CN100375753C - 采用imac纯化tnf结合蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明说明了肿瘤坏死因子结合蛋白的一种新的纯化方法。具体说，该方法的特征是采用了固定的金属亲和层析(IMAC)捕获步骤，其中采用铜作为金属。这种方法在产量、最终产品的纯度和产业规模的应用上具有优越性。

Description

采用IMAC纯化TNF结合蛋白的方法
发明领域
本发明涉及多肽纯化领域。更具体说，涉及肿瘤坏死因子结合蛋白的纯化。
发明背景
肿瘤坏死因子-α(TNFA)是一种强效细胞因子，能诱导通过与细胞表面受体结合来介导的广谱生物反应。可从人的组织细胞性淋巴瘤细胞系分离得到人TNF-α的受体(见Stauber等，JBio Chem.，263：19098-104，1988).
另一研究小组利用单克隆抗体证明有二种不同的TNF结合蛋白，二者均能特异性结合TNF-α和TNF-β且具有高亲和力(见Brockhaus等，Proc.Nat.Acad Sci.87：7380-7384,1990)，并分离到这二种受体之一的cDNA。他们发现该cDNA编码一种455个氨基酸的蛋白质，该蛋白分为含171个残基的胞外结构域和含221个残基的胞质结构域。
之后另一研究小组(Aggarwal等，Nature 318：665-667,1985)证明肿瘤坏死因子α和β通过结合共同的表面受体而启动其对细胞功能的作用。TNF-α和TNF-β受体大小不同，在不同的细胞系中有差异性表达(Engelmann等，J Bio Chem.265：1531-1536，1990)。
TNF-α受体1，某些人称为TNFR55，是二种受体中较小的。已克隆了二种受体的cDNA并测定了它们的核酸序列(见Loetscher等，Cel1.61：351-359,1990；Nophar等，EMBO J.9：3269-3278，1990；Schall等，Cell.61：361-370，1990和Smith等，Science.248：1019-1023，1990)。
此二种受体的胞外结构域在结构上非常相似，但它们的胞内结构域看来不相关。以该二受体的cDNA作为探针进行人基因组DNA的Southern印迹，结果表明它们各由一个基因编码。
为纯化这些多肽尝试了几种方法。最常用的方法之一是层析法，包括亲和层析，其中待纯化的物质先被吸附在其上固定了对该物质具有亲和力的物质的合适支持物的床或柱上，而将其捕获，并让粗制混合物的其它成分不结合而通过。然后改变环境条件如pH和/或盐浓度，来洗脱被吸附的物质而得到部分或完全纯化的分子。
在亲和层析领域，已描述了称为IMAC(固定的金属亲和层析法)的技术在某些情况下特别有效(见Arnold，Biotechnique第9卷，151-156页，1991年2月的综述文章)。描述了IMAC在纯化具有参与金属结合的功能基团，如Glu、Tyr、Cys、His、Asp和Met侧链以及氨基末端酰氨氮和主链羰基氧的多肽时，是一种非常有效的技术。
虽然此技术非常有效，但它不总是具备所需的特异性。例如，已确定对于含有一个或优选含多个组氨酸的多肽，吸附于含Cu2+的层析柱是特优的，但也发现在缺少三种据认为是对于吸附最重要的氨基酸，即组氨酸、色氨酸和半胱氨酸时，蛋白仍能吸附，这就削弱了纯化步骤的特异性。
虽然对纯化目的总体上说是满意的，但具体到当待纯化的多肽是糖蛋白时，吸附效率可能并非是最优的。此时糖链常常遮盖与金属螯合物结合的活性位点并降低吸附步骤中层析柱的亲和力。
发明内容
现已发现，TNF结合蛋白可用包含采用铜作为金属的固定化金属亲和层析(IMAC)步骤的方法来有效纯化。该步骤的pH和盐浓度的最适条件是pH2.8-3.2，优选pH3；和盐浓度为14-16mS，优选15mS。
根据本发明，“TNF结合蛋白”指对于TNF-α或TNF-β具有亲和力的和/或其胞外域中含有属于TNF受体家族某蛋白质的可溶性片段的任何蛋白质或其片段。
TNF受体家族成员的某些例子如下：
●肿瘤坏死因子受体l(TNFR1)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员1A(TNFRSF1A)，或肿瘤坏死因子α受体(TNFAR)或TNFR55-KD或TNFR60-KD(见OMIM*191190 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/emterz/query.fcgi？ db＝OMIM中所述)；
●肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(TNFRSF1B)，或肿瘤坏死因子β受体(TNFBR)或TNFR75-KD或TNFR80-KD(见OMIM*191191中所述)；
●OX40抗原(OX40)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)，或Tax-转录活化的糖蛋白质1受体(TXGP1L)或淋巴样活化抗原ACT35(ACT35)或CD134(见OMIM*600315中所述)；
●CD40L受体(CD40)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5(TNFRSF5)，或B细胞表面抗原CD40或CDw40或Bp50(见Swiss-ProtEntry No.P25942中所述)；
●FASL受体(FAS)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)，或凋亡介导表面抗原FAS或Apo-1抗原或CD95(见Swiss-Prot EntryNo.P25445中所述)；
●诱骗受体3(DcR3)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员6B(TNFRSF6B)，或FAS配体的诱骗受体或M68(见Swiss-Prot EntryNo.O95407中所述)；
●CD27抗原(CD27)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员7(TNFRSF7)，或T细胞活化抗原S152(S152)(见OMIM*602250中所述)；
●淋巴样活化抗原CD30(CD30，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8(TNFRSF8)(见OMIM*153243中所述)；
●淋巴细胞活化因子诱导产物(ILA)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)，或CD137(见OMIM*602250中所述)；
