KR20180055877A

KR20180055877A - 허혈성 조직으로 구리를 운반하기 위한 트리엔틴의 용도

Info

Publication number: KR20180055877A
Application number: KR1020187011153A
Authority: KR
Inventors: 위지엔 제임스 캉
Original assignee: 이노라이프 컴퍼니, 리미티드
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2018-05-25
Also published as: IL257904B; BR112018005638A2; US11033579B2; CA2998958C; CN108697669A; AU2016328156B2; US20210379102A1; EA037045B1; AU2016328156A1; NZ740728A; IL257904A; WO2017049529A1; PE20181166A1; CL2018000742A1; MX2018003434A; UA123503C2; CO2018004189A2; JP2018531931A; EP3352743A1; CN108697669B

Abstract

트리엔틴과 같은 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물을 투여함으로써 구리의 조직 재분재 및 재사용을 촉진시키는 것을 통해 허혈성 조직을 복구 및 재생시키는 방법. 개체에서 세포 내 구리 수준을 증가시키고 그리고/또는 허혈성 조직의 복구를 유도하는 방법 및 조성물. 허혈성 조직에서 증가된 구리 수준은 구리-의존성 HIF-1 전사 활성 및 조직 복구를 촉진시킬 수 있다.

Description

허혈성 조직으로 구리를 운반하기 위한 트리엔틴의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 9월 24일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/CN2015/090528호의 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.

ASCII 텍스트 파일에 대한 서열목록의 제출

ASCII 텍스트 파일에 대한 하기의 제출 내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독가능 형식(CRF)(파일명: OP160744.160921.sequence listing.txt).

본 발명은 트리엔틴(trientine)과 같은 테트라민(tetramine)을 포함하는 조성물의 사용을 통한 허혈성 조직 복구 및 재생에 관한 것이다.

저산소증-유발 인자(hypoxia-inducible factors, HIFs)의 활성화는 저산소증 또는 허혈성 인설트에 대한 인체의 초기 및 일차적 분자 반응이다. HIF-1 전사 인자는 HIF 패밀리에 속하며, 혈관 신생을 포함하는 저산소증 및/또는 허혈에 대한 다수의 세포 적응 반응에 관여하는 다양한 유전자(VEGF와 같은)의 발현을 조절한다. HIF-1은 2개의 서브 유닛, 즉, HIF-1α 및 HIF-1β을 포함한다. 저산소증/허혈성 조건 하에서, HIF-1α는 세포핵에 축적되어 HIF-1β와 헤테로다이머를 형성하여, 이는 하류 유전자의 전사를 개시한다.

그러나, 만성 심근 허혈 컨디션 하에서, 손상된 심근은 일반적으로 모세 혈관 밀도의 감소 및 혈관 형성의 저하를 특징으로 한다. 급성 허혈 인설트 하에서 축적된 HIF-1α에 의해 유도된 것과 같은 방어 메커니즘은, 연장된 허혈에 의해 유발된 심근으로부터 구리의 떠나감으로 인해 만성 허혈성 컨디션 하에서는 기능하지 않는다. HIF-1 전사 활성은 이전에 미량 원소 구리의 참여를 필요로 하는 것으로 나타났다. 만성 허혈성 심근병증(cardiomyopathy) 환자에서, 허혈성 심근 조직에서 HIF-1α 수준이 지속적으로 증가하더라도 VEGF와 같은 HIF-1 조절된 유전자의 발현이 저하된다. 심장 구리의 손실은 축적된 HIF-1α의 활성화를 차단하고, 심장 구리의 고갈은 이러한 환자에서 심장 기능장애의 정도와 매우 관련되어 있다. 또한, 감소된 심장 구리 함량은 심근 허혈성 질환이 있는 환자에서 높은 혈중 구리 수준을 동반한다. 그러므로, 구리는 허혈성 심근에 의해 재사용될 수 없는 형태로 심근에서 혈액 순환으로 방출되는 것으로 여겨진다. 이와 같이 사용불가능한 형태로 심근 구리가 순환으로 극적으로 유출되는 것은, 연장된 심근 허혈을 동반하는 HIF-1α 전사 활성 저하의 주요 원인으로 여겨진다. 결과적으로, 조직 복구 및 재생을 위한 중요한 단계인 HIF-1 조절된 유전자의 상향 조절은 사용가능한 구리의 손실로 인한 만성 허혈성 심근 질환 환자에서 발생하지 않을 수 있습니다. 그러므로, 구리의 적절한 조직 분포를 촉진시키는 것은 다양한 허혈성 질환 및 컨디션을 치료하는 효과적인 전략으로 작용할 수 있다.

트리엔틴은 구리를 해독하는 데 유용한 잘 알려진 구리 킬레이트제이다. 트리엔틴 디하이드로클로라이드는 윌슨 병, 특히 페니실라민에 비내성적인(intolerant) 환자에서 윌슨 병을 치료하기 위해 체내에서 과량의 구리에 바인딩하고 제거하는 데 널리 사용되어온 트레인틴의 약학적으로 허용되는 염이다. Cooper 등은 진성 당뇨병(diabetes mellitus) 및 합병증(예를 들어, 당뇨병성 심근병증), 심혈관 질환, 신경변성(neurodegeneration) 및 미토콘드리아-관련 질환을 포함하는 다양한 질병을 치료하기 위한 트리엔틴 및 기타 구리 안타고니스트 화합물의 용도를 기술하였다. 예를 들어, 미국 특허 제7,459,446호, 미국 특허 제7,928,094호, 국제 출원 공개 번호 WO2003077901 A1, 국제 출원 공개 번호 WO2005058294 A1 및 국제 출원 공개 번호 WO2007055598 A1를 참조바란다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원의 개시는 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다.

본 출원은 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물을 투여함으로써 개체 내에서 세포 내 구리 수준을 증가시키거나 허혈성 조직의 조직 복구를 유도하는 방법을 제공한다.

본 출원의 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키기 위한 의약의 제조에서 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도, 및 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 데 사용되는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

본 출원의 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리를 특이적으로 전달하는 방법이 제공되며, 이는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또한, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리를 특이적으로 전달하기 위한 의약의 제조에서 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도, 및 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리를 특이적으로 전달하기 위해 사용되는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

본 출원의 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 2가지의 조직 복구의 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또한, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 2가지의 조직 복구의 이벤트를 유도하기 위한 의약의 제조에서 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도, 및 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 2가지의 조직 복구의 이벤트를 유도하기 위해 사용되는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

본 출원의 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직으로의 줄기 세포의 이동을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또한, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동을 유도하기 위한 의약의 제조에서 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도, 및 허혈성 조직 손상을 가진 개체에서 허혈성 조직으로의 줄기 세포의 이동을 유도하는 데 사용되는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

본 출원의 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 또한, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 의약의 제조에서 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도, 및 허혈성 조직 손상을 가진 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 데 사용되는 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 개체는 손상된(compromised) 조직 복구 시스템을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 손상된 조직 복구 시스템을 갖지 않는다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 사지(limb) 조직으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온의 복합체는 결정성이다. 일부 구현에서, 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조(square-planar geometry)를 취하고, 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 조성물 중의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에게 유효량의 구리 이온을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(예를 들어, 약 80mg 내지 약 150mg, 약 80mg 내지 약 200mg, 약 200mg 내지 약 300mg, 약 80mg 내지 약 300mg, 약 80mg, 약 100mg, 약 125mg, 약 150mg, 약 200mg, 약 250mg, 약 300mg, 약 350mg 또는 약 400mg을 포함함)의 구리 킬레이트 테트라민을 포함한다. 일부 구현에서, 조성물은 1일 적어도 2회(예를 들어, 매일 2회, 3회 또는 4회 중 어느 하나를 포함함) 투여된다. 일부 구현에서, 조성물은 적어도 약 1개월 동안(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 또는 그 이상의 개월을 포함함) 투여된다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 조성물의 투여는 적어도 약 0.005mg/L(예를 들어, 적어도 약 0.01mg/L, 0.05mg/L, 0.1mg/L, 0.5mg/L, 1.0mg/L, 2.0mg/L, 3.0mg/L, 4.0mg/L 또는 5mg/L를 포함함)의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도한다. 일부 구현에서, 조성물의 투여는 적어도 약 1주간(예를 들어, 적어도 약 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 12개월 또는 그 이상 중 어느 것을 포함함) 적어도 약 0.005mg/L의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도한다.

전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준에 기초하여 조성물의 투여량(예를 들어, 유효량, 투여 빈도 및 이들의 조합을 포함함)을 조정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 출원의 다른 견지에서, 구리 킬레이트 테트라민 및 구리 이온을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 조성물은 트라엔틴 및 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다.

전술한 약학 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 약학 조성물은 정제, 캡슐 또는 필(pill)로서 제형화된다.

또한, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 조성물, 키트 및 물품이 제공된다.

본 명세서에서 기재된 본 발명의 견지 및 구현은 견지 및 구현으로 "구성되는(consisting)" 것 및/또는 "필수적으로 구성되는(consisting essentially of)" 것을 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 값 또는 파라미터를 "약(about)"으로 언급하는 것은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 변형을 포함한다(그리고 기술한다). 예를 들어, "약 X"를 언급한 설명은 "X"의 설명을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약 X-Y"는 "약 X 내지 약 Y"와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 달리 명시되지 않는 한 복수의 언급을 포함한다.

당업자에게 명백한 바와 같이, 평가되고, 선택된 및/또는 치료를 받는 개체는 그러한 활성을 필요로 하는 개체이다.

도 1은 트리엔틴과 구리 이온의 복합체의 결정 구조를 나타내며, 이는 2개의 염화 이온 및 물 분자와 추가로 결합된다. 라벨을 하지 않은 원자는 수소 원자이다.
도 2는 도 1의 결정 구조의 결합 길이, 결합 각도 및 비틀림 각의 예시적인 세트를 열거한 것이다.
도 3은 도 1의 예시적인 결정의 결정 및 구조 정제 데이터(crystal and structure refinement data)를 열거한 것이다.
도 4a-4c는 도 3의 정제된 결정 구조에서 원자 좌표 및 이방성 파라미터(anisotropic parameters)를 열거한 것이다. 도 4a는 비-수소 원자들의 부분 원자 좌표(fractional atomic coordinates) 및 등가 등방성 변위 파라미터(equivalent isotropic displacement parameters)를 열거한 것이다. 도 4b는 비-수소 원자의 이방성 변위 파라미터를 열거한 것이다. 도 4c는 수소 원자의 원자 좌표 및 등방성 변위 파라미터를 열거한 것이다.
도 5는 실시예 2의 실험 절차의 흐름도를 나타낸다.
도 6은 실시예 2의 상이한 실험 그룹에서의 프라이머리 네오나탈 래트 심근 세포(primary neonatal rat cardiomyocytes)의 세포 내 구리 농도를 나타낸다.
도 7은 실시예 3의 실험 절차의 흐름도를 나타낸다.
도 8a는 트리엔틴 처리를 하거나 하지 않은 상행 대동맥 수축(ascending aortic constriction, AAC) 및 모의 수술 그룹에서 래트의 심실 중격 깊이(interventricular septum depth, IVSD)를 심 초음파로 검출한 형태학적 변화를 나타낸다.
도 8b는 트리엔틴 처리를 하거나 하지 않은 AAC 및 모의 수술 그룹에서 래트의 좌심실 후부 벽 깊이(IVPWD)를 심 초음파로 검출한 형태학적 변화를 나타낸다.
도 9a는 트리엔틴 처리를 하거나 하지 않은 AAC 및 모의 수술 그룹에서 래트의 좌심실 박출분율(EF)을 심 초음파로 검출한 기능적 변화를 나타낸다.
도 9b는 트리엔틴 처리를 하거나 하지 않은 AAC 및 모의 수술 그룹의 좌심실 수축분율(shortening fraction)(FS)을 심 초음파로 검출한 기능적 변화를 나타낸다.
도 10a는 모의 컨트롤 그룹 및 처리되지 않은 ACC 그룹 및 트리엔틴 처리된 ACC 그룹에서 래트의 심장 조직에서의 평균 구리 농도를 나타낸다.
도 10b는 모의 컨트롤 그룹 및 처리되지 않은 ACC 그룹 및 트리엔틴 처리된 ACC 그룹에서 래트의 혈장에서의 평균 구리 농도를 나타낸다. AAC 쥐에서 초기 고농도의 혈장 구리 농도는 고-투여량 트리엔틴 처리 그룹(ACC-Tr(H))과 저-투여량 트리엔틴 처리 그룹(ACC-Tr(L)) 모두에서 트리엔틴 처리에 의해 감소되었다.
도 11은 실시예 4의 실험 절차의 흐름도를 나타낸다.
도 12는 처리되지 않은 그룹 및 트리엔틴 처리된 그룹에서 심부전을 가진 레서스 원숭이의 좌심실 박출분율(EF)을 심초음파 검사로 검출한 변화를 나타낸다.
도 13은 처리되지 않은 그룹 및 트리엔틴 처리된 그룹에서 심부전을 가진 레서스 원숭이의 다양한 조직 샘플에서 구리 농도를 나타낸다.
도 14는 실시예 5의 실험 절차의 흐름도를 나타낸다.
도 15는 처리되지 않은 그룹 및 트리엔틴 처리된 그룹에서 심근 경색이 있는 마우스의 좌심실 박출분율(LVEF)의 심 초음파로 검출된 변화를 나타낸다.
도 16은 처리되지 않은 그룹 및 트리엔틴 처리된 그룹에서 심근 경색이 있는 마우스의 다양한 조직 샘플에서의 구리 농도를 나타낸다.

본 출원은 구리의 조직 재분배 및 재사용을 촉진함으로써 허혈성 조직 복구 및 재생을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물 및 선택적으로 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물을 투여함으로써 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 기술된다. 본 명세서에 기술된 발명은 이전에 구리 이온을 제거하고 구리 수준을 감소시키는 데 사용된 (트리엔틴과 같은) 구리 킬레이트 테트라민이, 본 출원의 어느 방법에 따라 사용될 경우에, 허혈성 심근과 혈액 순환 사이에 구리의 재분배를 촉진할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 트리엔틴은, 예를 들어, 허혈성 조직에 특이적으로 바인딩하고 허혈성 조직에서 세포 내로 구리를 로딩하는 역할을 한다. 따라서, 트리엔틴 및 유사한 특성을 가진 다른 구리 킬레이트 테트라민은 허혈성 심근의 세포 내 구리 수준을 증가시켜 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 회복시키고, 조직 복구를 촉진하며, 심근 허혈성 경색을 역전시키는 데 유용하다. 따라서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 다양한 허혈성 질병 및 컨디션을 치료하는 데 유용하다.

세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법

본 출원은 일 견지로, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법을 제공하며, 이는 구리 킬레이트 테트라 민을 포함하는 테트라민 조성물(이하, "테트라민 조성물(tetramine composition)"이라 함)의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 중의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트라엔틴 및 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트라엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 중의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계, 및 상기 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배설을 감소시키며, 및/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 세포 기관들 중에서 구리의 분포를 변화시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며, 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리 이온을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트화되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체의 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리 이온을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리 촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배출을 감소 시키며, 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리 촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리 이온을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리 이온을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며, 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라 민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리 이온을 전달하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라 민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 구리의 조직 재분배 및 재사용을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 상기 방법은 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 구리의 조직 재분배 및 재사용을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리 촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며, 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리 촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 구리의 조직 제분배 및 재사용을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 구리의 조직 재분배 및 재사용을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며, 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 구리의 조직 재분배 및 재사용을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 증가시킨다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라 민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 세포 내 구리 수준은 치료 전에 개체의 허혈성 조직의 세포 내 구리 수준과 비교하여 개체의 허혈성 조직에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 높게 증가한다. 일부 구현에서, 개체의 허혈성 조직의 구리 수준(총 구리 수준과 같은)은 치료 전에 개체의 허혈성 조직의 구리 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 높게 증가한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 외 구리 수준(혈청 내 구리 수준과 같은)을 낮추지 않는다. 일부 구현에서, 상기 방법은 치료 전에 개체의 세포 외 구리 수준과 비교하여 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 높게 개체에서 세포 외 구리 수준(혈청 내 구리 수준과 같은)을 낮추지 않는다. 일부 구현에서, 상기 방법은 치료 전 개체의 세포 외 구리 수준과 비교하여 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 높게 개체에서 세포 외 구리 수준(혈청 내 구리 수준과 같은)을 낮추지 않는다. 일부 구현에서, 상기 방법은 치료 전 개체의 총 구리 수준과 비교하여 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 높게 개체에서 총 구리 수준을 낮추지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 투여시, 개체는 건강한 개체의 혈청 중에 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 평균 총 구리 수준을 갖는다.

전술한 방법들 중 어느 방법은 개체의 구리 수준의 모니터링(측정 및 결정 포함) 및 구리 수준에 기초한 치료 계획의 조정을 더 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 구리 수준은 허혈성 조직의 세포 외 구리 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 개체의 혈청 구리 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 허혈성 조직의 세포 내 구리 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 Cu¹⁺ 및 Cu²⁺ 수준 및/또는 세포 내 및 세포 외 모두의 구리 수준 모두를 포함하는 총 구리 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 Cu²⁺ 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 Cu¹⁺ 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 유리(즉, 바인딩되지 않은) 구리 수준이다. 일부 구현에서, 구리 수준은 유리 및 단백질-바인딩된 구리 수준 모두를 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준에 기초하여 테트라민 조성물의 투여량(예를 들어, 유효량, 투여 빈도 및 이들의 조합 포함)을 조정하는 단계를 추가로 포함한다.

다양한 구리 수준을 각 투여 단계 전에 및/또는 후에 단독으로 또는 조합으로 모니터링할 수 있으며, 테트라민 조성물의 투여 전후에 상응하는 구리 수준을 비교하여 현재 치료 계획에 의해 구리 수준이 증가되는지 또는 감소하는지 측정할 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 투여 후에 측정된 구리 수준은, 구리 수준이 추가로 증가될 필요가 있는지 여부를 결정하기 위해 미리 결정된 구리 수준과 비교된다. 미리 결정된 구리 수준은 구리-의존성 HIF 전사 활성을 촉진시키고 그리고/또는 하나 이상의 허혈성 조직 복구 이벤트를 유도하는데 필요한, 최소 구리 수준(세포 내 구리 수준 또는 세포 외 구리 수준과 같은)일 수 있다. 치료 계획은 허혈성 조직의 세포 외 구리 수준, 개체의 혈청 구리 수준, 허혈성 조직의 세포 내 구리 수준, 개체의 다른 구리 수준, 및 이들의 조합 중 어느 하나에 기초하여 (예를 들어, 구리-촉진 조성물이 투여되는지 여부, 테트라민 조성물 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 투여량, 빈도, 및 기간 등을 포함함) 조정될 수 있다. 또한 허혈성 조직 손상의 복구 범위를 모니터링하여 치료 계획을 평가할 수 있다. 허혈성 조직 손상의 복구를 모니터링하는 방법은, "조직 복구 유도 방법(Methods of inducing tissue repair)"의 섹션에 기재되어 있으며, 이러한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 허혈성 조직 손상과 관련된 병리학적, 조직학적 또는 분자 표지의 평가를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현("조직 복구 유도 방법" 섹션의 방법을 포함함)에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 만일 세포 내 구리 수준이 미리 결정된 세포 내 구리 수준 아래로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 하나인 경우, 개체의 세포 내 구리 수준은 테트라민 조성물의 투여 후 더욱 증가될 필요가 있다. 세포 내 구리 수준을 더욱 증가시킬 필요가 있는 일부 구현에서, 개체의 치료 계획은 다음 중 어느 하나 또는 그 조합에 의해 조정된다: (a) 테트라민 조성물의 계속 투여; (b) 보다 높은 투여량으로 테트라민 조성물을 투여하는 것; 또는 (c) 보다 높은 투여 빈도로 테트라민 조성물을 투여하는 것. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 내 구리 수준에 기초하여 테트라민 조성물의 투여량(예를 들어, 유효량, 투여 빈도 및 이들의 조합 포함)을 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체에서 세포 외 구리 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체의 세포 외 구리 수준이 테트라민 조성물의 투여 후 적어도 약 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 것으로 감소할 경우, 또는 개체의 세포 외 구리 수준이 미리 결정된 세포 외 구리 수준 아래로 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 것인 경우, 개체의 세포 외 구리 수준이 증가될 필요가 있다. 개체의 세포 외 구리 수준이 증가될 필요가 있는 일부 구현에서, 개체의 치료 계획은 다음 중 어느 하나 또는 그 조합에 의해 추가로 조정된다: (a) 구리 이온을 포함하는 테트라민 조성물을 투여하는 것, 여기서 현재의 치료 계획의 테트라민 조성물은 구리 이온을 포함하지 않음; (b) 구리-촉진 조성물을 투여하는 것, 여기서 현재의 치료 계획은 구리-촉진 조성물의 투여를 포함하지 않음; (c) 구리-촉진 조성물의 투여량을 증가시키는 것; (d) 구리-촉진 조성물의 투여 빈도를 증가시키는 것; (e) 상이한 구리-촉진 조성물을 투여하는 것; 또는 (f) 테트라민 조성물의 개체에 대한 투여를 중단하는 것.

구리 수준은 당업계에 공지된 어느 방법을 사용하여 측정 및/또는 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 구리 수준은 원자 흡수 분광광도법, 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICPMS) 또는 단백질 유도 X선 방출 현미경법(PIXE)에 의해 정량적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cooper G.J.S. et al. Diabetes (2004) 53: 2501-2508; Lu J. et al. Drug Metabolism and Disposition (2007) 35(2): 221-227]; 및 미국특허공개 제 20100160428A1호를 참조바란다. 예를 들어, 허혈성 조직 시료에서 총 구리 수준은 허혈성 조직의 세포 내 및 세포 외 내용물 모두를 포함하는 허혈성 조직의 균질화 시료(질산으로 균질화된 허혈성 조직과 같은)을 사용하여 측정될 수 있다. 허혈성 조직 시료에서의 세포 내 구리 수준은 허혈성 조직 시료로부터 분리된 세포를 사용하여 측정될 수 있으며, 여기서 세포는 분석 전에 세포 내 내용물을 방출하도록 더 용해된다. 개체에서 세포 외 구리 수준은, 이에 한정하는 것은 아니나, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 림프 및 점액을 포함하는 체액 시료를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 구현에서, 혈청을 사용하여 세포 외 구리 수준을 모니터링한다. 일부 구현에서, 간 생검은 개체에서 대사된 구리 수준을 측정하는데 사용된다. 예를 들어, 전자 상자성 공명 분광법(electron paramagnetic resonance spectroscopy)이 시료 내의 구리의 산화 상태(Cu¹⁺ 대 Cu²⁺)를 검출하고, 시료 내의 구리의 각 산화 상태의 백분율을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서 Cu²⁺ 수준은 시료에서 Cu²⁺의 백분율과 Cu¹⁺ 및 Cu²⁺ 모두를 포함한 총 구리 수준을 사용하여 계산할 수 있다. 유사하게, Cu¹⁺ 수준은 시료에서 Cu¹⁺의 백분율 및 Cu¹⁺ 및 Cu²⁺ 모두를 포함하는 총 구리 수준을 사용하여 계산될 수있다. 일부 구현에서, 혈청 세룰로플라스민(ceruloplasmin) 및/또는 혈청 알부민 단백질 농도는 예를 들어, 허혈성 조직에 의한 흡수 및/또는 재사용에 이용 가능한 구리의 수준을 모니터링하기 위해 항체-기초 방법(예를 들어, 웨스턴 블랏, ELISA 등)을 사용하여 측정된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 시료의 단면 슬라이스는 X-선 형광 이미징(XRF) 방법을 사용하여 세포 내 및 세포 외 구리 수준 모두를 측정하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 방법은 일반적으로 다양한 허혈성 조직에서 구리의 재분배(예를 들어, 세포 내 구리 수준의 증가 및/또는 구리의 세포로의 전달을 포함)에 적용가능하다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다.

조직 복구를 유도하는 방법

본 발명은 일 견지로 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 조직 복구의 적어도 하나(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함)의 이벤트를 유도하는 방법을 제공하며, 이는 개체에게 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트라엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에의 허혈 조직에서 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 적어도 어느 것을 포함하는) 조직 복구 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(예를 들어, 약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 적어도 어느 것을 포함하는) 조직 복구 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 적어도 어느 것을 포함하는) 조직 복구 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소 시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 적어도 어느 것을 포함하는) 조직 복구 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라 민 조성물은 매일 2회 투여된다.

전술한 바와 같은 조직 복구를 유도하는 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 이에 한정하는 것은 아니나, 중간엽 줄기세포(MSCs), 골수간엽 줄기세포(BMSCs), 다능성 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포(iPS) 또는 다양한 조직-유래 줄기세포를 포함 하는 줄기 세포의 허혈성 조직으로의 이동을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 허혈성 조직에서 줄기 세포의 분화를 유도하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 허혈성 조직에서 조직 재생을 유도하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 허혈성 조직에서 손상을 역전시키는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 허혈성 조직에서 신경섬유 세포 및 신경분비 세포의 미세환경의 재구성을 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)은 조직 재생을 촉발시키는 신호 분자를 유도하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 조직 복구의 적어도 하나의 이벤트(적어도 2개의 이벤트와 같은)는 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 것을 포함한다.

본 명세서에 기술된 방법은 다양한 타입의 허혈성 조직에서 조직 복구 이벤트(예를 들어, 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진하는 것 및/또는 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동을 유도하는 것을 포함함)를 유도하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동(즉, 호밍(homing))을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트티엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(예를 들어, 약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동(즉, 호밍)을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소 시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동(즉, 호밍)을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동(즉, 호밍)을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직으로 줄기 세포의 이동(즉, 호밍)을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 줄기 세포는 중간엽 줄기세포(MSC), 골수간엽 줄기세포(BMSC), 다능성 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포(iPS) 또는 조직-유래 줄기세포이다. 일부 구현에서, 조직-유래 줄기세포는 지방 조직-유래 줄기세포, 심장 조직-유래 줄기세포, 또는 제대혈 조직-유래 줄기세포이다. 다른 구현에서, 줄기세포는 성체 줄기세포이다. 특정 견지에서, 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포, 유방 줄기세포, 장 줄기세포, 태반의 중간엽 줄기세포, 지방 조직, 폐, 골수, 혈액, 탯줄의 와튼 젤리(Wharton's jelly) 또는 치아(덴탈 펄프 및 치주 인대의 혈관 주위 자리(perivascular niche)), 내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각 성인 줄기세포, 신경관 줄기세포 또는 생식기 줄기세포(예를 들어, 고환에서의 줄기세포)이다.

