HRP20050406A2 - Process for the purification of tnf-binding proteins using imac - Google Patents
Process for the purification of tnf-binding proteins using imac Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20050406A2 HRP20050406A2 HR20050406A HRP20050406A HRP20050406A2 HR P20050406 A2 HRP20050406 A2 HR P20050406A2 HR 20050406 A HR20050406 A HR 20050406A HR P20050406 A HRP20050406 A HR P20050406A HR P20050406 A2 HRP20050406 A2 HR P20050406A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- htbp
- column
- chromatography
- tnf
- buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 title 1
- 101100127285 Drosophila melanogaster unc-104 gene Proteins 0.000 title 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 11
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005498 polishing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 abstract description 37
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 77
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 11
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 11
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 9
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 7
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 6
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 description 5
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 5
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 5
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 5
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 5
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 4
- 108010049207 Death Domain Receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009058 Death Domain Receptors Human genes 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 101000597785 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Proteins 0.000 description 4
- 238000012369 In process control Methods 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 102100028785 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Human genes 0.000 description 4
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 4
- 101710165474 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Proteins 0.000 description 4
- 102100035284 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6B Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 4
- 238000010965 in-process control Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 108010046304 B-Cell Activation Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000007536 B-Cell Activation Factor Receptor Human genes 0.000 description 3
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102100028787 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11A Human genes 0.000 description 3
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 3
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- -1 or CDw40 Proteins 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010063916 CD40 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 2
- 101000638255 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 101000638251 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Proteins 0.000 description 2
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 2
- 101000610602 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Proteins 0.000 description 2
- 101000610609 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Proteins 0.000 description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010061593 Member 14 Tumor Necrosis Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010037255 Member 7 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Proteins 0.000 description 2
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108010035042 Osteoprotegerin Proteins 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 108010038036 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Proteins 0.000 description 2
- 102000010498 Receptor Activator of Nuclear Factor-kappa B Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102000050862 Transmembrane Activator and CAML Interactor Human genes 0.000 description 2
- 102100032100 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 2
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 2
- 102100040115 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C Human genes 0.000 description 2
- 102100040110 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10D Human genes 0.000 description 2
- 101710178436 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11A Proteins 0.000 description 2
- 102100032236 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11B Human genes 0.000 description 2
- 101710178302 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Proteins 0.000 description 2
- 101710187780 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 14 Proteins 0.000 description 2
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 2
- 102100022203 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 25 Human genes 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N octadec-7-ynoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC#CCCCCCC(O)=O XXUPLYBCNPLTIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001326 26S Proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 description 1
- 102100029510 26S proteasome regulatory subunit 6A Human genes 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100216285 Arabidopsis thaliana APO3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 1
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 1
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100100117 Homo sapiens TNFRSF10B gene Proteins 0.000 description 1
- 101100153525 Homo sapiens TNFRSF25 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000851434 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Proteins 0.000 description 1
- 101000597779 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Proteins 0.000 description 1
- 101000648503 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 11A Proteins 0.000 description 1
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229910004809 Na2 SO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108091007178 TNFRSF10A Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 102100035283 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 18 Human genes 0.000 description 1
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100033726 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 17 Human genes 0.000 description 1
- 102100022205 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Human genes 0.000 description 1
- 101710187751 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 21 Proteins 0.000 description 1
- 102100022202 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 27 Human genes 0.000 description 1
- 101710187836 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 27 Proteins 0.000 description 1
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012863 analytical testing Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001714 calcium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N ethanol etoh Chemical compound CCO.CCO OCLXJTCGWSSVOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- BCVXHSPFUWZLGQ-UHFFFAOYSA-N mecn acetonitrile Chemical compound CC#N.CC#N BCVXHSPFUWZLGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011012 sanitization Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
- B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Opisan je novi postupak pročišćavanja za faktor tumorske nekroze. Ovaj postupak karakterizira glavni korak koji koristi imobilizirajuću metalnu afinitetnu kromatografiju (IMAC) uz korištenje bakra kao metala. Sve navedeno poboljšava iskorištenje, stupanj čistoće, čistoću finalnog produkta i primjenjivost u industrijskom mjerilu.
Description
Područje izuma
Ovaj izum odnosi se na područje pročišćavanja polipeptida. Točnije, odnosi se na postupak pročišćavanja Faktora Tumorske Nekrozije - vezivnog proteina.
Pozadina izuma
Faktor tumorske nekrozije-alfa (Tumor necrosis factor-alpha TNFA), potentni citokin, odgovoran je za cijeli spektar bioloških odgovora koji su povezani vezanjem na površinske stanične receptore. Receptor za humani TNF-alfa može se izolirati iz humanih histiocitnih limfomnih staničnih linija. (vidi Stauber et. al., J. Biol.Chem.,263, 19090-104,1988).
Korištenjem monoklonalnih antitijela, druga je grupa iznijela dokaze za 2 različita TNF-vezivna proteina, oba specifično vežu TNF-alfa i TNF-beta, i maju visoke afinitete (vidi Brockhaus et al, Proc.Nat. Acad Sci. 87: 7380-7384, 1990) i izolirana je cDNA za jedan od receptora. Oni su utvrdili da odgovara proteinu od 455 aminokiselina koji je podijeljen u ekstracelulanu domenu od 171 aminokiselinskih ostataka i citoplazmatsku domenu od 221 aminokiselinskih ostataka.
Kasnije je grupa (vidi Agarwal et.al Nature 318: 665-667, 1985) pokazala da faktor tumorske nekrozije- alfa i beta, pokazuju učinak na stanično djelovanje vezujući se na slične površinske stanične receptore. TNF-alfa i TNF-beta receptori su različitih veličina i ponašaju se različito u različitim staničnim linijama (vidi Engelmann et al., Biol.Chem. 265: 1531-1536, 1990).
TNF-alfa receptor I, referiran prema nekima kao TNFR55, je manji od 2 receptora. cDNA za oba receptora je klonirana i određena je sekvenca nukleinskih kiselina (vidi Loetscher et.al., Cell 61: 351-359, 1990; Nophar et al.., EMBO J. 9: 3269-3278, 1990; 1990; Schall et al., Cell 61: 361-370, 1990 and Smith et.al., Science 248: 1019-1023, 1990).
Iako su ekstracelularne domene 2 receptora gotovo podudarne u strukturi, čini se da njihove intracelularne domene nisu povezane. Southern blott humanog genoma DNA, koji koristi cDNA 2 receptora kao probu, pokazao je da je svaki enkodiran s jednim genom.
Postoji više pristupa pročišćavanju polipeptida. Kromatografija je najčešće upotrebljavana metoda, što uključuje afinitetnu kromatografiju,u kojoj se tvar pročišćava da se prvo adsorbira na odgovarajućoj koloni, te se na nju veže spoj koji ima visok i specifičan afinet vezivanja te je na taj način tvar imobilizirana, a preostale komponente sirove smjese nisu vezane i prolaze kroz kolonu. Adsorbirana tvar se nakon toga ispire a pri tom se mijenjaju uvjeti kao što je pH i/ili koncentracija soli da bi se dobila djelomično ili sasvim pročišćena molekula.
U području afinitetne kromatografije tehnika IMAC (Imobilizirajuća Metalna Afinitetna (C)kromatografija) posebno je učinkovita u nekim slučajevima (vidi članak od Arnold, Biotehnology, Vol. 9, str. 151-156, Feb.1991). IMAC je opisana kao tehnika za pročišćavanje peptida koji imaju funkcionalne skupine koje sudjeluju u vezivanju metala, kao što su pobočni lanci Glu, Tyr, Cys, His, Asp i Met, kao i amino-terminalni amidni dušik i kisik na karbonilu.
Iako je tehnika moćna, ne podrazumijeva uvijek specifičnost. Na primjer, utvrđeno je da adsorpcija uz Cu2+ na kromatografskoj koloni dobra je za polipeptide koji sadrže jedan ili više histidina, ali je uočeno da nedostatak tri aminokiseline koje su važne za adsorpciju, imenom, histidin, triptofan i cistein, dozvoljava mogućnost adsorpcije ali utječe na specifičnost samog koraka pročišćavanja.
Djelotvornost apsorpcije, općenito za namjene pročišćavanje, ne mora biti optimalna, posebno ako je polipeptid koji se pročišćava glikoprotein. U tom slučaju često ugljikohidratni lanac može zauzeti aktivno mjesto za vezivanje metalnih kelata i tako smanjiti afinitet kromatografske kolone u koraku adsorpcije.
Opis izuma
Utvrđeno je da se TNF vezni protein može djelotvorno pročistiti postupkom Imobilizirajuće Metalne Afinitetne (C)kromatografije (IMAC) pri tom koristeći bakar kao metal. Optimalni uvjeti pH i slanosti za ovaj korak su pH od 2.8 do 3.2, poželjno 3, a slanost od 14 do 16ms, poželjno 15ms.
