléculas que tienen solo pequeñas diferencias en carga para dar una separación de resolución muy alta. Las fracciones se recogen en forma concentrada y purificada. La separación se basa en la interacción reversible entre una molécula con carga y un medio cromatográfico con carga opuesta.

Las moléculas se unen conforme se cargan sobre la columna. Se alteran entonces las condiciones, de modo que las sustancias unidas son eluidas diferencialmente. La elución se lleva a cabo usualmente mediante cambios en la concentración de sales o el pH. Los cambios se hacen gradualmente o con un gradiente continuo. Se usan comúnmente columnas de Q Sepharose o SP Sepharose en cromatografía de intercambio iónico. "Q Sepharose" es un fuerte intercambiador aniónico de amonio cuaternario (grupos con carga: -?+(??3)3), mientras que "SP Sepharose" es un fuerte ¡ntercambiador catiónico de sulfopropilo (grupos con carga: -S03")- La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), es un método versátil para la purificación y separación de biomoléculas con base en diferencias en su carácter hidrofóbico de superficie. Las proteínas y péptidos secuestran usualmente aminoácidos hidrofóbicos en los dominios lejos de la superficie de la molécula. Sin embargo, muchas biomoléculas consideradas como hidrofílicas tienen grupos hidrofóbicos suficientes expuestos que permiten la interacción con ligandos hidrofóbicos unidos a la matriz cromatográfica. En comparación con la cromatografía de fase invertida, la densidad del ligando sobre la matriz es mucho menor. Esta característica promueve la alta selectividad de la HIC, mientras permite buenas condiciones de elución que ayudan a preservar la actividad biológica. Se usa de preferencia la columna "Butyl Sepharose" de conformidad con la invención, en el paso de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Sobre esta columna, el grupo n-butilo se usa como ligando hidrofóbico.

De conformidad con la presente invención, las proteínas de unión al FNT se producen mediante tecnología de ADN recombinante en células eucarióticas, de preferencia células de mamífero. El procedimiento recombinante para producirlas se reporta aquí a continuación para integridad. En el paso inicial del procedimiento, la secuencia de ADN que codifica para la proteína deseada es insertada y ligada en un plásmido adecuado. Una vez formada, el vector de expresión es introducido en una célula hospedera adecuada, la cual expresa entonces el vector o los vectores para dar la proteína deseada. La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención como se menciona en la presente, puede efectuarse en células eucarióticas (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero) o células procarióticas, usando los vectores de expresión adecuados. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican para las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriores, se insertan en vectores de expresión adecuadamente construidos mediante técnicas bien conocidas en la materia (véase Sambrook et al, 1989). ADNc de doble cadena es enlazado a vectores de plásmido mediante formación de cola homopolimérica, o mediante enlace de restricción que incluye el uso de enlazadores de ADN sintético o técnicas de ligación de extremos rasurados: se usan ADN ligasas para ligar las moléculas de ADN, y se evita la unión no deseable mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.

Para poder expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe comprender también secuencias de nucleótidos específicas que contengan información reguladora de la transcripción y traducción enlazada al ADN que codifica para la proteína deseada, de tal forma que permita la expresión génica y la producción de la proteína. Primero en orden para que el gen sea transcrito, debe ir precedido de un promotor reconocible por la ARN polimerasa, a la cual la polimerasa se une e inicia de esta manera el proceso de transcripción. Existe una variedad de dichos promotores en uso, los cuales funcionan con diferentes eficiencias (promotores fuertes y débiles). Para hospederos eucarióticos, pueden usarse diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y traducción, dependiendo de la naturaleza del hospedero. Pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma de bovinos, virus de simios, o similares, en donde las señales reguladoras se asocian con un gen particular el cual tiene un alto nivel de expresión. Ejemplos son el promotor TK del virus de herpes, el promotor temprano de SV40, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Pueden seleccionarse señales reguladoras del inicio de la transcripción que permitan represión y activación, de modo que pueda modularse la expresión de los genes. La molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína híbrida de la invención, es insertada en vectores que tienen las señales reguladoras de la transcripción y traducción enlazadas operablemente, la cual es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas en la célula hospedera. Las células que han sido transformadas establemente por el ADN introducido, pueden seleccionarse introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de células hospederas que contienen al vector de expresión. El marcador puede proveer también fototrofia a un hospedero auxotrópico, resistencia a biocidas, por ejemplo, antibióticos, o metales pesados tales como cobre, o similares. El gen del marcador seleccionare puede enlazarse directamente a las secuencias génicas del ADN que se va a expresar, o pueden introducirse en la misma célula mediante cotransfección. Pueden requerirse también otros elementos para la síntesis óptima de proteínas de la invención. Los factores de importancia para seleccionar un vector viral o plásmido particular, incluyen: la facilidad con la cual células receptoras, que contienen al vector, pueden reconocerse y seleccionarse de aquellas células receptoras que no contienen al vector; el número de copias del vector que se deseen en un hospedero particular; y, si es deseable, sean capaces de "hacer ir y venir" el vector entre células hospederas de diferentes especies. Una vez que se han preparado los vectores o la secuencia de ADN que contiene a las construcciones para expresión, las construcciones de ADN pueden introducirse en la célula hospedera adecuada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc. Las células hospederas pueden ser procarióticas o eucarióticas.