●死亡受体4(DR4)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)，或TNF-相关的凋亡诱导配基受体1(TRAILR1)或APO2(见OMIM*603611中所述)；
●死亡受体5(DR5)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员10B(TNFRSF10B)，或TNF-相关的凋亡诱导配基受体2(TRAILR2)或Killer/DR5或TRICK2(见OMIM*603612中所述)；
●诱骗受体1(DCR1)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员10C(TNFRSF10C)，或TNF-相关的凋亡诱导配基受体3(TRAILR3)或无胞内结构域的TRAIL受体(TRID)(见OMIM*603613中所述)；
●诱骗受体2(DCR2)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员10D(TNFRSF10D)，或TNF-相关的凋亡诱导配基受体4(TRAILR4)或含有截短的死亡结构域(TRUNDD)的TRAIL受体(见OMIM*603014中所述)；
●NF-κ-B受体激活剂(RANK)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员11A(TNFRSF11A)，或破骨细胞分化因子受体(ODFR)或PDB2或TRANCER(见OMIM*603499中所述)；
●破骨蛋白素(Osteoprotegerin，OPG)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)，或破骨细胞发生抑制因子(0CIF)(见OMIM*602643中所述)；
●死亡受体3(DR3)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员12(TNFRSF12)，或APO3或淋巴细胞相关的死亡受体(LARD)(见OMIM*603366中所述)；
●跨膜激活剂和Caml相互作用因子(TACI)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13B(TNFRSF13B)(见OMIM*604907中所述)；
●BAFF受体(BAFFR)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13C(TNFRSF13C)，或B细胞活化因子受体(见OMIM*606269中所述)；
●单纯疱疹病毒进入介质(HVEM)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14)，或单纯疱疹病毒进入介质A(HVEA)或TR2(见OMIM*602746中所述)；
●神经生长因子受体(NGFR)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员16(TNFRSF16)，或p75(NTR)(见OMIM*162010中所述)；
●B细胞成熟因子(BCMA)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)，或BCM(见OMIM*109545中所述)；
●糖皮质激素诱导的TNFR-相关基因(GITR)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)，或活化可诱导的TNFR家族成员(AITR)(见OMIM*603905中所述)；
●TRADE，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员19(TNFRSF19)，或毒性和JNK诱导剂或TROY或TAJ(见Swiss-Prot Entry No.Q9NS68中所述)；
●X-连锁的外胚异常蛋白(X-Linked Ectodyplasin)-A2受体(XEDAR)，也称为EDA-A2受体(见Swiss-Prot Entry No.Q9HAV5中所述)；
●死亡受体6(DR6)也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员21(TNFRSF21)(见OMIM*605732中所述)；
根据本发明的优选实施方案，TNF结合蛋白选自重组的h-TBP-1(人TNF受体-1的重组胞外可溶性片段，含有对应于Nophar等的20-180氨基酸片段的氨基酸序列)和重组的h-TBP-2(TNF受体-2的重组胞外可溶性片段，含有对应于Smith等23-257的氨基酸序列)。最优选的是重组h-TBP-1(r-TBP-1)。所有其它蛋白的可溶性胞外结构域见于相应的Swiss-Protentry中。
根据本发明的另一优选实施方案，TNF结合蛋白的纯化过程除“IMAC”步骤作为“捕获”步骤外，还包括以下“中间步骤”：在酸性pH(优选3-4之间)下的离子交换层析(IEC)继之以碱性pH(优选8-10之间)下的离子交换层析。
根据本发明的另一优选实施方案，TNF结合蛋白的纯化过程还包括作为“精加工(polish)步骤”的疏水作用层析(HIC)。
更优选地，上述每种层析后进行超滤。
本发明的“捕获步骤”指从有重组TNF-结合蛋白的重组宿主细胞培养物的粗提上清液中分离和浓缩该蛋白的步骤。此最初步骤末的高产量对该方法的整个性能和产量有很大的影响。根据本发明，该捕获步骤在铜螯合(Cu-Chelate)FF上进行，用pH3.0洗脱，得到的产物纯度>40％，回收率>80％。
“中间步骤”是去除原液中大多数的杂质，如其它蛋白质、核酸、内毒素和病毒的步骤。
“精加工步骤”是去除任何残留的微量杂质或密切相关物质以获得高纯蛋白质的步骤。
“离子交换层析(IEC)”能够分离电荷上仅有微小差别的分子而得到极高分辨的分离。收集纯化浓缩的组分。该分离是依据带电分子与带相反电荷层析介质之间的可逆性相互作用。分子加到层析柱上时即结合于其上，然后改变条件使结合的物质差异性洗脱。洗脱常通过改变盐浓度或pH进行。可逐步改变或连续梯度改变。在离子交换层析中常用Q Sepharose或SP Sepharose柱。“Q Sepharose”是一种季铵强阴离子交换剂(带电基团：-N+(CH3)3)，而“SP Sepharose”是磺丙基强阳离子交换剂(带电基团：-SO3 -)。
疏水作用层析(HIC)是根据生物分子表面疏水性差异进行纯化和分离的多用途方法。蛋白质和肽的结构域中的疏水性氨基酸通常与分子表面相隔离。然而，许多被认为是疏水性的分子具有足够的暴露的疏水基团使得其能与层析基质上连接的疏水性配基相互作用。与反相层析相比，基质上这种配基的密度低得多。这种特征促进了HIC的高选择性，同时允许温和的洗脱条件有助于保存生物活性。本发明在疏水反应层析(HIC)步骤中优选采用“丁基Sepharose”柱。此柱上的正丁基用作疏水性配基。