U skladu sa ovim izumom "TNF - vezni protein" odnosi se na bilo koji protein koji ima afinitet za TNF-alfa ili TNF-beta i/ili protein koji sadrži ekstracelularni, topiv fragmet proteina koji pripada TNF obitelji receptora, ili fragment prethodno svega navedenog.
Navedeni su neki članovi TNF obitelji:
◾ Faktor Tumorske Nekrozije Receptor 1 (TNFR1), također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Receptor Superobitelj, Član 1A (TNNRS1A), ili Faktor Tumorske Nekrozije alfa Receptor (TNFAR) ili FTNR 55-KD ili TNFR 60-KD (vidi opis na OMIM*191190) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)
◾ Faktor Tumorske Nekrozije Receptor 2 (TNFR2), također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Receptor Pod obitelj Član 1B (TNFRP1B), ili Faktor Tumorske Nekrozije beta Receptor (TNFBR) ili FTNR 75-KD ili TNFR80-KD (vidi opis na OMIM*191191)
◾ OX40 Antigen (OX40), koji se također zove Faktor Tumorske Nekrozije Receptor Superobitelj, Član 4 (TNFRS4), ili Tax-Transkripcijski aktivirani Glikoproteinski 1Receptor (TXGP1L) ili Limfoidni aktivacijski antigen ACT35 (ACT35) ili CD134 (vidi opis na OMIM*600315).
◾ CD40L Receptor (CD40), također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Receptor Superobitelj, Član 5 (TNFRS5) ili B-stanični površinski antigen CD40, ili CDw40, ili Bp50 (vidi opis Swiss-Prot Entry No. P25942);
◾ FASL Receptor (FAS) koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Receptor Superobitelj, Član 6 (FTNRS6), ili Apoptozni površinski antigen Površinski antigen FAS ili Apo-1 Antigen ili CD95 (vidi opis Swiss-Prot Entry No. P25445);
◾ Decoy Receptor 3 (DcR3), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 6B (TNFRSF6B) ili Decoy Receptor za FAS Ligand ili M68 (vidi opis Swiss-Prot Entry No.095407)
◾ CD27 Antigen (CD27), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 7 (TNFRSF7) ili T-Stanični Aktivacijski Antigen S152 (S152) (Vidi opis na OMIM*602250)
◾ Limfoidni Aktivacijski Antigen CD30 (CD30), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 8 (TNFRSF8) (Vidi opis na OMIM* 153243),
◾ Indciciran Limfocitni Aktivator (ILA), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 9 (TNFRSF9) (Vidi opis na OMIM*602250)
◾ Receptor Stanične Smrti 4 (Death Receptor DR 4), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 10A (TNFRSF10A), ili FTN –Relevantan Apoptoza Inducirajući Ligand Receptor 1 (TRAILR1) ili APO2 (vidi opis na OMIM*603611);
◾ Receptor Stanične Smrti 5 (DR 5), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 10B (FTNRSF10B), ili TNF –Relevantan Apoptoza Inducirajuči Ligand Receptor 1 (TRAILR2) ili Ubojica/DR5 ili TRICK2 (vidi opis na OMIM*603612);
◾ Decoy Receptor 1 (DCR1), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 10C (TNFRSF10C), TNF –Relevantan Apoptoza Inducirajuči Ligand Receptor 3 (TRAILR3) ili TRAIL Receptor bez intracelularne domene (TRID) (vidi opis na omim*603613)
◾ Decoy Receptor 2 (DCR2), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 10D (TNFRSF10D), TNF –Relevantan Apoptoza Inducirajući Ligand Receptor 4 (TRAILR4) ili TRAIL Receptor sa skraćenom domenom smrti (TRUNDD) vidi opis na OMIM*603612);
◾ Receptor Aktivator NF-KAPPA-B (RANK), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 11A (TNFRSF11A) ili Osteoklastni Diferencijacijski Faktorski Receptor (ODFR) ili PDB2 ili TRANCER (vidi opis na OMIM*603499),
◾ Osteoprotegerin (OPG), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 11B (TNFRSF11B) ili Osteoklastni Inhibitorski Faktor (OCIF) (vidi opis na OMIM*602643),
◾ Receptor Stanične Smrti (DR3), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član 12 (TNFRSF12) ili APO3 ili Limfocitncitni-Asociciran Receptor Stanične Smrti (LARD) (vidi opis na OMIM*603366).
◾ Transmembranski aktivator i Caml Interactor (TACI), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član13B (FTNRSF13B) (vidi opis na OMIM*604907).
◾ BAFF Receptor (BAFFR), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član13C (TNFRSF13C) ili B Stanični –Aktivirajući Faktorski Receptor (vidi opis na OMIM*606269),
◾ Herpesvirus Ulazni medijator, (HVEM), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član14 (TNFRSF14), ili Herpesvirus Ulazni Medijator A (HVEA) ili TR2 (vidi opis na OMIMI* 602746).
◾ Živčani Receptor Faktora Rasta (nerve growth factor, NGFR), koji se također zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član16 (TNFRSF16), ili p75 (NTR) (vidi opis na OMIM*162010)
◾ B-Stanični Faktor Starenja (BCMA), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član17 (TNFRSF17) ili BCM (vidi opis na OMIM*109545)
◾ Glukokortikoidni –Inducirani TNFR –Relevantan Gen (GITR), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član18 (FTNRSF18), ili Aktivacijski Inducibilan FTNR Član Obitelji (AITR), (vidi opis na OMIM*603905).
◾ TRADE, koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član19 (TNFRSF19), ili Toksični i JNK inducirani ili TROY ili TAJ)vidi opis na Swiss-Prot Entry. No. Q9NS68);
◾ X-Povezani Ectodyplasin –A2 Receptor (XEDAR), još se zove EDA-A2 receptor (vidi opis na Swiss-Prot Entry No. Q9HAV5)
◾ Receptor Stanične Smrti 6 (DR 6), koji se također se zove Faktor Tumorske Nekrozije Superobitelj, Član21, (TNFRSF21) (vidi opis na OMIM*605732).
U skladu s prethodnim opisom u izumu FTN - vezni protein je selektiran iz rekombinantne h-TBP-1 (rekombinantni, ekstracelularni, topivi fragment humanog FTN receptora-1, koji sadrži slijed aminokiselina koji odgovara fragmentu od 20-180 aminokiselina prema Nophar et.al.) i rekombinantni h-TBP-2 (rekombinantni, ekstracelularni topivi fragment FTN receptora-2, koji sadrži slijed aminokiselina 23-257 koje odgovaraju Smith et.al.) Najpoželjnije, je rekombinantni Htpb-1 (r-hTBP-1). Za sve ostale topiv proteine, ekstracelularna domena je naznačena u odgovarajućem wiss-Prot entry.
Nadalje u skladu s prethodnim dijelovima izuma, proces pročišćavanja FTN-veznog proteina uključuje "IMAC" korak kao "glavni korak" i nadalje sadrži sljedeće korake kao "među korake": na ionskoj izmjeničnoj kromatografiji (IEC), pri kiselom pH (poželjno između 3 i 4) uz ionsku izmjeničnu kromatografiju pri bazičnom pH (poželjno između 8 i 10).
U skladu sa izumom postupak pročišćavanja FTN-vezivnog proteina sadrži i "polirajući korak"-završni korak, hidrofobnu interakcijsku kromatografiju (HIC).
Još poželjnije je da se nakon svakog prethodno opisanog kromatografskog koraka provede ultrafiltracija.
"Glavni korak" prema ovom izumu je korak u kojem rekombinantni FTN-vezivni protein se izolira i koncentrira iz sirovog supernantanta rekombinantne kulture stanica. Visoko iskorištenje na kraju ovog početnog koraka ima veliki utjecaj na ukupnu izvedbu i iskorištenje cjelokupnog procesa. U sladu s ovim izumom, glavni korak se provodi sa Cu-kelatnim FF i poželjno, na pH 3.0, te je čistača >40% a iskorištenje je > 80 %.
"Među koraci" sastoje se od uklanjanja nečistoća kao što su proteini i nukleinske kiseline, endotoksini i virusi.
"Polirajući koraci" su koraci pri kojima se uklanjaju bilo koji zaostali tragovi nečistoća ili sličnih tvari s ciljem da se dobije visok stupanj čistioče proteina.
"Ionskom izmjeničnom Kromatografijom" (IEC) mogu se odvojiti molekule, s vrlo velikom rezolucijom, koje imaju vrlo male razlike u naboju. Tako dobivene frakcije se skupljaju i koncentriraju. Postupak odvajanja zasniva se na reverzibilnoj interakciji između nabijenih molekula i suprotno nabijenom kromatografskom mediju. Molekule se vežu prolaskom kroz kolonu. Tada se uvjeti promjene tako da se vezana tvar otpušta drugačije. Ispiranje se provodi promjenom koncentracije soli ili pH. Promjene se provode u koracima sa kontinuiranim gradijentom. " Q Sepharose" je kvaterna amonijeva sol, jaki anionski izmjenjivač (nabijene grupe-N+(CH3)3) dok je "SP Sepharose" sulfopropilni jak kationski izmjenjivač (nabijene grupe-SO3-).