Se prefieren hospederos eucarióticos, por ejemplo, células de mamífero, tales como células de humano, mono, ratón, y células de ovario de hámster chino (CHO), debido a que proveen modificaciones de post-traducción para las moléculas de proteína, incluyendo corrección de plegamiento o glucosilación en sitios correctos. Asimismo, células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones de péptidos post-traducción, incluyendo glucosilación. Existen muchas estrategias de ADN recombinante que usan secuencias de promotores fuertes y alto número de copias de plásmidos que pueden usarse para la producción de las proteínas deseadas en levaduras. La levadura reconoce secuencias guía en productos clonados de genes de mamífero, y secreta péptidos que poseen secuencias guía (es decir, pre-péptidos). Después de la introducción de los vectores, las células hospederas se desarrollan en un medio selectivo, el cual selecciona para el crecimiento de células que contienen al vector. La expresión de las secuencias génicas clonadas, resulta en la producción de las proteínas deseadas. La purificación de las proteínas recombinantes obtenidas de esta manera, se lleva a cabo de acuerdo al método de la invención. Una modalidad muy detallada de la presente invención se presentará en la siguiente parte de esta especificación, y se resume esquemáticamente en la figura 1.

Abreviaturas FNT Factor de necrosis tumoral TBP Proteína de unión al FNT IDA Acido iminodiacético Quelato de Cu FF Quelato de cobre de flujo rápido Q-SEPH.FF Q-Sepharose de flujo rápido SP-SEPH.FF SP-Sepharose de flujo rápido Butyl-SEPH FF Butyl-Sepharose de flujo rápido IEC Cromatografía de intercambio iónico ACN Acetonitrilo CBB Azul brillante de Coomassie ADN Acido desoxirribonucleico EtOH Etanol HIC Cromatografía de interacción hidrofóbica IEF Enfoque isoeléctrico ÍE A Prueba inmunoenzimométrica IFMA Prueba ¡nmunofluorimétrica IPC Control durante el procedimiento KD Kilodaltons LOQ Límite de cuantificación OD Densidad óptica l Punto isoeléctrico RP-HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase invertida SDS-PAGE o SDS Electroforesis de dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida SE-HPLC Cromatografía de líquidos de alto rendimiento de exclusión por tamaño S W Estándares de peso molecular SS Sulfato de sodio Tris Tris(hidroximetil)aminometano BV Volumen del lecho BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA La figura 1 muestra un diagrama de flujo del procedimiento usado para la purificación de r-hTBP-1. Del paso de captura al logro del material global de r-hTBP-1 , se realizan 8 pasos, siendo el más crítico el paso de captura. Cada uno de los pasos se describirá y detallará en los siguientes ejemplos: EJEMPLOS Materiales Equipo Columna cromatográfica XK26/20 (2.6x20 cm) Pharmacia Columna cromatográfica XK50/20 (5x20 cm) Pharmacia Bomba peristáltica Miniplus 2 Gilson Bomba peristáltica P-1 Pharmacia Registrador de gráficos 2210 Pharmacia Detector de luz UV Uvicord 2158 Pharmacia Monitor de conductividad-pH en línea Biosepra Sistema cromatográfico de baja presión FPLC Pharmacia Sistema de CLAR analítico Merck Detector fluorimétrico modelo 9070 Varían Caja refrigerada MCF-1500 Angelantoní Espectrofotómetro de luz UV UV1204 Shimadzu Sistema de ultrafiltración modelo Minitan Millipore Placas Minitan 4/K Millipore Celda agitada modelo 8400 Amicon Celda agitada modelo 8050 Amicon Membrana de ultrafiltración tipo YM10 Amicon Membrana de ultrafiltración tipo Y 10 Amicon Resinas y columnas SP Sepharose FF Pharmacia Q Sepharose FF Pharmacia Butyl Sepharose FF Pharmacia Sepharose quelante FF Pharmacia SP Sepharose, perlas grandes Pharmacia Phenyl Sepharose 6 FF (alto sub.) Pharmacia CM Sepharose FF Pharmacia DEAE Sepharose FF Pharmacia DEAE-HyperD Biosepra Supeicosil LC-308 0.46x5 Supelco Aquapore RP-300 Brownlee Applied Biosystems TSK-G2000 SWXL 0.78x30 TOSO-HAAS Mono-Q HR 5/5 Pharmacia Compuestos químicos Tris(hidroximet¡l)-amino metano (Tris) Merck Cloruro de sodio Merck Acido orto-fosfórico a 85% Merck Hidróxido de sodio (pellas) Merck Fosfato ácido disódico Merck Fosfato diácido de sodio Merck Etanol absoluto Merck Acetonitrilo (ACN) Merck Acido trifluoroacético (TFA) Baker Hidróxido de sodio a 50% Baker Sulfato de sodio Merck Sulfato de cobre Merck Cloruro de zinc Merck Acido clorhídrico a 37% Merck 1 -propanol cod. 1024 Merck Acido etílendiaminotetraacético (EDTA) Merck Sulfato de amonio Merck Materiales biológicos r-hTBP-1 , cosecha cruda INTERPHARM LABORATORIES LTD. McAb para TBP-1 , clon 18 INTERPHARM LABORATORIES LTD. Albúmina estándar, cod. 2321 Pierce Se describirá ahora en detalle la purificación de r-hTBP-1 (Onercept).

Paso 1 - paso de captura Descripción de reguladores de pH y soluciones Regulador de pH de carga de resina Se disuelven 32 g de sulfato de cobre en 900 mi de agua purificada, y después de disolución, el volumen se lleva a 1 litro.

Agua acidificada Se añaden 0.5 mi de ácido acético a 1 litro de agua.

Regulador de pH de equilibrio Se disuelven 1.68 +/-0.1 mi de ácido orto-fosfórico a 85% y 1 1.68 +/-0.1 g de NaCI en 900 mi de agua purificada, el pH se ajusta a 6.8+/- 0.1 con solución de NaOH a 50%, y el volumen se lleva a 1 litro.

Solución de lavado Se usa 1 litro de agua purificada como solución de lavado.