根据本发明，在真核细胞，优选哺乳动物细胞中用重组DNA技术产生TNF结合蛋白。产生TNF结合蛋白的重组方法在下文中作全面说明。
在该方法的最初步骤中，将编码所需蛋白的DNA序列插入和连接到合适的质粒中。一旦形成表达载体，将其导入合适的宿主细胞中，然后表达该载体产生所需的蛋白质。
可在真核细胞(如酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中，用合适的表达载体，如上所述表达本发明的任何重组蛋白质。可采用本领域已知的任何方法。
例如，可用本领域熟知的技术(见Sambrook等，1989)将编码获自上述方法之一的蛋白质的DNA分子插入到适当构建的表达载体中。通过均聚体缝合(homopolymeric tailing)或涉及采用合成的DNA接头或平端连接技术的限制性连接，可将双链cDNA连接于质粒载体：用DNA连接酶来连接DNA分子，用碱性磷酸酶处理避免不需要的连接。
为了能表达所需要的蛋白质，表达载体还应包含含有连接于所需蛋白编码DNA的转录和翻译调控信息的特异性核苷酸序列，转录和翻译调控信息与所需蛋白编码DNA的连接方式使基因表达和产生该蛋白质。首先在待转录的基因之前必须有RNA聚合酶所识别的启动子，聚合酶与其结合而启动转录过程。已有各种这样的启动子在使用，它们的工作效率不同(强和弱启动子)。
对于真核宿主，可采用不同的转录和翻译调控序列，这取决于宿主的性质。它们可来源于病毒，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿病毒等，其中调控信号与具有高水平表达的特定基因相结合。例子有单纯疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母菌ga14基因启动子等。可选择能抑制和激活的转录启动调控信号，从而调节基因的表达。
将含有编码本发明杂合蛋白的核苷酸序列的DNA分子，插入到含可操作性连接有转录和翻译调控信号的载体中，其能将所需基因序列整合入宿主细胞中。可同时导入一种或多种标记来选择已被导入的DNA稳定转化的细胞，这些标记使得含有表达载体的宿主细胞可被选择。此标记可以是为营养缺陷型宿主提供光合营养、生物杀灭剂抗性如抗生素，或重金属铜等。可将选择性标记基因直接连接到待表达的DNA基因序列，或通过共转染导入同一细胞中。本发明蛋白质的合成若要优化也可能需要其它元件。
选择具体质粒或病毒载体中的重要因素包括：含有该载体的受体细胞与那些不含该载体的受体细胞应当易于识别和选择；在具体宿主中所需的载体拷贝数；是否需要能在不同种宿主细胞之间穿梭的载体。
一旦制备了用于表达的含所述构建物的载体或DNA序列，可用各种适合的方法：转化、转染、结合、原生质融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等，将DNA构建物导入合适的宿主细胞中。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选真核宿主，例如哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们能对蛋白质分子进行翻译后修饰，包括正确折叠或在正确部位的糖基化。酵母细胞也可进行包括糖基化在内的翻译后多肽修饰。有很多利用可用于在酵母菌中生产所需蛋白质的强启动子序列和高拷贝数质粒的重组策略。酵母菌能识别克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并分泌带有前导序列的多肽(即，前肽)。
导入载体后，在选择性培养基中培养宿主细胞，选择生长的含载体细胞。克隆基因序列的表达将产生所需的蛋白质。
如此获得的重组蛋白质的纯化按照本发明方法进行。
本说明书以下部分将提供本发明详尽的实施方案，在图1中作了图示归纳。
缩写
TNF                   肿瘤坏死因子
TBP                   TNF结合蛋白
IDA                   氨基二乙酸
铜螯合(Cu-Chelate)FF  铜螯合，快流(Fast Flow)
Q-SEPH.FF             Q-Sepharose，快流
SP-SEPH.FF            SP-Sepharose，快流
丁基-SEPH FF          丁基-Sepharose，快流
IEC                   离子交换层析
ACN                   腈
CBB                   考马斯亮兰
DNA                   脱氧核糖核苷酸
EtOH                  醇
HIC                   疏水作用层析
IEF                   等电聚焦电泳
IEMA                  免疫酶计量试验
IFMA                  免疫荧光计量试验
IPC                   过程控制
KD                    千道尔顿
LOQ                   定量限度
OD                    光密度
PI                    等电点
RP-HPLC               反相高效液相色谱
SDS-PAGE或SDS         十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳
SE-HPLC                 体积排阻高效液相色谱
OMw                     分子量标准品
SS                      硫酸钠
Tris                    三(羟甲基)氨基甲烷
Bv                      柱床体积
附图说明
图1显示用于纯化r-hTBP-1的工艺的流程图。从捕获步骤到获得r-hTBP-1粗料共需要8个步骤，其中最重要的是捕获步骤。在以下实施例中详细说明这8步的每一步。
实施例
材料
设备
层析柱XK26/20(2.6×20cm)          Pharmacia
层析柱XK50/20(5×20cm)            Pharmacia
蠕动泵Miniplus2                   Gilson
蠕动泵P.1                         Pharmacia
图表记录仪2210                    Pharmacia