일부 구현에서, 줄기 세포는 생체 내에서 기관 또는 조직 구획으로부터 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 다른 기관 또는 조직 구획 내의 허혈성 손상 부위로 이동한다. 예를 들어, MSCs는 골수(BM), 제대혈(UCB), 제대혈 간질(왓슨 젤리(Wharton's jelly)), 태반 및 지방 조직(AT)으로부터 이동할 수 있다. 다른 구현에서, MSCs는 기관 또는 조직 구획으로부터 분리되고, 시험 관내에서 농축 및/또는 처리된 다음, 조직 또는 기관 손상 부위로의 이동을 위해 생체 내에서 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용될 수 있는 세포 이동 측정을 위한 어세이는 이에 한정하는 것은 아니나, 바이오마커, 생체발광, 형광, 양전자 방출 단층 촬영(PET)/CT 및 생체 내 자기 공명 영상(MRI)을 포함한다. 생체 내 어세이는 다른 방법, 예를 들어, 조직 절편 상의 IHC로 확인 및 확증될 수 있다.

생체 내에서 줄기 세포 이동을 분석하기 위한 비침습적 이미징 기술은 X-선, 라만 분광법, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 또는 초음파(US) 양식을 사용하여 시각화할 수 있는 MSC에 로딩된 골드-덱스트란 코팅된 입자를 이미징하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 생체적합성 나노입자 구조물, 트레이서 또는 초상자성 입자는 X-선, CT, US, PET 또는 MRI에 의한 세포 시각화를 가능하게 하는 특성을 갖는 MSCs와 같은 줄기 세포에 로딩된다. 일부 구현에서, 줄기 세포의 이동은 맹장 결찰(cecal ligation) 및 천자(CLP)와 같은 기술을 사용하여 어세이될 수 있다. 예를 들어, GFP 키메라 마우스에서 CLP를 수행하면 복부 패혈증의 설정에서 BMSC의 거동을 관찰할 수 있다. FACS, 유동 세포 계측법 및 면역조직 화학은 말초 혈액, 폐, 간, 피부 상처 및 허혈성 손상의 주요 부위로 BMSC의 이동을 추적하는 데 사용될 수 있다. BMSC 거동은 손상의 시간뿐만 아니라 국소적(RT-PCR을 사용하여) 및 전신 수준의 사이토카인 및 케모카인과 상관될 수 있다. 줄기 세포의 이동 추적은 허혈성 조직 손상 후 국소 및 원거리의 기관 및 조직 복구 및 재생에 대한 BMSC의 기여를 밝히는데 도움이 될 수 있다.

일부 구현에서, 줄기세포의 이동은 개체에 투여된 표지화된 세포를 사용하여 모니터링할 수 있다. 동위원소 표지 및 염색과 같은 접근법은 줄기세포를 표지하는 데 사용된다. 일부 구현에서, 표지 접근법은 Y 염색체가 추적자가 될 수 있도록 수컷 동물의 줄기세포를 암컷에게 주입하는 것; A종의 특정 유전자가 세포 추적자가 될 수 있도록 A종의 줄기세포를 B종에 주입하는 것; 줄기세포를 염료 또는 추적자에 대한 특정 효소 반응으로 추적할 수 있도록 줄기세포를 pKH26, BrdU 또는 다른 염료로 라벨링하는 것을 포함한다.

일부 구현에서, 동위원소 표지는 생체 내에서 줄기세포를 추적하는 데 사용된다. 줄기세포는 세포를 표지하는 동위원소에 의해 추적될 수 있지만, 안전 문제와 방사성 반감기를 고려해야 한다는 점은 주목할만 하다. 줄기세포의 다른 생체 내 추적 접근법은 이에 한정하는 것은 아니나, DID와 같은 세포 염료에 의한 세포 염색, 2-광자 여기 형광 현미경에 의한 체 표면 세포의 라이브 이미징, 2-광자 여기 형광 현미경에 의한 트랜스제닉 동물의 특정 체세포의 라이브 이미징, SPIO를 이용한 표지 및 MRI에 의한 추적자 추적 등을 포함한다. 줄기 세포는 여러 형광 염료에 의해 표지된 다음, 동물에 주입될 수 있다. 추적 실험 직전에, 대상 기관은 동결되고, 슬라이스되고, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 하에 직접 관찰될 수 있다. 이 추적 접근법은 너무 많은 표지된 세포(10⁶ 세포/토끼)를 취하지 않기 때문에 기관과 조직의 자연 환경에서 자가 세포를 추적할 수 있다.

줄기 세포의 표지는 예를 들어, pKH26과 같은 단독 추적자에 의해 달성될 수있다. pKH26은 지용성 염료이며, 표지는 pKH26이 세포막을 관통하지 못하게 한다. 따라서, pKH26은 라이브 이미징에 적합하다. 본 명세서에 기술된 추적 공정은 2개 또는 3개의 염료에 의한 다중 표지를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 핵 추적자(DAPI, Hoechst) 및 멤브레인 추적자가 다중 표지에 사용된다. 핵 추적자는 세포의 핵을 확인하고 동시에 멤브레인 트래커 pKH26을 에코한다. 일부 구현에서, 2개의 멤브레인 트래커, 예를 들어, Dio(3) & pKH26은 다중 표지에 사용된다. 이들 추적자는 유사한 메커니즘을 통해 세포를 표지하지만, 상이한 여기 및 방출 파장을 가지며, 이는 2개의 상이한 형광 신호로부터 줄기 세포(예컨대, BMSCs)의 이동 (즉, 호밍)의 동시 확인을 가능하게 한다. 이 추적 방법에서 서로 다른 파장(적색 및 녹색 신호와 같은)의 중첩 신호만 호밍 신호로 간주된다.

많은 종류의 동물 조직은 자가-형광성이며, 자연 조직에서 가장 흔한 자가-형광은 녹색 형광이다. 심장 세포는 상대적으로 낮은 형광을 갖지만, 이들의 형광은 관찰을 방해할 만큼 강하다. 슬라이스의 절단 가장자리는 항상 가장 강하게 형광성이다. 간섭에 대처하기 위해, 녹색과 적색 중첩 신호만 트래킹 신호로 인식할 수 있다. 적색 형광은 (적색 형광 신호의 명백한 부정확성을 제외하고) 이의 특이성에 대한 IOD 값을 갖는 통계 분석에 더 적합하다.

일부 구현에서, 허혈성 조직에서 줄기 세포의 분화를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소 시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 줄기 세포는 골아 세포, 지방 세포, 연골 세포, 내피 세포, 상피 세포, 장 세포, 골 세포, 신경 세포, 간 세포, 신장 세포, 근육 세포(골격근 및 평활근), 및 심장근육세포를 포함하는 중간엽 세포 타입으로 분화할 수 있다. 다른 구현에서, 줄기 세포는 베타 세포, 간 세포 및 뉴런을 포함하는 비중배엽 기원의 세포로 분화할 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

줄기세포 분화의 공정 및 분화된 줄기세포(예를 들어, BMSC와 같은 MSCs와 같은)의 표현형을 밝히는 데 당업계에 공지된 분석법이 사용될 수 있으며, 이러한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 골아세포를 위한 알칼린 포스파타아제 및 알리자린 레드 S 염색, 지방세포를 위한 오일 레드 O 염색, 및 연골형성을 위한 알시안 블루 염색을 포함한다. MSCs와 같은 줄기 세포를 다양한 세포 타입으로 분화하는 것은 유전자 발현 프로파일링으로 어세이할 수 있다. 예를 들어, 전사 프로파일링은 골형성 분화(FHL2, ITGA5, Fgf18), 연골 형성(FOXO1A) 및 테노제네지스(tenogenesis)(Smad8)에 관여하는 특정 유전자들을 확인해 주었다. 일부 구현에서, MSCs는 대규모 증식에 의해 높은 세포 수로 증가될 수 있다.

일부 구현에서, 조직 재생을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 허혈성 조직에서 세포 증식을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 허혈성 조직에서 혈관신생을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 허혈성 조직에서 혈관 성숙을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 상술한 효과들 중 둘 이상을 일으킨다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

본 명세서에 개시된 조직 재생은, 예를 들어, 조직의 일부가 손상되거나 제거되는 유기체에서 어세이될 수 있다. 그 다음, 본 명세서에 기재된 바와 같은 테트라민 조성물은 유기체에 투여되고 조직 재생 속도(rate)가 측정된다. 조직 재생 속도는 유기체가 투여된 경우 컨트롤 또는 처리되지 않았을 때 관찰된 속도와 비교될 수 있다. 조직 재생 어세이 동안 측정될 수 있는 다른 파라미터는 이에 한정하는 것은 아니나, 통증 또는 통증의 징후, 염증의 사인(signs) 또는 증상, 최종 재생 정도 및 재생 퀄러티와 같은 증상 또는 결과를 포함한다. 일부 구현에서, 여기서 조직 재생 분석은 하나 이상의 기관 기능 파라미터, 예컨대 하나 이상의 심장 기능 마커, 하나 이상의 신장 기능 마커 및 하나 이상의 뇌 기능 마커를 평가하는 것을 포함한다.

일부 구현에서, 심장 재생 및 복구의 분석에서 하기 파라미터 중 하나 이상을 본 명세서에 기재된 방법들의 평가에 사용할 수 있다: (1) 재구성된 조직 또는 심근 질량 및 관상 혈관계의 양; (2) 회복된 근세포 및 혈관의 수 및 크기; (3) 새로 형성된 근육 세포 및 혈관과 주변 심근의 통합; 및 (4) 재생된 심근 구조의 기원. 일 견지에서, 자기 공명 영상(MRI)은 흉터 영역, 전체 좌심실 기능, 국소 기능(벽 운동 및 농축) 및 국소 심실 관류를 연구하기 위해 수행될 수 있다. 다른 견지에서, MRI는 심실 기능을 향상시키는 새로운 혈관, 조직 또는 세포의 존재를 검출 및/또는 확인하는데 사용된다. 또 다른 견지에서, 조직 병리학은 흉터 영역 및 c-kit 양성 심장 줄기세포의 확인 및 정량화를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 병리학은 또한 새로운 혈관 및 심근 세포의 분포, 크기 및 밀도에 대한 데이터를 제공한다. 조직 병리학은 조직 및 세포 수준에서 복구 공정을 문서화할 수 있다. 예를 들어, 경색 섹션 내에서 미세혈관 밀도(vWF-양성 혈관/mm²), BrdU 양성 세포 및 c-kit 양성 세포를 평가하기 위한 시험을 수행한다. vWF(von Willebrand factor)를 사용하여 미세혈관 밀도를 정량화하면 경색 구역에서 생성되는 새로운 혈관의 양을 측정할 수 있다. BrdU 양성 세포는 심장 세포를 포함하여 세포의 증식을 나타낸다. c-kit 양성 세포 테스트는 선택된 경색 섹션 내의 줄기세포 양을 보여준다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 데미지를 역전시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

조직 데미지의 역전은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 정상 조직 항상성 및/또는 지속적인 조직 손상의 세포 마커의 검출(예를 들어, 면역조직화학 또는 DNA 및 전사체 수준 측정에 의한), 데미지의 면적 또는 데미지의 부피 측정, 또는 어느 임상적으로 관련된 인디케이터 평가에 의해 어세이될 수 있다. 예를 들어, 경색(infracted) 조직의 심장 조직 손상의 역전은 근세포, 섬유 아세포의 수와 같은 세포 수의 정량화, 또는 흉터의 양에 의해, 또는 LVEDP, LVDP, max dp/dt, min dp/dt, LV 중량, 챔버 부피, 및 심장 확장기 벽 응력(Diastolic Wall Stress)을 포함하는 심장 기능의 아웃풋 또는 구조적 견지에 대한 기능적 어세이로 측정될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 임의의 이러한 임상적 평가 또는 이들의 임의의 조합으로 현저한(예를 들어, 적어도 2배) 변화를 초래하는 경우에 허혈성 조직에서의 데미지를 역전시키는 것으로 언급된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 허혈성 조직에서 섬유화를 역전시킨다. 섬유화는 데미지된 조직에서 상처-치유 과정의 일부로서 일어날 수 있는 섬유 조직의 비정상적인 축적이다. 이러한 조직 데미지는 신체적 손상, 염증, 감염, 독소에 대한 노출 및 기타 원인으로부터 발생할 수 있다.

섬유성 조직은 고혈압, 고혈압성 심장 질환, 죽상동맥 경화증 및 심근 경색의 결과로서 심장 및 혈관에 축적된다. 고혈압 또는 고혈압증은 다양한 요인에 의해 유발될 수 있으며, 심장 마비 및 심근 경색으로 진행되는 고혈압성 심장 질환 (HHD)의 발달로 이어질 수 있다. 유사하게, 죽상동맥 경화증 및 다른 허혈성 심장 질환은 또한 종종 심장 마비를 일으킨다. 이러한 심혈관 질환은 모두 세포 외 매트릭스 또는 섬유성 침착의 축적을 나타내어, 혈관 조직의 경화 및 심장 조직 자체의 경화를 초래한다. 섬유성 물질의 이러한 침착은 고혈압 및/또는 경화 상태에 의해 유도된 데미지에 대한 반응이지만, 이 반응의 효과는 또한 혈관 및 심장 경화뿐만 아니라 심실 확장의 부정적인 결과를 초래한다. 경우에 따라, 심혈관 질환에서의 증가된 심장 섬유증은 심장의 조직 스캐폴딩을 통해 심근 세포로 전달되는 신호를 분열시키거나 변경시켜, 효율적인 심장 기능의 장애를 유발하고 심장 마비 및 심근 경색을 촉진시킨다.

본 개시에 따르면, 조직 손상 동안 차등 조절된 유전자의 발현 프로파일을 사용하여 본 명세서에 개시된 치료 방법에서 조직 데미지의 역전을 평가할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 마이크로어레이-기반 분석은 (섬유아세포와 심근 세포와 같은) 인간 세포의 분석에 기초하여 이루어져 선택된 자극을 받으면, 세포 외 콜라겐 축적과 증식을 일으켜 섬유증의 전형적인 특징을 나타낼 수 있다. 자극은 조직-특이적 섬유화 과정에 있는 자극을 모방하도록 선택할 수 있다. 섬유화(예를 들어, 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 조직 섬유증, 당뇨병성 신장 병증 및 신장 섬유증)와 관련된 유전자 발현 프로파일을 이용하여 섬유화 및 조직에 대한 섬유증 데미지의 역전을 어세이할 수 있다. 다른 구현에서, 섬유증의 역전과 관련된 유전자 발현 프로파일(예를 들어, 섬유증을 적어도 부분적으로 역전시키는 것으로 알려진 치료 하에서)이 섬유화 및 조직에 대한 섬유증 데미지의 역전을 어세이하기 위해 사용될 수 있다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 신경원섬유(neurofibril) 세포 및 신경분비 세포의 미세 환경을 재구성하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(예를 들어, 약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같이)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

미세 환경은 구조적 세포와 염증 세포, 사이토카인, 단백질 및 성장 인자 모두의 복잡한 네트워크이다. 심장 섬유성 질병 또는 컨디션과 관련된 허혈의 경우, 심장은 심근 세포, 상피 세포, 섬유아세포 및 상주하는 심근 세포의 전구 세포 및 사이토카인 분비 세포와 같은 상주하는 구조 세포를 포함한다. 이 세포들은 섬유화의 발병기전 중에 섬유화 인자와 상호작용한다. 특정 견지에서, 섬유아세포 및 근섬유아세포는 섬유아세포 환경을 생성하는 데 중요한 역할을 하며, 과도한 콜라겐 및 매트릭스 물질을 분비하여 돌이킬 수 없는 흉터를 유발한다. 세포 대 세포 부착 분자 및 세포 외 매트릭스 리간드는 섬유성 미세 환경에서 중요한 인자이며, 섬유증 및 섬유아세포 분화를 촉진한다. 일부 구현에서, 접착-매개 시그널링은 조직 미세 환경에서 어세이된다. 예를 들어, 세포 분화 및 이동은 주위 매트릭스의 강성과 같은 미세 환경의 기계적 신호에 따라 반응하여 일어난다. 일 견지에서, 허혈성 손상 부위로의 줄기 세포 호밍, 허혈성 손상 부위에서의 줄기 세포 분화, 조직 복구 및/또는 조직 데미지의 역전을 촉진하기 위해 중간엽 줄기세포(MSCs)의 조직 또는 배양 매트릭스의 탄력성을 어세이하고 조절한다. 일 구현에서, 연질 매트릭스는 MSCs를 뉴런-유사 세포로 분화시키며, 한편 강성 매트릭스는 MSCs를 근육성으로 분화시킨다. 일 견지에서, 세포 외 기질 및 허혈성 손상 부위의 성분은 미세 환경이 부위로의 줄기세포 이동, 허혈성 손상 부위에서의 줄기세포 분화, 조직 복구 및/또는 조직 데미지의 역전을 촉진하는지 여부를 나타내기 위해 어세이된다.

일부 구현에서, 자연 환경의 정황에서 세포의 변화를 측정하여 본 명세서에 개시된 치료 방법의 효능 및/또는 독성을 나타낸다. 일부 구현에서, 도너 조직 또는 기관(골수와 같은) 및 허혈성 손상 부위의 줄기세포 미세 환경을 어세이 및/또는 조절하여, 줄기세포의 부위로의 이동, 허혈성 손상 부위에서의 줄기세포 분화, 조직 복구 및/또는 조직 데미지의 역전을 촉진한다. 국소 조직 미세환경은 발색 또는 형광 ISH를 이용한 단백질 염색(IHC 및 IF) 및 RNA 염색으로 어세이될 수 있다. 예를 들어, 저산소 미세 환경은 저산소 마커 염색, 내피세포 마커 염색, 미세-혈관 밀도 분석, 근접 분석으로 나타낼 수 있다. 조직 미세 환경은 또한 문헌 [Benbrook, 2006, Drug Discovery Today: Disease Models, 3(2): 143-148]에 개시된 바와 같이 기관 배양 또는 기관형 배양을 사용하여 연구할 수 있다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 조직 재생을 촉발시키는 신호 분자를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다 . 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴 및 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현예에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(예를 들어, 약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

본 명세서에 기재된 적절한 시그널링 분자는 이에 한정하는 것은 아니나, HIF-1, VEGF, SDF-1, CXCR4, CXCL12(SDF-1α라고도 함), MMPs, HGF/c-met, TGF-β1, IL-1β, TNF-α, CCR1, CCR4, CCR7, CCR10, CCR9, CXCR5, CXCR6, CD44, CD54, CD56, CD106, E-캐더린, P-셀렉틴, 인테그린-베타1 및 CD49a, b, c, e, f(인테그린 a1, 2, 3, 4, 6)과 같은 인테그린 및 VCAM 및 ICAM과 같은 인테그린 리간드를 포함한다.

SDF-1/CXCR4 축은 줄기세포 호밍의 가장 중요한 메커니즘 중 하나이다. CXC-케모카인 패밀리에 속하는 SDF-1(기질 세포-유래 인자 1 또는 CXCL12)은 소 분자 분비 단백질이다. SDF-1의 발현은 HIF-1(Hypoxia inducible factor-1)에 의해 조절된다. HIF-1은 HIF-1α와 HIF-1β/ARNT(아릴 탄화수소 핵 이동제, ARNT)를 포함하여 구성된다. HIF-1β는 세포질 내에서 안정하므로 HIF-1α의 발현과 축적은 HIF-1의 활성을 결정한다. 정상 산소 상태에서, HIF-1α 단백질은 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 신속히 합성 및 분해된다. 프롤릴 하이드록실라아제(PHDs)는 HIF-1α를 하이드록실레이트화하고, 하이드록실레이티드 HIF-1α는, 폰 히펠 린다우(von Hippel-Lindau) 종양 억제 단백질(pVHL)에 의해 인식되며, 이는 단백질 분해를 위해 HIF-1α를 표적하는 유비퀴틴-단백질 리가아제를 구성한다. 허혈성 조직 손상시, 데미지된 부위는 저산소 상태로, 이는 PHD의 활성을 억제하여 HIF-1α의 축적과 핵으로의 전이를 가능하게 하며, 여기서 HIF-1α가 HIF-1β와 이합체하여 HIF-1을 형성하고, 이는 다른 인자들과 결합하고 표적 유전자의 전사를 개시한다. 손상된 조직은 고 수준의 SDF-1을 발현하고, SDF-1을 순환계로 방출하여, 손상된 부위에서 순환의 먼 쪽 끝까지 농도 구배를 형성한다. 따라서, 구배는 손상된 조직에 BMSCs를 포함하는 CXCR4 발현된 줄기세포를 끌어 당긴다.

심장이 만성 저산소증 하에 있는 경우에, 관상 동맥에 있는 혈액은 심근의 수요를 충족시킬 수 없다. 만성 허혈은 심근 섬유증을 유도하고, 미세 동맥의 밀도를 감소시키며, 혈액 펌핑에 영향을 미치고, 결국 허혈성 심근 경색증을 초래할 수있다. 만성 허혈 하에서 HIF-1의 활성은 제한되어 HIF-1에 의해 조절되는 혈관신생 인자의 발현을 억제한다. 따라서, 혈액 공급이 회복될 수 없고, 경색이 일어날 수 있다.

보통, 허혈성 손상 조직에서의 HIF-1 활성은 일시적으로 제한적이다. 동물 실험과 임상 시험 모두 심장 허혈 하에서 손상된 조직의 HIF-1α가 손상 후 즉시 축적되지만, 이후에는 점차적으로 감소한다는 것이 증명되었다. HIF-1의 활성은 HIF-1의 수준보다 더 빨리 떨어지며, 일시적인 증가 후에 VEGF 및 SDF-1과 같은 HIF-1 조절 인자의 발현을 감소시킨다. HIF-1에 의한 조절때문에, 심근 경색 후 첫 번째 또는 두 번째 날에 SDF-1의 발현이 최고조에 달한다. SDF-1 발현은 서서히 감소하고, 약 1개월에 기준선 수준으로 감소한다. SDF-1은 줄기세포 호밍 모빌라이저 중 하나이기 때문에, SDF-1 수준의 감소는 줄기세포 호밍의 후퇴와 심지어 사라짐을 이끈다.

중요하게도, 급성 허혈성 조건 하에서 활성화된 HIF-1α에 의해 유도된 방어 메커니즘은 연장된 허혈성 조건 하에서와 다르게 기능한다. 장기 허혈 상태 하에서, 허혈성 심근에서 HIF 단백질 수준은 증가하는 반면 HIF(VEGF와 같은)에 의해 조절되는 유전자는 억제되어 혈관재생 감소 및 재생 장애를 유발한다. 구리 결핍은 표적 유전자의 HRE 서열 및 HIF-1 전사 복합체의 성분인 P300에 대한 HIF-1α 바인딩을 감소시킨다. 더욱이, 구리는 연장된 허혈 후 심근에서 혈액으로 실질적으로 동원된다. 관상 동맥 내에서의 구리 동원은 민감하게 연장되지만 짧지 않은 심장 허혈을 따른다. 심근 구리의 손실은 심장 기능 상실의 정도와 관련이 있다. 결과적으로, HIF 단백질 수준이 상승한 상태에서도 심근의 손실로 인해 HIF 조절된 유전자의 상향 조절이 일어나지 않는다. 구리와 같은 미량 원소는 HIF-1α 합성, 안정화, 세포질에서 핵으로의 전위, 표적 유전자의 HRE 서열에 대한 바인딩 및 HIF-1 전사 복합체 형성을 포함하여 HIF-1의 활성화를 유도할 수 있다. 따라서, HIF-1의 표적 유전자의 구리-의존성 유도 또는 HIF-1의 표적 유전자의 구리-의존성 억제를 포함하는 구리-의존성 HIF-1 전사 활성은 허혈성 조직의 복구에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법은 HIF-1α 및 구리-의존성 HIF-1(HIF-1α와 같은) 표적 유전자와 같은 하나 이상의 시그널링 분자를 유도하는데 유용하다.

본 출원의 일 견지에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체의 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 VEGF, GAPDH, GLUT1, PGK1 및 BNIP3로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리 촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소 시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 VEGF, GAPDH, GLUT1, PGK1 및 BNIP3로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 VEGF, GAPDH, GLUT1, PGK1 및 BNIP3로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 VEGF, GAPDH, GLUT1, PGK1 및 BNIP3으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈 조직 손상을 갖는 개체의 허혈 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 유도한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 허혈성 조직에서 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현을 억제한다. 일부 구현에서, 적어도 하나의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 VEGF, GAPDH, GLUT1, PGK1 및 BNIP3로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

HIF-1 표적 유전자는 당업계에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Benita Y. et al, (2009) Nucleic Acids Research, 37 (14): 4587-4602; Shen C. et al, (2008) J. Biol. Chem., 280: 20580-20588; Elvidge G.P. et al, (2006) J. Biol. Chem., 281: 15215-15266; Manalo DJ. et al, (2005) Blood, 105: 659-669]을 참조바란다. 상기 참고문헌에 기재된 HIF-1 표적 유전자는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. HIF-1 표적 유전자의 서브 세트의 HIF-1에 의한 전사 조절은 구리에 의존하고, HIF-1 표적 유전자의 서브 세트는 본 명세서에서 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자로 지칭된다. HIF-1에 의한 일부 HIF-1 표적 유전자의 HIF-1에 의한 전사 조절은 구리로부터 독립적이다. 예를 들어, 문헌 [Zhang Z. et al, (2014) Metallomics 6(10): 1889-93]을 참조바란다. 예시적인 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자는 이에 한정하는 것은 아니나, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH), 글루코스 트랜스포터 1(GLUT1), 포스포글리세레이트 키나아제 1(PGK1) 및 BCL2/아데노 바이러스 E1B 19kDa 단백질-상호 작용 단백질 3(BNIP3)을 포함한다.