Regulador de pH de elución (se ha puesto a prueba una escala de pH 2.8 a 3.2) Se disuelven 6.75+/-0.5 mi de ácido orto-fosfórico a 85% y 5.84+/-0.1 g de NaCI en 900 mi de agua purificada, el pH se ajusta a 3+/-0.1 con solución de NaOH a 50%, y el volumen se lleva 1 litro. La conductividad resultante es de 15+/-1 mS.

Regulador de pH de regeneración Se disuelven 18.61 +/-0.1 g de EDTA y 58.4+/-1 g de NaCI en 900 mi de agua purificada, y el volumen se lleva a 1 litro.

Solución de sanitización Se disuelven 40 g de NaOH en 900 mi de agua purificada, volumen se lleva a 1 litro.

Solución de almacenamiento Se usa etanol a 20% o NaOH a 0.01 M como solución de almacenamiento.

Preparación de la columna Se acoplan 8+/-1 mi de Sepharose quelante, de flujo rápido (Amersham Biosciences) con resina de ácido iminodiacético, y se empacan en la columna cromatográfica, de modo que la altura del lecho sea de 4+/-0.5 cm. La columna empacada se lava con 10 BV de agua acidificada, y se carga entonces con 2 BV de sulfato de cobre a 0.2 M, pH 4-4.5. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se usa una solución a 2-3 mM de acetato de sodio, pH 4-4.5, para facilitar la disolución del sulfato de cobre y evitar la precipitación a pH neutro. La resina se lava entonces con 10 BV de agua acidificada.

Procedimiento La cosecha cruda que contiene r-hTBP-1 (proteína recombinante-1 de unión al FNT), almacenada a 4°C, se lleva a temperatura ambiente; el pH se ajusta a 6.8 mediante la adición, gota a gota, de ácido orto- fosfórico a 85%, y la conductividad se lleva a 21+/-1 mS mediante la adición de NaCI crudo (puede aplicarse también la cosecha cruda después de una fase de concentración preliminar de ultrafiltración para remover los componentes del medio que podrían afectar negativamente la interacción de r-hTBP- con cobre). La columna preparada como se describió anteriormente es equilibrada primero mediante baldeo con 15-20 BV de regulador de pH de equilibrio, y se carga entonces con la cosecha cruda de r-hTBP-1 mediante operación a temperatura ambiente (22+/-3°C) y una velocidad de flujo lineal de 200 ml/cm2/hora. La columna se lava primero con regulador de pH de equilibrio hasta que la señal de luz UV alcance la línea de referencia, y entonces se lava con 12-15 BV de agua, y se desecha el efluente de la columna. La elución se lleva a cabo con el regulador de pH de elución, y se inicia la colecta del eluato cuando se detecta una señal de luz UV. La elución de r-hTBP-1 se logra con 5-6 BV de regulador de pH de elución. El efluente que contiene r-hTBP-1 semipurificada, se recoge y se almacena a -20°C. La columna se regenera con 3 BV de regulador de pH de regeneración, y se desecha el efluente de la columna. Después, la columna es sanitizada con 5 BV de solución de sanitización. Para almacenamiento, la columna se lava con 5 BV de solución de almacenamiento, y se almacena con la misma.

Los datos de pureza después de este paso, se resumen en el cuadro 1 más adelante.

Rendimiento del paso de captura (comparación con I AC de El paso de captura se llevó a cabo originalmente sobre una columna de IMAC de quelato de Zn2+. Sin embargo, se consideró que la capacidad de carga del paso de captura para la r-hTBP-1 cruda es demasiado baja (250-300 mcg de r-hTBP-1 o 40 volúmenes de columna de cosecha cruda/ml de resina). Mediante el reemplazo de zinc con cobre como metal de carga, se ha obtenido un incremento significativo en la capacidad de carga. Durante este paso de captura de IMAC de Cu2+, la r-hTBP-1 es unida a la resina, la mayor parte de las proteínas contaminantes son eluidas en la fracción no unida, y se obtiene r-hTBP-1 semipurificada en la elución con un nivel de pureza adecuado para los siguientes pasos. Mediante las condiciones seleccionadas, se ha logrado la mejora requerida en la capacidad de unión, junto con algunas otras ventajas. Los resultados más relevantes relacionados con la presente invención, se resumen a continuación. El paso de captura de r-hTBP-1 , llevado a cabo mediante cromatografía de quelato de metal, muestra las siguientes características: 1. Concentración: concentración de r-hTBP-1 25 a 30 veces mayor, en comparación con la cosecha cruda (véase el cuadro 1). 2. Purificación: el paso es efectivo en la reducción de los contaminantes, como se muestra en el cuadro 1. 3. Capacidad de aumento progresivo. El método es adecuado para aumento progresivo y escala industrial; 4. Productividad: la recuperación del paso es satisfactoria, como se muestra en el cuadro 2. Además, el paso es muy rápido, reproducible y fácil de llevar a cabo. La resina puede usarse otra vez después de la sanitización y recarga adecuadas. Además, las principales ventajas del uso de Cu2+ sobre Zn2+, pueden resumirse de la manera siguiente: - Mayor capacidad de carga: 1 mi de resina de Cu se une a 1-1.2 mg de r-hTBP-1 , contra 0.25-0.5 mg/ml de resina de Zn; - Mejora del nivel de pureza del material después del paso de captura de 30 a 35% obtenido mediante la resina de Zn, por 40 a 50% de la resina de Cu, como se muestra en el cuadro 2 (RP-HPLC cuantitativa). - Reducción del número de pasos de lavado de 3 de resina de Zn, a 1 de resina de Cu, con una reducción del tiempo de trabajo y consumo de regulador de pH.

CUADRO 1 Captura de r-hTBP-1 con quelato de Cu - datos de recuperación mediante IEMA calculado respecto a la cantidad total de r-hTBP-1 cargada.