UV检测仪Uvicord2158               Pharmacia
在线pH-电导率监测仪               Biosepra
低压层析系统FPLC                  Pharmacia
HPLC分析系统                      Merck
荧光检测仪9070型                  Varian
冷藏盒MCF1500                     Angelantonl
UV分光光度仪UV1204                Shimadzu
超滤系统Minitan型                 Millipore
Minitan平板4/K                    Millipore
搅拌器8400型                      Amicon
搅拌器8050型                      Amicon
超滤膜YM10型                          Amicon
超滤膜YM10型                          Amicon
树脂和层析柱
SP Sepharose FF                       Pharmacia
Q Sepharose FF                        pharmacia
丁基Sepharose FF                      Pharmacia
螯合Sepharose FF                      Pharmacia
SP Sepharose大珠                      Pharmacia
苯基Sepharose 6FF(高sub)              Pharmacia
CM Sepharose FF                       pharmacia
DEAE Sepharose FF                     Pharmacia
DEAE-HyperD                           Biosepra
Supelcosil LC-308 0.46x6              Supelco
Aquapore RP-300 Brownlee              Applied Biosystem
TSK-G2000 SWXL 0.78×30               TOSO-HAAS
Mono-Q HR 5/5                         Pharmacia
化学试剂
三(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)             Merck
氯化钠                                Merck
正磷酸85％                            Merck
氢氧化钠(片状)                        Merck
磷酸氢二钠                            Merck
磷酸二氢钠                            Merck
无水乙醇                              Merck
乙腈(ACN)                             Baker
三氟乙酸(TFA)                         Baker
50％氢氧化钠                          Merck
硫酸钠                        Merck
硫酸铜                        Merck
氯化锌                        Merck
盐酸37％                      Merck
1-丙醇cod.1024                Merck
乙二胺四乙酸(EDTA)            Merck
硫酸铵                        Merck
生物试剂
r-hTBP-1粗提物                INTERPHARM LABORATORIESLTD
抗TBP-1克隆18单抗             INTERPHARM LABORATORIESLTD
白蛋白标准品 cod.2321         Pierce
以下详细描述r-hTBP-1(Onercept)的纯化。
步骤1——捕获步骤
缓冲液和溶液说明
使树脂带电荷的缓冲液(resin charging buffer)
取32克硫酸铜溶于900ml纯水中，溶解后加纯水至体积1升。
酸化水
在1升水中加入0.5ml乙酸。
平衡缓冲液
将1.68±0.1ml的85％正磷酸和11.68±0.1g NaCl溶于900ml纯水中，用50％NaOH溶液调pH至6.8±0.1，加纯水至体积1升。
洗涤液
用1升纯水作为洗涤液。
洗脱缓冲液(经测试DH在2.8-3.2范围)
将6.75±0.5ml的85％正磷酸和5.84±0.1g NaCl溶于900ml纯水中，用50％NaOH溶液调pH至3±0.1，加纯水至体积1升。所得导电率为15±1mS。
再生缓冲液
将18.6±0.1gEDTA和58.4±1g NaCl溶于900ml纯水中，加纯水至体积1升。
清洁液
将40g NaOH溶于900ml纯水中，加纯水至1升。
贮存液
采用20％乙醇或0.01M NaOH作为贮存液
层析柱准备
使8±1ml的螯合Sepharose快流(Chelating Sepharose Fast Flow)(Amersham Biosciences)与亚氨基二乙酸树脂偶联，填装入层析柱中，柱床高4±0.5cm。用10BV的酸化水洗涤此填装柱，然后加入2BV的0.2M硫酸铜pH4-4.5。按制造商说明书，用2-3mM，pH4-4.5乙酸钠溶液促进硫酸铜溶解，避免在中性pH下发生沉淀。然后用10BV酸化水洗涤树脂。
过程
将4℃贮存的含r-hTBP-1(重组TNF结合蛋白-1)的粗提物回暖至室温，滴加85％正磷酸调pH至6.8，加固体NaCl使电导率至21±1mS(也可在该粗提物经初步超滤浓缩去除可能对r-hTBP-1与铜相互作用有不利影响的培养基成分后使用)。
如上所述准备好的层析柱在室温(22±3℃)下操作，先灌注15-20BV的平衡缓冲液进行平衡，然后加入r-hTBP-1粗提物，线性流速为200ml/sqcm/小时。
此柱先用平衡缓冲液洗涤直到UV信号降至基线，然后用12-15BV的水洗涤，弃去柱流出液。
用洗脱缓冲液洗脱，当测到UV信号时开始收集洗脱液。r-hTBP-1的洗脱需5-6BV的洗脱缓冲液。收集含半纯化r-hTBP-1的流出液，-20℃保存。