Hidrofobna interakcijska kromatografija (HIC) je metoda za pročišćavanje i odvajanje biomolekula i zasniva se na razlikama u površinskoj hidrofobnosti. Proteini i peptidi često imaju hidrofobnu amino kiselinsku domenu daleko od površine molekule. Međutim neke biomolekule koje se smatraju hidrofilne imaju izložene hidrofobne grupe koje mogu interagirati sa hidrofobnim ligandima na kromatografskom matriksu. Uspoređujući sa reverznom faznom kromatografijom, gustoća liganda na matriksu je bitno niža, tako se postiže visoka selektivnost HIC, dok blagi uvjeti pri ispiranju omogućuju sačuvati biološku aktivnost. " Butyl Sepharose" kolona se koristi u skaldu s izumom u hidrofobnoj interakcijskoj kromatografiji (HIC). Na toj koloni n-butilna grupa se koristi kao hidrofobni ligand.
U skladu sa ovim izumom, TNF-vezni protein se dobiva rekombinantnom DNA tehnologijom u eukariotskim stanicama, poželjno stanicama sisavaca. Nadalje će biti opisan kompletan postupak dobivanja navedenog proteina.
U početnom koraku postupka kodirajuća DNA sekvenca za željeni protein se insertira u odgovarajući plazmid. Jednom kad se formira, ekspresijski vektor je unesen u odgovarajuću stanicu domaćina, gdje dolazi do ekspresije vektor(a) u željeni protein.
Ekspresija bilo kojeg rekombinantnog proteina u ovom izumu može se provesti i u eukariotskim stanicama (npr.kvasac, insekt ili stanice sisavaca) ili u prokariotskim stanicama, koristeći pri tom odgovarajući vektor. Može se koristiti bilo koja metoda koja je do sad poznata kao takva.
Na primjer kodirajući DNA molekule za proteine se insertiraju u odgovarajuće konstruiran ekspersijski vektor pomoću tehnika koje su poznate kao takve.(vidi Sambrook et al, 1989)
Duplo pakirana (engl. stranded) c DNA je povezana sa plazmidnim vektorom homoplimernim repom ili restriktivnom vezom koja uključuje korištenje sintetskog DNA linkera ili blut-ended tehnike povezivanja: DNA ligaza se koristi da bi se povezale DNA molekule a neželjeno povezivanje se izbjegava djelovanjem alkalne fosfataze.
Da bi se postigla željena ekspresija proteina, ekspresijski vektor mora sadržavati specifičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži transkripcijske i translacijske regulacijske informacije koje su vezane sa DNA, kodiranjem željenog proteina a na taj način da dopuštaju genu ekspresiju i produkciju proteina. Prvo, da bi gen bio transkribiran mora prvo biti prepoznat od promotorske RNA polimeraze, odnosno mora se vezati na polimerazu i tako inicirati proces transkripcije. Postoje različite vrste promotora, koji imaju različite učinke (jaki i slabi promotori).
Kod eukariotskih stanice domaćina, transkripcijske i translacijske regulacijske sekvence mogu varirati zavisno kakva je priroda stanice domaćina. Navedene sekvence mogu potjecati iz viralnih izvora, kao adenovirusa, goveđi papiloma virus, Simian virus ili neki slični, gdje je regulacijski signal povezan sa određenim genom koji ima visok stupanj ekspresije. Primjer je TK promotor Herpes virusa, SV40 rani promotor, kvaščev gal4 genski promotor, itd. Transkripcijski inicijalni regulacijski signali mogu se aktivirati ili deaktivirati, odnosno ekspresija gena se može modulirati.
DNA molekula sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira hibridni protein u ovom izumu, te je insertirana u vektor(e), koji imaju operabilne povezane transkripcijske i translacijske regulacijske signale, te imaju mogućnost integracije željene genske sekvence u stanicu domaćina. Stanice koje su transformirane zbog uvođenja DNA mogu se selektirati uvođenjem jednog ili više markera kojim se mogu označiti stanice domaćina koje sadrže ekspresijski vektor. Marker se može koristiti i kod fototropije za auksotropičnog domaćina, biocidne rezistencije. npr. na antibiotik, ili teške metale kao bakar ili slično. Odabrani markerski gen može biti ili direktno vezan na DNA sekvencu koja se eksprimira ili može biti unesen u stanicu co-transfekcijom. Dodatni elementi su potrebiti za optimalnu sintezu proteina u ovom izumu.
Faktori koji uključuju važnost u izboru određenog plazmida ili viralnog vektora su:
lakoća kojom stanica primatelj, koja sadrži vektor se može prepoznati i odvojiti od onih stanica koje nemaju vektor; broj željenih kopija u određenoj stanici domaćinu, te potreba da se "prebacuju" vektori između dva domaćina različitih vrsta.
Jednom kad je vektor(i) ili DNA sekvenca pripremljena za ekspresiju DNA, mora se na prikladan način uvesti u stanicu domaćina, te za to postoji više različitih postupaka: transformacija, transfekcija, konjugacija, fusija protoplasta, elektrokorporacija, kalcijum-fosfatna precipitacija, direktna mikroinjekcija itd.
Stanica domaćin može biti ili prokariotska ili eukariotska. Poželjni eukariotski domaćini su npr. stanice sisavaca, kao humane, majmunske, mišje i stanice jajnika od kineskog hrčka (CHO) stanice, zato jer se događaju post-translacijske modifikacije na proteinima, koje uključuju ispravno uvijanje (engl. folding) ili glikozilaciju na točno određenim mjestima. Također, stanice kvasca mogu se provesti post-translacijske modifikacije peptida što uključuje glikozilaciju. Broj rekombinantnih DNA je funkcija jakost promotorske sekvence kao i visok broj kopija plazmida koji se koriste za dobivanje željenog proteina iz kvasca. Kvasac može prepoznati sekvencu kloniranog gena u stanicama sisavca njihove produkte i sekrete peptide (tzv. pro-peptide)
Nakon unošenja vektora, stanica domaćin raste na selektivnoj podlozi, koja uzrokuje rast stanica sa vektorom zaraženih stanica. Ekspresija klonirane genske sekvence(i) rezultira dobivanjem željenog proteina.
Postupak pročišćavanja rekombinantnog proteina je proveden u skladu s metodom u ovom izumu.
Vrlo detaljan opis ovog izuma je priložen u slijedećem dijelu te je shematski sažet u prikazu 1.
Kratice
TNF (Tumor Necrosis Factor) Faktor tumorske nekrozije
TBP (TNF Binding Protein) TNF vezni protein
IDA (Iminidiacetic acid) Iminodiacetatna kiselina
Cu-Chelate FF (Cooper-Chelate Fast Flow) Bakreni kelat brzog protoka
Q-SEPH.FF (Q-Sepharose Fast Flow) Q-Separoza brzog protoka
SP-SEPH.FF (SP-Sepharoze Fast Flow) SP- Separoza brzog protoka
Butyl- SEPH.FF (Butyl-Sepharoze Fast Flow) Butilna Separoza brzog protoka
IEC (Ion Exchange Chromatography) Ionska izmjenična kromatografija
ACN (Acetonitrile) Acetonitril
CBB (Comassie Brilliant Blue) Comassie brilliant plavo
DNA (Deoxyribonucleic Acid) Deoksiribonukleinska kiselina
EtOH (Ethanol) Etanol
HIC (Hydrofobic Interaction Chromatography) Hidrofobna interakcijska kromatografija
IEF (Iso Electric Focusing) Izo električno fokusiranje
IEMA (Immuno-EnzymoMetric Assay) Imuno-enzimometrički test
IFMA (Immuno Fluorimetric Assay) Imuno florometrički test
IPC (In Process Control) Ulazna kontrola procesa
KD (Kilo Dalon) Kilo Dalon
LOQ (Limit Of Quantitation) Kvantifikacijske granice
OD (Optical Density) Optička gustoća
PI (Isoelectric Point) Izoelektrična točka
RP-HPCL (Reverse Phase High tekuća kromatografija reverzne faze
Performance Liquid Chromatography)
SDS-PAGE ili SDS (Sodium Dodecil Sulphate Natrijeva dodecil sulfatna poliakrilamidna
Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) gel elektroforeza
SE-HPLC (Size Exclusion HPLC) Razdvajanje prema molekulskoj veličini HPL kromatografijom
SMW Standard molekulske veličine
SS (Sodium Sulfat) Natrijev Sulfat
Tris (Tris(hydroxymethyl) aminoethane) Tris(hidroksimetil) aminoetan
BV (Bed Volume) Volumen stupca (tavana)
Opis slike
Slika 1: na ovoj slici je prikazan tijek postupka koji se primjenjuje za pročišćavanje proteina http-1. Prikaz kreće od glavnog koraka do konačnog dobivenog praha ar-http-1, te je prikazano u 8 koraka, među kojima je najkritičniji glavni korak. Svaki korak je detaljno opisan kao što slijedi u slijedećim primjerima.