Paso 2 - cromatografía de intercambio iónico sobre SP Sepharose FF Descripción de reguladores de pH y soluciones Regulador de pH de equilibrio Se añaden 1.68 mi de ácido orto-fosfórico a 85% y 17.53 g de NaCI a 900 mi de agua con agitación. El pH se ajusta a 3.0+/-0.1 con NaOH a 50%, y el volumen se ajusta a 1 litro.

Regulador de pH de lavado Se añaden 0.68 mi de ácido orto-fosfórico a 85% a 900 mi de agua, con agitación. El pH se ajusta a 4.0+/-0.1 con NaOH a 50%, y el volumen se ajusta a 1 litro.

Regulador de pH de elución Se añaden 3.37 mi de ácido orto-fosfórico a 85% y 17.53 g de NaCI a 900 mi de agua, con agitación. El pH se ajusta a 4.0 ± 0.1 con NaOH a 50%, y el volumen se ajusta a 1 litro.

Regulador de pH de regeneración Se añaden 3.37 mi de ácido orto-fosfórico a 85% y 116.8 g de NaCI a 900 mi de agua, con agitación. El pH se ajusta a 6.0±0.1 con NaOH a 50%, y el volumen se ajusta a 1 litro.

Solución de sanitización Se disuelven 20 g de NaOH en 900 mi de agua, con agitación, y el volumen se ajusta a 1 litro.

Solución de almacenamiento Se añaden 200 mi de etanol absoluto a 800 mi de agua bajo agitación.

Preparación de la columna La columna se empaca con resina de SP-Sepharose FF, siguiendo las instrucciones del fabricante, hasta una altura del lecho de 6-6.5 cm. La columna es sanitizada baldeando 3 BV de NaOH a 0.5M, seguido de 3 BV de agua. La columna se equilibra mediante baldeo de 4-5 BV de regulador de pH de equilibrio. Se verifican el pH y la conductividad del efluente de la columna (pH 3.0±0.1 , conductividad de 29.5+0.5 mS/cm), y la columna se equilibra además finalmente si los valores medidos no están dentro de las escalas indicadas. NB: en forma alternativa, el regulador de pH de equilibrio puede reemplazarse con regulador de pH de fosfato a 25 mM, pH 2.8+/-0.1 sin NaCI; el regulador de pH de lavado puede eliminarse; el regulador de pH de regeneración puede reemplazarse con NaCI a 1.5 M; y la solución de almacenamiento puede reemplazarse con NaOH a 10 mM.

Procedimiento Todas las operaciones se llevan a cabo a una temperatura de 2 a 8°C, y a una velocidad de flujo de 40-50 ml/cm/hora. Se descongela la r-hTBP-1 congelada obtenida de la elución del paso de captura a temperatura ambiente o 6±2°C. El pH se ajusta de 3.7±0.2 a 3±0.1 añadiendo ácido fosfórico a 85%, y se ajusta la conductividad de 14+3 mS/cm a 22+3 mS/cm añadiendo cloruro de sodio sólido, y la solución se carga sobre la columna. Después de que concluye la carga, la columna se baldea con 3 BV de regulador de pH de equilibrio, seguido de 4 BV de regulador de pH de lavado. En forma alternativa, puede eliminarse el lavado con el regulador de pH de lavado (véase la nota de NB anterior). Entonces, se inicia la elución con regulador de pH de elución. La r-hTBP-1 comienza a eluir después de 180-220 mi. Esta primera parte se desecha, y se recogen los siguientes 3.5 BV que representan la r-hTBP-1 semipurificada. La fracción eluida se muestrea (5x0.5 mi) para IPC, y se almacena a 6±2°C por no más de 3 días. Después de que concluye la elución, la columna se baldea con aproximadamente 3 BV de regulador de pH de regeneración. La fracción (1x1 mi) se muestrea y se desecha. Para almacenamiento, la columna se baldea con 3 BV de EtOH a 20% (o, en forma alternativa, con NaOH a 10 mM), y se almacena a 6+/-2°C. Los resultados de siete experimentos de este paso se dan en el cuadro 2 siguiente: CUADRO 2 Rendimiento del paso de cromatografía de intercambio catíóníco El cuadro 3 siguiente muestra el rendimiento de la combinación de los pasos de IMAC y SP-Sepharose FF.

CUADRO 3 Pureza de la r-hTBP-1 obtenida de diferentes fuentes Paso 3 - ultrafiltración del eluato de SP Procedimiento Todas las operaciones se llevan a cabo a temperatura ambiente (23±3°C). El ultrafiltro almacenado en NaOH se lava con agua hasta pH 7.0+0.5. El ultrafiltro ensamblado con membrana se carga con la solución de r- hTBP-1. La solución se concentra hasta 50 mi. La fracción de material retenido se diluye con aproximadamente 200 mi de agua, y se concentra de nuevo hasta 50 mi. El paso de lavado descrito anteriormente se repite tres veces más. Se verifica la conductividad del material permeado: si es <0.5 mS/cm, comenzar con el siguiente paso. Si el valor de conductividad es >0.5 mS/cm, repetir una vez más el presente paso de lavado. Se añaden 200 mi de Tris a 50 mM (a pH 9.0+0.1 y conductividad de 0.55+0.1 mS/cm) a la fracción de material retenido, y se concentra de nuevo hasta 50 mi de solución. La operación descrita anteriormente se repite tres veces y, si es necesario, continúa hasta que el pH y la conductividad de la fracción de material permeado sean de 9.0+0.2 y 0.55+0.1 mS/cm, respectivamente. La fracción de material retenido se recoge, y el ultrafiltro se lava con tres alícuotas de 100 mi de Tris a 50 mM (a pH 9.0+0.1 y conductividad de 0.6+0.1 mS/cm), añadiendo las fracciones de lavado. El ultrafiltro se lava y se sanitiza con NaOH a 0.1 M (o, en forma alternativa, NaOH a 0.5 M) mediante recirculación por no más de 30 minutos. El ultrafiltro se enjuaga con agua, hasta que el pH del material permeado sea de 7.0±0.5. El ultrafiltro se almacena entonces en 0.01 M o, en forma alternativa, NaOH a 0.05 M a 23±3°C.