본 출원에 의해 고려되는 구리-의존성 HIF-1 전사 활성은 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현의 유도 또는 억제(즉, 전사 조절)를 포함한다. 일부 구현에서, 구리-의존성 HIF-1 전사 활성(예를 들어, 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 유도 또는 억제의 폴드)은 컨트롤 수준과 비교하여, 치료를 받기 전 개체의 허혈성 조직에서 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40% , 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 것으로 감소된다. 일부 구현에서, 개체의 허혈성 조직 내 구리-의존성 HIF-1 전사 활성(예를 들어, 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 유도 또는 억제의 폴드)은 개체가 치료를 받은 후에 컨트롤 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 것으로 회복된다. 구리-의존성 HIF-1 전사 활성의 컨트롤 수준은 정상(예, 데미지 받지 않거나 정상 산소의) 조건과 관련하여, 급성 허혈성 조건 하에서 또는 저산소 조건의 동등한 수준 하에서, 건강한 조직에서 HIF-1 표적 유전자의 유도 또는 억제의 폴드에 기초할 수 있다. 구리-의존성 HIF-1 전사 활성은 허혈성 조직에서의 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현 수준(예: RNA 수준 및/또는 단백질 수준)을 건강한 조직에서 구리-의존성 HIF-1 표적 유전자의 발현 수준과 비교함으로써 측정될 수 있다. RNA 발현 수준은 이에 한정하는 것은 아니나 역전사-PCR(RT-PCR), 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱 방법을 포함하는 당업계에 어느 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 단백질 발현 수준은 이에 한정하는 것은 아니나 항체-기초 방법(웨스턴 블랏 및 ELISA와 같은) 및 정량적 프로테옴 방법(정량적 질량 분광계와 같은)을 포함하는 당업계에 어느 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 조직 복구의 적어도 2개(예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상 중 어느 것을 포함함)의 이벤트를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 조직 복구의 적어도 2개의 이벤트는 골수 간엽 줄기세포와 같은 줄기세포의 허혈성 조직으로의 이동을 유도하는 것, 허혈성 조직에서 줄기세포의 분화를 유도하는 것, 허혈성 조직에서 조직 재생을 유도하는 것, 조직 재생을 촉발시키는 시그널링 분자를 유도하는 것, 허혈성 조직에서 데미지를 역전시키는 것, 허혈성 조직에서 신경섬유 세포 및 신경분비 세포의 미세환경을 재구성하는 것, 및 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진하는 것으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직에 줄기세포(예를 들어, BMSC와 같은 MSC와 같은)의 이동을 유도하고, 허혈성 조직에서 줄기 세포의 분화를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 허혈성 조직에 줄기세포(예를 들어, BMSC와 같은 MSC와 같은)의 이동을 유도하고, 허혈성 조직에서 조직 재생을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 허혈성 조직에 줄기세포(예를 들어, BMSC와 같은 MSC와 같은)의 이동을 유도하고, 허혈성 조직에서 줄기세포의 분화를 유도하고, 허혈성 조직에서 조직 재생을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체의 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직 복구를 유도하는 (또는 허혈성 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직 복구를 유도하는 (또는 허혈성 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구체 예에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직 복구를 유도하는 (또는 허혈성 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량, 및 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 동시에 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물은 연속적으로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라 민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직 복구를 유도하는 (또는 허혈성 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리 엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직 복구를 유도하는 (또는 허혈성 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 개체는 구리를 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량으로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 개체는 테트라민 조성물의 투여 전 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 또는 그 이상 중 어느 하나에 구리-촉진 조성물로 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

또한, 본 명세서에 기재된 어느 방법을 사용하여 허혈성 조직 손상과 관련된 질병 또는 컨디션을 치료하는 방법이 제공된다.

일부 구현에서, 개체에서 허혈성 심부전을 치료하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 적어도 약 1개월(적어도 약 3개월 또는 적어도 약 6개월과 같은) 동안 투여된다. 일부 구현에서, 개체는 기준선에서 약 35% 이하의 좌심실 박출 기능(LVEF)을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 클래스 II 또는 클래스 III 심부전(뉴욕 심장 협회 또는 NYHA 기능 분류에 기초함)을 갖는다.

허혈성 기원(즉, 허혈성 심부전)을 갖는 어느 클래스 또는 단계의 심부전은 본 명세서에 기재된 방법으로 치료할 수 있다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 I 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 Ⅱ 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 III 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 IV 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 A 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 B 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 C 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 기원의 NYHA 클래스 D 허혈성 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 피로, 심계항진(palpitation), 호흡 곤란 또는 신체 활동의 제한과 같은 허혈성 심부전의 하나 이상의 증상을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 심혈관질환의 하나 이상의 증상을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20, 25, 30일 또는 그 이상 중 어느 하나 동안 입원한 자이다.

본 명세서에 기재된 방법 중 어느 하나의 효능은 허혈성 조직의 복구 정도를 평가함으로써 추가로 측정될 수 있다. 예를 들어, 데미지의 면적 또는 데미지의 부피에 의해 조직 복구를 평가할 수 있다. 환자에서 데미지된 조직의 복구는 임상적으로 관련된 표준을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 경색(infracted) 조직의 복구는 근세포, 섬유 아세포의 수와 같은 세포 수의 정량화, 또는 흉터의 양에 의해, 또는 LVEDP, LVDP, max dp/dt, min dp/dt, LV 중량, 챔버 부피, 및 심장 확장기 벽 응력(Diastolic Wall Stress)을 포함하는 심장 기능의 아웃풋 또는 구조적 견지에 대한 기능적 어세이로 측정될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 방법은 임의의 이러한 임상적 평가 또는 이들의 임의의 조합으로 현저한(예를 들어, 적어도 2배) 변화를 초래하는 경우에 데미지받은 조직을 복구시키는 것으로 언급된다.

조직 복구를 어세이하기 위해 임의의 적절한 방법(들)이 수행될 수 있다. 예를 들어, 조직 치유를 평가하는 방법, 복구된 조직의 기능을 평가하는 방법, 조직에서 세포 성장을 평가하는 방법을 수행할 수 있다. 조직 치유의 정도를 측정하기 위해, 시딩된 세포 증식 및/또는 개선된 조직학적 외형을 검출하기 위해 조직학 및 세포 염색을 수행할 수 있다. 일부 경우에, 조직 부분을 수집하고, 예를 들어 중성 완충 포르말린과 같은 고정제로 처리할 수 있다. 그러한 조직 부분은 조직학적 분석을 위해 탈수되고, 파라핀에 매립되고, 마이크로톰으로 섹셔닝될 수 있다. 절편은 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색한 다음, 형태와 세포질의 현미경 평가를 위해 유리 슬라이드에 마운팅될 수 있다. 일부 경우에, 여기에 제공된 방법 및 재료에 따른 치료 후에, 조직 이동 및 기능성을 평가하기 위해 생리학적 검사를 수행할 수 있다. 예를 들어, 복구된 힘줄 조직 또는 복구된 관절의 굴곡 일(work of flexion, WOF) 또는 굴곡 각도를 측정하기 위해 시험관 내 기계적 검사가 수행될 수 있다. 생체 내 분석은 기관의 기능적 평가, 증상 평가 또는 영상 기술을 포함할 수 있다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 치료 방법을 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후, 조직 및/또는 기관 기능은 다음 방법 중 어느 하나 이상에 의해 평가될 수 있다: 유세포 분석법, 면역형광법, ELISA, 포스포-라벨링, 하이브리드화, 핵산 증폭, 또는 웨스턴 블롯과 같은 방법에 의한, 개선된 조직 기능을 나타내는 적어도 하나의 바이오마커의 생화학적 분석; 면역형광법 또는 유세포 분석법에 의한 아넥신 V 염색, 카스파아제 활성의 검출, 저산소 어세이, TUNEL 어세이, 세포 DNA 래더링, H₂O₂에 대한 반응으로 로드-형상 세포의 수, 유전자 발현의 qPCR 평가, 및 H & E 염색에 의한 괴사 면적 측정을 포함하는 세포 아포토시스 어세이, 괴사 어세이, 및 세포 생존성 어세이와 같은 세포 기능적 어세이; 데미지받은 또는 경색 부위에서 섬유 아세포 세포 수 측정, 콜라겐 디포지션 및 흉터 형성과 관련된 다른 매트릭스 단백질 수준의 측정을 포함하는 흉터 형성 어세이; 줄기세포 또는 전구 세포의 데미지받은 영역으로의 이동; 및 기타 임상적으로 관련된 기관 기능 검사.

일부 구현에서, 심근 기능은 다음의 파라미터 중 하나 이상에 의해 평가될 수 있다: 예를 들어, 근세포 크기의 분포 빈도, 피크 단축, 단축 및 연장의 속도와 같은, 근세포 역학 및 세포 융합, 및 세포 융합(X 염색체의 수)의 평가; LVEDP, LVDP, +dp/dt, LV 중량, 챔버 부피, 및 심장 확장기 벽 응력(Diastolic Wall Stress), 및 MI-처리 및 MI-미처리 대상의 비교를 포함하는 심장 기능의 아웃풋 또는 구조적 견지; 재생된 심근의 조성, 치료 대 미치료 대상에서 경색 부위에서의 BrdU 양성 세포, 및 치료 대 미치료 대상에서 경색 부위에서의 미오신 양성 세포의 평가와 같은 심근 재생; 경색 크기, 섬유증의 양 및 심근 세포 비대와 같은 심장 구조. 특정 구현에서, 본 명세서에 개시된 방법은 심장 기능의 하나 이상의 표시를 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 심장 기능의 표시는 흉부 심장 출력(CO), 심장 지수(CI), 폐동맥 쐐기 압력(PAWP), 심장 지수(CI), 분획 단축%(%FS), 박출률(EF), 좌심실 박출률(LVEF); 좌심실 말단 심장 확장기 직경(LVEDD), 좌심실 말단 수축 직경(LVESD), 수축성(dP/dt), 심방 또는 심실 기능의 감소, 펌핑 효율의 증가, 펌핑 효율의 손실 속도 감소, 혈류역학적 기능 상실의 감소, 또는 컨트롤과 비교하여 심근 병증과 관련된 합병증의 감소이다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 치료 방법을 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여 한 후의 뇌 기능은 신경학적 시험 또는 전기생리학적으로, 예를 들어 감소된 신호 대 소음 비율에 의해, 또는 생화학적으로, 예를 들어 기관 기능, 조직 기능 및/또는 중추 신경계 또는 말초 신경계의 세포 기능을 나타내는 적어도 하나의 바이오마커의 분석에 의해 평가될 수 있다. 예시적인 전기생리학적 기법으로는 뇌파 검사(EEG), 심전도 검사(EKG), 근전도 검사(EMG), 이벤트-관련 포센셜(ERPs), 유발 포텐셜(EPs), 자기뇌파 검사(MEG), 및 신경전도 검사(NCS)가 포함된다. 다른 구현에서, 뇌 기능은 다음의 방법 또는 파라미터 중 어느 하나 이상에 의해 평가될 수 있다: 웩슬러 약식 지능 척도(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence) 및 웩슬러 성인 지능 척도-III(Wechsler Adult Intelligent Scale-III)과 같은 일반 지능 기능; 웩슬러 기억 척도-III(Wechsler Memory Scale-III)의 숫자 주의력(Digit Span), 공간 스팬 하위 시험과 같은 기본적인 주의력; 웩슬러 성인 지능 척도-III(Wechsler Adult Intelligence Scale-III)의 숫자 주의력(Digit Span), 문자 번호 시퀀싱 및 연산 하위 시험(Letter Number Sequencing and Arithmetic subtest)과 같은 복잡한 주의력(작업 기억); 위스콘신 카드 분류 테스트(Wisconsin Card Sorting Test), 트레일 매이킹 테스트 B(Trail Making Test B), 스트룹 시험(Stroop Test), 런던 타워 테스트(Tower of London Test), 도박 테스트, 프론탈 시스템 행동 척도(Frontal System Behavior Scale) 및 전두엽 기능의 아이오와 척도(Iowa Scales of Frontal Lobe Function)와 같은 실행 기능(executive functions); 웩슬러 기억 척도-III(Wechsler Memory Scales-III), 레이 청각, 언어 학습 시험(Rey Auditory, Verbal Learning Test), 캘리포니아 언어, 학습 시험-II(California Verbal, Learning Test-II), 수정된 간단 시각 기억 시험(Brief Visual Memory Test Revised)과 같은 기억(시각 및 언어); 미네소타 다면적 인성 검사-2, 감정 스트룹 시험(Minnesota Multiphasic Personality Inventory-2, Affective Stroop Test), 프론탈 시스템 행동 척도(Frontal System Behavior Scale) 및 전두엽 기능의 아이오와 척도(Iowa Scales of Frontal Lobe Function)와 같은 감정 조절; DANVA(Diagnostic Analysis of Nonverbal Behavior)와 같은 감성 자극(emotion stimuli)의 해석; 웩슬러 성인 지능 척도-III, 트레일 매이킹 시험(Wechsler Adult Intelligent Scale-III, Trail Making Test), 및 심볼 디지트 양식 시험(Symbol Digit Modalities Test)의 처리 속도 지수(심볼 서치, 코딩)와 같은 처리 속도; 보스톤 명명 시험(Boston Naming Test)과 같은 언어; 조절된 구두 어연상 검사(Controlled Oral Word Association Test); 의미론적 단어 유창성 검사(Semantic Word Fluency Test); 및 다중 언어 실어증 검사(Multilingual Aphasia Examination); 레이-오스터리에스 복합도형 검사(Rey-Osterrieth Complex Figure Test), 블록 디자인(Block Design), 및 웩슬러 성인 지능 척도-III의 모양 맞추기 서스셋과 같은 시각적-구성 검사(visuo-constructional tests); 및 WAIS-III의 매트릭스 추론(Matrix Reasoning), 및 선 방향 판단 검사(Judgment of Line Orientation Test)와 같은 시-공간 시험(visuo-spatial tests).

일부 구현에서, 본명세서에 개시된 치료 방법을 투여하기 전, 투여하는 동안, 또는 투여한 후 골격근 건강이 시험된. 일부 구현에서, 골격근 건강은 근육 통증, 근육 데미지, 운동에 대한 대사 변화 및 세포골격 재구성을 포함한다. 골격 근육 기능은 근육 강도, 근육 내구성, 훈련 적응, 관절의 움직임을 허용하는 근육의 정상 상태, 또는 건강한 포유 동물에서 골격근의 표준 생리학적 신진 대사 및 기능일 수 있다. 근육 강도(특정 동작에서 생성되는 최대 힘), 근육 내구성(설정된 빈도 및 힘에서 수행될 수 있는 최대 수축 수) 및 근력 (힘/시간, 근육에 의해 생성된 최대 효과)을 포함하여 골격근의 어느 기능적 변수가 측정될 수 있다. 철저하지는 않지만 전형적인 근육-특이적 기능에는 근아세포(myoblast) 분화, 근아세포 측정, 근육 발달, 근육 수축, 근절(sarcomeric) 변화, 근아세포 융합, 체세포 근육 발달 및 근발생(myogenesis)이 포함된다.

일부 구현에서, 환자의 골격근 섬유증이 평가된다. 환자로부터 근육 조직의 생검을 얻고, 섬유 조직의 존재를 검출하는 데 민감한 조직화학적 또는 면역-조직화학적인 염색으로 생검을 평가하는 것을 포함하는, 골격근 섬유증의 상태를 측정하는 다수의 방법이 이용가능하다. 조직화학적 염색의 예는, 예를 들어, 헤마톡실린 및 에오신(H & E), 삼중체 및 ATPase(예를 들어, pH 4.3, 4.65 및 10.4에서)를 포함한다. 면역-조직화학 염색을 위해 근육 섬유를 표지하는데 사용될 수 있는 대표적인 항체는, 예를 들어, 미오신, IV형 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 및 디스트로핀을 포함한다. 대안적으로, 섬유증이 환자의 골격근에 퍼지는 정도를 측정하는 기능적 방법이 사용될 수 있다. 기능적 방법은 환자에게 하나 이상의 일련의 테스트 및 물리적 측정을 실시하는 것과 관련된다. 이러한 검사 및 측정은 전형적으로 신경 강도 시험, 근력, 균형, 보행, 자세, 감각 조정 평가, 및 예를 들어 생체 용량 및 강제 호기 용량(forced expiratory capacity)과 같은 폐 기능 검사를 포함하며, 이들은 모두 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 구현에서, 조직 복구는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 신호 분자의 발현 수준(들)에 기초하여 평가될 수 있다. 조직 복구의 지표로서 적합한 바이오마커는 이에 한정하는 것은 아니나, p53, p21, GADD45a, ATM, 인산화 H2AX 히스톤, IL-6, CRP, SAA, IL-1, IL-5, IL-10, KC/GRO, IFN, IL-2, IL-4, TNF-알파, IL-12, IL-3, IL-7, IL-6, 침 베타-아밀라아제(salivary beta-amylase), 시트룰리네이티드 단백질(citrulinated proteins), S100B, SP-D, BPI, TSP, CA15-3, CDBB, CKMB, CKMM, FABP2, GFAP, NSE, CD5, CD-16b, CD20, CD177, CD26, CD27, CD40, CD45, Flt-3L, G-CSF, KFG, EPO, TPO, GM-CSF, 또는 SDF-1α와 같은 DNA-데미지 바이오마커, 염증-반응 바이오마커, 조직-데미지 바이오마커, 조직-데미지 복구 바이오마커 또는 혈액학적 대리 마커를 포함한다.

구리(구리 이온 포함)는 조직 데미지의 복구 및/또는 조직 재생에 관여하는 하나 이상의 인자(예를 들어, 전사 인자)의 조절 인자이며, 결국, 조직 복구는 이러한 인자들 중 어느 하나 이상을 평가함으로써 평가될 수 있다. 구리 조절 인자는 이에 한정하는 것은 아니나, Ctr 1, Ctr 3, DMT1, Atox 1, ATP7A/7B, Cox 17, CCS, Sco 1/2, Cox 11, 글루탐산성 N-메틸 D-아스파테이트 리셉터(NMDAR), 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 구리 대사 유전자 MURR1 도메인(COMMD1), 아포토시스의 X-연관 인히비터(X-linked inhibitor of apoptosis)(XIAP), 호모시스테인(homocysteine)(Hcy), 시토크롬 c 옥시다아제의 서브유닛 II(COX II), 시토크롬 c 옥시다아제의 서브유닛 I(COX I), FGF-1, VEGF, 안지오포이에틴(ANG1 또는 ANG2와 같은), 피브로넥틴, 콜라게나아제, MMPs-TIMPs, 엘라스틴, PDGF, 및 eNOS와 같은 Cu 항상성 단백질; 시토크롬 C 옥시다아제(CCO), 수퍼옥시드 디스뮤타아제(SOD), 메탈로티오네인(Metallothionein)(MT), 글루타티온(Glutathione)(GSH), 도파민-β-모노옥시게나아제(Dopamine-β-monooxygenase)(DBH), 펩티딜글리신-α-아미데이팅 모노옥시게나아제(Peptidylglycine-α-amidating monooxygenase)(PAM), 티로시나아제, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 디아민 옥시다아제, 헤파에스틴(Hephaestin), 및 카틸레이즈 매트릭스 글리코프로틴(Cartilage matrix glycoprotein)과 같은 세포 내 Cu 바인딩 단백질; 세룰로플라스민(Ceruloplasmin)(CP), 리실 옥시다아제(Lysyl oxidase)(LOX), 알부민(ALB), ㅌ트트랜스큐프레인(Transcuprein), 아민 옥시다아제(Amine oxidase), 혈액응고인자 V 및 VIII, 페록시다아제 II, 세포 외 수퍼옥시드 디스뮤타아제(Extracellular superoxide dismutase), 및 세포 외 메탈로티오네인(Extracellular metallothionein)과 같은 세포 외 Cu 바인딩 단백질을 포함한다. 구리 조절 인자는 문헌 [Zheng et al., Role of copper in regression of cardiac hypertrophy, Pharmacol. Ther. doi:10.1016/j.pharmthera.2014.11.014 (2014)]에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 일부 구현에서, 구리 이온 또는 구리 이온은 HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1 및 이들 전사 인자에 의해 조절되는 신호 전달 네트워크 중 하나 이상의 전사 활성을 조절한다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 구리에 의해 조절되는 하나 이상의 인자의 수준 및/또는 활성은 본 명세서에 개시된 치료 또는 예방 조성물로 처리한 후에 개체에서 분석된다. 일부 구현에서, HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성이 측정되고, 치료 또는 예방 조성물에 대한 개체의 반응과 상관된다. 일부 구현에서, 반응은 정상 조직 항상성 및/또는 지속적인 허혈성 조직 데미지의 세포 마커를 측정하는 것에 의해(예를 들어, 면역조직화학 또는 DNA 및 전사체 수준 측정에 의해), 데미지 면적 또는 데미지 용적을 측정하는 것에 의해, 또는 임상 관련 지표를 평가하는 것에 의해 검출된다. 따라서, 특정 측면에서, 하나 이상의 구리 조절 인자(HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1)의 수준 및/또는 활성은 본 명세서에 개시된 치료 또는 예방 요법에 대한 개체의 반응의 종말점 바이오마커로서 사용될 수 있다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 구리에 의해 조절되는 하나 이상의 인자는 본 명세서에 개시된 테트라민 조성물 또는 치료 또는 예방 방법에 대한 반응을 분석하고 예측하기위한 예후 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 개체가 본 명세서에 개시된 치료 또는 예방 조성물에 긍정적으로 반응할 가능성을 나타낼 수 있으며, 그 치료 또는 예방 조성물이 개체에게 투여될 수 있다. 반대로, HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성이 개체가 치료 또는 예방 조성물에 대해 반응하지 않거나 부정적으로 반응할 가능성이 있다고 나타내면, 대안적인 치료 과정이 처방될 수 있다. 부정적인 반응은 효과적 반응의 부재 또는 독성 부작용의 존재로 정의될 수 있다. 치료 또는 예방적 처리에 대한 반응은 다음 모집단 중 어느 모집단의 대상자가 유전형화 되어있는 배경 연구에서 예측될 수 있다: 치료 요법에 호의적으로 반응하는 모집단, 치료 요법에 현저히 반응하지 않는 모집단, 및 치료 요법에 불리하게 반응하는 모집단(예: 하나 이상의 부작용을 나타냄). 이러한 모집단은 예로서 제공되며 다른 모집단과 부분 모집단을 분석할 수 있다. 이러한 분석의 결과에 기초하여, 개체는 치료 요법에 호의적으로 반응하는지, 치료 요법에 현저히 반응하지 않는지, 또는 치료 요법에 대해 불리하게 반응할지를 예측하기 위해 유전형화된다. 따라서, 일부 구현에서, HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1 중 하나 이상의 수준 및/또는 활성은 본 명세서에 개시된 치료 또는 예방 요법에 대한 개체의 반응 지표로서 사용될 수 있다. 반응 지표는 치료 또는 예방 요법을 투여하기 전, 투여하는 동안 및/또는 투여 후에 평가할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 반응 지표는 환자가 계속된 치료로 이득을 볼 수 있는지 또는 대체 치료가 필요한지 평가하기 위해 지속적인 투여량들 사이의 간격 동안 평가할 수 있다.

상술한 예후 시험은 임상 시험에 적용할 수 있다. 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 하나 이상의 반응 인디케이터(HIF-1, SP1, MT, Atox 1, CCS 및 COMMD1)를 확인할 수 있다. 그 후, 구리 킬레이트 테트라민 및 선택적으로 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물을 포함하는 테트라민 조성물의 임상 시험에서 잠재적 참가자는 테트라민 조성물에 호의적으로 반응할 가능성이 가장 높은 개체를 확인하고 부작용을 경험할 가능성이 있는 자들을 배제하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방식으로, 연구에서 긍정적으로 반응하지 않을 가능성이 있고 바람직하지 않은 안전 문제를 일으킬 위험이 없는 개체를 포함한 결과로서 측정값을 낮추지 않고 테트라민 조성물에 긍정적으로 반응하는 개체에서 치료의 효과를 측정할 수 있다.

일부 구현에서, 주사 부위에서 VEGF의 발현을 증가시키지 않고 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 조직 복구를 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 개체에서 허혈성 손상 부위를 향해 혈관 성장을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 주사 부위에서 VEGF의 발현을 증가시키지 않고 개체에서 허혈성 손상 부위를 향해 혈관 성장을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴 및 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각-평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고, 구리 배출을 감소시키며 및/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

조직 내의 혈관 형성 및 성장은 혈관신생 및/또는 혈관형성에 의해 발생할 수 있다. 일부 구현에서, 혈관은 혈액 수송을 지원하기 위해 완전히 기능적인 모세혈관형 구조물을 포함한다. 일부 구현에서, 혈관신생은 기존 혈관으로부터의 새로운 혈관의 성장, 혈관신생의 발아, 현존 혈관의 스프라우팅 오프(sprouting off) 또는 혈관신생 분열(전충(intussusception))에 의한 새로운 혈관의 형성, 현존 혈관의 스플릿팅 오프(splitting off)에 의한 새로운 혈관의 형성을 포함하는 프로세스를 포함한다. 일부 구현에서, 혈관생성은 기존 혈관이 존재하지 않을 때 새로운 혈관의 형성과 같은, 내피 줄기세포 증식에 의해 새로운 혈관의 새로운 생성을 포함하는 프로세스를 포함한다.