PRIMJERI
Materijali
Oprema
Kromatografska kolona XK26/20 (2.6X20cm) Pharmacia
Kromatografska kolona XK50/20 (5X20cm) Pharmacia
Peristaltička pumpa Miniplus 2 Gilson
Peristaltička pumpa P-1 Pharmacia
Chart Recorder 2210 Pharmacia
UV detektor Uvicord 2158 Pharmacia
On line monitor za praćenje pH-vodljivosti Biosepra
Kromatografski sistem FPLC pod niskim pritiskom Pharmacia
HPLC analitički sustav Merck
Flourimetrijski detektor mod. 9070 Varian
Rashladna kutija MCF 1500 Angelantoni
U.V. Spektrofotometar UV 1204 Shimatzu
Ultrafiltracijski sistem mod. Minitan Milipore
Mješalica za stanice mod 8400 Amicon
Miješalica za stanice mod 8050 Amicon
Ultrafiltracijska membrana tip YM10 Amicon
Ultrafiltracijska membrana tip YM10 Amicon
Nastavci i kolone
SP- Separoza brzog protoka Pharmacia
Q-Separoza brzog protoka Pharmacia
Butilna Separoza brzog protoka Pharmacia
Separozni kelat brzog protoka Pharmacia
SP Separoza velike kapi (big beads) Pharmacia
Fenil Separoza 6 brzog protoka (high sub) Pharmacia
CM Separoza brzog protoka Pharmacia
DEAE Separoza brzog protoka Pharmacia
DEAE-Hyper D Biosepra
Supercosil LC-308 0.46x5 Supelco
Evaporator RP-300 Brownlee Applied Biosystem
TSK-G2000 SWXL 0.78X30 TOSO-HAAS
Mono-Q HR 5/5 Pharmacia
Kemikalije
Tris(hidroksimetil) amino metan (Tris) Merck
Natrij klorid Merck
Orto-fosforna kiselina 85% Merck
Natrijev dihidrogen fosfat Merck
Natrijev dihidrogen fosfat Merck
Apsolutni etanol Merck
Acetronitril (ACN) Merck
Trifloracetatna kiselina (TFA) Backer
50% natrijev hidroksid Backer
Natrijev sulfat Merck
Bakar sulfat Merck
Cink klorid Merck
Klorovodična kiselina 37% Merck
1-propanol cod.1024 Merck
Etilendiaminotetraoctena kiselina (EDTA) Merck
Amonijum sulfat Merck
Biološke tvari
r-hTBP-1 sirova smjesa interpharm laboratories ltd.
McAb TBP-1 klon 18 interpharm laboratories ltd.
Standardni albumin cod.2321 Pierce
Postupak pročišćavanja r-Htbp-1 nadalje je detaljno opisan.
Korak 1-glavni korak
Opis pufera i otopine
Pufer DXXX
32g bakrenog sulfata otopi se u 900 ml destilirane vode te se volumen nadopuni s destiliranom vodom do volumena 1litre.
Kisela voda
0.5 ml acetone kiseline doda se u 1 litru vode
Ravnotežni pufer
1.68± 0.1 ml 85% orto-fosforne kiseline i 11.68± 0.1g NaCl otopi se u 900 ml destilirane vode, pH se namjesti na 6.8+/-0.1 sa 50% NaOH otopinom i volumen se nadopuni do 1litre.
Otopina za pranje
1litra destilirane vode koristi se kao otopina za pranje.
Pufer za ispiranje (raspon pH od 2.8 do 3.2)
6.75+/-0.5 ml 85% orto-fosforne kiseline i 5.84+/- 0.1 g NaCl se otope u 900 ml destilirane vode, pH se namjesti sa 3+/-0.1 sa 50% NaOH otopinom i volumen se nadopuni do 1 litre. Nastala vodljivost je 15+/-1ms.
Pufer za regeneraciju
18.61+/-0.61 g EDTA i 58.4+/-1g NaCl se otopinu 900ml destilirane vode i volumen se nadopuni do 1 litre.
Otopina za sterilizaciju
40 g NaOH se otopi u 900ml destilirane vode i volumen se nadopuni do 1 litre.
Otopina za čuvanje
20% etanola ili 0.01M NaOH se koristi kao otopina koja se može skladištiti (čuvati).
Preparacija kolone
8+/- Separozni kelat brzog protoka (American Biosciences) je spojena sa iminodiacetatnim kiselinskim ostatkom i pakirana u kromatografsku kolonu tako da je visina stupca 4+/-0.5 cm. Tako pakirana kolona se ispire sa 10BV kiselom vodom i onda puni sa 2BV 0.2M bakrenog sulfata peh 4-4.5. Prema uputstvima proizvođača otopina od 2-3mM natrijevog acetata pH 4-4.5 se koristi da ne bi došlo do precipitacije na neutralnom pH. Ostatak se zatim ispire sa 10BV kisele vode.
Postupak
Sirova smjesa koja sadrži r-hTBP-1 (rekombinantni TNF vezni protein), čuva se na 4°C, a na sobnoj temperaturi pH namjesti se na 6.8, dokapavanjem 85% ortofosforne kiseline a nakon toga podesi se vodljivost na 21+/-1 ms dodatkom NaCl (sirova smjesa se ultrafiltrira da bi se uklonile komponente koje mogu negativno djelovati na interakciju r-hTBP-1 sa bakrom).
Nadalje je opisan postupak pripreme kolone, prvo se kolona ispire sa 10-20 BV ravnotežnim puferom i onda se na sobnoj temperaturi (22+/-3°C) puni sa sirovom smjesom r-hTBP-1 pri lineranom protoku od 200ml/kvcm/sat.
Kolona se prvo ispire sa ravnotežnim puferom dok UV signal bude u baznoj liniji te se nakon toga ispire sa 12-15 Bv vode i kolona nema naboja.
Eludacija se provodi eludacijskim puferom i sa skupljanjem eluata se započinje kad je detektiran UV signal. Eluacija r-hTBP-1 se postiže sa 5-6 BV eluacijskim puferom. eluent sadrži djelomično pročišćen r-hTBP-1 koji se skuplja i čuva na -20°C.
Regeneracija kolone provodi se sa 3BV regeneracijskim puferom i kolona nema naboja. Nakon toga kolona se sterilizira sa 5BV otopinom za sterilizaciju.
Za čuvanje, kolona se ispire sa 5BV otopinom za čuvanje i tako se pohranjuje.
Podaci o dobivenom stupnju čistočr sažeti su ispod u TABLICI 1.
Provedba glavnog koraka (usporedba sa Zn 2+ IMAC)
Izvorno, glavni korak se provodi na Zn2+-kelatnom IMAC koloni. Međutim kapacitet punjenja za sirovu smjesu r-hTBP-1 nije dostatan. (250-300 mcg r-hTBP-1 ili 40 volumena kolone sirove smjese /ml ostatka). Zamjenom cinka sa bakrom, dolazi do značajnog povećanja kapaciteta punjenja. Tijekom navedenog Cu2+IMAC glavnog koraka, r-hTBP-1 se veže za ostatak, dok se većina ostalih proteina eluira u nevezanoj frakciji i djelomično pročišćeni r-hTBP-1 se nalazi u eluatu sa stupnjem čistoće dovoljnim za slijedeći korak.
Mijenjanjem uvjeta, mogu se postići bolji kapacitet vezivanja kao i neka druga poboljšanja. Najvažniji rezultati u ovom izumu su sažeti ispod.
Glavni korak r-hTBP-1, proveden metal-kelatnom kromatografijom pokazuje slijedeće karakteristike:
1. Koncentracija: 25-30 koncentracije r-hTBP-1 fold proteina u usporedbi sa sirovom smjesom (vidi tablicu 1).
2. Pročišćavanje: Korak je djelotvoran u otklanjanju nečistoća, kao što je prikazano u tablici 1.
3. Povećanje u industrijsko mjerilo-Scale up: metoda je pogodna za scale up i industrijsko mjerilo.
4. Produktivnost: Korak obnavljanja je zadovoljavajući kao što je pokazano u tablici 2.
Nadalje, korak obnavljanja je brz, reproducibilan i lako ga je provesti. Ostatak se može ponovo iskoristiti nakon odgovarajuće sterilizacije i punjenja.