Paso 4 - cromatografía de intercambio iónico sobre Q-Sepharose FF Regulador de pH y soluciones Regulador de pH de equilibrio: Tris a 50 mM, pH 9.0+0.1 , conductividad de 0.55+0.1 mS/cm. Regulador de pH de elución: Tris a 250 mM, pH 9.0+0.1 , NaCI a 50 mM, conductividad de 7.2±0.5 mS/cm. Regulador de pH de regeneración: Tris a 250 mM, pH 6.0+0.1 , NaCI a 2 M o, en forma alternativa, NaCI a .5 M. Solución de sanitización: NaOH a 0.5 M. Solución de almacenamiento: etanol a 20% o NaOH a 10 mM.

Procedimiento Todas las operaciones se llevan a cabo bajo las siguientes condiciones: Temperatura: 2-8cC o, en forma alternativa, temperatura ambiente; velocidad de flujo lineal: 80-90 ml/cm2/hora. Se verifica el pH de r-hTBP-1 post ultrafiltración y, si es diferente de pH 9.0+0.1 , se ajusta con Tris a 1 M o HCI a 3M. Se verifica también la conductividad. La columna se empaca con resina de Q-Sepharose FF, siguiendo las instrucciones del fabricante, hasta una altura del lecho de 13 cm.

La columna de Q-Sepharose se sanitiza entonces baldeando 3 BV de NaOH 0.5 M, seguido de 6 BV de agua. Entonces, la columna se baldea con 4 BV de regulador de pH de elución, y se equilibra con 7-8 BV de regulador de pH de equilibrio, y se verifica el pH y la conductividad del efluente de la columna (pH 9.0+0.2, conductividad de 0.55+0.1 mS/cm). El equilibrio de la columna se realiza finalmente en forma continua, si los valores medidos no están dentro de las escalas indicadas. La columna se carga entonces con la r-hTBP- ultrafiltrada preparada como se indicó anteriormente. Después de que concluye la carga, la columna se baldea con 3 BV de regulador de pH de equilibrio. Se inicia la elución con el regulador de pH de elución. La h-hTBP-1 pura comienza a eluir después de 1 BV; se inicia la colecta de r-hTBP-1 después del primer BV de acuerdo al perfil cromatográfico; entonces, la elución concluye después de 5-6 BV. La columna se baldea con 3 BV de regulador de pH de regeneración, se muestrea (1 x 1 mi) y se desecha entonces. La columna se baldea de nuevo con 3 BV de NaOH a 0.5 M, y se enjuaga con agua hasta que el pH del efluente esté entre 7 y 8. Por último, la columna se baldea con 3 BV de EtOH a 20%, y se almacena a 2 a 8°C.

Paso 5 - nanofiltración sobre DV 50 PALL Se instala el soporte de acero inoxidable en el soporte de discos, y se coloca el filtro DV50 (47 mm de diámetro) sobre el soporte. El Pall Ultipor® VF Grado DV50, es un cartucho de filtración que se usa normalmente para la remoción de virus. Se añaden unas cuantas gotas de agua arriba del disco. Se instalan sellos adecuados, y el soporte de discos se cierra herméticamente. El sistema se llena con 50 mi de regulador de pH de elución Q, se cierra y se conecta a la fuente de nitrógeno. Al inicio del baldeo, el nitrógeno se abre a una presión inicial de 0.5 bars, y entonces la válvula de desfogue localizada sobre el soporte de discos se abre para purgar el sistema. Tan pronto como la primera gota de líquido aparece en la válvula de desfogue sobre el soporte de discos, se cierra herméticamente, y el nitrógeno se abre a la presión correcta, 3.0-3.5 bars. La membrana se baldea entonces con los 50 mi de regulador de pH para asegurar que la membrana esté húmeda para eliminar aire, si está presente, entre las capas de la membrana y realice la prueba de integridad sobre el filtro. El sistema se llena con el material proveniente del paso anterior, y se opera de la manera siguiente: al inicio de la filtración, el nitrógeno se abre a una presión inicial de 0.5 bars, y entonces la válvula de desfogue localizada sobre el soporte de discos se abre para purgar el sistema. Tan pronto como la primera gota de solución comienza a aparecer, la válvula de desfogue del soporte de discos se cierra, y el nitrógeno se abre a una presión de 1.5-2.5 bars. La presión de nitrógeno se mantiene a 1.5-2.5 bars, y entonces ia solución se filtra. La solución filtrada se recoge en un contenedor, y al final de la filtración, la fuente de nitrógeno se cierra y la válvula de desfogue se abre para eliminar el exceso de nitrógeno. Al final de la filtración, el sistema se lava con 5 a 10 mi del regulador de pH de elución del paso anterior, a la misma presión de trabajo de 1.5-2.5 bars. La solución de lavado se recoge en el mismo contenedor de la solución filtrada, y se muestrea para IPC.