일부 구현에서, 혈관 형성 및 성장은 안지오포이에틴(Ang-1 및 Ang-2와 같은), 에프린(ephrin)(Eph), 혈관 내피 성장 인자(VEGF-A 및 VEGF-C와 같은), 혈소판 유리 성장 인자(PDGF), 섬유 아세포 성장 인자(FGF-1 및 FGF-2와 같은), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨(IL), 모노사이트 케모탁틱 단백질-1(MCP-1)(CCL-2라도로 알려짐), 형질 전환 성장 인자-α(TGF-α), 형질 전환 성장 인자-βs(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3 및 TGF-β2와 같은), 엔도스태틴, 바소히빈, 케모카인, 트롬보스폰딘, 안지오스태틴, 혈관 세포 접착 분자(VCAM-1과 같은), 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP-2 및 MMP-9과 같은), 인테그린, 카데린, 플라스미노겐 활성제, 및 플라스미노겐 활성제 억제제와 같이 상기 프로세스를 직접 조절하는 성장 인자 및 기타 단백질들로부터의 신호를 필요로 한다.

일부 구현에서, 혈관 성장은 온전한(intact) 동물에서 모세혈관을 발달시키는 데 필요한 내피 세포 증식을 측정함으로써 어세이된다. 일부 구현에서, 내피 증식에 대한 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 투여 작용은 직접 세포 수, DNA 합성 및/또는 대사 활성에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 내피 세포는 허혈성 손상 부위로부터 분리될 수 있고, 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물로 처리한 후에 이들의 증식 속도에 대해 어세이할 수있다. 다른 구현에서, 허혈성 손상 부위에서의 내피 세포의 증식은 세포를 표지하고 세포 카운트, DNA 합성 및/또는 대사 활성을 원 위치에서 측정하여 모니터링할 수있다. 다른 구현에서, 표지된 내피 세포를 개체에게 투여할 수 있고, 허혈성 손상 부위에서 표지된 내피 세포의 증식을 원 위치에서 모니터링할 수 있다. 일부 구현에서, 내피 세포는 방사성 동위 원소, 형광성 부(moiety), 또는 예를 들어 항체에 의해 특이적으로 검출될 수 있는 마커로 표지된다. 특정 구현에서, 세포는 [³H] 티미 딘 또는 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 표지된다.

일부 구현에서, 혈관 성장은 기저막을 분해하고, 예를 들어 발아성 혈관신생 동안에 혈관신생촉진(proangiogenic) 성장 인자에 의해 확립된 화학적 구배를 따라 이동하는 내피 세포의 이동을 측정함으로써 어세이된다. 특정 구현에서, 허혈성 손상 부위에서 내피 세포를 표지하고 세포 이동을 생체 내에서 모니터링한다. 다른 견지에서, 표지된 내피 세포는 대상자에게 투여되고, 허혈성 손상 부위로의 이동은 생체 내에서 모니터링된다. 다른 견지에서, 허혈성 손상 부위에서 내피 세포는 분리될 수 있고, 이들의 이동 특성은 보이덴 챔버 어세이, 언더-아가로스 어세이, 상처 치유 분석, 테플론 펜스 분석, 파고키네틱(phagokinetic) 트랙 어세이 및 유사 어세이를 포함하는 다수의 시험관 내 어세이에 의해 어세이될 수 있다.

일부 구현에서, 혈관 성장은 혈액의 흐름을 수행하는 내강을 갖는 관을 형성하는, 즉 내피세포의 관 형성(tubulogenesis) 내피 세포를 측정함으로써 어세이된다. 일부 구현에서, 혈관 성장은 대동맥 고리 어세이에 의해 어세이된다. 혈관 성장을 어세이하기 위한 대동맥 고리 어세이는 문헌 [Li et al., "Copper promotion of angiogenesis in isolated rat aortic ring: role of vascular endothelial growth factor," Journal of Nutritional Biochemistry 25(2014) 44-49]에 개시되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다. 대동맥 고리로부터의 발아성 미세 혈관은 상주하는 대식세포, 혈관 주위 세포 및 섬유아세포와 질서있는 순서로 긴밀하게 상호작용하며, 이는 온전한 동물에서 혈관신생을 모방한다. 일부 구현에서, 내피 세포는 계대 배양에 의해 미리 선별되지 않으며, 따라서 온전한 동물의 것과 유사한 정지 상태에 있다. 혈관신생 기능(예: 기질 분해, 이동, 증식, 관 형성과 같은)을 포함하는 다른 혈관신생 어세이는 배양체(embryoid) 어세이, 마우스 중족골(metatarsal) 어세이 및 유사 어세이를 포함한다.

일부 구현에서, 생체 내 어세이는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물 투여 후 혈관 성장을 측정하는 데 사용된다. 이러한 어세이는 이에 한정하는 것은 아니나, 각막 혈관신생 어세이, 병아리 장뇨막(chick chorioallantoic membrane) 막 어세이, 및 Matrigel 플러그 어세이를 포함한다. 예를 들어, 각막은 무혈관성과 투명성이 모두있는 유일한 신체 조직으로 혈관신생의 관찰에 이상적이다. 일부 구현에서, 혈관신생촉진(proangiogenic) 분자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물)를 함유하는 펠렛 또는 스펀지는 외과적으로 생성된 기조직(stromal) 주머니 내로 이식될 수 있다. 말초 윤부 맥관구조로부터의 새로운 혈관의 내 성장(ingrowth)은 혈관 신생 속도가 측정되도록 매일 모니터링될 수 있다. 마트리겔 플러그 어세이에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 테트라민 조성물(구리 이온을 갖거나 갖지 않는)을 함유하는 마트리겔은 허혈성 손상 부위 또는 그 근처에 개체에 이식될 수 있으며, 이후에 마트리겔 플러그는 혈관의 시각화를 위해 제거된다. 일부 구현에서, 내피 세포는 하나 이상의 마커로 표지되고, 허혈성 손상 부위에서의 이들의 증식, 이동, 내피세포의 관 형성(tubulogenesis), 혈관 형성 및/또는 혈관 성장은 예를 들어, 적절한 이미징 기술을 이용하여 생체 내에서 어세이된다.

병용 요법

허혈성 조직의 복구를 유도하기 위해 상기 테트라민 조성물 및 선택적으로 상기 구리-촉진 조성물과 조합하여 단일 제제로서 사용되거나, 또는 줄기세포나 줄기세포의 유도 인자와 함께 병용 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 조직 복구를 유도하는 (또는 조직의 기능을 개선시키는) 방법이 제공되며, 이는 a) 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계; 및 b) 줄기세포(골수 간질 줄기세포(BMSC)와 같은 간엽 줄기세포(MSC)와 같은) 또는 줄기세포의 유도 인자의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 줄기세포(예를 들어, BMSC와 같은 MSC와 같은)의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 상기 방법은 줄기세포의 유도 인자의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각-평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 섭취를 증가시키고 구리 배출을 감소시키며 및/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 2회 투여된다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 줄기세포는 간엽 줄기세포(MSC), 골수 간질 줄기세포(BMSC), 다능성 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포(iPS) 또는 조직-유래 줄기세포이다. 일부 구현에서, 조직-유래 줄기세포는 지방 조직-유래 줄기세포, 심장 조직-유래 줄기세포 또는 제대혈 조직-유래 줄기세포이다. 일부 구현에서, 줄기세포는 성체 줄기세포의 유도 인자이다. 일부 구현에서, 성체 줄기세포는 조혈 줄기세포, 유방 줄기세포, 장 줄기세포, 태반의 중간엽 줄기세포, 지방 조직, 폐, 골수, 혈액, 탯줄의 와튼 젤리 또는 치아(치과용 펄프 및 치주 인대의 혈관 주위 틈새와 같은), 내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각 성인 줄기세포, 신경능 줄기세포(neural crest stem cell) 또는 생식 줄기세포(예를 들어, 고환에서의 줄기세포)이다.

일부 구현에서, 본 명세서에 기술된 줄기세포의 유도 인자는 중간엽 줄기세포(MSC), 골수 간엽 줄기세포(BMSC), 다능성 줄기세포, 유도된 다능성 줄기 세포(iPS), 또는 지방 조직-유래 줄기세포, 심장 조직-유래 줄기세포, 또는 제대혈 조직-유래 줄기세포와 같은 조직-유래 줄기 세포의 유도 인자이다. 일부 구현에서, 줄기세포의 유도 인자는 조혈 줄기세포, 유방 줄기세포, 장 줄기 세포, 태반의 중간엽 줄기세포, 지방 조직, 폐, 골수, 혈액, 탯줄의 와튼 젤리 또는 치아(치과용 펄프 및 치주 인대의 혈관 주위 틈새와 같은), 내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각 성인 줄기세포, 신경능 줄기세포(neural crest stem cell) 또는 생식 줄기세포(예를 들어, 고환에서의 줄기세포)와 같은 성체 줄기세포의 유도 인자이다.

일부 구현에서, 줄기세포 또는 줄기세포의 유도 인자는 전신 투여된다. 일부 구현에서, 줄기세포 또는 줄기세포의 유도 인자는 허혈성 조직에 국소 투여된다. 일부 구현에서, 줄기세포 또는 줄기세포의 유도 인자는 허혈성 손상 부위 이외의 부위에 국소 투여된다.

일부 구현에서, 줄기세포(또는 줄기세포의 유도 인자), 테트라민 조성물(구리 이온을 갖거나 갖지 않음) 및 선택적으로 구리-촉진 조성물을 동시에 투여한다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 줄기세포(또는 줄기세포의 유도 인자) 및 테트라민 조성물(구리 이온을 갖거나 갖지 않음) 및 선택적으로 구리-촉진 조성물은 임의의 적합한 순서로 순차적으로 투여된다.

줄기세포(또는 줄기세포의 유도 인자), 테트라민 조성물(구리 이온을 갖거나 갖지 않음) 및 선택적으로 본 명세서에 기재된 구리-촉진 조성물을 포유류(예: 사람)에게 투여하면, 일부 구현에서 상기 세포의 존재 및/또는 생물학적 활성은 다수의 공지된 어느 방법에 의해 모니터링된다. 일부 구현에서, 상기 세포는 생체 내에서 개체의 허혈성 조직으로부터 이동하고, 조직 손상 부위로 가는 도중에 상기 세포의 존재 및/또는 생물학적 활성이 모니터링 및/또는 조절된다.

본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 조직 복구의 모든 견지에 적용가능하나, 하기 중 어느 하나 이상의 목적을 위해 사용될 수 있는 것으로 이해된다: 골수 간엽 줄기세포의 허혈성 조직으로의 이동 유도, 허혈성 조직에서 줄기세포의 분화 유도, 허혈성 조직에서 조직 재생 유도, 조직 재생을 촉진시키는 신호 분자 유도, 구리-의존성 HIF-1 전사 활성 촉진, 허혈성 손상의 부위에서 데미지 역전, 및 허혈성 손상의 부위에서 신경원 섬유 세포 및 신경 분비 세포의 미세환경 재구성.

또한 본 명세서에는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체에서 허혈성 조직 데미지를 예방하는 방법이 제공된다. 킬레이트 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직, 및 허혈성 골격근 조직(허혈성 사지 조직과 같은)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 심장 조직이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직은 허혈성 뇌 조직이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 추가로 구리 이온을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 테트라민과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어, 사각-평면 기하학적구조를 취하며, 그리고 여기서 결정성 복합체는 2개의 염화 이온과 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에는 불충분하다. 일부 구현에서, 상기 방법은 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물을 개체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시킬 수 있는 구리-촉진 조성물로 미리 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이다. 일부 구현에서 구리-촉진 조성물은 구리 이온을 포함하지 않는다. 일부 구현에서 구리-촉진 조성물은 구리 흡수를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며 그리고/또는 아연의 독성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg에서 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 하루에 두 번 투여된다.

일부 구현에서, 개체에서 허혈성 심부전의 예방 방법이 제공되며, 이는 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)을 포함하는 테트라민 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추는 데 불충분하다. 일부 구현에서 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg에서 약 450mg(약 80mg 내지 약 300mg, 또는 약 150mg 내지 약 350mg과 같은)이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 하루에 두 번 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 적어도 약 1개월동안(적어도 약 3개월 또는 적어도 약 6개월과 같은) 투여된다. 일부 구현에서, 개체는 기준치에서 약 35% 이하의 좌심실 박출 기능(LVEF)를 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 (New York Heart Association 또는 NYHA Functional의 분류에 기초하여) II 클래스 혹은 III 클래스 심부전을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 적어도 약 150pg/mL의 혈장 B형 나트륨이뇨펩티드(BNP)를 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 약 600 pg/mL 이상의 NT-proBNP(N-말단 pro-BNP)를 갖는다.

본 명세서에서 사용하는 “예방(preventing)”은 질병에 걸리기 쉽지만 아직 질병으로는 진단되지 않은 개체의 질병 발생 또는 재발에 관한 예방(prophylaxis)을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병 발달을 지연 시키거나 조직 손상과 같은 질병의 진행을 늦추는 데 사용된다.

질병을 예방하거나 치료하기 위한, 적절한 투여량 또는 투여경로는 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방 또는 치료 목적인지 여부, 이전의 치료법, 개체의 임상 내력 및 테트라민 조성물 및/또는 세포에 대한 반응 그리고 주치의의 재량에 따라 달라진다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물, 구리-촉진 조성물, 줄기세포, 및 줄기세포 유도 인자는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 개체에게 적절하게 투여된다.

일부 구현에서, 본 발명은 허혈성 조직 데미지를 치료 및 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구현에서, 본 명세서에서 제공되는 테트라민 조성물, 구리-촉진 조성물 및/또는 세포는 개체에서 조직 데미지를 일으키거나 일으킬 가능성이 있는 치료 전, 치료 동안 및/또는 치료 후에 투여되고, 이러한 투여는 암 방사선 요법 및 화학 요법과 같은 치료와 관련된 허혈성 조직의 데미지를 예방하거나 감소시킨다.

일부 구현에서, 본 명세서에서 개시된 테트라민 조성물이나 방법은 줄기 세포의 조직으로의 이동(예를 들어, 호밍(homing))을 유도함으로써, 심지어 개체의 조직이 자연적으로 줄기세포를 모으는 본래의 기능을 상실한 후에도 허혈성 조직 데미지를 예방하거나, 허혈성 조직 데미지의 구역(area), 부피 또는 기간을 감소시킨다. 일부 구현에서, 본 발명의 테트라민 조성물 및/또는 세포의 투여는 허혈성 조직 데미지에 대해 증진된 내성을 유도하는 일련의 다른 이벤트를 촉발시키며, 이는 예를 들어 상기 조직 부위에서 줄기세포의 분화를 유도하는 것, 상기 조직 부위에서의 조직 재생을 유도하는 것, 조직 재생을 촉발하는 신호 분자를 유도하는 것, 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 것, 부가적인 데미지가 가해지기 전에 초기 허혈성 손상 부위에서 데미지를 역전시키는 것, 및/또는 상기 조직에서 신경 섬유 세포 및 신경 분비 세포의 미세환경을 재구성하는 것을 포함한다.

예를 들어, 심근 허혈 또는 심근 경색은 기능적인 심장 조직에서 펌프 기능의 가능성 있는 악화와 사망으로 인해 비가역적인 상실을 초래할 수 있다. 관상 동맥의 폐색은 의존성 모세 혈관 시스템의 혈액 공급을 방해한다. 영양과 산소가 없다면, 심근 세포는 사멸하고 괴사를 겪는다. 주변 조직의 염증은 염증 세포의 침입 및 세포 파괴물의 식균 작용으로 발생한다. 섬유성 상처가 생기고 피해 입은 심장 부위는 수축력을 잃게 된다. 어떠한 간섭 없이 심장 근육이 조직의 손실을 보충하는 유일한 방법은 나머지 심근 세포의 비대(세포 내부에 세포성 단백질 및 수축성 요소의 축적)이다. 내분비, 대사성(알코올) 또는 감염성(바이러스 심근염) 제제와 암 치료제는 세포 사멸을 일으키며, 결과적으로 심근 기능이 저하된다. 일부 구현에서, 본 명세서에서 개시된 테트라민 조성물 또는 방법은 허혈성 심장 조직 데미지를 예방하거나 허혈성 심장 조직 데미지의 구역, 부피 또는 기간을 감소시킨다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 테트라민 조성물은 중간엽 줄기세포(예를 들어, BMSCs)의 허혈성 심장조직으로 이동(예를 들어, 호밍) 및/또는 보유를 유도한다. 일부 구현에서, 심근 허혈 또는 심근 경색의 경우, 심근은 심근 세포로의 줄기세포의 분화를 통해 조직 손실을 보충할 수 있어서, 심근 비대 및 추가적인 심근 조직 데미지를 피하거나 감소시킨다.

테트라민 조성물

또한 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 것, 구리를 세포에 전달하는 것, 조직 복구의 적어도 하나(2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 적어도 어느 것과 같은)의 이벤트를 유도하는 것, 줄기세포의 이동을 유도하는 것, 또는 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 것을 포함하는 (약학 조성물을 포함하는) 테트라민 조성물이 본 명세서에 제공된다.킬레이트 선택적으로 구리-촉진 조성물 및/또는 줄기세포(또는 줄기 세포 유도 인자)와 조합하여 임의의 테트라민 조성물이 상술한 방법에 사용될 수 있다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 테트라민 조성물이 제공된다. 본 명세서에서 고려되는 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)은 이에 한정하는 것은 아니나, 구리 킬레이트 테트라민 화합물 그 자체, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이의 활성대사물, 이의 프로드럭, 및 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 “구리 및 구리 킬레이트 테트라민(Copper and copper chelating tetramines)” 섹션에 기재된 바와 같은 화학식 (II)의 테트라민과 같은 트리엔틴의 유사체이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리와 같은 미량 원소를 포함하지 않는다. 일부 구현에서, 조성물은 혈액 내의 구리 이온을 킬레이트할 수 있고, 구리 이온을 허혈성 조직의 세포 내로 전달할 수 있다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온의 혼합물을 포함하는 테트라민 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 혼합물을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 상대적인 비율(몰 대 몰)은 약 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 또는 1:100 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 상대적인 비율은 1:1이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 상대적인 비율(몰 대 몰)은 약 50:1-100:1, 20:1-50:1, 10:1-20:1, 5:1-10:1, 4:1-5:1, 3:1-4:1, 2:1-3:1, 1:1-2:1, 1:2-1:1, 1:3-1:2, 1:4-1:3, 1:5-1:4, 1:10-1:5, 1:20-1:10, 1:50-1:20, 1:100-1:50, 1:100-1:10, 1:10-1:1, 1:1-10:1, 10:1-100:1, 또는 1:10-10:1 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 이온의 적어도 일부분은 구리 킬레이트 테트라민과의 복합체로 존재한다. 일부 구현에서, 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민 및 구리 이온의 복합체를 포함하는 테트라민 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리이온의 복합체를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 화학양론은 약 1:1이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 복합체는 결정성이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 결정성 복합체는 열역학적 동질이상체(polymorph)이다. 결정성 복합체의 상이한 열역학적 동질이상체는 x-선 결정학과 같은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있는 기하학적 구조, 단위 셀 치수, 공간군(space group) 및 구조적 좌표의 특정 세트에 의해 표현될 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각-평면의 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 결정성 복합체는 두 개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함한다. 일부 구현에서 테트라민 조성물은 아래에 나타낸 바와 같은 화학식 (I)의 결정성 복합체를 포함한다.

화학식 (I)

여기서 Cu는 구리 이온이고, 점선은 수소결합을 나타낸다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하고, 여기서 결정성 복합체는 도 1에 나타낸 바와 같이 결정(crystal) 구조를 갖는다. 일부 구현에서 결정 구조는 도 2에 열거된 바와 같은 결합 길이, 결합 각, 비틀림 각을 갖는다. 일부 구현에서, 결정성 복합체는 도 3에 열거된 바와 같은 공간군 및 파라미터를 갖는 결정을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 결정성 복합체의 결정 구조는 도 4a-4c에 나열된 바와 같은 원자 좌표에 의해 정의된다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 복합체를 포함하며, 여기서 복합체는 결정성이지 않다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는 구리 이온을 추가로 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는 구리 이온과 복합체의 상대적 비율(몰 대 몰)은 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 또는 1:100 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는 구리 이온과 복합체의 상대적 비율(몰 대 몰)은 약 1:2-1:1, 1:3-1:2, 1:4-1:3, 1:5-1:4, 1:10-1:5, 1:20-1:10, 1:50-1:20, 1:100-1:50, 1:100-1:10, 또는 1:10-1:1 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 복합체로 존재하는 테트라민 조성물에서 총 구리의 백분율은 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)과 복합체로 존재하는 테트라민 조성물에서 총 구리의 백분율은 약 1%-5%, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 1%-10%, 10%-50%, 50%-80%, 또는 80%-100% 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 이온과 복합체로 존재하는 테트라민 조성물에서 총 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)의 백분율은 적어도 약 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100% 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 이온과 복합체로 존재하는 테트라민 조성물에서 총 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)의 백분율은 약 1%-5%, 5%-10%, 10%-20%, 20%-30%, 30%-40%, 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70%-80%, 80%-90%, 90%-100%, 1%-10%, 10%-50%, 50%-80%, 또는 80%-100% 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)과 복합체로 존재하지 않는 구리 이온은 황산구리, 염화구리, 산화구리, 질산구리, 아세트산 구리, 포름산 구리, 구리 글루코네이트, 구리 아미노산 킬레이트 등과 같은 염으로 존재한다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민 및 구리 이온을 포함하는 테트라민 조성물이 제공되며, 여기서 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 트리엔틴 및 구리 이온을 포함하며, 여기서 구리이온은 트리엔틴과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 구리 이온은 황산구리, 염화 구리, 산화 구리, 구리 글루코네이트, 구리 아미노산 킬레이트 등과 같은 염으로 존재한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)과 구리 이온의 상대적인 비율(몰 대 몰)은 약 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 또는 1:100 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴 같은)과 구리 이온의 상대적인 비율(몰 대 몰)은 약 50:1-100:1, 20:1-50:1, 10:1-20:1, 5:1-10:1, 4:1-5:1, 3:1-4:1, 2:1-3:1, 1:1-2:1, 1:2-1:1, 1:3-1:2, 1:4-1:3, 1:5-1:4, 1:10-1:5, 1:20-1:10, 1:50-1:20, 1:100-1:50, 1:100-1:10, 1:10-1:1, 1:1-10:1, 10:1-100:1, 또는 1:10-10:1 중 어느 하나이다.

이에 한정하는 것은 아니나, 구리 킬레이트 테트라민의 화학적 구조, 테트라민 조성물에서 구리 킬레이트 테트라민과 구리의 비율, 구리 이온과 구리 킬레이트 테트라민의 상호작용(예를 들면, 복합체의 여부, 복합체의 결정성 여부 등)을 포함하는 테트라민 조성물의 다수의 인자들이 허혈성 조직에서 세포 내부에 구리를 전달(예를 들어, 언로드(unload)와 같은)하는 테트라민 조성물의 용량(capacity)에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 구리 킬레이트 테트라민은 구리 이온의 가역적인 결합을 촉진하는 형태(킬레이트 정밀도, 공여체 결합기, 공동의 크기를 포함)를 가질 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 허혈성 조직에 있는 세포 내부의 구리 이온에 대해 충분히 낮은 친화성을 갖는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하며, 여기서 테트라민 조성물은 세포 내의 구리 이온을 해리 및 언로드한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 허혈성 조직에서 세포 내부에 구리 이온의 언로딩을 증가시키는 추가 화합물 및/또는 제제를 포함한다.

또한, 본 명세서에 기술된 방법에 사용하기 위한, 본 명세서에 기술된 어느 테트라민 조성물 및 당해 기술분야에 공지 된 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 안정화제, 희적제 및/또는 다른 제제들을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

따라서, 본 명세서의 일 견지에서, 구리 킬레이트 테트라민 및 구리 이온을 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 트리엔틴 및 구리 이온을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온의 복합체를 포함하는 약학 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 트리엔틴과 구리 이온의 복합체를 포함하는 약학 약학 조성물이 제공된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 복합체는 결정성이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 결정성 복합체는 열역학적 동질이상체이다. 일부 구현에서, 약학 약학 조성물은 트리엔틴과 구리이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각 평면 기하학적 구조를 취하며, 그리고 여기서 결정성 복합체는 추가로 2개의 염화 이온 및 물 분자를 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)과 구리 이온의 복합체는 결정성이 아니다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온을 포함하는 약학 조성물이 제공되며, 여기서 구리 이온의 적어도 일부(예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는다. 일부 구현에서, 트리엔틴과 구리 이온을 포함하는 약학 약학 조성물이 제공되며, 여기서 구리 이온의 적어도 일부(예를 들어, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 중 어느 하나)는 트리엔틴과 복합체로 존재하지 않는다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온을 포함하는 약학 약학 조성물이 제공되며, 여기서 상기 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 트리엔틴과 구리 이온을 포함하는 약학 약학 조성물이 제공되며, 여기서 상기 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재하지 않는 구리 이온은 황산구리, 염화 구리, 산화 구리, 질산 구리, 아세트산 구리, 포름산 구리, 글루코네이트 구리, 구리 아미노산 킬레이트 등과 같은 염으로 존재한다.

본 명세서에 기재된 어느 약학 조성물은 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키고, 적어도 2 가지(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상 중 어느 하나)의 조직 복구 이벤트를 유도하고, 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진하고, 및/또는 허혈성 조직 손상과 관련된 어느 질병 또는 컨디션을 치료(예방 포함)하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 약학 약학 조성물은 용액, 유화제, 서스펜션, 확산제 또는 적합한 약학적 용매 또는 담체 내의 시클로덱스트린과 같은 내포 복합체, 또는 필(pill), 정제, 로젠지(lozenges), 좌약, 사세(sachets), 당의정(dragees), 과립제, 분말, 재구성용 분말, 또는 다양한 투여 형태의 제조를 위한 업계에 공지된 통상적인 방법에 따른 고형 담체와 함께 캡슐로 제형화될 수 있다. 그 구현의 약학 약학 조성물은 예를 들어, 경구, 비경구, 직장, 비강, 국소 또는 안구투여 또는 흡입과 같은 적합한 전달 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 구현에서, 약학 조성물은 경구 투여용으로 제형화된다. 일부 구현에서, 약학 조성물은 (정맥 투여와 같은) 비경구 투여용으로 제형화된다.