用3BV再生缓冲液再生此柱，丢弃柱流出液。然后用5BV清洗液洗柱。
用5BV贮存液洗涤此柱并在其中进行再贮存。
此步骤后的纯度数据小结于下表1中。
捕获步骤的效能(与Zn 2+ IMAC比较)
此捕获步骤原先在Zn2+螯合IMAC柱上进行。然而考虑到此步骤对粗提r-hTBP-1的负载容量太低(每ml树脂250-300mcg r-hTBP-1或40柱体积的粗提物)，故用铜代替锌作为带电金属，负载容量得到显著提高。在此Cn2+IMAC捕获步骤中，r-hTBP-1结合于树脂，大部分杂蛋白在不结合组分中洗脱，洗脱液中获取的半纯化r-hTBP-1纯度水平适合后续步骤。
通过所选条件，结合容量改进到了所需的要求，同时产生了一些其它优点。与本发明最为相关的结果小结如下。
金属螯合层析进行r-hTBP-1捕获步骤显示了以下特征：
1.浓缩：与粗提物相比较，r-hTBP-1的浓度提高了25-30倍(见表1)。
2.纯度：如表1所示，此步骤有效地减少了污染。
3.规模可放大性：此方法适合放大规模和制造规模。
4.产率：如表2所示，此步骤回收率满意。
此外，此步骤非常快速、重复性好和易于操作。树脂经适当清洗和再带电荷(recharge)后可重复使用。
此外，采用Cn2+代替Zn2+的主要优点小结如下：
●荷载量更高：1ml Cu-树脂能结合1-1.2mg的r-hTBP-1，而Zn树脂为0.25-0.5mg/ml。
●物质纯度水平的提高：从Zn树脂捕获步骤后的30-35％提高到Cu树脂的40-50％，见表2所示(定量RP-HPLC)。
●洗涤次数减少：从Zn树脂的3次到Cu树脂的1次，并减少操作时间和缓冲液的消耗。
表1：铜螯合捕获r-hTBP-1-----IEMA测定的回收率数据
  运行1   起始   1200   8.5   10.2   --
  未结合   1300   1.0   1.3   12.7
  洗涤   98   1.4   0.12   1.2
  洗脱   45   234   10.5   100
  运行2   起始   1100   8.2   9.0--
  未结合   1200   0.9   1.0   11
  洗涤   88   1.2   0.1   1.1
  洗脱   38   214   8.2   91
  运行3   起始   1200   8.2   9.8   --
  未结合   1300   1.6   2.0   20
  洗涤   88   1.6   0.14   1.4
  洗脱   41   200   8.2   83.6
*根据荷载的r-hTBP-1总量计算。
步骤2在SP Sepharose FF上进行离子交换层析
缓冲液和溶液说明
平衡缓冲液
搅拌中将1.68ml的85％正磷酸和17.53g NaCl加入900ml水中，用50％NaOH溶液调pH至3.0±0.1，加水至体积1升。
洗涤液
搅拌中将0.68ml的85％正磷酸加入900ml水中，用50％NaOH溶液调pH至4.0±0.1，加水至体积1升。
洗脱缓冲液
搅拌中将3.37ml的85％正磷酸和17.53g NaCl加入900ml纯水中，用50％NaOH调pH至4.0±0.1，加水至体积1升。
再生缓冲液
搅拌中将3.37ml的85％正磷酸和116.8g NaCl加入900ml水中，用50％NaOH溶液调pH至6.0±0.1，加水至体积1升。
清洗液
搅拌中将20g NaOH加入900ml纯水中，加纯水至1升。
贮存液
搅拌中将200ml无水乙醇加入到800ml水中。
层析柱制备
按制造商说明书在柱子中装入SP Sepharose FF树脂至6-6.5cm柱床高。
灌注3BV的0.5M NaOH然后3BV的水清洗该柱。
灌注4-5BV的平衡缓冲液平衡此柱。检测柱流出液的pH和导电率(pH3.0±0.1，导电率29.5±0.5mS/cm)。如果测定值不在此范围内则继续平衡此柱。
NB：或者，平衡缓冲液可用无NaCl的25mM pH2.8±0.1磷酸盐缓冲液代替；不需洗涤缓冲液；再生缓冲液可用1.5M NaCl代替；贮存缓冲液可用10mMNaOH代替.
过程
所有操作在2-8℃ 中进行，流速40-50ml/cm/小时。
室温或6±2℃下融化捕获步骤洗脱时获得的冻结r-hTBP-1。加入85％磷酸将pH从3.7±0.2调至3±0.1，加入固体氯化钠将电导率从14±3mS/cm调至22±3mS/cm，然后将该溶液上柱。上柱完毕后，用3BV的平衡缓冲液灌注，然后用4BV的洗涤液洗柱。或者可省去洗涤液洗涤步骤(见上述NB)。
接着开始洗脱液洗脱。180-220ml后，r-hTBP-1开始洗脱。弃去前面部分，收集其后含有半纯化r-hTBP-1的3.5 BV洗脱液。洗脱组分取样(5X0.5ml)作IPC，贮存在6±2℃不超过3天。
洗脱完毕后，此柱灌注3BV的再生缓冲液，取样(1×1ml)后组分丢弃。
此柱注入3BV的20％EtOH(或10mM NaOH)后保存在6±2℃。
此步骤7次实验的结果见表2：
表2：阳离子交换层析步骤的性能
  运作   起始SP总量mg   r-hTBP-1回收率
  CS P-HTPB-1/015 RUN5   436   95.8％
  CS P-HTPB-1/015 RUN6   435   95.4％
  CSP-HTPB-1/015 RUN7   454   93.4％
  CSP-HTPB-1/015 RUN8   419   93.0％
  CSP-HTPB-1/015 RUN9   576   97.6％
  CSP-HTPB-1/015 RUN10   579   98.7％
  CSP-HTPB-1/015 RUN11   382   102％
下表3显示步骤IMAC和SP-Sepharose FF联用的情况。
表3-获自不同来源r-hTBP-1的纯度
  上游加工   IMAC后纯度   SP后纯度   数据来源
  有血清   58％--62％   82％--100％   GMP Runs BS01-BS05
  无血清   57％--77％   81％--98％   GMP Runs MS01-MS05
步骤3-SP洗脱液的超滤
步骤
所有操作在室温(23±3℃ )下进行。
将保存在NaOH中的超滤器用水洗涤至pH 7.0±0.5。超滤器装好膜后加入r-hTBP-1溶液。超滤浓缩该溶液至50ml。保留组分用约200ml水稀释再浓缩至50ml。上述洗涤步骤再重复3次。
检测滤过液的导电率：如果<0.5mS/cm，开始以下步骤。
如果导电率值>0.5mS/cm，再重复一次洗涤步骤。
在保留组分中加入200ml的50mM Tris(pH9.0±0.1，导电率0.55±0.1mS/cm)，再浓缩至50ml溶液.