Paso 6 - interacción hidrofóbica sobre butyl Sepharose FF Reguladores de pH y soluciones Regulador de pH de equilibrio: Tris-HCI a 200 mM, pH 7.5±0.1 , Na2S04 a 1 M, conductividad de 90±5 mS/cm. Regulador de pH de elución: Tris-HCI a 200 mM, pH 7.5+0.1 , Na2S04 a 0.7 M, conductividad de 75+5 mS/cm. Solución de regeneración: agua purificada. Solución de sanitización: NaOH a 1 M. Solución de almacenamiento: etanol a 20% o NaOH a 10 mM. Procedimiento Todas las operaciones se llevan a cabo a una temperatura de 23+3°C y a una velocidad de flujo lineal de 80-90 ml/cm/hora. Se añade Na2S04 sólido al eluato de Q-Sepharose, post-ultrafiltración a 100 KD bajo agitación, hasta 1 M. Después de que concluye la disolución de la sal, el pH se ajusta a 7.5±0.1 con HCI a 3 M. La columna se baldea entonces con 3 BV de NaOH a 1M, seguido de 4 BV de agua purificada. La columna se baldea de nuevo con 5-6 BV de regulador de pH de equilibrio. Se verifican el pH y la conductividad del efluente (pH 7.5±0.2, conductividad de 90+5 mS/cm), y el equilibrio de la columna se realiza continuamente, si los valores medidos están fuera de las escalas indicadas. La solución preparada como se indicó anteriormente se carga a la columna y, después de que concluye la carga, la columna se lava con 3 BV de regulador de pH de equilibrio. Se continúa el lavado con regulador de pH de equilibrio. Después de 2-3 BV de lavado, las proteínas comienzan a eluir. Esta fracción contiene r-hTBP- , casi 10 a 12% del total, contaminadas por contaminantes del cultivo de células. Este lavado se prolonga hasta que la elución de la proteína alcance la meseta, dando un valor máximo amplio (aproximadamente 2 BV). Entonces, la elución se inicia con regulador de pH de elución. Los primeros 1-2 BV se reúnen con la muestra de lavado, puesto que contienen una pequeña cantidad de contaminantes, e inmediatamente después, se inicia la colecta de r-hTBP-1. La r-hTBP-1 purificada es eluida de inmediato después de que el material contaminado y la elución continúan durante otros 2.5-3 BV. La colecta se detiene cuando la absorbencia de luz UV alcanza los 0.5% del máximo. Después de la colecta de la r-hTBP-1 , la fracción (5x0.5 mi) se muestrea y se almacena a 2 a 8°C por no más de 3 días. La columna se baldea con 3 BV de agua purificada, y se recoge la fracción. Se sanitiza la columna con 3 BV de NaOH a 1 M, y se enjuaga con agua hasta que el pH del efluente esté entre 7 y 8. Entonces, la columna se baldea de nuevo con 3 volúmenes de columna de etanol a 20%, y se almacena a temperatura ambiente por no más de 2 semanas.

Paso 7 - ultrafiltración a 10 KD El tipo de célula agitada 8400, ensamblado con la membrana, se carga con el eluato de Butyl-Sepharose. La solución se concentra hasta aproximadamente 25 mi, bajo presión de nitrógeno de 3 bars. La fracción de material retenido se diluye con aproximadamente 100 mi de agua, y se concentra de nuevo hasta 25 mi. El paso de lavado descrito anteriormente se repite tres veces más. Se verifica la conductividad del material permeado: si es <0.3 mS/cm, entonces puede iniciarse el siguiente paso. Si el valor de conductividad es >0.3 mS/cm, debe repetirse el paso de lavado. Se añaden 100 mi de regulador de pH global a la fracción de material retenido, y se concentran de nuevo hasta 25 mi de solución. Esta operación se repite tres veces y, si es necesario, hasta que el pH y la conductividad de la fracción de material permeado sea de 7.1+0.2 y 5.8+0.2 mS/cm, respectivamente. La fracción de material retenido se desecha y se carga sobre el tipo de célula 8050 agitada más pequeña de la ultrafiltración, ensamblado con la membrana. El material retenido se concentra hasta un volumen mínimo (aproximadamente 3-5 mi). La fracción de material retenido se recoge, y el ultrafiltro con el volumen se lava añadiendo las fracciones de lavado a la r-hTBP- concentrada. El volumen final se ajusta para obtener una concentración final de aproximadamente 20-30 mg/ml mediante OD a 280 nm (e=0.71 ). Los~u Itraf iltros ~sen lavan y~se "sañitizañ ~ con ~NaO H a" 072 "M mediante recirculación durante por lo menos 30 minutos. Los ultrafiltros se enjuagan entonces con agua, hasta que el pH del material permeado sea de 7.0+0.5. Los ultrafiltros se almacenan entonces en NaOH a 0.01 M a 6±2°C.

Paso 8 - microfiltración Se conecta una jeringa desechable a un filtro de 0.22 mieras, lleno con la solución concentrada de r-hTBP-1 , se filtra y se lava dos veces con 1 mi de regulador de pH global, reuniendo los lavados con el volumen filtrado. La solución resultante se muestrea para pruebas analíticas (15 x 0.2 mi), y se almacena a -20°C. Los resultados son satisfactorios bajo los puntos de vista de cuantificación y pureza, como se muestra mediante los siguientes cuadros (cuadros 4 a 6) que reflejan los resultados de un número adecuado de replicaciones de este procedimiento (serie). Más crítico para el procedimiento de esta invención, es el paso de cromatografía inicial sobre la columna de quelato de Cu+2. Además, es importante también la combinación de la cromatografía con SP-Sepharose a un pH ácido, con una posterior Q Sepharose a un pH básico. En estas condiciones, se han obtenido resultados notablemente buenos sometiendo una cosecha cruda de producción de r-hTBP-1 (Onercept) por células CHO.

Se ha mostrado que el paso de captura en particular es capaz de concentrar 25 a 30 veces más r-hTBP-1 , para reducir efectivamente los contaminantes, para tener una recuperación satisfactoria de la proteína, y para aumento en proporción para fabricación industrial. Aún más sorprendente es el hecho de que se obtienen datos de pureza sobresalientes cuando el material de partida es un sobrenadante crudo del cultivo de células que contienen suero, y cuando proviene de cultivos libres de suero, como se muestra a continuación.