경구 투여를 위해, 약학 조성물은 정제 또는 캡슐과 같은 고체 형태로 제공되거나 용액, 에멀젼, 또는 서스펜션으로 제공될 수 있다. 일부 구현에서, 약학 조성물은 정제, 캡슐 또는 필로서 제형화된다. 경구 정제는 희석제, 분해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향료, 착색제 및 보존제와 같은 호환성의 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 혼합된 활성성분(들)을 포함한다. 적합한 불활성 충전제는 소듐 및 칼슘 카보네이트, 소듐 및 칼슘 포스페이트, 락토오스, 전분, 당, 글루코스, 메틸 셀룰로오스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 예시적인 액체 경구 부형제는 에탄올, 클리세롤, 물 등을 포함한다. 전분, 폴리비닐-피롤리돈(PVP), 소듐 전분 글리콜레이트, 마이크로크리스탈린셀룰로오스 및 알긴산은 예시적인 분해제이다. 결합제는 전분과 젤라틴을 포함한다. 윤활제가 존재하는 경우에 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석이 될 수 있다. 필요에 따라, 정제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 물질로 코팅되어 소화관에서의 흡수를 지연시킬 수 있으며, 또는 장용피로 코팅될 수 있다. 경구 제형은 각각 미리 정해진 양의 활성 성분을 함유하는 캡슐, 카세제 또는 정제와 같은 별개의 단위로; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비수성 액체의 용액 또는 서스펜션으로서; 또는 수중유형 액체 에멀젼 또는 유중수형 액체 에멀젼으로서 제공될 수 있다. 활성 성분은 볼러스(bolus), 연질약, 페이스트로 제공될 수 있다.

정제는 압축 또는 성형(moulding)에 의해 제조될 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 제조될 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동형태의 활성 성분을 적절한 기계에서, 선택적으로 바인더(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 분해제(예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트. 가교 결합된 포비돈, 가교 결합된 소듐 카르복시 메틸 셀룰로오스), 표면활성제 또는 분산제와 혼합하여 적절한 기계에 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 적절한 기계에서 불활성 액체 희석제로 습윤화된 분말 화합물의 혼합체를 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 평가될 수 있으며, 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 다양한 비율의 히드록시프로필메틸셀룰로오스를 이용하여 활성 성분의 느리거나 제어된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.

경구 투여를 위한 캡슐은 경질과 연질 젤라틴 캡슐을 포함한다. 경질 젤라틴 캡슐을 제조하기 위해, 활성 성분(들)을 고체, 반고체 또는 액체 희석제와 혼합할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 활성 성분을 물, 땅콩 오일 또는 올리브유와 같은 오일, 액체 파라핀, 짧은 사슬 지방산의 모노 및 디-글리세리드의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 400, 또는 프로필렌 글리콜과 혼합하여 제조될 수 있다. 캡슐은 또한 비활성 성분으로서 젤라틴, 산화철, 스테아르산 및 이산화티타늄을 함유할 수 있다.

경구 투여를 위한 액체는 서스펜션, 용액, 에멀젼 또는 시럽형태일 수 있거나, 사용 전 물이나 다른 적절한 비이클로 재구성하기 위해 동결건조 되거나 건조 생성물로 제공될수 있다. 그러한 액체 조성물은 서스펜션제(예를 들어, 소르비톨, 메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 젤라틴, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 알루미늄 스테아레이트 젤 등)과 같은 약학적으로 허용되는 부형제; 오일(예를 들어, 아몬드 오일 또는 정제 코코넛 오일)과 같은 비수성 비이클, 프로필렌 글리콜, 에틸 알코올, 또는 물; 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산); 레시틴과 같은 습윤제; 및 필요에 따라, 향료 또는 착색제를 선택적으로 포함한다.

정맥 내, 근육 내, 복강 내, 비강 내 또는 피하 경로를 포함하는 비경구 사용을 위해, 테트라민 조성물은 멸균 수용액 또는 서스펜션으로 제공될 수 있으며, 적절한 pH 및 등장성 또는 비경구적으로 허용되는 오일로 완충될 수 있다. 적절한 수성 비이클은 링거 용액과 등장성 소듐 클로라이드를 포함한다. 그러한 형태는 앰플 또는 일회용 주사 장치와 같은 단위-투여 형태로 존재하거나, 적절한 투여량을 회수할 수 있는 바이알과 같은 다중-투여 형태로 존재하거나, 주사 가능한 제형을 제조하는데 사용될 수 있는 고체 형태 또는 예비-농축물로 제공될 수 있다. 정맥 내 투여를 포함하는 비경구용으로 적합한 제형은 항산화제, 버퍼, 세균 발육 저지제 및 의도된 수용자의 혈액과 등장성을 제형에 제공하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사용액; 및 서스펜션제와 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 서스펜션을 포함한다. 제형은 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어, 밀폐된 앰플 및 바이알로 존재할 수 있으며, 제형은 사용 직전에 예를 들어, 주사용수와 같은 멸균된 액체 담체의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조된(리오필라이즈드(lyophilized) 컨디션으로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 서스펜션은 전술한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

투여량과 투여방법

본 명세서에서 기재된 치료 방법 중 어느 하나에 대해 생체 내에서 사용되는 경우, 테트라민 조성물(약학적 조성물 포함), 그리고 선택적으로 구리-촉진 조성물 및/또는 줄기세포(또는 줄기세포 유도 인자)가 개체에게 유효량으로 투여된다. “유효량(effective amount)”은 적어도 허혈성 조직 손상과 관련된 질병 또는 컨디션의컨디션을 측정 가능한 개선 또는 예방에 필요한 최소의 농도이다. 본 명세서에서 유효량은 개체의 허혈성 손상정도, 사용된 특정 테트라민 조성물, 구리 이온 및/또는 줄기세포(또는 줄기세포 유도 인자)의 특성, 예를 들어, 치료 지수, 개체(나이, 성별, 체중 및 병력 등)와 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 유효량은 또한 치료의 어느 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 적은 것이다. 예방적 용도를 위해 유익하거나 바람직한 결과에는 위험을 줄이거나 없애는 것, 중증도를 낮추거나, 질병 또는 컨디션의 생화학, 병리학 및/또는 행동적 증상, 질병 또는 컨디션의 발달 도중에 존재하는 이의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 포함하는 질병이나 컨디션의 온셋을 지연시키는 것과 같은 결과가 포함된다.컨디션컨디션이나 치료적 사용을 위해, 유익한 또는 바람직한 결과는 질병 또는 컨디션으로 인한 하나 이상의 증상의 감소와 같은 임상적 결과, 질병으로 고통받는 자들의 삶의 질 증가, 질병을 치료하는데 필요한 다른 약물의 투여량 감소, 표적화와 같은 또 다른 약제의 효과 증진, 질병의 진행 지연 및/또는 생존 연장을 포함한다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학적 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 치료전의 개체의 허혈성 조직의 세포 내 구리 수준과 비교하여 개체의 허혈성 조직의 세포 내 구리 수준이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 중 어느 것보다 많은 증가를 일으키는데 효과적이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 치료 전의 개체의 허혈성 조직에서 총 구리 수준과 비교하여 개체에서 허혈성 조직의 총 구리 수준이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 중 어느 것보다 많은 증가를 일으키는데 효과적이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 개체의 세포 외 구리 수준(혈액 내의 구리 수준과 같은)을 낮추지 못한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 치료 전의 개체의 세포 외 구리 수준과 비교하여 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 것보다 많이 개체의 세포 외 구리 수준(혈액 내의 구리 수준과 같은)을 낮추지 못한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 개체의 총 구리 수준을 낮추지 못한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 유효량 및 선택적으로 구리-촉진 조성물의 유효량과의 조합은 치료전의 개체의 총 구리 수준과 비교하여 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 중 어느 하나보다 많이 총 구리 수준을 낮추지 못한다.

하나 또는 그 이상의 투여를 통해 유효량이 투여될 수 있다. 임상적 관점에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물, 또는 약학 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과의 결합을 달성하거나 달성하지 않을 수 있다. 그러므로 “유효량”은 하나 또는 그 이상의 치료제를 투여하는 관점에서 고려될 수 있고, 단일 제제는 하나 또는 그 이상의 다른 제제와 함께 결합되는 경우에 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 또는 달성되는 유효량으로 주어지는 것으로 간주될 수 있다.

테트라민 조성물 단독, 혹은 구리-촉진 조성물(구리 이온과 같은) 및/또는 줄기세포(또는 줄기세포 유도 인자)와의 조합의 유효량, 투여량 및 투여 요법은 의사와 임상의에게 익숙한 방법으로 임상 전 시험과 임상 시험 도중에 결정될 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 유효량은 약 0.5 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 80 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 225 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 또는 1200 mg 중 어느 하나보다 적다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 유효량은 약 0.5 mg 에서 약 5 mg, 약 5 mg 에서 약 10mg, 약 10 mg 에서 약 25 mg, 약 25 mg 에서 약 50mg, 약 50 mg 에서 약 75mg, 약 75 mg 에서 약 100mg, 약 100 mg 에서 약 125mg, 약 125 mg 에서 약 150mg, 약 150 mg 에서 약 175mg, 약 175 mg 에서 약 200mg, 약 200 mg 에서 약 225mg, 약 225 mg 에서 약 250mg, 약 250 mg 에서 약 275mg, 약 275 mg 에서 약 300mg, 약 300 mg 에서 약 350mg, 약 350 mg 에서 약 400mg, 약 400 mg 에서 약 500mg, 약 500 mg 에서 약 600mg, 약 600 mg 에서 약 1200mg, 약 1200 mg 에서 약 2400mg, 약 0.5mg 에서 약 50mg, 약 50mg 에서 약 100mg, 약 10mg 에서 약 125mg, 약 80mg 에서 약 200mg, 약 150mg 에서 약 300mg, 약 200mg 에서 약 300mg, 약 300mg 에서 약 600 mg, 약 0.5mg 에서 약 200mg, 약 80mg 에서 약 300mg, or 약 80 mg 에서 약 400 mg, 또는 약 80 mg 에서 약 450 mg 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 인간 환자에게 하루에 약 80mg에서 약 450mg의 구리 킬레이트 테트라민(이염화염 형태로와 같은)이다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 유효량은 적어도 약 1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg 중 어느 것을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 유효량은 약 35 mg/kg, 30 mg/kg, 25 mg/kg, 20 mg/kg, 18 mg/kg, 15 mg/kg, 10 mg/kg, 5 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 또는 0.1 mg/kg 중 어느 것 미만을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물에서 구리 킬레이트 테트라민의 유효량은 하루당 약 1 mg/kg에서 약 10 mg/kg, 약 10 mg/kg에서 약 15 mg/kg, 약 15 mg/kg에서 약 20 mg/kg, 약 20 mg/kg에서 약 25 mg/kg, 약 25 mg/kg에서 약 30 mg/kg, 약 30 mg/kg에서 약 40 mg/kg, 약 1 mg/kg에서 약 100 mg/kg, 약 10 mg/kg에서 약 50 mg/kg, 약 15 mg/kg에서 약 50 mg/kg, 약 15 mg/kg에서 약 40 mg/kg, 또는 약 20 mg/kg에서 약 35 mg/kg 중 어느 하나이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 레서스 원숭이에게 하루당 18mg/kg인 것과 같이 하루당 20mg/kg을 넘지 않는다. 일부 구현에서, 마우스에게 테트라민 조성물의 유효량은 하루당 약 15mg/kg에서 약 35mg/kg를 넘지 않는다.

일부 구현에서, 약학적 조성물(예를 들어, 단위 투여 형태)에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 유효량은 약 80 mg에서 약 150 mg, 약 80 mg에서 약 200 mg, 약 200 mg에서 약 300 mg, 또는 약 80 mg에서 약 300 mg와 같은 약 5 mg에서 약 300 mg의 범위 내이다. 일부 구현에서, 약학적 구성물에서 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은)의 농도는 희석되거나(약 0.1 mg/ml) 농축(약 100mg/ml)되며, 이는 예를 들어, 약 0.1에서 50mg/ml, 약 0.1에서 약 20mg/ml, 또는 약 1에서 약 10mg/ml 중 어느 하나를 포함한다.

예시적인 투여 빈도는 이에 한정하는 것은 아니나, 하루에 4번, 하루에 3번, 하루에 2번, 하루에 1번, 2일에 1번, 3일에 한번, 4일에 한번, 일주일에 한번 중 어느 하나를 포함한다. 일구 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 적어도 약 일주일에 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 또는 7x(즉, 매일)중 어느 하나로 투여된다. 일부 구현에서, 각 투여 사이의 간격은 약 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 12시간, 6시간, 4시간, 또는 3시간 중 어느 하나보다 짧다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 매일 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 적어도 하루에 2번 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 예를 들어, 적어도 1일 2회, 3회, 또는 4회 중 어느 것을 포함하여 적어도 1회 투여된다.

일부 구현에서, 투여 빈도와 결합된 테트라민 조성물의 유효량은 혈액에서 또는 허혈성 조직에서와 같은 개체에서 테트라민(트리엔틴과 같은)의 고농도를 유지하기에 충분하다. 일부 구현에서, 테트라민의 고농도는 구리 의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진하거나 적어도 하나(적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상을 포함하는)의 조직 복구 이벤트를 유도하는 농도이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 투여는 적어도 약 0.005mg/L(예를 들어, 0.01mg/L, 0.05 mg/L, 0.1 mg/L, 0.5mg/mL,1.0 mg/L, 2.0 mg/L, 3.0 mg/L, 4.0 mg/L 또는 5.0 mg/L 중 어느 것을 포함함)의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도한다. 생물학적 샘플(예를 들어, 허혈성 조직의 혈액 또는 생검)에서 테트라민의 농도는 형광 분광법, 질량 분광법, 크로마토그래피 방법, 표지된 테트라민의 수준 측정과 같이 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.

일부 구현에서, 투여 빈도와 결합된 테트라민 조성물의 유효량은 적어도 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 시간 중 어느 것 동안 개체에서 고농도의 테트라민(트리엔틴과 같은)을 유지하기에 충분하다. 일부 구현에서, 투여 빈도와 결합된 테트라민 조성물의 유효량은 개체에서 적어도 약 8시간 동안 고동도의 테트라민(트리엔틴과 같은)을 유지하는데 충분하다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 테트라민 조성물에서 적어도 약 1 mg/kg/일, 2 mg/kg/일, 5 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 12 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 18 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 50 mg/kg/일, 또는 그 이상의 트리엔틴 중 어느 것이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 테트라민 조성물에서 1 mg/kg/일, 2 mg/kg/일, 5 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 12 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 18 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 50 mg/kg/일 중 어느 것 이하의 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 테트라민 조성물에서 약 1 mg/kg/일에서 약 2 mg/kg/일, 약 2 mg/kg/일에서 약 5 mg/kg/일, 약 5 mg/kg/일에서 약 10 mg/kg/일, 약 10 mg/kg/일에서 약 15 mg/kg/일, 약 15 mg/kg/일에서 약 20 mg/kg/일, 약 20 mg/kg/일에서 약 30 mg/kg/일, 약 30 mg/kg/일에서 약 50 mg/kg/일, 약 1 mg/kg/일에서 약 5 mg/kg/일, 약 5 mg/kg/일에서 약 15 mg/kg/일, 약 1 mg/kg/일에서 약 10 mg/kg/일, 또는 약 1 mg/kg/일에서 약 18 mg/kg/일의 트리엔틴 중 어느 것이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 유효량은 테트라민 조성물에서 약 18mg/kg/일의 트리엔틴이다. 일부 구현에서, 테트라민의 조성물의 유효량은 테트라민 조성물에서 약 1mg/kg/일에서 약 10mg/kg/일의 트리엔틴이다.

테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 투여는 약 1주 내지 최대 약 수 년 중 어느 하나와 같은 연장된 기간에 걸쳐서 이루어질 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 또는 84개월 또는 그 이상의 기간 중 어느 하나의 기간에 걸쳐서 투여된다. 일부 구현에서 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 또는 그 이상의 개월 중 어느 것을 포함하여 적어도 한달 동안 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 적어도 약 한달간 투여되고, 여기서 테트라민 조성물은 적어도 하루에 한번(예를 들어, 두 번, 세 번, 또는 네 번) 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물을 포함하여)의 투여는 적어도 약 1주일(예를 들어, 적어도 약 2주, 1달, 2달, 3달, 4달, 6달, 12달 또는 그 이상 중 어느 하나를 포함함) 동안 적어도 약 0.005mg/L(예를 들어, 적어도 약 0.01 mg/L, 0.05 mg/L, 0.1 mg/L, 0.5mg/mL,1.0 mg/L, 2.0 mg/L, 3.0 mg/L, 4.0 mg/L 또는 5.0 mg/L 중 어느 하나를 포함함)의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도한다.

본 명세서에 기재된 어느 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 다양한 경로, 예를 들어, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 폐내, 경구, 흡입, 혈관 내, 근육 내, 기관 내, 피하, 안구 내, 척수강 내, 점막 경우, 경피, 종양 내, 혈관 벽에 직접주입, 직장 내, 또는 구내를 통해서 개체(인간과 같은)에게 투여될 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)의 지속적인 연속 방출 제형이 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 비경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 허혈성 조직에 직접(예를 들어, 하기 기재된 직접 전달 방법을 사용하여) 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물은 혈관 성형술과 같은 개입(intervention) 방법을 통해 투여된다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 제 2 치료 화합물 및/또는 제 2 치료법과 함께 투여될 수 있다. 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은) 및 제 2 화합물의 투여량 및 투여 빈도는 투여하는 의사의 판단에 기초하여 치료과정 동안 조정될 수 있다. 일부 구현에서, 제 1 치료와 제 2 치료는 동시에, 순차적으로, 또는 동시에 투여된다. 본 명세서에서 사용된 “동시 투여(simultaneous administration)”는 병용 치료로 제 1 치료와 제 2 치료가 예를 들어, 약 10분, 5분, 또는 1분 중 어느 것 이하와 같이 이하와 같이 약 15분 이하의 시간 분리로 투여되, 는 것을 나타낸다. 제 1 치료와 제 2 치료가 통시에 투여되는 경우, 제 1 치료와 제 2 치료는 동일한 조성물(예를 들어, 제 1 및 제 2 치료 모두를 포함하는 조성물)을 포함하거나 별도의 조성물(예를 들어, 하나의 조성물에는 제 1치료가, 다른 하나의 조성물에는 제 2 치료가 포함됨)을 포함한다. “순차적 투여(sequential administration)”는 병용 치료에서 제 1 치료 및 제 2 치료가 예를 들어, 약 20분, 30분, 40분, 50분, 60분 또는 그 이상 중 어느 것보다 많은 것과 같이 적어도 약 15분 초과의 시간 분리, 로 투여되는 것을 나타낼 수 있다. 제 1 치료 또는 제 2 치료 중 어느 하나가 처음으로 투여될 수 있다. 제 1 및 제 2 치료는 동일하거나 다른 패키지나 키트에 포함될 수 있는 별개의 조성물에 포함된다. 동시 투여는 병용 치료에서 제 1 치료의 투여와 제 2 치료의 투여가 서로 중첩되는 것을 나타낼 수 있다. 개별적으로 투여되는 경우, 약학 조성물 및 제 2 화합물은 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은)은 매일 투여될 수 있으나, 한편 제 2 화합물은 다소 빈번하게 투여될 수 있다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 제 2 화합물의 지속적인 연속 방출 제형이 사용될 수 있다. 지속적인 방출을 위한 다양한 제형 및 장치는 당업계에 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 투여 형태의 조합을 사용할 수 있다. 일부 구현에서, 제 2 화합물은 구리 이온(구리 염 또는 킬레이트된 구리)이다. 일부 구현에서, 제 2 치료는 줄기세포 또는 줄기세포 유도 인자를 포함한다.

일부 구현에서, 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물의 유효량을 개체에게 추가로 투여한다. 일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물의 유효량은 치료전의 개체의 세포 외 구리 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상 중 어느 하나로 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시키기에 충분하다. 일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물의 유효량은 치료전의 개체의 허혈성 조직의 총 구리 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상 중 어느 하나로 개체의 허혈성 조직의 총 구리 수준을 증가시키기에 충분하다.

일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물의 유효량은 치료전의 개체의 세포 외 구리 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상 중 어느 하나로 개체의 세포 외 구리 수준을 증가시키기에 충분하다. 일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물의 유효량은 치료전의 개체의 허혈성 조직의 총 구리 수준과 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 또는 그 이상 중 어느 하나로 개체의 허혈성 조직의 총 구리 수준을 증가시키기에 충분하다. 일부 구현에서, 구리 이온을 포함하지 않는 구리-촉진 조성물이 세포 외 구리 수준을 증가시키는데 사용된다. 예를 들어, 상기 구리-촉진 조성물은 구리의 흡수를 증가시키고, 구리의 배출을 감소시키며, 및/또는 아연 독성을 감소시킬 수 있다.

일부 구현에서, 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물에서 구리 이온의 유효량은 하기의 어느 범위에 포함된다: 약 0.01 mg에서 약 0.1 mg, 약 0.1 mg에서 약 0.5 mg, 약 0.5 mg에서 약 1 mg, 약 1 mg에서 약 2 mg, 약 2 mg에서 약 3 mg, 약 3 mg에서 약 4 mg, 약 4 mg에서 약 5 mg, 약 5 mg에서 약 8 mg, 약 8 mg에서 약 10 mg, 약 0.01 mg에서 약 1 mg, 또는 약 0.1 mg에서 약 2.5 mg. 일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물에서 구리 이온의 유효량은 적어도 약 5 mcg/kg, 10 mcg/kg, 20 mcg/kg, 30 mcg/kg, 50 mcg/kg, 100 mcg/kg, 200 mcg/kg, 300 mcg/kg, 400 mcg/kg, 500 mcg/kg, 600 mcg/kg, 700 mcg/kg, 800 mcg/kg, 900 mcg/kg, 또는 1000 mcg/kg 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현에서, 개체에게 투여되는 구리-촉진 조성물에서 구리 이온의 유효량은 약 1000 mcg/kg, 900 mcg/kg, 800 mcg/kg, 700 mcg/kg, 600 mcg/kg, 500 mcg/kg, 400 mcg/kg, 300 mcg/kg, 200 mcg/kg, 100 mcg/kg, 50 mcg/kg, 30 mcg/kg, 20 mcg/kg, 10 mcg/kg, 또는 5 mcg/kg 중 어느 하나보다 적은 것을 포함한다.

일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 매일 투여되거나 하루에 두 번 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 테트라민 조성물과 동일한 투여 빈도 또는 기간으로 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 테트라민 조성물과 다른 투여 빈도 및/또는 기간으로 투여된다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 경구 투여된다. 구리-촉진 조성물의 유효량 및 투여 빈도는 의사 및 임상의에게 친숙한 방법으로 전임상실험 및 임상실험 중에 결정될 수 있다.

환자의 질병이 개선되면, 예방적 또는 치료 유지를 위해 용량을 조정할 수 있다. 예를 들어, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두 증상의 상관적 요소로서 원하는 치료 또는 예방 효과가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다. 물론, 증상이 적절한 수준으로 완화되면, 치료가 중단될 수 있다. 그러나, 환자는 증상이 재발된다면, 장기간 만성적인 간헐적 치료가 필요할 수 있다. 환자는 또한 장기간에 걸친 만성 치료가 필요할 수 있다.

당업계에 다양한 직접적인 전달 방법이 공지되어 있으며, 이는 테트라민 조성물(약학 조성물과 같은) 및/또는 구리-촉진 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 미세기포를 통해 전달된다. 일부 구현에서, 구리 이온은 구리를 포함하는 펩티드 기반의 나노입자를 통해서 전달된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 나노입자(또는 마이크로스피어)를 통해 허혈성 조직으로 방출 또는 전달을 유도하는 물리적인 효과를 통해 수동적으로 허혈성 조직에 전달되거나 표적화된다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 허혈성 조직으로 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물의 직접적인 투여에 의해 전달된다. 일부 구현에서, 본 명세서에 기재된 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 허혈성 조직 손상의 부위로 경구 투여된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 소화관을 통해서 흡수된다. 일 견지로, 흡수된 조성물 및/또는 구리 이온은 허혈성 손상 부위에 표적화(능동적 표적화 또는 수동적 표적화에 의해)되며, 조직 복구를 위한 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물의 효과적인 국소 농도를 제공하기 위해 허혈성 손상 부위에 국소적으로 방출된다. 일부 구현에서, 경구 전달된 구리 이온은 단백질, 펩티드, 아미노산, 모노-, 디-, 폴리사카라이드와 화합물 또는 혼합물을 형성한다. 일부 다른 구현에서, 구리 이온은 소분자 유기 금속화합물 같은 유기 금속 화합물로 존재한다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 지속 전달 조성물은 테트라민 조성물 및/또는 구리 조성물을 포함하는 장기 작용 주사용액(예를 들어, 유성 주사제, 주사용 서스펜션, 주사용 마이크로스피어, 그리고 주사 가능한 원 위치(in situ) 시스템) 및 데폿(depot) 주사를 위한 제제 및 폴리머, 상업적으로 이용 가능한 데폿 주사, 주사 가능한 지속 방출 전달 시스템을 포함한다. 특정 구현에서, 본 명세서에 개시된 지속 전달 조성물은 폴리머 매트릭스의 확산 및/또는 분해에 의해 제제가 방출되는 폴리머릭 매트릭스를 포함한다. 따라서, 제제의 방출 패턴은 폴리머 매트릭스뿐만 아니라 하중 퍼센트 및 제조방법에 의해 주로 결정된다. 일부 구현에서, 지속 방출 조제용 물질은 생분해성 폴리머를 사용한다. 이러한 경우, 지속적인 방출 조제용 물질은 대상자로부터 조제용 물질의 수술적인 제거를 요구하지 않는다. 전형적으로, 그러한 조제용 물질은 천천히 분해되어 환자의 신체에 흡수되고, 궁극적으로 다른 용해 가능한 대사성 폐기물과 함께 처분된다.