重复上述操作3次，如果需要，继续进行直到滤过液组分的pH和导电率分别为9.0±0.2和0.55±0.1mS/cm。
收集保留组分，超滤器用等份的50mM Tris(pH 9.0±0.1导电率0.6±0.1mS/cmI)加洗涤组分100ml洗3次。
用0.1M NaOH(或0.5M NaOH)循环清洗超滤器不超过30分钟。用水洗超滤器直到滤过液pH为7.0±0.5。然后将超滤器保存在23±3℃的0.01M或0.05M NaOH中。
步骤4-在Q Sepharose FF上进行离子交换层析
缓冲液和溶液
平衡缓冲液：50mM Tris pH9.0±0.1.导中.率0.55+0.1 mS/cm
洗脱缓冲液：250mM Tris pH9.0+0.1，50mMNaCl导由率7.2+0.5mS/cm
再生缓冲液：250mM Tris pH6.0±0.1，2M NaCl或1.5M NaCl
清洗液：0.5M NaOH
贮存液：20％乙醇或10mM NaOH
过程
所有操作在以下条件进行：
温度：2-8℃或室温；  线性流速：80-90ml/cm2/小时。
检测超滤后r-TBP-1的pH，如果不是pH9.0±0.1，用1MTris或3M HCl调节。也检测导电率。
按制造商说明书装入Q-Sepharose FF树脂至13cm柱床高。
然后灌注3BV 0.5M NaOH，继之以6BV水清洗Q-Sepharose柱。此柱灌注4BV洗脱液并用7-8BV平衡液平衡，检测柱流出液的pH和电导率(pH9.0±0.2，电导率0.55±0.1mS/cm)。如果测定值不在此范围内，继续进行直到柱最终平衡。
将上述制备的超滤的r-TBP-1上柱。上柱完毕后用3BV平衡液灌注此柱。
用洗脱液开始洗脱。1BV后开始洗脱纯的r-TBP-1；根据层析图谱1BV后开始收集r-hTBP-1；5-6BV后完成洗脱。
用3BV再生液灌注此柱，取样(1X1ml)然后弃去其余流出液。再用3BV 0.5M NaOH灌洗此柱，用水洗涤直到流出液的pH在7-8之间。最后用3BV EtOH 20％灌柱，2-8℃保存。
步骤5-在DV 50 PALL上进行纳米级超滤
将不锈钢底安置在圆筒上，DV50滤膜(47mm直径)放置在该不锈钢底上。Pall UltiporVF Grade DV50是通常用于除去病毒的滤筒。在盘顶加几滴水。装上合适的密封条，紧紧关闭圆筒。该系统装入50ml Q洗脱液，关紧，连接氮源。
灌注开始时，打开氮气，初压为0.5巴，然后打开位于圆筒上的出气阀吹洗该系统。
一旦在圆筒的出气阀出现第一滴液体时，关紧它，打开氮气至正压3.0-3.5巴。
用50ml缓冲液灌注膜，确保膜被打湿并除去膜之间可能存在的空气，对滤膜进行完整性测试。
用前述步骤得到的物质灌满此系统，并如下操作：过滤开始时，打开氮气，初压为0.5巴，然后打开位于圆筒上的出气阀吹洗该系统。一旦出现第一滴液体，关闭圆筒的出气阀，打开氮气至压力为1.5-2.5巴。
保持氮气压为1.5-2.5巴，然后过滤溶液。
将过滤后的溶液收集在一容器中，过滤结束时关闭氮源，打开出气阀除去多余氮气。
过滤结束时，用前一步的洗脱液5-10ml以相同工作压力1.5-2.5巴清洗此系统。
将清洗液收集到过滤液的同一容器中，取样作IPC。
步骤6-在丁基Sepharose FF上进行疏水作用层析
缓冲液和溶液
平衡缓冲液：200mM Tris-HCL pH7.5±0.1.1M Na2SO4，电导率90±5mS/cm洗脱缓冲液：200mM Tris-HC1 pH7.5±0.1.0.7M Na2SO4电导率75±5mS/cm
再生缓冲液：纯水
清洗液：1MNaOH
贮存液：20％乙醇或10mM NaOH
过程
所有操作均在23±3℃下进行，线性流速为80-90ml/cm/小时。搅拌下在经100KD超滤后的Q-Sepharose洗脱液中加入固体Na2SO4至1M。盐完全溶解后用3M HCl调pH至7.5±0.1。用3BV的1M NaOH继之以4BV的纯水灌洗此柱。
此柱再用5-6 BV的平衡液灌洗。检测流出液的pH和电导率(pH7.5±0.2，电导率90±5mS/cm)，如果测定值不在标明范围外，继续进行平衡。
将上述制备的溶液上柱，完成后，用3BV平衡液洗柱。继续用平衡液清洗。
2-3BV洗后，蛋白质开始洗脱。此组分所含r-TBP-1占总蛋白的10-12％，但被细胞培养污染物污染。延长洗涤直到蛋白质洗脱达到平台出现宽峰(约2BV)。
然后用洗脱液开始洗脱。前1-2BV洗脱液与洗涤样品合并，因其含有少量污染物，此后立即开始收集r-TBP-1。
在污染物后纯r-TBP-1立即开始洗脱，继续洗脱2.5-3BV。当UV吸光值达到最大值的0.5％时停止收集。收集r-TBP-1后，组分取样(5X0.5ml)，贮存在2-8℃不超过3天。
用3BV纯水洗柱，收集组分。
用3BV的1M NaOH清洗柱，用水洗涤直到流出液pH在7-8之间。
再用3柱体积的20％乙醇洗柱，室温贮存不超过2周。
步骤7-10KD超滤
在装有膜的8400型搅拌室中加入丁基-Sepharose洗脱液。在3巴的氮压下浓缩此溶液至大约25ml。用约100ml水稀释保留组分再浓缩到25ml。再重复上述洗涤步骤3次。检测滤出液的电导率：如果<0.3mS/cm，那么开始以下步骤。如果导电率>0.3mS/cm，应重复此洗涤步骤。
在保留组分中加入100ml缓冲液再浓缩至25ml溶液。重复此操作3次，如果需要，直到滤出液的pH和电导率分别为7.1±0.2和5.8±0.2mS/cm。
倒出保留组分，加入到装有膜的较小8050型超滤搅拌室中。浓缩该保留组分至最小体积(约3-5ml)。收集该保留组分，用滤出组分清洗超滤器，加到浓缩的r-TBP-1中。调整最后体积以达到最终浓度约20-30mg/ml(通过OD280nm测定，ε＝0，71)。
用0.2M NaOH循环清洗超滤器至少30分钟。然后用水清洗超滤器直到滤过液pH为7.0±0.5。然后将超滤器6±2℃下保存在0.01 MNaOH中
步骤8-微滤
将一次性注射针筒接上0.22μ滤器，装入r-TBP-1浓缩液，过滤，用1ml缓冲液洗2次，合并洗液与滤过液。所得溶液取样作分析试验(15x0.2ml)，-20℃保存。
如下表(表4-6)所示，从产量和纯度角度看结果满意，反映此过程(RUN)有足够的重复性。