CUADRO 4 Datos de recuperación gradual y acumulativa Butyl- Volumen SP-Sepharose Q-Sepharose filtrado CUADRO 5 Datos de cuantificación global mg de r-hTBP-1 obtenidos mediante OD.

CUADRO 6 Datos de pureza global Mediante la aplicación de pasos análogos del procedimiento al otro receptor de FNT, r-hTBP-2, se obtienen datos de cuantificación y pureza similares.

Protocolos analíticos 1. Procedimiento de trabajo con RP-HPLC cuantitativa Se ha usado el siguiente método para cuantificar la r-hTBP-1 en todas las muestras de purificación. Usa una columna C8 con TFA acuoso y n-propanol; se obtiene una buena resolución entre la r-hTBP-1 y los contaminantes del cultivo de células. La r-hTBP-1 puede resolverse en uno o dos valores máximos, dependiendo del lote de la columna. El procedimiento se describe a continuación. 1.1 Equipo y materiales y método - Sistema de HPLC analítica (Merck o equivalente) - Mezclador dinámico (Merck o equivalente) - Columna: SUPELCOSIL LC-308 0 0.46x5 cm - cod. 5-8851- Supelco - Eluyente A: TFA acuoso a 0.1 % - Eluyente B: TFA a 0.1% en agua/n-propanol 50:50 - Eluyente C: acetonitrilo - Temperatura: 23±3°C - Detección de luz UV: 214 nm - Tiempo de inyección: 62 minutos - Volumen de inyección: 10-100 µ? - Estándar: BTC10, 1.53 mg/ml mediante OD a 280 nm (e=0.71 ), inyectados a 10 y 20 µ? - Gradiente: 1.2 Cálculo Se ha obtenido la cantidad de r-hTBP-1 en cada muestra de purificación, de la manera siguiente: - Calcular el factor de respuesta (RF) para el estándar (BTC10), de acuerdo a la fórmula: pj = TBP1, mcg/ml TBP1, área máxima Multiplicar el área máxima de r-hTBP-1 de cada muestra por el RF del estándar durante la concentración de la muestra en mcg/ml, como se muestra: TBP1 , mcg/ml = TBP1 , área máxima x RF estándar Favor de notar que: - El BTC 10 usado como estándar, se ha elegido con base en la disponibilidad; - El tiempo de retención del valor máximo de r-hTBP-1 puede variar en cada nueva preparación de regulador de pH (1 -3 minutos); - La muestra concentrada tiene que diluirse en el eluyente A. 2. Procedimiento de trabajo con RP-HPLC fluorimétrica Con base en experiencias previas con otras proteínas recombinantes, se ha diseñado un análisis de RP-HPLC con una detección fluorimétrica, para calcular el nivel de pureza de los contaminantes del cultivo de células residuales en volúmenes de r-hTBP-1 y en muestras del procedimiento, puesto que no se contaba con método inmunoquímico alguno cuando se inició el estudio de purificación. Se encontró que este método es útil para monitorear la remoción de contaminantes del cultivo de células en el último paso de purificación, es decir, cromatografía de Butyl Sepharose, y fue determinante en la selección de las condiciones operativas del paso anterior, puesto que podría usarse para analizar las muestras en el procedimiento, y no se requieren materiales y/o aparatos especiales. La RP-HPLC es rápida (tiempo de 62 minutos), y da resultados comparables al inmunoensayo cuando se cuenta con esta prueba. Puesto que no había aún un estándar para contaminantes, se usó como un estándar una solución de BSA de Pierce para calcular el nivel de contaminación en las muestras. Como la RP-HPLC cuantitativa, esta prueba da una buena resolución entre la r-hTBP-1 y el área de BSA. 2.1 Equipo, materiales y método - Sistema de HPLC analítica (Merck o equivalente) - Mezclador dinámico - Detector fluorimétrico (Varían o equivalente) - Columna: Aquapore RP-300, 7µ, Brownlee, 0 0.46x22 cm -cod. 071 1-0059, Applied Biosystems - Eluyente A: TFA acuoso a 0.1 % - Eluyente B: TFA a 0.1% en acetonitrilo - Temperatura: 23±3°C - ? de excitación: 220 nm - ? de emisión: 330 nm - Volumen de inyección: 10-100 µ? - Tiempo de inyección: 62 minutos - Estándar: BSA (Pierce), 2 mg/ml, diluido 1 :100, 10 y 20 µ? inyectados; - Control: BTC10, 1.53 mg/ml medíante OD a 280 nm (e=0.71 ), se inyectan 200 µ?; - Muestras de r-hTBP-1 : 1-5 mg/ml mediante OD a 280 nm (e=0.71 ). - Gradiente: Velocidad de Tiempo Paso % de A % de B flujo ml/min (minutos) 1 2 0 70 30 2 2 5 70 30 3 2 15 65 35 4 2 25 50 50 5 2 35 50 50 6 2 36 0 100 7 2 45 0 100 8 2 46 70 30 9 2 61 70 30 2.2 Cálculo Se obtiene la cantidad de contaminantes en cada muestra de purificación de butilo, de la manera siguiente: - Calcular el factor de respuesta (RF) para el estándar (BSA), de acuerdo a la fórmula: BSA, mcg inyectados RF=- BSA, área máxima Multiplicar el área máxima de los contaminantes de cada muestra por el RF del estándar y por 1000, obteniendo la cantidad de contaminantes en la muestra inyectada, en ng. Al dividir este valor entre la cantidad de r-hTBP-1 inyectada, se obtiene la contaminación en partes por millón, de acuerdo a la fórmula: área máxima de contaminarles x RF de BSA x 1000 ppm de contaminartes = TBP1, mg inyectados Favor de notar que: - La muestra de prueba tiene que diluirse en el eluyente A. -La contaminación de la muestra control varía entre 90 ppm. 3. Análisis y caracterización del volumen de r-hTBP-1 Se han diseñado y usado los métodos analíticos descritos más adelante para caracterizar el volumen de la r-hTBP-1 originada mediante el nuevo procedimiento de purificación. 