일부 구현에서, 주사 가능한 폴리머릭 디폿 시스템은 허혈성 손상 부위에서 테트라민 조성물 및/또는 구리 조성물을 함유하는 원 위치(in situ)로 형성되는 임플란트를 전달하기 위해 사용된다. 원 위치로 형성되는 임플란트 시스템은 전형적으로, 주사기를 통해 체내로 주사될 수 있고, 일단 주사되면 응결되어 생분해성 고체 임플란트를 형성할 수 있는, 생분해성 물질로 만들어 진다. 일부 구현에서, 상기 임플란트는 열가소성 페이스트, 원 위치 가교 폴리머, 원 위치 폴리머 침전, 열적으로 유도되는 겔화, 또는 원 위치u 응고 오르가노겔에 의해 형성된다. 열가소성 페이스트의 디폿 형성 메커니즘은 용융된 형태로 체내로 주사 한 후 체온으로 냉각시 반고체를 형성하는 것이다. 가교 폴리머 네트워크는 고체 폴리머 시스템이나 겔을 형성하는 다양한 방법으로 원 위치에서 달성될 수 있다. 원 위치 가교 시스템의 방법은 자유 라디칼 반응을 포함하며, 보통 열에 의해 또는 광자의 흡수에 의해, 또는 작은 양이온과 폴리머 음이온 사이의 이온 상호 작용에 의해 개시된다. 원 위치 형성은 용액에서 폴리머 침전을 일으킴으로써 생성될 수 있다. 불용성이며 생분해될 수 있는 폴리머는 생체 적합한 유기 용매에 가용화되며, 여기에 약물이 첨가되면 혼합 후에 용액 또는 서스펜션이 형성된다. 이 제형이 몸에 주입되면, 물과 혼합할 수 있는 유기 용매는 분해되고 물은 유기상으로 침투된다. 이는 주입 부위에서 디폿을 형성하는 폴리머의 상 분리 및 침전을 유도한다. 열 유도 겔화 시스템은 열 가역성 졸/겔 전이를 보여주며, 보다 낮은 임계온도를 가진 용액을 특징으로 한다. 이들은 실온에서 액체이며, 보다 낮은 임계 용액 온도 이상에서 겔을 생성한다. 원 위치 응고 오르가노겔은 물에서 팽창하고 다양한 타입의 친액성(lyotropic) 지질 결정을 형성하는, 불용성의 양친매성 지질을 포함한다.

일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 허혈성 손상 부위로 주입된다. 예를 들어, 직접적인 경피적 천공, 중재적 카테터, 또는 척추 내 주사에 의한 방법을 따른다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물과 함께 코팅된 임플란트, 스텐트 또는 플레이트, 또는 주입된 임플란트를 이용하여 허혈성 손상 부위에 직접적으로 전달된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물이 부착된 혈관 내 스텐트로부터 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물을 천천히 방출함으로써 손상된 허혈성 부위에 직접 전달된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 파지티브 타겟팅 리포솜 또는 수용체-공여체 복합체에 의해 허혈성 손상 부위에 직접적으로 전달된다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 물리 치료 요법, 초음파, 이온삼투압, 초음파 침투 강화, 전기천공법, 및/또는 스폰지 어플리케이션을 이용하여 허혈성 손상 부위에 전달된다. 허혈성 손상 부위에 대한 테트라민 조성물 및/또는 세포의 적용은 국소(예를 들어, 피부를 통해)적 이거나, 신체 표면의 내부에 있는 손상된 조직의 일부 위치일 수 있거나, 둘 모두일 수 있다. 예를 들어, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은 혈관, 내피 세포층 또는 다른 내부 조직을 통해 이온 삼투의 방법으로 허혈성 손상 부위에 전달되어, 조직의 복구에 효과적인 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물의 국소 농도를 제공한다.

일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 지속 방출 조성물은 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물의 조절된 전달을 위해 생분해성 폴리머를 포함한다. 적합한 생분해성 폴리머는 전형적으로 폴리락티드(PLA), 폴리글리코라이드(PGA), 폴리(락티드-코-글리코라이드)(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 폴리글리코네이트, 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리(디옥사논), 그리고 폴리알킬시아노아크릴레이트를 포함한다. 일부 구현에서, 지속된 방출 조성물은, 예를 들어, PLGA 마이크로스피어, PCL 마이크로스피어, 폴리안하이드라이드 마이크로스피어, 폴리오르토에스테르 마이크로스피어, 그리고 폴리알킬시아노아크릴레이트와 같은, 주사 가능한 생분해성 마이크로스피어를 포함한다.

특정 구현에서, 다양한 타입의 구리-함유 화합물이 직접적으로 허혈성 손상 부위에 구리-촉진 조성물의 국소화된 전달을 위해 사용될 수 있다. 적합한 구리 이온-함유 용액의 예는 염화 구리(I), 염화 구리(II), 아세트산 구리 및 황산구리 용액이다. 일부 구현에서, 구리는 단백질, 펩티드, 아미노산, 모노-, 디-, 또는 폴리사카라이드, 하나 혹은 그 이상의 폴리머, 또는 소 분자와 함께 화합물 또는 혼합물을 형성하며, 그 화합물 또는 혼합물은 허혈성 손상 부위에 직접적으로 국소화된 전달을 하는데 사용된다. 일부 구현에서, 구리 이온을 함유하는 유기 금속 화합물이 허혈성 손상 부위에서 직접 국소화된 전달을 위해 사용된다.

일부 구현에서, 손상부위에 국소화된 직접적인 전달을 위해 사용되는 구리-촉진 조성물에서 구리 이온의 농도는 약 5 μM에서 약 10 μM, 약 10 μM에서 약 20 μM, 약 20 μM에서 약 40 μM, 약 40 μM에서 약 60 μM, 약 60 μM에서 약 80 μM, 약 80 μM에서 약 100 μM, 약 100 μM에서 약 200 μM, 약 200 μM에서 약 400 μM, 약 400 μM에서 약 600 μM, 약 600 μM에서 약 800 μM, 약 800 μM에서 약 1 mM, 약 1 mM에서 약 5 mM, 약 5 mM에서 약 10 mM, 약 10 mM에서 약 20 mM, 약 20 mM에서 약 40 mM, 또는 약 40 mM에서 약 60 mM이다. 구리 이온의 농도는 의사 및 임상의에게 친숙한 방법에 따른 임상전시험 및 임상시험 동안에 결정될 수 있다.

구리 및 구리 킬레이트 테트라민

본 명세서에서 제시되는 “구리”, “구리 이온”, 그리고 “구리 요소(copper element)”는 상호 교환적으로 사용 가능하다. 생물학적 시스템에서, 구리 이온은 보통 제1구리의(Cu¹⁺, 구리(I) 또는 환원된) 상태 및 제2구리의(Cu²⁺, 구리(II) 또는 산화된) 상태인 두 가지 산화 상태로 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 제1구리 상태와 제2구리 상태 모두를 포함한다. 일부 구현에서, 구리는 제2구리 상태(Cu²⁺)이다. 일부 구현에서, 구리는 제1구리 상태(Cu¹⁺)이다. 일부 구현에서, 구리는 자유 이온 이다, 즉 단백질 또는 작은 유기 분자와 같은 다른 분자와 결합되거나 복합체를 형성하지 않는다. 일부 구현에서, 구리는 염의 형태로 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 황산 구리, 염화 구리, 산화 구리, 구리 글루코네이트, 그리고 구리 아미노산 킬레이트로부터 선택된 염으로서 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 복합 이온(complexed ion)으로서 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 소 분자 유기 금속 화합물과 같은, 유기 금속 화합물로 존재한다. 일부 구현에서 구리는 구리 킬레이트 테트라민과 복합체로 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 본 개시에 따라 세포, 조직 또는 유기체에 구리를 도입함으로써 생성되는 다양한 종의 이온을 포함하는 복합 이온이다. 일부 구현에서, 구리는 단백질, 펩티드, 아미노산, 또는 모노-, 디-, 또는 폴리사카라이드와 함께 화합물이나 복합체를 형성한다. 생물학적 시스템에서 발견되는 중요한 구리 바인딩 단백질은 이에 한정하는 것은 아니나 시토크롬 c 옥시다아제(CcO), 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(Cu, Zn-SOD), 도파민 β-히드록실라제(DBH), 프리온 단백질(PrP), 티로시나아제, 아포토시스 단백질의 X-관련 억제제(XIAP), 리실 옥시다아제, 메탈로티오네인(MT) 및 세룰로플라스민을 포함한다. 일부 구현에서, 구리는, 예를 들어, 세룰로플라스민과 복합체로 존재하는 것과 같이, 허혈성 조직에 의한 흡수 또는 사용에 이용할 수 없는 형태로 존재한다. 일부 구현에서, 구리는 허혈성 조직에 의한 흡수 또는 사용에 이용할 수 있는 형태로 존재한다. 일부 구현에서, 본 명세서에 개시된 구리는 HIF-1 전사 활성의 유도 인자이다.

상기 기재된 어느 구리 이온 종을 포함하는 구리-촉진 조성물은 본 명세서에서 기재된 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 Cu²⁺를 포함한다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 Cu¹⁺를 포함한다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 염 형태(황산 구리, 염화 구리, 산화 구리, 구리 글루코네이트, 및 구리 아미노산 킬레이트로부터 선택된 어느 것 또는 조합과 같은)의 구리 이온을 포함한다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 유기 금속 화합물을 포함한다. 일부 구현에서, 구리-촉진 조성물은 구리 이온이나 구리 화합물을 포함하지 않는다.

본 명세서에 기재된 어느 방법에 의해 언급되는 “구리 수준(copper level)”은 Cu²⁺, Cu¹⁺, 또는 총 구리의 농도와 같은 상기 언급된 어느 하나의 구리 종(예를 들어, Cu¹⁺ 및 Cu²⁺, 및/또는 자유 또는 바인딩된 구리)의 농도를 나타낸다. 일부 구현에서, 구리 수준은 제2구리 상태의 수준을 지칭한다. 일부 구현에서, 구리 수준은 허혈성 조직에서 흡수 또는 사용이 가능한 형태로 존재하는 구리의 수준을 지칭한다.

“구리 킬레이트 테트라민”은 구리 바인딩 또는 킬레이트 테트라민 화합물을 지칭한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 Cu²⁺와 바인딩한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 Cu¹⁺와 바인딩한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 Cu¹⁺보다 Cu²⁺에 특이적(즉, 보다 높은 친화력을 갖는다)이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 사각 평면, 왜곡된 사각 평면, 삼각뿔-피라미드, 사각 피라미드, 또는 왜곡된 팔면체 구조의 형태로 구리 이온과 복합체를 형성한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 세포 또는 유기체에서 Cu¹⁺ 과 Cu²⁺ 사이의 평형을 변화시킨다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 개체의 구리 수준(총 구리 수준과 같은)을 변화(감소와 같은)시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 개체의 혈액 내 구리 수준(총 구리 수준과 같은)을 변화(감소와 같은)시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 세포 내의 구리 수준(총 또는 제2구리 수준과 같은)을 증가시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 개체의 허혈성 조직에 이용 가능한 형태로 구리의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 세포 내 트래피킹 및/또는 조직 간 또는 기관 간 구리 수송을 방향 전환(redirecting)시킬 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 허혈성 심장 조직과 같은 허혈성 조직에 특이적으로 바이니딩하며, 그리고/또는 허혈성 심장 조직과 같은 허혈성 조직에 의해 흡수된다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(구리와의 복합체를 포함하여)은 멤브레인을 투과할 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민(구리와의 복합체를 포함하여)은 지용성(liposoluble)이다. 일부 구현에서, 이의 복합체에서 구리 킬레이트 테트라민 대 구리의 화학양론은 약 1:1이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 구리에 가역적으로 바인딩한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 허혈 조직에서 세포 내부에 충분히 낮은 친화성을 갖는 구리 이온에 바인딩하며, 이는 구리 이온의 언로딩이나 해리를 가능하게 한다.

세포 내 구리 수준을 증가시킬 수 있는 어느 구리 킬레이트 테트라민이 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 구리 킬레이트 테트라민은 화합물 그 자체, 이의 약학적으로 허용되는 염, 활성 대사물, 유도체 및 프로드럭뿐만 아니라, 입체이성질체, 거울상 이성질체, 라세미혼합체, 및 적용가능한 어느 유사물을 지칭할 수 있다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 선형이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 분지형이다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 고리형이다. 일부 구현에서 구리 킬레이트 테트라민은 트리에틸렌테트라민(2,2,2-테트라민), 2,3,2,-테트라민, 및 3,3,3-테트라민으로부터 선택된다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴이다. “트리엔틴(trientine)”은 또한 트리에틸렌테트라민, 2,2,2-테트라민, N, N'-비스(2-아미노에틸)-1,2-에탄디아민, 1,8-디아미노-3,6-디아자옥탄, 3,6-디아자옥탄-1,8-디아민, 1,4,7,10-테트라아자데칸, 트리엔, TETA, TECZA, N,N'-비스(아미노에틸)에틸렌디아민, N,N'-비스(2-아미노에틸)에텐디아민, 및 N,N'-비스(2-아미노에틸)-에틸렌디아민을 지칭한다. 일부 구현에서, 트리엔틴은 화학식: NH₂(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH(CH₂)₂NH₂ 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 화합물이다.

유사한 구리 킬레이트 성질을 갖는 다른 구리 킬레이트 테트라민은 이에 한정하는 것은 아니나, 화학식 (II)의 화합물, 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다:

화학식 (II)

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 화학식 (II)의 비고리형 화합물이며, 여기서 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 H, CH₃, C2-C10 직쇄 또는 분지형 알킬, C3-C10 시클로알킬, C1-C6 알킬 C3-C10 시클로알킬, 아릴, 모노, 디, 트리, 테트라 및 펜타 치환된 아릴, 헤테로아릴, 융합된 아릴, C1-C6 알킬 아릴, C1-C6 알킬 모노, 디, 트리, 테트라 및 펜타 치환된 아릴, C1-C5 알킬 헤테로아릴, C1-C6 알킬 융합된 아릴, CH₂COOH, CH₂SO₃H, CH₂PO(OH)₂, CH₂P(CH₃)O(OH)로부터 독립적으로 선택되며; n1, n2, 및 n3은 2 또는 3으로 독립적으로 선택되며; 그리고, R7, R8, R9, R10, R11, 및 R12는 H, CH₃, C2-C10 직쇄 또는 분지형 알킬, C3-C10 시클로알킬, C1-C6 알킬 C3-C10 시클로알킬, 아릴, 모노, 디, 트리, 테트라, 및 펜타 치환된 아릴, 헤테로아릴, 융합된 아릴, C1-C6 알킬 아릴, C1-C6 알킬 모노, 디, 트리, 테트라 및 펜타 지환된 아릴, C1-C5 알킬 헤테로아릴, C1-C6 알킬 융합된 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 또한, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 R6 중 하나 또는 여러 개는 예를 들어, 펩티드, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 및 그 구조물의 전반적인 약동학, 전달 가능성 및/또는 반감기를 개질하기 위한 기타 이러한 화학적 엔티티(chemical entities)에 대한 접착을 위해 기능화(functionalized)될 수 있다. 그러한 기능화의 예에는 이에 한정하는 것은 아니나 C1-C10 알킬-CO-펩티드, C1-C10 알킬-CO-단백질, C1-C10 알킬-CO-PEG, C1-C10 알킬-NH-펩티드, C1-C10 알킬-NH-단백질, C1-C10 알킬-NH―CO-PEG, C1-C10 알킬-S-펩티드, C1-C10 알킬-S-단백질이 포함된다. 더욱이, R7, R8, R9, R10, R11, 또는 R12 중 하나 또는 여러 개는 예를 들어, 펩티드, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 및 구조물의 전반적인 약동학, 전달 가능성 및/또는 반감기를 개질하기 위한 기타 이러한 화학적 엔티티에 대한 접착을 위해 기능화될 수 있다. 그러한 기능화의 예에는 이에 한정하는 것은 아니나 C1-C10 알킬-CO-펩티드, C1-C10 알킬-CO-단백질, C1-C10 알킬-CO-PEG, C1-C10 알킬-NH-펩티드, C1-C10 알킬-NH-단백질, C1-C10 알킬-NH―CO-PEG, C1-C10 알킬-S-펩티드, C1-C10 알킬-S-단백질이 포함된다.

일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민은 화학식 (II)의 고리 화합물이며, 여기서 R1 및 R6은 서로 연결되어 브릿지 그룹(CR13R14)_n4를 형성하며, 그리고 여기서 R2, R3, R4, 및 R5는 H, CH₃, C2-C10 직쇄 또는 분지형 알킬, C3-C10 시클로알킬, C1-C6 알킬 C3-C10 시클로알킬, 아릴, 모노, 디, 트리, 테트라 및 펜타 치환된 아릴, 헤테로아릴, 융합된 아릴, C1-C6 알킬 아릴, C1-C6 알킬 모노, 디, 트리, 테트라 및 펜타 치환된 아릴, C1-C5 알킬 헤테로아릴, C1-C6 알킬 융합된 아릴, CH₂COOH, CH₂SO₃H, CH₂PO(OH)₂, CH₂P(CH₃)O(OH)로부터 독립적으로 선택되며; n1, n2, 및 n3은 2 또는 3이 되도록 독립적으로 선택되며; 그리고, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 및 R14는 H, CH₃, C2-C10 직쇄 또는 분지형 알킬, C3-C10 시클로알킬, C1-C6 알킬 C3-C10 시클로알킬, 아릴, 모노, 디, 트리, 테트라, 및 펜타 치환된 아릴, 헤테로아릴, 융합된 아릴, C1-C6 알킬 아릴, C1-C6 알킬 모노, 디, 트리, 테트라, 및 펜타 치환된 아릴, C1-C5 알킬 헤테로아릴, C1-C6 알킬 융합된 아릴로부터 독립적으로 선택된다. 또한, R2, R3, R4, 또는 R5는 예를 들어, 펩티드, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 및 구조물의 전반적인 약동학, 전달 가능성 및/또는 반감기를 개질하기 위한 기타 그러한 화학적 엔티티에 대한 접착을 위해 기능화될 수 있다. 그러한 기능화를 위한 예에는 이에 한정하는 것은 아니나 C1-C10 알킬-CO-펩티드, C1-C10 알킬-CO-단백질, C1-C10 알킬-CO-PEG, C1-C10 알킬-NH-펩티드, C1-C10 알킬-NH-단백질, C1-C10 알킬-NH―CO-PEG, C1-C10 알킬-S-펩티드, C1-C10 알킬-S-단백질이 포함된다. 더욱이, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 및 R14 중 하나 또는 여러 개는 예를 들어, 펩티드, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 및 구조물의 전반적인 약동학, 전달 가능성 및/또는 반감기를 개질하기 위한 기타 그러한 화학적 엔티티에 대한 접착을 위해 기능화될 수 있다. 그러한 기능화를 위한 예에는 이에 한정하는 것은 아니나 C1-C10 알킬-CO-펩티드, C1-C10 알킬-CO-단백질, C1-C10 알킬-CO-PEG, C1-C10 알킬-NH-펩티드, C1-C10 알킬-NH-단백질, C1-C10 알킬-NH―CO-PEG, C1-C10 알킬-S-펩티드, C1-C10 알킬-S-단백질이 포함된다.

“약학적으로 허용되는 염(pharmaceutically acceptable salts)”은 무기 또는 유기 염기 및 무기 또는 유기 산 등을 포함하는 약학적으로 허용되는 무독성 염기 또는 산으로부터 제조된 염을 지칭한다. 예를 들어, 화합물이 염기일 때, 염은 유기 및 무기 산을 포함하는 약학적으로 허용되는 무독성 산으로부터 제조될 수 있다. 그러한 산은 예를 들어, 아세트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄포술폰산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루콘산, 글루탐산, 브롬화수소산, 염산, 이세티온산, 젖산, 말레익산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 점액산, 질산, 팜모산, 파토텐산, 인산, 숙신산, 황산, 타르타르산, p-톨루엔술폰산 등을 포함한다. 일부 구현에서, 구리 킬레이트 테트라민의 약학적으로 허용되는 염은 염산 염(예를 들어, 트리에틸렌테트라민 디하이드로클로라이드), 숙신산 염(예를 들어, 트리에틸렌테트라민 디숙시네이트), 말레이트 염(예를 들어, 트리에틸렌테트라민 테트라말레이트) 및 푸마레이트 염(예를 들어, 트리에틸렌테트라민 테트라푸마레이트)으로부터 선택된다. 트리엔틴과 같은 구리 킬레이트 테트라민은 또한 질소 원자가 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 아르알킬 부(moiety)와 같은 적합한 유기기를 운반하는 4가 암모늄 염의 형태로 존재할 수 있다. 구리 킬레이트 테트라민의 대사물은 이에 한정하는 것은 아니나 N-아세틸 트리에틸렌테트라민(예를 들어, 모노아세틸-트리에틸렌테트라민)과 같은 아세틸화 대사물을 포함한다. 구리 킬레이트 테트라민의 유도체는 이에 한정하는 것은 아니나 PEG-개질된 테트라민(트리엔틴-PEG과 같은)을 포함한다.

트리엔틴을 포함하는 구리 킬레이트 테트라민은 당업계에 공지된 다양한 화학합성, 분리, 및 정제 방법 중 어느것을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [미국특허 제4,806,517호, 미국특허 제4,550,209호, 미국특허 제5,225,599호, 미국특허 제4,766,247호, 유럽특허 제EP262562호, 미국특허 제8,394,992호, 및 미국특허공개 제US20130108709 A1]를 참조바란다.

허혈성 조직 손상을 가진 개체

본 명세서에 기재된 "허혈성 조직 손상(ischemic tissue injury)"은 예를 들어, 심혈관, 간, 뇌, 골격근 등을 포함하는 조직의 손상을 말하며, 이는 조직으로의 혈액 공급을 제한하여, 조직에서 세포성 대사에 필요한 산소 및 포도당의 부족을 일으킨다. 손상은 혈류의 방해를 초래하는 외부의 힘에 의한 다수의 병리학적 컨디션 또는 트라우마 중 어느 것을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 심혈관 허혈이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 대뇌 허혈 또는 허혈성 뇌졸중이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 하지 허혈과 같은 사지 허혈이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 허혈성 장염 또는 장간막 허혈과 같은 대장 허혈이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 피부 허혈이다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 색전증, 혈전증, 동맥류, 트라우마, 심근경색증, 승모판막질환, 만성 심방세동, 심근병증, 의지(prosthesis), 흉곽 출구 증후군, 죽상경화증, 저혈당, 심박 급속증, 저혈압, 종양의 혈관압박, 겸상적혈구증, 동상, 동정맥 기형, 말초 동맥 폐쇄성 질환, 중요 혈관의 파열, 빈혈, 당뇨, 당뇨병성 발 궤양, 괴사성 장염, 궤양성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환, 재협착(혈관 성형술 또는 스텐트 삽입술), 또는 췌장염과 관련된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 심근병증과 관련된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 심근경색과 관련된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직 손상은 당뇨병과 관련된다.

따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 허혈성 조직 손상을 포함하는 많은 질병에 적용 가능하다. 이들은 이에 한정하는 것은 아니나 심근 경색증, 심근 병증, 동맥류, 협심증, 대동맥 협착증, 대동맥염, 부정맥, 동맥 경화증, 동맥염, 비대칭 중격 비대증(ASH), 죽상 동맥 경화증, 심방 세동 및 조동, 세균성 심내막염, 발로우 증후군(승모판일탈증후군), 서맥, 버거병(폐색성혈전혈관염), 심장비대증, 심장염, 경동맥, 대동맥 협착, 선천성 심장병, 울혈성 심부전, 관상동맥 질병, 아이젠멘거 증후군, 색전증, 심장내막염, 피부홍통증, 섬유성 연축, 섬유근육형성이상증, 심장블록, 심장잡음, 고혈압, 저혈압, 특발성 영아 동맥 석회화, 가와사키병(급성열성피부점막 림프절증후군, 점액피부림프절증후군, 영아 다발 동맥염), 대사 증후군, 미세혈관 협심증, 심근염, 발작성 심방빈막(PAT), 결절성동맥주위염(다발 동맥염, 결절성다발동맥염), 심막염, 말초혈관병, 중증 사지 허혈증, 정맥염, 폐동맥판 협착증(폐동맥판협착), 레이노드 병, 신장 동맥 협착, 신혈관성고혈압, 　류마티스 성 심장병, 당뇨병 성 혈관 병증, 중격 결손, 무증상 허혈, X 증후군, 빈맥, 타까야수동맥염, 팔로의 4징후, 　대혈관 전위증, 삼첨판 폐쇄증, 동맥간, 판막 심장 질환, 정맥류 궤양,　정맥류, 혈관염, 심실 중격 결손, 울프-파킨슨-화이트 증후군, 심내막상결손증, 급성 류마티스 열, 급성 류마티스성 심낭염, 급성 류마티스성 심내막염, 급성 류마티스성 심근염, 만성 류마티스성 심장 질환, 승모판 질환, 승모판 협착증, 류마티스성 승모판 부전증, 대동맥 판막 질환, 다른 심근 구조의 질병, 허혈성 심장 질환(급성 및 아급성), 협심증, 급성 폐 심장 질환, 폐 색전증, 만성 폐 심장 질환, 척추 측만증 성 심장병, 심근염, 심장 내막염, 심근 섬유증, 심장 내막 섬유 아세포증, 방실 차단, 심장 부정맥, 심근 변성, 뇌 혈관 질환, 동맥 질환, 세동맥 및 모세 혈관, 또는 정맥 및 림프관 질환; 후천적 뇌 손상, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중(허혈성, 뇌내 출혈, 지주막 하 출혈 포함), 무산소 상처, 대사 장애, 뇌염, 감염으로 인한 뇌 손상 등을 포함한다. 특정 구현에서, 허혈성 조직 손상을 포함하는 질병은 전신성 유육종증, 피부질환 또는 컨디션, 로프그렌 증후군, 폐 질환 또는 컨디션, 심장 질환 또는 컨디션, 눈 질환 또는 컨디션, 간 질환 또는 컨디션, 근골격계 질환 또는 컨디션, 및 신장 질환 또는 컨디션을 포하한다. 따라서 본 출원은 또한 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 임의의 질병을 치료하는 것을 포함한다.