本发明此工艺最关键的是最初在Cu+2螯合柱上的层析步骤。然而，联用酸性pH下的SP Sepharose层析和随后碱性pH下的Q Sepharose也很重要。在这些条件下，从CHO的r-hTBP-1粗提产物(Onercept)获得了极好的结果。特别是捕获步骤显示能将r-hTBP-1浓缩25-30倍，并有效地减少了污染物，蛋白质回收结果满意，并可放大规模用于产业制备。
甚至更令人惊奇的是如下所示，原料是含血清细胞培养物的粗制上清液和无血清培养物时均获得了极高的纯度数据。
表4-步骤和累积的回收数据
运行 SP-Sepharoseq-步骤回收率(％) Q-Sepharose步骤回收率(％) 丁基步骤回收率(％) 成品步骤回收率(％) 总产率<sup>*</sup>
运行1 95.8 98.2 84.8 102 73.8
运行2 95.4 90.4 86.2 104 79.5
运行3 93.4 94.3 90.4 106 82.3
运行4 93.0 93.3 90.5 102 89
运行5 97.6 95.7 80.9 108 83.3
运行6 98.7 89.2 87.3 101 80.1
运行7 102 90 81.6 100 75.2
表5-成品定量数据
成品批次 体积(ml) OD(mg/ml) 定量RP-HPLC(mg/ml) Bradford(mg/ml) 生物活性(IU/mg)¤
运行1 16 20.3 20.2 22.7 25985
运行2 13.7 25 25.3 26.2 27350
运行3 14 26 26.7 26.1 23834
运行4 13.5 28.6 27.7 30.2 23003
运行5 16 29 30.2 28.7 23803
运行6 16 29 29 27.0 27339
运行7 13 20.5 20.4 19.6 27752
¤：OD测定所得的r-hTBP-1的mg数
表6-成品纯度数据
成品批次 SE-HPLC测定的纯度(％) 细胞培养物蛋白质(ppm)¤ 荧光RP-HPLC(ppm)¤ DNA(pg/mg)¤ SDS-PAGE银染色(ppm)¤-2
运行1 99.7 <6 <95 17 <100ppm
运行2 99.9 <5 <75 10 <100ppm
运行3 99.9 3 <46 11 <100ppm
运行4 99.7 <4 <65 12 <100ppm
运行5 99.7 <4 <86 11.5 <100ppm
运行6 99.7 <2 <39 没做 <100ppm
运行7 99.9 没做 <121 没做 <100ppm
将类似的方法步骤应用于另一TNF受体，r-hTBP-2，获得了相似的量和纯度数据。
分析方案
1.定量RP-HPLC-工作程序
采用以下方法来定量所有纯化样品中的r-hTBP-1。采用C8柱和TFA水溶液及正丙醇；r-hTBP-1与细胞培养污染物之间的分辨率良好。r-hTBP-1可解析于1个或2个峰中，取决于柱的批次。下面描述该程序。
1.1设备、材料和方法
-分析型HPLC系统(Merck或等同设备)
-动力混合器(Merck或等同设备)
-层析柱：SUPELCOSIL LC-308Φ0.46x5cm-cod 5-885 1-Supelco
-洗脱液A：0.1％TFA水溶液
-洗脱液B：0.1％TFA水溶液/正丁醇50∶50
-洗脱液C：乙腈
-温度：23±3℃
-UV检测：214nm
-注射时间：62分钟
-注射体积：10-100微升
-标准品：BTC10，用OD280nm测定为1.53mg/ml(ε＝0.71)，注射10和20微升
-梯度：
步骤 流速ml/分 时间(分) ％A ％B ％C
1 0.7 0 90 10 0
2 0.7 5 70 30 0
3 0.7 14 65 35 0
4 0.7 27 0 100 0
5 0.7 35 0 100 0
6 1 35.1 0 20 80
7 1 40 0 20 80
8 1 40.1 90 10 0
9 1 50 90 10 0
10 0.7 61 90 10 0
1.2计算
如下获得每份纯化样品中的r-hTBP-1量：
●按下式计算标准品(BTC10)的反应系数(RF)
Figure C20038010860900251
各样品的r-hTBP-1峰面积乘以标准品的RF获得样品的浓度mcg/ml如下：
TBP1 mcg/ml＝TBP1峰面积XRF标准品
请注意：
●根据可获得性选择BTC10作为标准品；
●r-hTBP-1峰的保留时间在每次制备新的缓冲液时可发生漂移(1-3分钟)；
●浓缩样品必须用洗脱液A稀释。
2.荧光RP-HPLC-工作程序
根据先前用其它重组蛋白质做的实验，进行了荧光检测RP-HPLC分析来估计r-hTBP-1成品和加工样品中残留的细胞培养基污染物的水平，因为当开始此纯化研究时尚无免疫化学方法可用。
发现此法可用于监测最后的纯化步骤，即丁基-Sepharose层析中细胞培养基污染物的去除，该方法对于选择以上步骤的操作条件也是决定性的，因为它可用于分析加工的样品，也无需特定物质和/或装置。RP-HPLC快速(运行时间62分钟)，所得结果与免疫试验(能做该试验时)相当。因为还没有得到污染物的标准品，采用Pierce的BSA作为标准品来评估样品中的污染水平。作为定量性RP-HPLC，此试验对r-hTBP-1与BSA区域的分辨率良好。
2.1设备、材料和方法
-分析型HPLC系统(Merck或等同系统)
-动力型混合器-
-荧光检测仪(变种或等同仪器)
-层析柱Aquapore RP-300,7μ，Brownlee，Φ0.46x22cm-cod 0711-0059,Applied B iosystem
-洗脱液A：0.1％TFA水溶液
-洗脱液B：0.1％TFA乙腈溶液
-温度23±3℃
-λ激发光：220nm
-λ发射光：330nm
-注射体积：10-100微升
-注射时间：62分钟
-标准品：BSA(Pierce)2mg/ml1∶100稀释，注射10和20微升；
-对照：BTC10，OD280nm测定为1.53mg/ml(ε＝0.71)，当注射200微升时；
-r-hTBP-1样品：OD280nm测定为1-5mg/ml(ε＝0.71)
-梯度
步骤 流速ml/分 时间(分) ％A ％B
1 2 0 70 30
2 2 5 70 30