Dalje slijedi sažeti opis glavnih prednosti korištenja Cu2+ nad Zn2+:
◾ Viši kapacitet punjenja: 1ml Cu-ostatka veže 1-1.2 mg r-hTBP-1 naspram 0.25-0.5 mg/ml Zn - ostatka.;
◾ Poboljšanje čistoće materijala nakon glavnog koraka od 30-35% promatrano sa Zn--ostatkom do 40-50% dok kod Cu-ostatka prikaz u tablici 2 (kvantitativna RP-HPLC).
◾ Smanjenje koraka ispiranja od 3 sa Zn-ostatkom na 1 sa Cu ostatkom uz smanjenje vremena rada i potrošnje pufera.
Tablica 1: podaci o glavnom Cu-kelatnom- r-hTBP-1 koraku- IEMA podaci
[image]
* računano na bazi ukupne sume r-hhTBP-1 punjenja.
Korak 2-ionska izmjenična kromatografija na sp separozi
Opis pufera i otopina
Ravnotežni pufer
1.68 ml 85% orto-fosforne kiseline i 17.53g NaCl se doda mješajuči u 900ml vode. pH se namjesti na 3.0+/-0.1 sa NaOH i volumen se nadopuni do 1litre.
Pufer za ispiranje
0.68 ml 85% orto-fosforne kiseline se doda mješajući u 900 ml vode. pH se namjesti na 4.0+/-0.1 sa 50%NaOH i volumen se nadoda do 1litre.
Eluacijski pufer
3.37 ml 85% orto-fosforne kiseline i 17.53 g NaCl doda se mješajući u 900 ml vode. pH se namjesti na 4.0+/-0.1 sa 50%NaOH i volumen se nadoda do 1litre.
Regeneracijski pufer
3.37 ml 85% orto-fosforne kiseline i 116.8 NaCl se doda miješajući u 900 ml vode. pH se namjesti na 6.0+/-0.1 sa 50%NaOH i volumen se nadoda do 1litre.
Otopina za sterilizaciju
20g NaOH miješajući otopi se u 900ml vode i volumen se nadoda do 1 litre.
Otopina za čuvanje
200 ml apsolutnog etanola se pomiješa u miješalici sa 800 ml vode.
Preparacija kolone
Kolona je pakirana sa SP Separoznim FF ostatkom, te prema uputstvima proizvođača visina stupca 6-6.5cm.Kolona se sterilizira ispiranjem 3 BV NaOH M te zatim dodatkomn 3BV vode.
Ravnoteža na koloni postiže se sa ispiranjem 4-5BV ravnotežnog pufera. pH i vodljivost eluenta se provjerava (pH 3.0±0.1, vodljivost 29.5± 29.5± 0.5ms/cm) te se kolona eventualno uravnotežuje ako mjerene vrijednosti nisu u navedenim rasponima.
NB: Alternativno, ravnotežni pufer se može zamijeniti sa 25mM fosfatnim puferom pH 2.8± 0.1 bez NaCl, te se može eliminirati pufer za ispiranje, regeneracijski pufer se može zamijeniti sa 1.5M NaCl, a otopina za čuvanje se može zamijeniti sa 10mM NaOH.
Procedura
Sve operacije provode se na temperaturi od 2-8°C uz protok od 40-50ml/cm/sat.
Smrznuti r-hTPB-1 dobiven u glavnom koraku se ostavi na sobnu temperaturu ili 6±2 ̊C pH se namješta od 3.7±0.2 do 3±0.1 dodavanjem 85% fosforne kiseline i vodljivost se namješta od 14±3 mS/cm do 22±3 mS/cm dodavanjem krutog natrijevog klorida i tom otopinom se puni kolona. nakon što je punjenje završeno, kolona se ispire sa 3 BV ravnotežnog pufera, a nakon toga 4BV pufera za ispiranje. alternativno, pranje sa puferom za ispiranje se može izbjeći (vidi NB)
Nakon toga počinje eluacija eluacijskim puferom. r-hTBP-1 se počinje eluirati nakon 180-220 ml Ovaj prvi dio se odvaja a sljedeći sa 3.5BV predstavlja djelomično čisti skupljen r-hTBP-1. Elirane frakcije se uzorkuju (5x0.5ml) za IPC i pohranjuju ne više od 3 dana na 6±2°C.
Nakon što je eluacija završila, kolona se ispire sa oko 3BN regeneracijskog stupca. Frakcija (1x1) se skuplja i odstranjuje.
Za čuvanje, kolona se ispire sa 3BV EtOH 20% (ili alternativno sa 10mM NaOH) i čuva na 6±2°C.
Rezultati sedam eksperimenata ovog koraka prikazani su u slijedećoj tablici 2:
Tablica 2. Provedba koraka kationske izmjene
[image]
Slijedeća tablica 3 prikazuje izvedbu kombinacijskog koraka IMAC i Sp-Separoze FF.
Tablica 3 Čistoća r-hTBP-1 dobivenog iz raznih izvora
[image]
Korak 3- sp eluacijska ultrafiltracija
Procedura
Sve operacije provode se na sobnoj temperaturi (23±3°C)
Ultrafilter se čuva u NaOH te se ispire do pH 7.0±0.5. Ultrafilter udružen sa membranom se puni otopinom r-hTBP-1. Otopina se koncentrira do 50 ml. Retencijska frakcija se razrijeđuje sa 200 ml vode i koncentrira do 50 ml. Ovdje opisan korak pranja ponavlja se još tri puta.
Vodljivost uhvaćenog uzorka (frakcije) se provjerava; ako je <0.5 mS/cm onda se nastavlja sa slijedećim korakom.
Ako je vodljivost >0.5 mS/cm mora se još jednom provesti korak pranja.
Dodaje se 200ml 50 mM Tris (pH9.0±0.1 i vodljivosti 0.55±0.1 mS/cm) u retencijsku frakciju i ponovo se koncentrira na 50ml-sku otopinu.
Opisana operacija se ponavlja tri puta, i ako je potrebno, nastavlja se dok pH i vodljivost uhvaćene frakcije (permeata) bude (pH9.0±0.2 i vodljivosti 0.55±0.1 mS/cm).
Retencijska frakcija se skuplja i ultrafiltere se ispire sa tri 100ml alikvota od 50mM Tris (pH9.0±0.1 i vodljivosti 0.6±0.1 mS/cm) uz dodatak ispranih frakcija.
Ultrafilter se ispire i sterilizira sa 0.1M NaoH (ili, alternativno 0.5M NaoH) recikliranjem ne dužim od 30 minuta. Utra filter se ispire sa vodom sve dok permeatima pH 7.0±0.5. Ultrafilter se zatim čuva u 0.01M ili alternativno 0.05 M NaOH na 23±3°C.
Korak 4-ionska izmjenična kromatografija na q-separozi ff
Puferi i otopine
Ravnotežni pufer: 50mM Tris pH 9.0±0.l vodljivost 0.55±0.1mS/cm
Eluacijski pufer: 250mM Tris pH 9.0±0.l 50mM NaCl vodljivost 7.25±0.5mS/cm
Regeneracijski pufer: 250mM Tris pH 6.0±0.l 2M NaCl alternativno 1.5M NaCl
Otopina za sterilizaciju: 0.5M NaOH
Otopina za čuvanje: 20% etanola ili 10mM NaOH
Procedura
Svi postupci provedeni su pri slijedećim uvijetima:
Temperatura: 2-8°C, alternativno sobna temp, linearni protok 80-90ml/cm kv/sat.
Nakon ultrafiltracije pH r-hTBP-1 se provjerava, i ako je različit od pH 9.0±0.l, onda se namjesti sa 1M Tris ili 3M HCl, također se provjerava i vodljivost.
Kolona je punjena sa Q-separozom FF ostatkom, prema uputama proizvođača do visine stupca do 13cm. Kolona Q-Sepaharoze se zatim sterilizira sa ispiranjem 3BV NaoH 0.5 M NaOH i onda 6 BV vode. Nakon toga kolona se ispire sa 4BV eluacijskog pufera i uravnotežuje sa 7-8BV ravnotežnog pufera, pH i vodljivost kolonskog eluenta se provjerava (9.0±0.2 vodljivost 0.55±0.1mS/cm) Ravnoteža na koloni će biti kontinuirana ako mjerene vrijednosti spadaju naznačen raspon vrijednosti.
Nakon toga kolona se puni ultrafiltriranim r-hTBP-1 koji je dobiven predhodno opisanim postupkom. Nakon što se završi s punjenjem kolona se ispire sa 3BV ravnotežnim puferom.
Eluacija počinje sa eluacijskim puferom. Čisti r-hTBP-1 počinje eluirati nakon 1BV, a skupljanje r-hTBP-1 počinje nakon 1 BV u skladu sa kromatografskim profilom, a eluacija je završena nakon 5-6 BV.