본 명세서에 기재된 "개체(individual)", "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 소, 황소, 양, 염소, 말, 원숭이 및 기타 비-인간 영장류 및 인간과 같은 포유류, 물고기와 같은 척추 동물 및 닭과 같은 조류를 나타낸다. 포유류는 농장동물, 스포츠동물, 설치류 동물 및 애완 동물을 포함한다. 일부 구현에서, 개체는 인간이다.

본 명세서에 기재된 방법은 이에 한정하는 것은 아니나 허혈성 심근 손상, 허혈성 뇌 손상, 허혈성 척수 손상, 허혈성 근육 부상, 허혈성 골격 손상, 급성 관상 괴사, 허혈성 장 손상, 허혈성 폐 손상, 허혈성 간 손상, 허혈성 신장 손상, 허혈성 피부 손상, 탈장, 혈관 문합, 죽상경화판, 혈관종, 무딘 또는 침투성 외상 후 손상을 포함하는 하나 또는 그 이상의 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에 적용할 수 있다.

본 명세서에 기재된 어느 방법에 따르는 일부 구현에서, 개체는 손상된(compromised) 조직 복구 시스템을 갖지 않다. 일부 구현에서, 개체는 손상된 조직 복구 시스템을 갖는다. 조직 복구 시스템을 갖는 개체는 다음과 같은 특징 중 적어도 하나 이상을 가질 수 있다. (a) 고령(예를 들어, 적어도 약 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 그 이상 중 어느 것을 포함하는 적어도 약 60세와 같은); (b) 만성적인 조직 손상(적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 또는 24 개월 중 어느 기간 동안 조직 손상을 입은 개체와 같은); (c) 줄기세포의 결핍; (d) 줄기세포의 이동(예를 들어, 호밍와 같은)의 결핍; (e) 조직 회복 시스템의 결함; 그리고 (f) 다음에 해당하는 증상이나 컨디션 중 하나 이상: 기억의 상실, 운동능력(이에 한정하는 것은 아니나 힘 능력, 속도 내구성, 유연성, 및 관절의 운동성을 포함함)의 저하 또는 감소, 감각저하, 근력약화, 청력상실 및 만성적인 염좌.

일부 구현에서, 개체는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 또는 그 이상의 나이 중 어느 하나다. 일부 구현에서, 개체는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80의 나이 중 어느 하나보다 어리다. 일부 구현에서, 개체는 만성적인 허혈증을 가지고 있다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 조직(예를 들어, 허혈성 심근 같은)에서 혈액 순환으로 구리의 유출이 있다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 조직의 구리 수준이 감소(1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%중 어느 하나 이하 같은)된다. 일부 구현에서, 허혈성 조직에서 구리 레벨의 감소는 만성적인 허혈성 컨디션에 의해 야기된다. 일부 구현에서, 개체는 HIF-1 전사 활성이 억제된다.

일부 구현에서, 개체는 세포 내 구리 수준, 세포 외 구리 수준, 총 구리 수준 및 혈청(즉, 혈액)의 구리 수준과 같은 그 또는 그녀의 구리 수준에 기초하여 치료를 위해 선택된다. 만성적인 허혈 컨디션을 겪는 개체는 주로 허혈성 조직에서 낮은 세포 내 구리 수준을 갖는데, 이는 건강한 개체의 해당 조직에서의 평균 세포 내 구리 수준의 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 그 미만 중 어느 것보다 적은 수준이다. 만성적인 허혈 컨디션을 겪는 개체는 혈청의 구리 레벨은, 예를 들어, 혈청의 총 구리 수준, 혈청에서 단백질(예를 들어, 세룰로플라스민 같은)이 바인딩된 구리 수준, 또는 혈청에서 자유로운(즉, 결합하지 않은) 구리 수준, 건강한 개체의 혈청에서의 평균 구리 수준보다 높다(약 1.2배, 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배, 또는 그 이상 중 하나와 같은). 일부 구현에서, 테트라민 조성물을 투여하기 전에 개체는 혈청에서 적어도 약 60 g/dL, 70 g/dL, 80 g/dL, 90 g/dL, 100 g/dL, 110 g/dL, 120g/dL, 130g/dL, 140g/dL, 150 g/dL, 175 g/dL, 200 g/dL, 250 g/dL, 300 g/Dl 또는 그 이상의 총 구리 수준 중 어느 것을 갖는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 투여 전, 개체는 건강한 개체의 혈청에서 평균 총 구리 수준의 약 1배, 1.2배, 1.5배, 1.75배, 또는 2배 중 어느 것 이하를 갖는다. 일부 구현에서, 개체에 테트라민 조성물을 투여하기 전, 혈청에서 총 구리 수준은, 약 60 g/dL, 70 g/dL, 80 g/dL, 90 g/dL, 100 g/dL, 110 g/dL, 120g/dL, 130g/dL, 140g/dL, 150 g/dL, 175 g/dL, 200 g/dL, 250 g/dL, 300 g/dL 중 어느 것 이하이다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물의 투여 시, 개체는 건강한 개체의 혈청에서 평균 총 구리 수준의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 중 어느 것을 갖는다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 투여 시, 개체는 적어도 약 60 g/dL, 70 g/dL, 80 g/dL, 90 g/dL, 100 g/dL, 110 g/dL, 120g/dL, 130g/dL, 140g/dL, 또는 150 g/dL의 혈청 중 총 구리 수준 중 어느 것을 갖는다.

일부 구현에서, 개체는 그 또는 그녀의 HIF-1 활성 수준에 기초하여 치료를 위해 선택된다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 조직의 HIF-1 표적 유전자의 억제된 전사 활성을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 허혈성 조직에서 HIF-1αα의 높은 수준(예를 들어, 단백질 또는 RNA 수준과 같은)을 가지나, 허혈성 조직에서 HIF-1 표적 유전자의 억제된 전사 활성을 갖는다. 일부 구현에서, 개체는 억제된 HIF-1의 활성을 일으키는 만성적인 허혈을 갖는다.

키트, 및 제조 물품

본 출원은 또한 본 명세서에서 기술된 어느 방법에서 사용하기 위한 키트, 의약품, 조성물 및 단위 투여 형태를 제공한다.

본 명세서에서 제공되는 키트는 본 명세서에 기술된 테트라민 조성물(약학 조성물을 포함함) 및/또는 다른 제제(들) 중 어느 하나를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하며, 일부 구현에서는, 본 명세서에서 기술된 어느 방법에 따른 사용 설명서를 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 설명은 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트와 같은) 상에 기재된 설명이지만, 기계-판독이 가능한 설명(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크로 운반되는 설명과 같은)이 또한 허용된다.

예를 들어, 일부 구현에서, 키트는 a) 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 테트라민 조성물; 및 선택적으로 b) 허혈성 조직 손상과 관련된 질병 또는 컨디션의 치료를 위한 테트라민 조성물 투여용 설명서를 포함한다.

일부 구현에서, 키트는 a) 구리 킬레이트 테트라민(트리엔틴과 같은) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 테트라민 조성물; b) 구리 이온(CuSO₄ 또는 CuCl₂과 같은) 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 구리-촉진 조성물; 및 선택적으로 c) 허혈성 조직 손상과 관련된 질병 또는 컨디션의 치료를 위한 상기 테트라민 조성물 및 구리-촉진 조성물 투여용 설명서를 포함한다.

본 발명의 키트는 적합하게 포장되어 있다. 적합한 포장은 이에 한정하는 것은 아니나 바이알, 병, 단지, 연질 포장(예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 가방과 같은)을 포함한다. 키트는 버퍼나 해석상의 정보와 같은 추가적인 구성요소에 대해서 선택적으로 제공한다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알(밀봉된 바이알과 같은), 병, 단지, 연질 포장 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

일부 구현에서, 키트는 테트라민 조성물, 구리-촉진 조성물 및/또는 추가적인 치료제를 개체에게 전달하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 성분들을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현에서, 키트는 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물을 개체에게 병변 내의 전달을 용이하게 하는 성분들을 포함한다. 일부 구현에서, 키트는, 예를 들어, 개체에게 세포를 전달하기에 적합한 주사기 및 바늘 등을 포함한다. 이러한 구현에서, 테트라민 조성물, 및/또는 구리-촉진 조성물은 가방 또는 하나 이상의 바이알 안의 키트에 함유될 수 있다. 일부 구현에서, 키트는 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물을 개체에게 정맥 내 또는 동맥 내 전달을 용이하게 하는 성분을 포함한다. 일부 구현에서, 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물은, 예를 들어, 병 또는 가방(예를 들어, 세포를 포함하는 약 1.5L까지의 용액을 함유할 수 있는 혈액 가방 또는 유사한 가방 같은)을 포함하며, 키트는 테트라민 조성물 및/또는 구리-촉진 조성물을 개체에 전달하기 위한 적합한 튜빙 및 바늘을 추가적으로 포함한다.

일반적으로 조성물의 사용에 관한 설명은, 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 투여량, 벌크 포장(예를 들어, 다중 투여 패키지) 또는 부-단위 투여일 것이다. 예를 들어, 1주일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월, 또는 그 이상의 기간 중 어느 것과 같은 연장된 기간 동안 개체의 효과적인 치료를 제공하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 구리 킬레이트 테트라민의 충분한 투여량을 함유하는 키트가 제공될 수 있다. 키트는 또한 약학적 조성물의 다중 단위 투여량 및 사용 설명서를 포함할 수 있으며 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국 같은 약국에서 저장하고 사용하기에 충분한 양으로 포장된다.

또한 본 명세서에 기술된 방법에 유용한 의약, 조성물 및 단위 투여 형태가 제공된다.

하기의 비제한적인 실시예는 본 발명의 조성물 및 방법을 추가적으로 설명한다. 당업자는 본 발명의 범위 및 사상 내에서 여러 구현이 가능함을 인식할 것이다. 본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예를 참고하여 보다 상세히 기술될 것이다. 하기의 실시예는 본 발명을 추가적으로 설명하지만, 물론 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로 한정하는 것으로 이해해서는 안된다.

실시예

실시예 1: 트리엔틴과 구리 이온의 복합체의 결정구조

트리엔틴 디클로라이드, 구리 이온, 물을 포함하는 복합체를 결정화하였다. 적합한 단일 결정(150116_s2_lzh_m)을 선택한 후, 엑스칼리버 에오스 회절분석기의 단일 결정을 사용하여 X선 회절 데이터를 수집하였다. 결정은 데이터 수집 중에 143.00 -143.10 K에서 유지되었다. Olex2(Dolomanov et al., (2009) J. Appl. Cryst. 42: 339-341)를 사용하여, 이 구조는 차지 플립핑(Charge Flipping)을 사용하는 Superflip(Palatinus et al., (2008) J. Appl. Cryst. 41: 975-98); ShelXL(Sheldrick GM(2008) Acta Cryst. A64: 112-122) 구조 솔루션 프로그램을 통해 분해(solved)되었으며, 리스트 스퀘어의 최소화된 알고리즘을 사용하는 정제 패키지인 ShelXL (Sheldrick G.M. (2008) Acta Cryst. A64: 112-122)로 정제되었다. 각 단위 세포에서 복합체의 실헙식은 C₆H₂₀Cl₂CuN₄O로 결정되었다. 정제된 결정구조 및 그의 파라미터는 도 1-3 및 4a-4c에 나타난다.

실시예 2: 트리엔틴 및 트리엔틴-구리 복합체에 의한 구리의 심근세포로의 세포 내 전달

이 실시예는 트리엔틴 및 트리엔틴-구리 복합체에 의한 심근세포로의 시험관 내(in vitro) 구리 전달 분석을 기술한다. 실험 절차의 흐름도는 도 5에 나타낸다.

신생아 래트의 심근세포의 일차 배양은 에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 무-혈청의 Dulbecco의 DMEM(modified Eagle medium)에서, 37℃, 10% CO₂에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 그 세포는 무-혈청의 DMEM으로 옮겨졌고, 그 세포들을 다섯 개의 실험 그룹(하나의 컨트롤 그룹과 4개의 처리 그룹)으로 나누기 전에 37℃, 10% CO₂에서 12시간 동안 배양하였다. 컨트롤 그룹에서, 세포는 37℃, 10% CO₂, 무-혈청의 DMEM에서 추가적으로 6시간 동안 배양하였다. 4개의 처립 그룹에서, 세포는 각각 CuCl₂ 단독, 트리엔틴 단독, 트리엔틴-구리 복합체, 및 트리엔틴과 CuCl₂의 혼합물로각각의 10 μM의 트리엔틴 및/또는 10 μM 의 구리의 최종농도로 하여 37℃, 10% CO₂에서 6시간동안 배양하였다. 트리엔틴-구리 복합체는 인 하우스에서 합성되었으며 질량분석 및 X선 회절(XRD)에 의해 특징지어졌다. 트리엔틴-구리 복합체는 실시예 1에 기재된 바와 같은 조성 및 구조를 가졌다. 트리엔틴과 구리의 혼합물은 그 혼합물을 신생아 래트의 심근 세포를 치료하는데 사용하기 전에, 37℃에서 24시간동안 동일한 몰의 트리엔틴과 CuCl₂를 10 μM의 최종농도로 무-혈청의 DMEM에 첨가하여 제조하였다.

치료 후에, 세포는 셀 스크레퍼에 의해 수집되었으며, 10Mm EDTA(Sigma, USA)가 포함된 아이스-콜드 PBS로 3회 세정하여 세포 외 구리가 완전히 제거되는 것을 확실히하였으며, 3000rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 세포 펠렛은 1% SDS 용액(Beyotime, CN)을 사용하여 용해시켰다. 용해물은 두 부분으로 나뉘었다. 일부는 50℃에서 72시간 동안 농축 질산으로 분해하고 흑연로 원자 흡수법 분광광도계를 이용하여 분석하여 세포 내 구리 농도를 평가하였다. 또 다른 일부는 바이신코닉산(Bicinchoninic Acid)(BCA) 단백질 분석법(Bio-Rad, USA)에 의해 총 단백질 농도를 측정하는데 사용되었다. 각 처리 그룹의 세포 내 구리 농도는 총 단백질 농도로 표준화되었다.

도 6은 5개의 실험 그룹의 표준화된 세포 내 구리 농도를 보여준다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었다. 초기 분석에는 일방적인 분산 분석(one-way analysis of variance)을 사용했으며, 여러 그룹 간의 비교에는 Student-Newman-Keuls를 사용했다. 실험 그룹 간의 차이는 P <0.05에서 유의한 것으로 간주되었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 컨트롤 그룹과 비교하여, 트리엔틴-구리 복합체(즉, Cu-트리엔틴) 처리 그룹 및 트리엔틴과 CuCl₂의 혼합물(즉, Cu+트리엔틴) 처리 그룹의 세포 내 구리 농도가 유의하게 증가하였으며, 두 그룹의 세포 내 구리 농도의 증가는 CuCl₂ 단독 처리보다 더 두드러졌다. 특히, 트리엔틴과 CuCl₂의 혼합물(즉, Cu+트리엔틴)은 시험된 모든 조건 중에서 세포 내 구리 농도의 최대 증가를 유도하였고, 이는 트리엔틴이 높은 구리 수준을 갖는 세포 환경으로부터 구리를 심근세포로 이동시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 3. 병리학적 심근 비대 래트 모델에서 트리엔틴 치료

이 실시예는 병리학적 심근 비대를 가진 Sprague-Dawley 래트에서 트리엔틴 치료의 효과를 평가하기 위한 생체 내(in vivo) 실험을 기술한다. 병리학적 심근 비대 래트 모델은 상행 대동맥 협착 수술에 의해 확립되었다. 도 7은 실험 절차의 흐름도이다.

1.1 래트에서 병리학적 심장 비대의 확립

수술 절차 전에, 모든 개체는 10% 클로랄 수화물(0.35 mg/kg)를 복강 내 주사하여 진정을 유도하였다. 왼쪽 가슴을 덮고있는 털은 수술을 위해 완전히 면도하였다. 환기를 위해 기관 내 삽관이 도입되었다. 1.2mL에서 1.5mL의 1회 호흡량을 달성하기 위해 보조호흡이 시행되었다. 호흡률은 거의 80/분이었고, 흡기/호기의 비율은 1:1이었다.

수술 중, 래트의 위치를 우측 외측 둔부에 맞추고, 래트를 입체현미경 아래에 두었다. 수술 부위는 무균 방식으로 격리되었다. 격리는 한 조각의 일회용 멸균 드레이프로 수행하였다.

수술 부위는 좌측 두 번째 늑간격의 선에서 약간 내측으로 절단되었고, 가슴 뼈 끝의 좌측에서 바깥쪽으로 1-1.5cm의 횡 절개가 이루어졌다. 피하조직과 근육 평면은 늑막 아래로 절개되었으며, 늑막 공간으로 들어갔다. 면봉을 삽입하여 늑막 공간을 청소하고 폐의 손상을 막기 위해 수술 부위에서 폐를 밀어내었으며, 그 다음 가슴을 열고 흉선과 지방을 노출 시키기 위해 견인기로 늑간 절개를 넓혔다.

흉선과 지방을 절개한 후, 좌심방 부속기관의 상부에 주요 혈관이 노출 되었다. 대동맥의 상행 부분은 우측의 폐동맥 트렁크로부터 해부되었다. 축(constriction) 부위는 대동맥 판막과 무명 동맥 사이의 상행 대동맥에 위치하였다.

상행 대동맥은 20 게이지 바늘(O.D. 0.9mm)로 수축되었다. 상행 대동맥과 바늘은 6-0수술용 나사의 단일 조각을 사용하여 묶었다. 그 다음 바늘은 내강에 협착 대동맥을 제공하기 위해 즉시 제거하였다. 수축 후, 좌심실과 좌측 외이가 부었다.

가슴을 닫기 전에, 가슴 견인기를 제거하고, 흉선과 지방은 이의 정상 위치로 되돌려 놓았다. 두 번째 및 세 번째 갈비뼈를 2개의 3-0 나일론 봉합선으로 모아 흉강을 봉합하였다. 출혈과 기흉을 피하기 위해, 갈비뼈 봉합 시 확장된 심장을 관통하고 폐를 손상시키지 않도록 주의를 기울였다. 폐는 늑막 절개를 닫는 동안 손가락을 사용하여 1-2초 동안 인공 호흡기의 유실을 멈춤으로써 다시 부풀어 올랐고, 그 결과 공기는 흉강에서 공기가 배출될 수 있었다. 늑막 절개가 닫힌 후, 근육 및 피부 절개는 5-0 실크 봉합으로 층을 형성하여 닫고, 살균 방식으로 세척하였다. 자발적인 호흡이 회복된 후에 기관 내 튜브를 철회하였다. 수술 수 통증을 완화시키기 위해 진통제인 데조신(0.8mg/kg)을 근육 내로 그 다음 이틀 동안 1일 1회 투여하였다.

1.2 심초음파

래트는 심초음파 측정을 위해 10%의 클로랄 수화물(0.35mg/kg)을 복강 내 주사하여 진정되었다. 대동맥 협착 수술 후 4개월과 트리엔틴 처리 후 1, 3 및 5주에, 11.5-MHz 변환기(Vivid 7 Dimension, GE)를 사용하여 일련의 심 초음파 검사를 시행하였다. 심실 중격 깊이(LVSD)와 좌심실 후부 벽 깊이(LVPWD)는 2-차원 모드를 사용하여 단축 단면적과 좌심실의 길이를 측정하여 얻어졌다.

좌심실의 박출률(EF)와 수축률(FS)은 심슨의 단일-평면 방법으로 평가하였다. 좌심실 확장기말 용적(LVEDV), 수축기말 용적(LVESV), 확장기말 내부 지름(LVID_d) 및 수축기말 내부 지름(LVID_s)은 직접 기록되었다. EF와 FS는 다음의 식으로 계산되었다: EF = (LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%, FS = (LVID_d-LVID_s)/LVID_d×100%

1.3 트리엔틴 처리

수술 후 4개월에, 좌심실 동심 비대 및 심근 간질 섬유증이 관찰되었다. 병리학적 심장 비대 모델의 확립은 심장 형태 및 기능의 초음파 평가에 의해 확인되었다. 트리엔틴 처리는 병리학적 심장 비대 상태를 확인한 후 시작하였다. 대동맥 상행 수축(ACC) 그룹은 컨트롤 그룹(NS 그룹)과 두 개의 트리엔틴 처리 그룹(Tr(H) 그룹과 Tr(L) 그룹)의 3 그룹으로 나누었다. 모의 그룹의 래트는 대동맹 상행 수축의 단계를 제외하고는 동일한 외과 수술을 받았다. 모의 그룹의 래트는 또한 컨트롤 그룹(NS RNS)과 2개의 트리엔틴 처리 그룹(Tr(H) 그룹과 Tr(L) 그룹)의 3 그룹으로 나누었다. 컨트롤 그룹의 래트는 식염수 처리를 하였다. 트리엔틴 처리 그룹에서는 트리엔틴을 하루 2회 경구투여하였다. 45 mg/kg/일(Tr(H) 그룹) 및 90 mg/kg/일(Tr(L) 그룹)인 트리엔틴의 2회 복용량(트리엔틴 디하이드로클로라이드를 기준으로 계산된 복용량)이 투여되었다. 처리는 6주 동안 계속되었다.

본 실시예의 다음 섹션에서의 실험 절차 및 결과는 필수적으로 트리엔틴 디하이드로클로라이드로 구성된 트리엔틴 조성물에 의한 처리에 초점을 둔다. 동일함 실험 프로토콜은 래트 모델에서 심장 비대를 치료하기 위한 다른 트리엔틴 조성물의 치료 효과를 평가하는데 사용된다. 예를 들어, 한 가지 실험에서, 트리엔틴 처리에 추가적으로, 트리엔틴 처리 그룹의 ACC 래트에 6주간 매일 54mg/kg의 투여량으로 경구용 구리 보충제(예를 들어, 염화 구리와 같은)를 추가로 처리한다. 또 다른 실험에서, 실시예 1 의 트리엔틴-구리 복합체는 6주 동안 경구 투여에 의해 120 mg/kg/일의 투여 량으로 트리엔틴 처리 그룹의 ACC 래트를 처리하는데 사용된다.

1.4 심장 형태 및 기능 평가

심장 형태 및 기능을 심 초음파로 평가하고, 도 7에 나타낸 스케줄에 따라 트리엔틴 처리의 치료효능을 평가하기 위해 혈장의 구리 농도를 측정(즉, 혈액 검출)하였다.

추가적으로, 심장 조직 절편은 실험 종료 후 희생된 쥐로부터 얻어진다. 면역조직화학적 실험은 조직 절편에서 수행된다. 심장 조직 절편의 모세혈관 밀도가 결정되고, 콜라겐 함량의 변화가 감지된다. 경색증 조직, 경색증 조직의 더 넓은 범위, 및 경색증 구역으로부터 멀리 떨어진 심장 조직에서의 HIF-1와 VEGF 및 VEGFR-1같은 그의 표적의 mRNA및 단백질 수준이 측정된다.

1.5 심장 조직의 구리 농도

조직 샘플을 바로 동결시키고,동결 건조시키기 전에 -80℃에서 보관하였다. 동결 건조 및 질산을 이용한 조직의 다이제스션 후, 샘플은 무색 또는 담황색이며, 눈에 보이는 침전물이나 잔류물이 전혀 없이 깨끗하였다. 구리 농도의 후속 분석을 위해 초순수를 각 용기에 첨가하여 HNO₃를 2%로 희석시켰다. 구리 농도는 하기 표 1에 나타낸 프로그램에 따라 흑연로 원자 흡수 분광광도계(ICE3500, Thermo)에 의해 결정되었다.

흑연로 원자 흡수 분광광도계 프로그램

온도（℃）	시간（s）	아르곤 가스 흐름（L/분）
90	20	0.2
120	20	0.2
850	20	0.2
2100	3	0
2500	3	0.2

1.6 통계 분석

모든 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. 레벤 검정(Levene test)의 균질성과 변동 계수(CV)를 사용한 각 실험 그룹 간의 각 파라미터의 변화를 비교하였다. SPSS 14.0 통계 패키지(SPSS, Chicago, IL)를 사용하였으며 P 값이 0.05 미만일 때 유의한 차이로 칭하였다.

2. 결과

2.1 심장 형태 및 기능

심 초음파 검사는 트리엔틴 치료 후 형태학적인 수준에서 병리학적 심장 비대의 회귀가 발생함을 보여준다. 처리 후 3주 후에, 래트의 심실 중격 깊이(IVSD) 및 좌심실 후벽 깊이(LVPWD)는 유의하게 감소하였다. 처리 기간이 연장됨에 따라, 트리엔틴의 치료 효과는 더욱 분명해졌다. ACC 래트를 5주 동안 치료했을 때, IVSD와 LVPWD는 모의 그룹의 그것과 비교하여 거의 정상이었다. 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 처리 그룹은 지속적인 모니터링 결과에 따라 IVSD 및 LVPWD값이 시간에 따라 유의하게 감소하는 경향을 보였다. 반대로, 컨트롤 그룹에서는 IVSD 및 LVPWD가 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하였다.

비록 심장 기능 파라미터, 박출률(EF) 및 수축률(FS)이 보상효과로 인해 모든 실험 그룹의 정상 범위 내에 있었지만, 도 9a 및 9b는 트리엔틴이 처리된 그룹의 EF 및 FS가 매우 유의하게 변동하지는 않았음을 보여준다. 반대로, EF 및 FS의 현저한 하향 경향이 미처리군에서 관찰되었다.

다양한 처리 그룹의 래트의 혈장 및 심근의 구리 농도를 원자 흡광 분광법에 의해 측정하였다. 도 10a에서 보여진 바와 같이, 래트가 ACC 수술을 받은 경우에 비대성 심근의 구리 농도는 감소하였다. 6주간의 트리엔틴 처리 후, 처리된 래트의 심장 조직에서 구리 농도가 증가했다. ACC-Tr 그룹에 상응하는 도 10a에서 막대는 고 투여량의 트리엔틴과 저 투여량의 트리엔틴 모두로 처리된 AAC 래트들(즉, AAC-Tr(H) 그룹과 AAC-Tr(L) 그룹을 조합한)의 심장조직에서의 평균 구리 농도를 나타낸다.