3 2 15 65 35
4 2 25 50 50
5 2 35 50 50
6 2 36 0 100
7 2 45 0 100
8 2 46 70 30
9 2 61 70 30
2.2计算
获得的每份丁基纯化样品的污染物量如下：
●按下式计算标准品(BSA)的反应系数(RF)
Figure C20038010860900271
各样品的污染物峰面积乘以标准品的RF，再乘以1000倍获得注射样品的污染物量(ng)。此值除以注射的r-hTBP-1量，按下式获得每百万部分的污染量：
Figure C20038010860900272
请注意：
●测试样品必须用洗脱液A稀释。
●对照样品的污染物在190-240ppm范围内。
3.r-hTBP-1成品的分析和鉴定
建立了下文所述的分析方法，用于鉴定此种新纯化法得到的r-hTBP-1成品。
3.1SE-HPLC
开发此法目的是定量测定成品中二聚体和聚集物的量。此法可区别r-hTBP-1单体与其二聚体和/或聚集物，这一点已通过用此法测试经UV处理的某些r-hTBP-1样品得到了证明，UV处理是公知的产生聚集形式分子的方法。简言之，如下进行此方法：
3.1.1设备、材料和方法
设备：        分析型HPLC系统
层析柱：      TSK G2000 SWXLcod。08021(TosoHaas)
移动相：      0.1 MpH6.7磷酸钠，0.1M硫酸钠
温度：        23±3℃
UV检测：      214nm
注射体积：    10-100微升，相当于20-30mcg的r-hTBP-1(用OD法测定)
注射时间：    30分钟
标准品：      BTC 10，OD280nm测定为1,53mg/ml(ε＝0.71)，注射10-20微升；
r-hTBP-1成品：稀释至OD280nm测定为1-2mg/ml(ε＝0.71)，注射10-20微升，样品纯度表示为r-hTBP-1峰/总面积比值的％纯度。
3.2 IE-HPLC
开发此法来评价成品中的同工型组成，目的是替代常用的色谱聚焦技术。与色谱聚焦相比，IEC分析更具有优势，因为比前者更快速，需要的材料更少(150-200mcg而非1-2mg)，采用常规缓冲液，不需要预处理测试样品。因为r-hTBP-1是糖蛋白，作为此类性质的物质，其特征是不同的同工型具有不同的等电点，由此决定了离子交换分析检测时它们的行为不同。获得的12个不同的峰，各对应于一糖基化变体。通过此法，分离得到了r-hTBP-1的所有同工型并进行了充分的特征分析。以下简单介绍此法的实施：
3.2.1设备、材料和方法
分析型惰性HPLC系统
层析柱：  Mono Q HR 5/5
缓冲液A：40Mm Tris/NCl pH8.5
缓冲液B：40Nm Tris/HCl pH8.5,0.3 M NaCl
梯度
步骤 流速ml/分 时间(分) ％A ％B
1 1 0 100 0
2 1 10 90 10
3 1 30 75 25
4 1 40 65 35
5 1 41 0 100
6 1 51 0 100
7 1 52 100 0
8 1 70 100 0
流速：    1ml/分
温度：    23±3℃
UV检测：  220nm
注射量：  10-15mcl相当于150-200mcg的r-hTBP-1(通过OD测定)
注射时间：70分钟
样品：    r-hTBP-1成品和参照品，用纯水作1∶2稀释。
4.通过OD定量测定r-hTBP-1
本发明制备的r-hTBP-1成品的浓度，用摩尔消光系数(ε)计算初期纯化r-hTBP-1的280nm光密度来测定。采用了新纯化方法生产的三批代表性r-hTBP-1成品，测得ε＝0.776。此新消光系数将用于放大和生产阶段。因为该成品的浓度范围是20-30mg/ml，必须用成品缓冲液(40mM PBS pH.7.1±0.2，10mM NaCl)将其稀释到1mg/ml，然后测定280nm吸光值。
5.Bradford法测定蛋白质
用Bradford法定量测定r-hTBP-1成品中的总蛋白(见Bradford，MM.Analytical Biochemistry 72：248-254,1 976和Stoscheck，CM.Methods inEnzymology 182：50-69，1990)。此试验中所用的标准品是BSA。
6.体外生物试验
r-hTBP-1的生物活性以其结合TNFα的能力表示。用此试验来测试加工样品和成品。

Claims (11)

1.纯的TNF结合蛋白-1的分离方法，其特征在于，该方法包括在采用铜作金属的固定化金属亲和层析柱上洗脱TNF结合蛋白-1的粗提溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化金属亲和层析是捕获步骤。
3.如权利要求1或2听述的方法，其特征在于，从固定化金属亲和层析柱上洗脱在pH2.8-3.2之间进行。
4.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，从IMAC柱上洗脱在电导率14-16毫西门子之间进行。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，该方法还包括，在所述IMAC柱上洗脱的步骤之后有以下步骤：在酸性pH进行离子交换层析；然后在碱性pH进行离子交换层析。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述酸性pH为pH3-4。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述碱性pH为pH8-10。
8.如权利要求5所述的方法，该方法还包括在碱性pH下进行离子交换层析后的疏水作用层析步骤。
9.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，每一层析步骤后是超滤步骤。
10.如前述权利要求任一项所述的方法，其特征在于，TNF结合蛋白-1是重组h-TBP-1。
11.制备TNF结合蛋白-1的方法，其特征在于，该方法包括按照前述权利要求任一项所述的方法，分离或纯化该蛋白质。
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