Nakon toga kolona se ispire sa 3BV regeneracijskog pufera 0.5 M NaOH, te se ispire s vodom dok pH eluenta bude između 7 i 8. Konačno kolona se ispire sa 3 BV EtOH 20% i čuva se na 2-8 ̊C.
Korak 5-nanofiltracija na dv 50 pall
Instalirana je čelična konstrukcija u držaču diska i DV50 filteru (47 mm dijametar). Pall Ultipor ® VF Grade DV50 je fliter cartrige, koji se inače koristi za uklanjanje virusa. Par kapi vode doda se na vrh diska.Instalira se odgovarajuća oprema i disk i držač se snažno zavinu. Sistem se napuni sa 50ml Q eluacijskog pufera i poveže se sa izvorom dušika.
Na samom početku puštanja dušika početni tlak je 0.5 bara te se ventil smješten na samom držaču diska otvori da bi se ispraznio sistem.
Trenom kad se pojavi prva ka tekućine ns držaču diska, stegne se jako i otvori se dotok dušika pod tlakom od 3.0-3.5 bara.
Zatim se membrana ispere sa 50ml pufera, da bi bila vlažna i da bi se uklonio zrak, koji se možda nalazi između slojeva te se tako ujedno testira filtar.
Nakon toga sistem se puni materijalom koji je dobiven iz prethodnog koraka, kao što je opisano: na početku filtracije dušik se otvori i početni tlak je 0.5 bara i zatim se otvori ventil na držaču diska da bi se sistem ispraznio. Trenom kad se pojavi prva kap vode, zatvara se ventil na držaču diska i dušik se pušta pod tlakom 1.5-2.5 bara.
Tlak dušika se drži na 1.5-2.5 bara i tako se otopina filtrira. Filtrirana otopina se skuplja u kontejner i na kraju filtracije izvor dušika se zatvara a ventil otvara da bi se uklonilo prisustvo dušika.
Na kraju filtracije, sistem se ispire sa 5-10 ml eluacijskog pufera od prethodnog koraka, pri tlaku od 1.5-2.5 bara.
Otopina za ispiranje se sprema u isti kontejner gdje se nalazi filtrirana otopina i uzorci za IPC.
Korak 6-hidrofobne interakcije na butilnoj separozi ff
puferi i otopine
Ravnotežni pufer: 200mM Tris-hcl pH 7.5±0.1, 1M Na2 SO4 vodljivosti 90±5 mS/cm.
Eluacijski pufer: 200mM Tris-hcl pH 7.5±0.1, 0.7 MNa2 SO4 vodljivosti 75±5 mS/cm.
Regeneracijska otopina: Destilirana voda
Otopina za sterilizaciju: 1M NaOH
Otopina za čuvanje: 20% etanola ili 10mM NaOH
Procedura
Sve operacije provode se na temperaturi između 23±3°C uz linearni protok od 80-90 ml/cm/sat. Čvrsti Na2SO4 dodaje se u Q-Separozni eluat, te se stavlja na 100KD ultrafiltarciju uz miješanje do 1M. Nakon što se otopi sol namjesti se pH na 7.5 ±0.1 sa 3 M HCl te se nadoda 4BV destilirane vode.
Kolona se opet ispere sa 5-6BV ravnotežnog pufera. pH i vodljivost se effluenta se (pH 7.5±0.2, vodljivost 90±5 mS) provjerava i uravnoteženje kolone se kontinuirano provodi s ciljem kontrole navedenih vrijednosti.
Otopina koja je dobivena na prethodno opisan način, se puni u kolonu, te kad je punjenje završeno, kolona se ispire sa 3 BV ravnotežnog pufera. Ispiranje sa ravnotežnim puferom se nastavlja.
Nakon 2-3 BV ispiranja, počinju se eluirati proteini. Ova frakcija sadrži 10-12% od ukupne količine r-hTBP-1, koji je onečišćen staničnim kulturama. Ispiranje se nastavlja sve dok eluacija proteina ne dostigne pik željene širine (oko"BV).
Eluacija počinje sa eluacijskim puferom. Prvih 1-2 BV je pomiješano sa ispranim uzorkom, te budući da sadrži malu količinu nečistoća pristupa se skupljanju r-hTBP-1.
Pročišćeni r-hTBP-1 se odmah eluira, te se eluacija nastavlja još 2.5-3 BV. Sakupljanje se prekida kada UV absorbancija dostigne 0.5% maximuma. Nakon skupljanja r-hTBP-1, frakcije (5X0.5) se uzorkuju i pohranjuju na 2-8°C ne više od 3 dana.
Kolona se ispire sa 3BV destilirane vode i skuplja se frakcija.
Kolona se sterilizira sa 3 BV 1M NaOH i ispire sa vodom dok pH eluenta dosegne vrijednost 7 i 8.
Nakon toga kolona se ponovo ispire 20% etanolom sa tri volumena kolone i čuva se na sobnoj temperaturi ne duže od 2 tjedna.
Korak 7- kd ultrafiltracija
Pokretni stanični tip 8400, sklopljen sa membranom se puni sa butilnim-separoznim eluatom. Otopina se koncentrira pod dušikovom atmosferom od 3 bara do 25 ml. Zaostala frakcija se razrijedi sa 100 ml vode i ponovo se koncentrira na 25 ml. Opisni korak se ponavlja još tri puta. Provjerava se vodljivost permeata: ako je <0.3 m/Scm onda se može krenuti sa slijedećim korakom, ako je vodljivost manja od 0.3 m/Scm treba se korak ispiranja ponoviti.
100 ml pufera u prahu doda se zaostaloj frakciji i opet se koncentrira do volumena otopine od 25ml. Ako je potrebno ova se operacija provodi tri puta, sve dok pH i vodljivost frakcije ne budu 7.1±0.2 i 5.8±0.2 m/Scm.
Zaostala frakcija nema naboja i puni se u pokretni ultrafilter stanični tip 8400, sklopljen sa membranom. Frakcija se koncentrira na minimalni volumen oko (3-5 ml). Renetacijska frakcija se skuplja i ultrafiltrira, te ultra filter se ispire dodavanjem frakcija koncentrireanog r-hTBP -1. Konačan volumen se namješta da bi se dobila koncentracija od 20-30 mg/ml OD 280nm (ε=0.71).
Ultrafilter se pere i sanitizira sa 0.2 M NaOH uz recikliranje najmanje 30 minuta. Ultrafilter se ispire s vodom sve dok permeat ima pH 7±0.5. Ultrafilter se zatim čuva u NaOH 0.01M na 6±2 ̊C.
Korak 8- mikrofiltracija
Siringa za jednu upotrebu se priključi na 0.22 μm filtar, te se napuni sa r-hTBP -1 koncentriranom otopinom, te se dva puta profiltrira i ispere sa 1ml pufera. Dobivena otopina se uzrokuje za analitički test (15x0.2ml) i čuva se na -20°C.
Rezultati su zadovoljavajući ako količina, stupanj čistioče i broj provedenih eksperimenata odgovaraju prema slijedećim tablicama (tablice od 4 do 6).
Kritični dio ovog izuma je početni koromatografski korak sa Cu+ kelatnoj koloni. Nadalje, važna je kombinacija SP separozne kromatografije pri kiselom pH a zatim Q separoze pri bazičnom pH. U ovim uvjetima, dobri rezultati se samo mogu dobiti razdvajanjem sirove smjese od CHO produkta r-hTBP -1. U ovom slučaju glavni korak je pokazao da je moguće koncentrirati 25-30 foldova r-hTBP -1 te da se tako djelotvorno reduciraju nečistoće, te se dobiva zadovoljavajući stupanj iskorištenja proteina s kojim se može ići u industrijsko mjerilo.
Iznenađujuća činjenica je da u slučaju kad je početni materijal sirovi supernatant iz seruma -ima kulture stanica a kad je početni materijal serum onda nema staničnih kultura, kao što je prikazano ispod.
Talica 4 - koraci i kumulativni podaci iskorištenja
SP-Separoza Q-Separoza Butil Bulk
[image]
Tablica 5 - Kvalitativni podaci Bulka
[image]
*mg r-hTBP-1 dobiveni OD
Tablica 6 - Čistoča Bulka
[image]
Primjenom analognog potupka na drugi TNF receptor, r-hTBP-2, dobiveni su slični kvalitativni podaci kao i podaci o čistači.
Analitički protokol
1. Kvantitativna RP-HPLC-Radna procedura
Slijedeća metoda se koristi za kvantifikaciju r-hTBP-1 u uzorcima koji se pročišćavaju. koristi se C8 kolona sa vodenim TFA i kn-propanolom; te je uočena dobra rezolucija između r-hTBP-1 i prisutne stanične kulture. r-hTBP-1 se može odvojiti u jednom ili dva pika ovisno o šarži. Postupak je opisan ispod.