3.1 SE-HPLC Se desarrolló este método con el propósito de cuantificar la cantidad de dímeros y agregados en el volumen final. El método puede discriminar entre el monómero de r-hTBP-1 y su dímero y/o agregados. Esto se ha demostrado poniendo a prueba algunas muestras de r-hTBP-1 después de tratamiento con luz UV, un método ampliamente conocido que genera formas de moléculas agregadas. En resumen, el método se lleva a cabo de la manera siguiente: 3.1.1 Equipo, materiales y método Equipo: sistema de HPLC analítica Columna: TSK G2000 SWXL, cod. 08021 (TosoHaas) Fase móvil: fosfato de sodio a 0.1 M, pH 6.7, sulfato de sodio Temperatura: 23±3°C Detección de luz UV: 214 nm Volumen de inyección: 10-100 µ? que corresponden a 20-30 mcg de r-hTBP-1 (mediante OD) Tiempo de inyección: 30 minutos Estándar: BTC10, 1.53 mg/ml mediante OD a 280 nm (e=0.71), 0 a 20 µ? inyectados Volumen de r-hTBP-1 : diluido a 1-2 mg/ml mediante OD a 280 nm (e=0.71 ), 10 a 20 µ? inyectados La pureza de la muestra se expresa como por ciento de pureza de relación de valor máximo de r-hTBP-1/área total. 3.2 IE-HPLC Se desarrolló este método para evaluar la composición de isoformas en el volumen final con el propósito de reemplazar la técnica de cromatoenfoque usada generalmente para el propósito anterior. En contraste al cromatoenfoque, el análisis de IEC es más ventajoso debido a que es más rápido que el anterior, requiere menos material (150-200 mcg en lugar de 1-2 mg), usa reguladores de pH comunes, y no requiere pretratamiento de la muestra de prueba. Puesto que la r-hTBP-1 es una glucoproteína, como una sustancia de esa naturaleza, se caracteriza por diferentes isoformas que tienen cada una un punto isoeléctrico diferente que determina un comportamiento diferente cuando se pone a prueba mediante un análisis de intercambio iónico. Se obtienen 12 valores máximos diferentes, cada uno correspondiendo a una variante de glucosilación. Mediante el presente método, todas las isoformas de la r-hTBP-1 se han aislado y caracterizado por completo. En resumen, el método se lleva a cabo de la manera siguiente: 3.2.1 Equipo, materiales y método Sistema de HPLC inerte analítica Columna: Mono Q HR 5/5 Regulador de pH A: Tris-HCI a 40 mM, pH 8.5 Regulador de pH B: Tris-HCI a 40 mM, pH 8.5, NaCI Gradiente: Velocidad de flujo: 1 ml/min Temperatura: 23±3°C Detección de luz UV: 220 nm Cantidad de inyección: 10-15 mcl que corresponden a 50-200 mcg de r-hTBP-1 (mediante OD) Tiempo de inyección: 70 minutos Muestra: volumen de r-hTBP-1 y referencia diluidos 1:2 con agua purificada. 4. Cuantificación de r-hTBP-1 mediante OD Se determinó la concentración de los volúmenes de r-hTBP-1 producidos de conformidad con la presente invención, mediante densidad óptica a 280 nm usando el coeficiente de extinción molar (e) calculado propiamente sobre el volumen de r-hTBP-1 producido durante la fase inicial de la purificación de la r-hTBP-1. Se han usado tres volúmenes de r-hTBP-1 representativos producidos con el nuevo procedimiento de purificación, obteniendo e=0.776. Este nuevo coeficiente de extinción se usará para las fases de aumento progresivo y producción. Puesto que la concentración de los volúmenes está en la escala de 20-30 mg/ml, es necesario diluir el material hasta 1 mg/ml con regulador de pH global (PBS a 40 mM, pH 7.1+0.2, NaCI a 10 mM), antes de poner a prueba la absorbancia a 280 nm. 5. Determinación de proteínas mediante el método de Bradford Se usó el método de Bradford para cuantificar proteínas totales en el volumen de r-hTBP-1 (véase Bradford, MM. Analytical Biochemistry 72: 248-254, 1976, y Stoscheck, CM.. Methods ¡n Enzymology 182: 50-69, 1990). El estándar usado en esta prueba es BSA. 6. Bioensavo in vitro La bioactividad de la r-hTBP-1 consiste en su capacidad para unirse al FNT alfa. Esta prueba se usó para poner a prueba las muestras y los volúmenes en el procedimiento.

Claims (4)

49 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para el aislamiento de proteínas puras de unión al FNT, que comprende eluir una solución cruda de una proteína de unión al FNT en una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC) usando cobre como metal. 2 - Un procedimiento para la purificación de proteínas recombinantes de unión al FNT que comprende, como paso de captura, una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados que usa cobre como metal. 3. - El procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque la elución de la columna de IMAC se lleva a cabo a un pH comprendido entre

2.8 y

3.2.

4. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la elución de la columna de IMAC se lleva a cabo a una salinidad comprendida entre 14 a 16 mS. 5 - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende los siguientes pasos, como pasos intermedios: una cromatografía de intercambio iónico (IEC) a un pH ácido, de preferencia entre 3 y 4, seguida de una 50 cromatografía de intercambio iónico a un pH básico, de preferencia entre 8 y 10. 6.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende además, como paso de refinamiento, una cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). 7 - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque cada paso de cromatografía va seguido de un paso de ultrafiltración. 8.- El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la proteína de unión al FNT es hTBP- recombinante. 9.- Un procedimiento para la fabricación de una proteína de unión al FNT, que comprende aislar o purificar la proteína de conformidad con el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.