1.1 Oprema i materijal i metoda
- Analitički HPLC System (Merck ili ekvivalent)
- Dinamički mikser (Merck ili ekvivalent)
- Kolona: SUPELCOSIL LC-308 θ 0.46x5 cm-cod 5-8851-Supelco
- Eluent A: 0.1% vodena TFA
- Eluent B: 0.1% TFA vodsa/n-propanol 50:50
- Eluent C: Acetonitril
- Temperatura 23±3 ̊C
- UV Detekcija 214 nm
- Vrijeme injektiranja: 62 minute
- Volumen injektiranja: 10-100μL
- Standard: BTC10, 1.53mg/ml OD 280 nm (ε=0.71) injektiran pri 10 i 20 μL
- Gradijent
[image]
1.2 Izračun
Količina r-hTBP-1 u svakom pročišćeno uzorku se računa kako slijedi:
- Izračuna se faktor odgovora (response faktor) RF za standard prema formuli:
RF=TBP1 mcg/TBP1 površina pika
- Pomnoži se površina ispod pika r-hTBP-1 svakog uzorka sa RF standarda uz račun koncentracije u mcg/ml kako slijedi:
TBP1 mcg/ml=TBP1 površina ispod krivulje RF standard
Treba naznačiti:
- BTC 10 koji se koristi kao standard je proizvoljnog karaktera,
- Vrijeme retencije r-hTBP-1 može se mijenjati sa svakom novom pripremom pufera (1-3min).
- Koncentrirani uzorak mora se razrijediti sa eluatom A.
2. Flourimetrijska RP-HPLC-Radna procedura
Na temelju prethodnih analiza RP-HPLC sa ostalim rekombinantnim proteinima sa florimetrijskom detekcijom, procjenjen je stupanj čistioče zaostalih nečistoća stanične kulture i to u r-hTBP-1 bulku i procesnim uzorcima. Imunokemijska metoda nije bila dostupna kad su počela navedena istraživanja.
Navedena metoda je korisna za praćenje uklanjanja nečistoća staničnih kultura pri zadnjem koraku pročišćavanja, sa butil separoznom kromatografijom, budući da je provedena pri tim radnim uvjetima, nema potrebe za dodatnim specijalnim materijalima ili aparaturom. RP-HPLC je brza metoda (62 minute) i daje rezultate koji su komparabilni sa imuno testom. Budući da standard za nečistoće je još nedostupan, koristi se BSA otopina Irce da bi se procijenila onečišćenje uzoraka. Kvantitativni RP-HPLC test daje dobru rezoluciju između r-hTBP-1 i BSA područja.
2.1 Oprema i materijal i metoda
- Analitički HPLC System (Merck ili ekvivalent)
- Dinamički mikser
- Florimertijski detektor (Varijan ili ekvivalent)
- Kolona: Aquaporte RP-300, 7μ, Brownlee,θ 0.4e6x22cm-cod 0711-0059
Applied Biosystem
- Eluent A: 0.1% vodena TFA
- Eluent B: 0.1% TFA u acetronitrilu
- Temperatura 23±3 ̊C
- λ pobuđivanje: 220 nm
- λ emisija: 330 nm
- Volumen injektiranja: 10-100μL
- Vrijeme injektiranja: 62 minute
- Standard: BSA (Pierce) 2 mg/ml razrijeđeno 1:100, 10 i 20 μL injektirano;
- Kontrola: BCT10, 1.53 mg/ml OD 280 nm (ε=0.71) kao da je 200 μL injektirano
- r-hTBP-1 uzorci: 1-5 mg/ml OD 280 nm (ε=0.71)
- Gradijent:
[image]
1.2 Izračun
Količina onečišćenja u svakom buutlno purificiranom (očiščenom) uzorku se dobiva kako slijedi:
- izračunati RF za standard (BSA) prema formuli:
RF= BSA injektirano / BSA površina pika
Pomnoži se pik onečišćenja svakog uzorka sa RF standardom sa 1000. Dobivena vrijednost podijeli se sa količinom injektiranog r-hTBP-1, dobivena vrijednost je u ppm, prema formuli:
ppm nečistoća=površina pika onečišćenja RF BSAX1000 / injektirani TBP1 mg
Treba naznačiti:
- Koncentrirani uzorak mora se razrijediti sa eluatom A.
- Kontrola onečišćenja uzorka je u rasponu od 190 do 240 pm.
3. Analiza i karakterizacija bulka hTBP-1
Analitička metoda koja će biti opisan ima svrhu karakterizacije hTBP-1 bulka dobivenog novim postupkom čišćenja.
3.1 SE-HPLC
Ova metoda je razvijena da bi kvantificirala količinu nastalog dimera i agregata u konačnom bulki. Metodom se može razlikovati monomer i dimer i/ili agregati hTBP-1. To se je dokazalo prilikom testiranja nekih hTBP-1 uzoraka UV zračenjem, metodom koja je poznata da generira agregirane oblike molekule. sažeto, ova je metoda opisana kako slijedi:
3.1.1. Oprema, materijali i metoda
Oprema: Analitički HPLC sistem
Kolona: TSK G2000 SW xl cod. 08021 (TosoHaas)
Mobilna faza: 0.1M natrijev fosfat pH 6.7, 0.1M natrijev sulfat
Temperatura: 23±3 ̊C
UV detekcija: 214nm
Volumen injektiranja: 10-100μL što odgovara 20-30 mcg hTBP-1 OD
Vrijeme injektiranja: 30 minuta
Standard: BTC 10, 1.53mg/ml OD 280nm (ε=0.71) 10-20
μL injektirano
r-hTBP-1: razrijeđeno 1-2 mg/ml OD 280nm (ε=0.71) 10-20
μL injektirano
Čistača uzorka se iskazuje kao %, čistioče hTBP-1 pika/ ukupna površina.
3.2. IE-HPLC
Ova metoda je razvijena da bi se evaluirala izomerna smjesa u konačnom bulku s ciljem da bi se zamijenila kromtografsko fokusiranje koje se inače primjenjuje. IEC analiza je brža i zahtjeva manje materijala (150-200 mcg umjesto 1 mg), koriste se uobičajeni puferi i ne zahtjeva se priprema uzorka,. Budući da je hTBP-1 prirodni glikoprotein, karakterizira ga veći broj izomera, a svaki izomer ima definiranu izoelektričnu točku koja se utvrđuje analizom ionske izmjene. Uočeno je 12 različitih pikova, od kojih svaki odgovara jednom glikoliziranom obliku. Opisanom metodom svi izomeri hTBP-1 su izolirani i u potpunosti karakterizirani.
Kratko je opisana metoda kako slijedi:
3.2.1. Oprema,.materijali i metoda
Analitički inert HPLC sistem
Kolona: Mono Q HR 5/5
Pufer A: 40mM Tris/HCl pH 8.5
Pufer B: 40mM Tris/HCl pH 8.5 0.3M NaCl
Gradijent:
[image]
Protok: 1ml/min
Temperatura: 23±3 ̊C
UV detekcija: 220nm
Količina injektiranog uzorka: 10-15 mcl koji odgovara 150-200 mcg hTBP-1(po OD)
Vrijeme injektiranja: 70 min
Uzorak: bulk hTBP-1 i referenca se razrijede 1: 2 sa destiliranom vodom.
4. Kvantifikacija hTBP-1 pomoću OD
Koncentracija bulka hTBP-1 dobivenog prema ovom izumu, određuje se metodom apsorpcije svjetlosti na valnoj duljini 280 nm koristeći molarni ekstinksijski koeicjent (ε) koji je izračunat na temelju podataka početne faze purifikacije hTBP-1. Korištena su tri reprezentativna hTBP-1 bulka koja su pročišćavana novim postupkom čišćenja, te je utvrđen ε=0.776. Ovako dobiven ekstinkcijski koeficjent se koristi za povećanje u industrijsko mjerilo i fazu proizvodnje. Budući da koncentracija bulka se kreće u rasponu od 20-30 mg/ml, potrebno je razrijediti materijal na 1 mg/ml sa bulk puferom (40mM, PBS, pH 7.1±0.2, 10mM NaCl) te se provjeri testom apsorbancije na 280nm.
5. Određivanje proteina po Bradfordu
Metoda po bradfordu se koristi za određivanje ukupnih proteina u hTBP-1 bulku (vidi Bradford, MM. Analitical Biochemistry 72: 248-254, 1976 and Stoscheck, CM.. Methdots in Enzymology 182: 50-69, 1990) Standardni test koji se koristi je BSA
6. Biotestiranje In vitro
Biokativnost hTBP-1 se odnosi na sposobnost vezanja sa TNF α. ovaj test se koristi za testiranje i tijekom procesa i bulka.
Claims (9)
1. Postupak izolacije čistog TNF vezivnog proteina naznačen time da se otopina sirovog TNF vezivnog proteina eluira imobilizirajučom metalnom afinitetnom kromatografijom (IMAC) pri to koristeći bakar kao metal.
2. Postupak za pročišćavanje rekombinantnog TNF vezivnog proteina, naznačen time da je glavni korak, imobilizirajuća metalna afinitetna kromatografija koja koristi bakar kao metal.
3. Postupak koji je u skladu sa zahtjevom 1 ili 2, naznačen time da se eluacija na IMAC koloni provodi u rasponu pH 2.8 do 3.2.
4. Postupak koji je u skladu sa bilo kojim predhodno navedenim zahtjevom, naznačen time da se eluacija na IMAC koloni provodi pri slanosti (salinitetu) u rasponu od 14 do 16ms.
5. Postupak koji je u skladu sabilo kojim prethodno navedenim zahtjevom, naznačen time da sadrži slijedeće korake, kao međukorake: ionska izmjenična kromatografija (IEC) pri kiselom pH, poželjno u rasponu od 3 do 4, nakon toga ionska izmjenična kromatografija pri bazičnom pH, poželjno u rasponu od 8 do 10.
6. Postupak koji je u skladu sa bilo kojim prethodno navedenim zahtjevom, naznačen time da je završni korak (polishing step), hidrofobna interakcijska kromatografija (HIC).
7. Postupak koji je u skladu sa bilo kojim predhodno navedenim zahtjevom, naznačen time da nakon svakog koraka kromatografije slijedi ultrafiltracija.
8. Postupak koji je u skladu sa bilo kojim predhodno navedenim zahtjevom, naznačen time da je TNF vezivni protein rekombinant hTBP-1.
9. Postupak za proizvodnju TNF vezivnog proteina naznačen time da je izolacija ili pročišćavanje proteina u skladu sa postupkom koji je opisan u bilo kojem od prethodnih zahtjeva.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02025755 | 2002-11-15 | ||
| PCT/EP2003/050824 WO2004046184A1 (en) | 2002-11-15 | 2003-11-13 | Process for the purification of tnf-binding proteins using imac |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20050406A2 true HRP20050406A2 (en) | 2006-02-28 |
Family
ID=32319541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20050406A HRP20050406A2 (en) | 2002-11-15 | 2005-05-06 | Process for the purification of tnf-binding proteins using imac |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060128616A1 (hr) |
| EP (1) | EP1560851A1 (hr) |
| JP (1) | JP2006517187A (hr) |
| KR (1) | KR20050074997A (hr) |
| CN (1) | CN100375753C (hr) |
| AR (1) | AR042038A1 (hr) |
| AU (1) | AU2003298287A1 (hr) |
| BG (1) | BG109152A (hr) |
| BR (1) | BR0315807A (hr) |
| CA (1) | CA2505385A1 (hr) |
| EA (1) | EA200500762A1 (hr) |
| HK (1) | HK1082751A1 (hr) |
| HR (1) | HRP20050406A2 (hr) |
| MX (1) | MXPA05005246A (hr) |
| NO (1) | NO20052916L (hr) |
| PL (1) | PL376745A1 (hr) |
| RS (1) | RS20050355A (hr) |
| WO (1) | WO2004046184A1 (hr) |
| ZA (1) | ZA200503702B (hr) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102234332B (zh) * | 2010-04-26 | 2014-12-17 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种重组人血白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 |
| WO2017049529A1 (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | Innolife Co., Ltd. | A pharmaceutical composition comprising a copper chelating tetramine and the use thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283339A (en) * | 1988-11-23 | 1994-02-01 | California Institute Of Technology | Immobilized metal aqueous two-phase extraction and precipitation |
| US5169936A (en) * | 1989-04-14 | 1992-12-08 | Biogen, Inc. | Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand |
| EP0393438B1 (de) * | 1989-04-21 | 2005-02-16 | Amgen Inc. | TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs |
| CN1130353A (zh) * | 1993-07-09 | 1996-09-04 | 史密丝克莱恩比彻姆公司 | 蛋白质的纯化 |
| US5932102A (en) * | 1998-01-12 | 1999-08-03 | Schering Corporation | Immobilized metal, affinity chromatography |
-
2003
- 2003-11-13 MX MXPA05005246A patent/MXPA05005246A/es unknown
- 2003-11-13 AU AU2003298287A patent/AU2003298287A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-13 PL PL376745A patent/PL376745A1/pl not_active Application Discontinuation
- 2003-11-13 CA CA002505385A patent/CA2505385A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-13 AR ARP030104173A patent/AR042038A1/es unknown
- 2003-11-13 EA EA200500762A patent/EA200500762A1/ru unknown
- 2003-11-13 WO PCT/EP2003/050824 patent/WO2004046184A1/en active Application Filing
- 2003-11-13 KR KR1020057008517A patent/KR20050074997A/ko not_active Application Discontinuation
- 2003-11-13 BR BR0315807-1A patent/BR0315807A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-11-13 RS YUP-2005/0355A patent/RS20050355A/sr unknown
- 2003-11-13 CN CNB2003801086090A patent/CN100375753C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-13 EP EP03796015A patent/EP1560851A1/en not_active Withdrawn
- 2003-11-13 JP JP2004552721A patent/JP2006517187A/ja not_active Withdrawn
- 2003-11-13 US US10/534,535 patent/US20060128616A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-05-06 HR HR20050406A patent/HRP20050406A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2005-05-09 ZA ZA200503702A patent/ZA200503702B/en unknown
- 2005-05-10 BG BG109152A patent/BG109152A/bg unknown
- 2005-06-15 NO NO20052916A patent/NO20052916L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-04-24 HK HK06104826A patent/HK1082751A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2003298287A1 (en) | 2004-06-15 |
| EA200500762A1 (ru) | 2005-12-29 |
| CA2505385A1 (en) | 2004-06-03 |
| PL376745A1 (pl) | 2006-01-09 |
| KR20050074997A (ko) | 2005-07-19 |
| NO20052916D0 (no) | 2005-06-15 |
| CN100375753C (zh) | 2008-03-19 |
| EP1560851A1 (en) | 2005-08-10 |
| ZA200503702B (en) | 2006-08-30 |
| AR042038A1 (es) | 2005-06-08 |
| MXPA05005246A (es) | 2005-07-25 |
| HK1082751A1 (en) | 2006-06-16 |
| BR0315807A (pt) | 2005-09-20 |
| RS20050355A (en) | 2007-06-04 |
| CN1738835A (zh) | 2006-02-22 |
| US20060128616A1 (en) | 2006-06-15 |
| BG109152A (bg) | 2006-04-28 |
| NO20052916L (no) | 2005-06-15 |
| JP2006517187A (ja) | 2006-07-20 |
| WO2004046184A1 (en) | 2004-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2061803B2 (en) | Process for the purification of fc-containing proteins | |
| US11332539B2 (en) | Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction | |
| JP6046089B2 (ja) | Ｔｎｆｓｆ一本鎖分子 | |
| Degli-Esposti | To die or not to die—the quest of the TRAIL receptors | |
| EP1689777B1 (en) | Process for the purification of il-18 binding protein | |
| US8592557B2 (en) | Multimeric TNF receptor fusion proteins and nucleic acids encoding same | |
| US20100267932A1 (en) | Process for the purification of fc-fusion proteins | |
| KR100372209B1 (ko) | 항체정제법 | |
| ES2373402T3 (es) | Método para purificar anticuerpos. | |
| KR100732934B1 (ko) | 활성 림포톡신-β수용체 면역글로불린 키메라 단백질을높은 수준으로 발현시키는 방법 및 이의 정제 방법 | |
| EP2753634B1 (en) | Method for preparing active form of tnfr-fc fusion protein | |
| NO331712B1 (no) | Fremgangsmate for rensing av IL-18 BP samt anvendelse av et vandig tofasesystem for rensing eller innfanging av IL-18BP | |
| EP3908664A1 (en) | Multi-functional fusion proteins and uses thereof | |
| JP2008522593A (ja) | オステオプロテゲリン・バリアントタンパク質 | |
| HRP20050406A2 (en) | Process for the purification of tnf-binding proteins using imac | |
| NZ574626A (en) | Process for removing free Fc-moieties from fluids comprising Fc-containing proteins using ion exchange chromatography | |
| Razmara et al. | Fn14-TRAIL, a chimeric intercellular signal exchanger, attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis | |
| CN116348481A (zh) | 使用工程化配体的材料和方法 | |
| RU2670166C1 (ru) | Способ получения слитого белка tnfr-fc с заданным содержанием примесей | |
| WO2004027026A2 (en) | Improved methods for preparing highly active april ligand polypeptides | |
| US20050255547A1 (en) | Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same | |
| Branschädel | Analysis of molecular components essential for the formation of signaling competent TNF-TNFR complexes | |
| WO2003095489A1 (en) | Hexamers of receptors, members of the tnf receptor family, their use in therapy and pharmaceutical compositions comprising the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20081112 Year of fee payment: 6 |
|
| OBST | Application withdrawn |