ACC 래트의 심장 조직에서 구리 유출의 결과로, ACC 래트의 혈장에 있는 구리농도는 모의 그룹에 있는 래트의 구리 농도보다 높았다. 그러나, 트리엔틴의 6주간의 처리 후, 처리 과정 중 상이한 시점(즉, 2주마다)에서의 측정에 따르면, ACC 래트의 혈장 내 높은 구리 농도는 시간이 지나면서 현저하게 감소하였다. 반대로, 모의 그룹의 래트의 혈장 구리 농도는 처리 과정 동안 상당히 안정한 채로 유지되었다(도 10b).

3. 디스커션

본 연구는 래트의 비대 심장 조직에서 구리 농도를 증가시키기 위해 트리엔틴을 사용했다. 그 결과 트리엔틴은 구리의 조직 재분배와 재사용을 촉진하고, 심장의 형태와 기능을 되돌릴 수 있음을 보여주었다. HIF-1의 전사 활성 및 모세 혈관의 밀도는 또한 비대 심장 래트에서 트리엔틴의 처리 결과와 마찬가지로 경색증 심장 조직에서도 증가할 수 있다. 더욱이, 심 초음파 검사 결과는 트리엔틴의 처리를 통해 정상적인 심장 기능이 유지되는 것을 보여주었다. 이 실험의 결과는 본 발명의 트리엔틴의 치료가 비대 심장의 치료를 위해 생체 내에서 허혈성 심장 조직에 구리를 효과적으로 전달할 수 있다는 강력한 증거를 제공한다.

실시예 4. 심근 허혈성 경색 후 레서스 원숭이의 심부전 모델에 대한 트리엔틴 치료

이 실시예는 심부전의 레서스 원숭이 모델에서 트리엔틴 치료의 효능을 평가하기 위한 생체 내 실험을 기술한다. 레서스 원숭이는 내부 구조, 전기 활동, 관상 동맥 분포, 관상 동맥의 곁순환, 및 흉강의 배치 및 부착과 관련하여 인간과 비슷한 고차원 심장을 가지고 있다. 따라서, 심부전의 레서스 원숭이 모델은 임간의 심부전 컨디션에 대한 치료법의 효능을 평가하기 위한 좋은 대리자이다. 이 실험에서, 심근 허혈성 경색은 관상 동맥 결착 수술에 의해 확립되었다. 수술 후, 허혈성 심장 조직은 점차적으로 콜라겐성 섬유로 대체 되고, 경색 조직이 되었다. 수술 후 1년 후, 동물의 비-경색 심장 조직은 경색 심장 조직의 상실된 기능을 보완할 수 없게 되었고, 따라서 심부전 모델이 발달되었다. 심부전 치료를 위해 후속적으로 원숭이에게 트리엔틴 처리를 제공하였다.

1.1 레서스 원숭이에서 심부전의 확립

수술 절차 전에, 모든 개체는 진정을 유도하기 위해 5mg/kg 케타민 및 0.2mg/kg 미다졸람을 근육내로 주사받았다. 가슴과 사지의 전극 부착 부위를 덮고 있는 털은 수술을 위해 그리고 심전도(ECG)의 기록 결과를 향상시키기 위해 완전히 면도하였다. 표준 양극 및 단극 사지유도를 기록하였다. 심박 급속증(분당 200회 초과의 박동), 부정맥, 기저선에서 명백한 ST 분절 편차와 같은 비정상적인 ECG를 나타내는 동물은 연구에서 제외되었다.

심전도, 커프 혈압, 맥박 산소 측정법, 및 카프노그래피를 포함한 표준 비침습적 측정은 지속적으로 모니터링(Dash3000, GE, USA)되었으며, 정맥 카테터가 개체에 설치되었다. 펜타닐(10μg/kg), 미다졸람(0.2mg/kg), 프로포폴(1mg/kg) 및 베쿠로니움(0.1mg/kg)의 정맥 내 주입에 의해 유도된 마취 후 수술 절차를 받은 모든 원숭이들이 우선 삽관되었다. 압력-제어 환기로 보조호흡이 수행되어 35mmHg에서 40mmHg 사이의 호기말(end-tidal) CO₂가 달성되었다. 흡기 압력은 12-20cm H₂O의 범위 내로 설정되었다. 호흡 속도는 40/min이고 들숨/날숨 비율은 1:2이었다.

수술 절차 중 마취 컨디션을 유지하기 위해, 펜타닐(0.1mg) 2 mL와 프로포폴(100mg) 10mL를 생리 식염수를 이용해 20mL로 희석하였다. 그 혼합물을 주사기 펌프로 5-10mL/h의 속도로 연속적으로 주입하였다. 펌프의 속도는 마취 상태와 수술 기간에 따라 조정되었다. 동맥관삽입술은 유치 바늘로 대퇴 동맥에 구멍을 뚫고, 수술 중 침습 혈압 모니터링을 위해 압력 모니터링 튜브와 연결되었다. 일반적으로, 대퇴 동맥 박동은 전방 장골 척추와 치골 결합 사이의 중간에서 촉진되었다. 수술 부위는 무균 방식으로 격리되었고, 격리는 처리가능한 멸균 시트 4매로 이루어졌다.

수술 영역은 좌측 제 4 늑간격의 라인에서 약간 내측으로 절단되고, 가슴뼈 끝의 좌측에서 바깥 쪽으로 4-5cm 횡 절개가 이루어졌다. 조직 절개와 응고 목적을 위해 모노폴라 디아테르미를 적용하였다. 피하 조직과 근육 평면을 흉막아래로 해부하여, 흉막강으로 들어가고 포셉을 열어 절개부분을 넓혔다. 면봉을 삽입하여 흉강을 청소하고 구멍에서 폐를 밀어 내고, 늑간 절개를 넓혀 가슴을 열고 심낭을 노출시켰다.

좌측 4번째 늑간 개흉 절개(4-5cm정도)를 통해 심장이 노출되고, 정점과 좌측 외이가 확인되었다. 좌측전단 하행 동맥(LAD)의 심외막 끝은 0 레벨로 정의되었으며; 좌측 외이 아래의 LAD의 기원은 레벨 100으로 정의되었다. 결찰은 LAD의 60%에서 수행되었다. 또한, 만약 대각선 동맥의 가지 부위가 결찰 부위 위에 있는 경우, 주요 대각선 가지는 일부 원숭이의 LAD 동맥의 결찰 부위에 평행하게 결찰되었다.

동맥은 1분동안 막은 후 5분간 재관류를 실시하였으며, 이 폐쇄-재관류를 최종 결찰 전에 3회 반복하였다. 최종 결찰 후, 좌심실 벽 운동의 차이, 전 방실 벽의 색 변화 및 심전도와 혈압의 변화를 모니터링하여 결찰이 성공적으로 이루어졌는지 확인하였다. 최종 결찰 후에 메틸렌 블루(1mL)를 1.0mL의 주사기를 사용하여 좌측 외이(auricle)에 한 회 분량을 주입하였다. 메틸렌 블루의 파일링 결함(filling defect)은 결찰의 완료를 나타낼 뿐만 아니라 허혈 부위를 예측하는 것을 도와주었다.

가슴을 닫기 전에, 심장의 컨디션을 45분간 집중적으로 모니터링하였다. 도부타민(3-5 ㎍·kg^-1*min^-1)이 심장 기능을 지지하기 위해 주입되고 필요할 경우 제세동기(HEARTSTART XL, Philips)가 사용되었다. 심막을 닫는 중에 심장을 손상시키지 않도록 주의를 기울였다. 소듐 하이알루네이트를 항-응고 치료를 위해 위심강에 주입하였다. 심막 및 늑막은 4-0 폴리에틸렌 봉합선으로 봉합하였다. 늑간 절개는 실코 봉합선으로 봉합하였다. 기흉을 피하기 위해 늑간의 봉합 동안 폐 손상의 방지를 위한 주의가 필요하였다. 늑간 절개를 봉합하는 동안 재 팽창되어 흉강에서 공기가 배출될 수 있었다. 늑간 절개가 닫힌 후, 생리 식염수를 피하 공간으로 떨어뜨려 폐를 다시 팽창시킴으로써 가슴 절개가 단단히 닫혔는지 확인하였다. 근육과 피부 절개는 #2-0 실크 봉합선으로 층을 이루며 봉합하고, 살균 방식으로 세척하였다. 자발적 호흡이 회복된 후에 기관 내 튜브가 철회되었다. 절개는 멸균 거즈와 붕대로 덮었다. 트라마돌(2mg/kg)을 근육 내 주사하여 통증을 완화시켰다. 붕대를 격일로 교체하고 수술 후 1주일에 봉합선을 제거하였다.

1.2 심전도(ECG) 모니터링

12-리드 ECG(MA8000, GE, USA)는 수술 전, 수술 직후(전체 수술 절차는 약 2시간), 및 수술 후 4주 및 8주 후 각 원숭이의 앙아위 위치에 25 mm/s 종이 속도 및 10 mm/mV 진폭에서 소아용 전극을 사용하여 기록되었다. 원숭이의 가슴 벽은 소아용 전극이 있더라고 동시에 6개의 흉부돌출 리드(leads)가 허용되기에 충분히 넓지 않았다. 따라서, 6개의 흉부돌출 리드는 2개의 그룹으로 나누어졌다: V1, V3, 및 V5가 한 그룹, V2, V4, 및 V6는 또 다른 그룹에서 기록되었다.

1.3 심 초음파 검사

2차원 심초음파 검사의 측정은 3회의 연속적인 심장 사이클을 갖는 표준 정점의 2- 및 4- 챔버 뷰에서 수행하였다. 프레임 속도는 70fps와 100fps사이로 유지하였다. 모든 원숭이는 수술 전, 수술 후 4주 및 8주에 좌측 측면 위치에서 10.3MHz 변환기(P10-4, Siemens ACUSON Antares System, German)를 사용하여 경 흉부 심 초음파 검사를 받았다.

좌심실의 박출률(EF)은 심슨의 단일-평면 방법에 의해 평가하였다. 좌심실 확장기말 부피(LVEDV)와 수축기말 부피(LVESV)를 직접 기록하였고 EF는 다음과 같이 계산하였다: EF = (LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%. 좌심실의 박출량(SV)은 다음과 같이 계산하였다: SV=LVEDV-LVESV.

1.4 트리엔틴 처리

수술 후 1년에, 허혈성 심장 조직은 콜라겐성 섬유로 완전히 대체 되었고 경색 조직이 되었다. 심장 기능의 초음파 평가로 확인된 심부전 모델이 확립되었다. 그 후 트리엔틴 처리가 수행되었다. 트리엔틴 처리 그룹에서, 트리엔틴은 하루에 두 번씩 각 원숭이에게 경구투여되었다. 트리엔틴의 투여량은 18mg/kg/일이었다. 이 처리는 8주 동안 계속되었다. 처리되지 않은(즉, 컨트롤) 그룹의 원숭이는 어떠한 처리도 받지 않았다. 심장 기능 및 형태는 트리엔틴의 치료효과를 평가하기 위해 도 11에 보여지는 스케줄에 따라 평가되었다.

본 실시예의 다음 섹션에서의 실험 절차 및 결과는 필수적으로 트리엔틴 디하이드로클로라이드로 이루어진 트리엔틴 조성물의 처리에 초점을 둔다. 레서스 원숭이 모델에서 심부전 치료를 위한 다른 트리엔틴 조성물의 치료 효능을 평가하기 위해서 동일한 실험 프로토콜이 사용된다. 예를 들어, 한 실험에서는, 트리엔틴 치료 외에도, 추가적으로 처리 그룹에서 심부전을 가진 레서스 원숭이를 구강 구리 보충제(예를 들어, 염화 구리)로 매일 16.5mg/kg의 용량으로 6주간 처리한다. 또 다른 실험에서, 실시예 1의 트리엔틴-구리 복합체는 6주 동안 경구 투여로 36.7mg/kg/일의 용량으로 처리 그룹에서 심부전을 가진 레서스 원숭이를 치료하는데 사용된다.

1.5 조직 병리학적 조사

원숭이는 염화칼륨(10%, 10mL)의 정맥 주사에 의해 희생되고 각 원숭이의 완전한 부검이 수행된다. 수확된 심장을 세척하고 눈에 보이는 병변에 대해 극심히 검사하고 10%의 포름알데히드 용액으로 고정시킨다. 그런 다음, 심장은 장축을 따라 정점에서 밑 부분까지 6개의 블록으로 절단된다. 각 블록의 두께는 0.5cm이다. 절개 중에는 각 부위의 표면이 부드럽고 균일하며, 그 부위는 라벨이 있는 묶음실로 표시된다. 얇은 부위는 현미경 검사를 위해 재절단 하고 Masson 및 H/E로 염색한다.

면역 조직화학

조직 절편은 HIF-1α, VEGFA 및 VEGFR1을 검출하기위한 면역조직화학적 방법을 사용하여 검사된다. 하기 항체들이 각각 사용된다: 마우스 항 인간 HIF-1α 단일 클론 항체(ab16066, Abcam); 마우스 항 인간 VEGFA 단일 클론(sc-57496, Santa Cruz); 토끼 항 인간 VEGFR1 단일 클론 항체(1303-12, Epitomics); 마우스 항 인간 CD31 단일 클론 항체(Maixin bio-tech company, Fuzhou). HIF-1α는 EDTA(pH 9.0)를 사용하는 고압 열 유도 항원 검색 방법으로 회수되고, VEGF 및 VEGFR1는 구연산 완충액(pH 6.0)을 사용하여 마이크로파 열 유도 항원 검색 방법으로 회수되고, CD31은 EDTA를 이용한 마이크로 웨이브 열 유도 항원 검색 방법으로 회수한다. 항체의 작동 농도는 다음과 같다: 항 HIF-1α의 경우 1:800, 항 -VEGF의 경우 1:100, 항 -VEGFR1의 경우 1: 00. 음성 컨트롤 샘플을 면역조직화학적 실험에서 1차 항체를 대신하여 PBS로 배양하였다. CD31은 내피세포의 마커이다. Ki-67 라벨은 공 초점 현미경을 이용하여 면역 형광법에 의해 검사된다.

모세혈관 밀도

조직 절편의 모세혈관 밀도는 다음과 같이 평가된다. 먼저, 최대 모세혈관 분포 시야는 100배 확대로 광학 현미경 하에서 결정되며, 그 후 모세혈관 밀도를 결정하기 위해 200배 확대로 광학 현미경 하에서 5개의 무작위 시야를 수집한다. 모세혈관은 적혈구 세포의 직경의 8배의 합계보다 작은 직경을 갖는 내강으로 정의된다. 측정은 두 명의 독립적인 기술자에 의해 수행된다.

반-정량 단백질 발현 분석

면역조직화학의 슬라이드는 광학 현미경 하에 관찰되며 Image-Pro Plus 6.0 이미지 분석 소프트웨어(Media Cybemetics)를 사용하여 반-정량적 방식으로 단백질 발현 수준을 결정하기 위해 이미지를 찍고 사용한다. 다른 그룹의 슬라이드는 두 명의 독립적인 기술자에 의해 평가된다. 경계 지역의 5개의 무작위 시야와 각 슬라이드의 경색에서 먼 곳의 이미지는 400배 확대에서 광학 현미경에 하에 취해진다.

1.6 웨스턴 블롯

조직 준비

가슴으로부터 심장을 제거한다. 좌심실 벽을 조심스럽게 검사하고 경색 영역, 경계 영역 및 원격 영역의 조직 샘플을 분리한다. 경색 영역은 창백한 외관을 기반으로한 비-경색 영역과 구별될 수 있다. 경계 영역은 경색 영역 내 1mm에서 경색 영역 외 3mm까지의 영역으로 정의된다. 원격 영역은 경색 영역 밖으로 3mm 초과로 정의된다. 샘플은 웨스턴블롯 분석을 위해 액체 질소에서 보존된다.

웨스턴 블롯

단백질 추출물은 액체 질소 중의 각각의 조직을 그라인딩하고 얼음 상에서 40 분 동안 1% 컴플리트 EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일(Roche, DE)을 함유하는 RIPA 라이시스 버퍼(Beyotime, CN)에서 그라인딩된 조직을 용해시킴으로써 얻어진다. 단백질 농도는 Pierce BCA 단백질 분석 키트(Thermo SCIENTIFIC, 23227, USA)에 의해 결정된다. 각 샘플로부터 동량의 단백질(30㎍)을 5X SDS 샘플 버퍼에 가용화시키고 10%-SDS 및 8% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리시킨다. 그런 다음 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(Bio-Rad, USA)에 전기영동으로 트랜스퍼한다. 멤브레인은 1시간 동안 5% 무지방 건조 우유(블로킹 용액)을 포함하는 Tris-버퍼된 식염수/Tween 20(TBST)(10 mM Tris-HCl, pH 8.0,150 mM NaCl, 및 0.1% Tween 20)에서 블록킹된 후, 4℃에서 항-HIF-1α(Abcam, ab113642, USA), 항-VEGF(Santa Cruz, sc57496, USA), 및 항-VEFGR-1(Abcam, ab32152, USA)와 같은 각각의 1차 항체를 벤더의 권장 사항에 따른 블로킹 용액으로 희석하여 이와 함께 밤새 배양한다. TBST로 세척한 후, 멤브레인은 적절한 2차 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 표적 단백질은 화학발광 HRP 기질(Milipore, USA)을 사용하여 시각화하고 QUANTITY ONE^TM 소프트웨어를 사용하여 농도 측정법으로 분석한다.

1.7 HIF-1 표적 유전자의 mRNA 수준

허혈성 심근에서 HIF-1 전사 활성을 정의하기 위해, VEGF 및 VEGFR-1(Flt-1로도 알려짐)과 같은 HIF-1α, HIF-1 표적 유전자의 mRNA 수준은 실시간 PCR(RT-PCR)에 의해 결정된다.

각 샘플로부터 총 RNA는 제조업자의 설명에 따라 TRIZOL^®(Invitrogen, 15596-026, USA)을 사용하여 분리한다. 총 RNA 1 ㎍은 37℃C에서 15분, 85℃에서 5분 그리고 4℃에서 5분동안 PRIMESCRIPT^TM RT 시약 키트(TaKaRa, RR037A, Japan)를 사용하여 역전사시킨다. 실시간 RT-PCR 반응은 SYBR^® Premix Ex TaqTM II 키트(TaKaRa, RR820A, Japan)를 사용하여 수행되었다. HIF-1α, VEGF 및 VEGFR1 cDNA 프레그먼트를 증폭하기 위해 샘플은 다음과 같은 프로그램과 함께 BIO-RAD CFX96 Real-Time System을 사용하여 처리한다: 95℃에서 30초간 변성, 그 후 95℃에서 5초 및 60℃에서 30초로 35 사이클. 성장 곡선의 로그 선형 위상의 결과를 분석하고 상대적인 정량화는 2-ΔCT 방법을 사용하여 수행한다. HIF-1α, VEGF 및 VEGFR1의 유전자 발현 수준은 각각 각 샘플에서 액틴 발현 수준으로 표준화된다. 각 샘플에서 적어도 3개의 복제가 실행된다. 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타낸다.

RT-PCR의 프라이머 서열

표적 유전자		프라이머 서열
레서스 원숭이 HIF-1α	정방향 프라이머	GTCTGCAACATGGAAGGTATTG (SEQ ID NO: 1)
레서스 원숭이 HIF-1α	역방향 프라이머	GCAGGTCATAGGTGGTTTCT (SEQ ID NO: 2)
레서스 원숭이 VEGF	정방향 프라이머	GAGCTTCCTACAGCACAACA (SEQ ID NO: 3)
레서스 원숭이 VEGF	역방향 프라이머	CCAGGACTTATACCGGGATTTC (SEQ ID NO: 4)
레서스 원숭이 VEGFR1	정방향 프라이머	GGGTCACATCACCTAACATCAC (SEQ ID NO: 5)
레서스 원숭이 VEGFR1	역방향 프라이머	CCTTTCTGCTGTCCCAGATTAC (SEQ ID NO: 6)
레서스 원숭이 액틴	정방향 프라이머	CCACGAAACTACCTTCAACTCC (SEQ ID NO: 7)
레서스 원숭이 액틴	역방향 프라이머	GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT (SEQ ID NO: 8)

1.8 심장의 구리 농도

조직 샘플을 바로 동결시키고 동결 건조시키기 전에 -80℃에서 저장하였다. 동결 건조 및 질산을 이용한 조직의 다이제스션 후, 그 분해물은 무색 또는 담황색이었으며, 침전물 또는 잔류물이 전혀 보이지 않고 깨끗했다. 구리 농도의 후속 분석을 위해 초순수 물을 각 용기에 첨가하여 HNO₃를 2%로 희석시켰다. 구리 농도는 실시예 3의 표 1에 나타낸 프로그램에 따라 흑연로 원자 흡수 분광광도계(ICE3500, Thermo)로 측정하였다.

1.9 통계 분석

모든 데이터는 평균± SD로 나타내었다. 레벤 검정(Levene test)의 균질성과 변동 계수(CV)를 사용하여 여러 실험 그룹 간의 각 파라미터의 변화를 비교하였다. SPSS 14.0 통계 패키지(SPSS, Chicago, IL)를 사용하였으며 P 값이 0.05 미만일 때 유의한 차이로 추정하였다.

2. 결과

2.1 심장 기능

심초음파 검사 결과는, 트리엔틴의 처리 후, 좌심실 박출률이 시간이 경과함에 따라 유의하게 증가함을 보였다. 그러나, 처리되지 않은 그룹에서 좌심실 박출률은 시간이 지남에 따라 감소하였다. 도 12 참조.

2.2 경색 심장에서의 구리 농도

심근 내의 구리 농도는 원자 흡수 분광법으로 측정하였다. 도 13에서 보이는 것과 같이, 구리 농도는 처리되지 않은 그룹의 것과 비교했을 때 처리된 그룹의 경색 영역 및 경계 영역으로부터의 조직 샘플에서 트리엔틴 처리 후에 현저하게 증가하였다. 반대로, 원격 영역의 조직 샘플의 구리 농도는 트리엔틴 처리 그룹과 미처리 그룹에서 비교가능하다.

3. 디스커션

심근 허혈은 HIF-1α의 축적 및 구리의 고갈을 초래한다. 허혈 컨디션 하에서, 축적된 HIFα는 HIF 전사를 활성화시킬수 없는데 이는 구리가 HIF 전사 복합체의 형성을 위해 그리고 표적 유전자에서 HIF와 HIF 반응 엘리먼트(HRE) 서열의 상호 작용을 위해 필요하기 때문이다. 따라서, 허혈성 심근에서 HIF의 축적이 발생하지만, 구리 결핍은 혈관 신생에 관여하는 HIF-조절 유전자의 발현을 차단하며, 이는 심근 혈관 신생의 억제를 초래한다. 이 효과는 심근 경색으로 이어지며, 이는 심부전으로 진행된다.

본 연구는 심근 경색 치료를 위해 국소 허혈성 조직에서 구리 농도를 증가시키기 위해 트리엔틴을 사용하였다. 그 결과 트리엔틴은 구리의 조직 재분배와 재사용을 촉진한다는 것을 보여주었다. 또한, 심 초음파 검사 결과 트리엔틴 처리 후에 심장 기능이 향상되었음을 보여준다. 이 실험에서 트리엔틴의 투여량은 레서스 원숭이에게 하루당 18mg/kg을 투여하였고, 이는 사람 개체에게 하루 420mg/kg을 투여하는 것과 동등하다. 윌슨 병에 걸린 환자의 혈청 구리 농도를 감소시키는 데 사용되는 트리엔틴의 전형적인 투여량(소아 환자에게는 500-700 mg/일에서 최대 1500 mg/일까지, 성인 환자에게는 750-1250 mg/일에서 최대 2000 mg/일까지)과 비교하면, 이 실험에서 사용된 투여량은 훨씬 적다. 이 실험의 결과는 본 명세서에 기술된 저-투여량 트리엔틴 처리가 심근 경색의 치료를 위해 생체 내에서 구리를 전달하는 효과적인 전략이라는 강력한 증거를 제공한다.

실시예 5. 심근 허혈성 경색의 마우스 모델에서 트리엔틴 치료

이 실험에서, 심근 허혈성 경색의 마우스 모델은 영구적인 관상동맥 결찰 수술에 의해 확립되었다. 수술 후 4주에, 허혈성 심장 조직은 콜라겐성 섬유로 대체되었고 경색 조직이 되었다. 트리엔틴 처리는 도 14에서 보여지는 프로토콜에 기술된 바와 같이 수행되었다.

트리엔틴 치료는 위 내 경로를 통해 모델링된 마우스의 네 그룹에게 하루 2 회, 하루에 16.75, 33.49, 55.94, 또는 78.25mg/kg의 투여량으로 투여되었다. 이러한 처리는 4주 동안 계속되었다. 미처리 그룹은 어떠한 트리덴틴 처리를 받지 않았다.

심 초음파

심장기능은 트리엔틴의 치료 효능을 평가하기 위해 심 초음파로 평가되었다. 모든 마우스는 12MHz 트랜스듀서(i13L, Vivid7, GE 초음파)로 흉부 심장 초음파 검사를 받았다. 좌심실의 박출률(EF)은 심슨의 단일 평면 방법으로 평가되었다. 좌심실 이완기말 부피(LVEDV)와 수축기말 부피(LVESV)를 직접 기록하였고, EF는 다음과 같이 계산되었다: EF = (LVEDV-LVESV)/LVEDV×100%.

심장에서의 구리농도

조직 샘플을 바로 동결시키고 동결 건조 시키기 전에 -80℃에서 보관하였다. 동결 건조 및 질산으로 조직을 다이제스션한 후, 분해물은 무색 또는 담황색이며, 눈에 보이는 침전물이나 잔류물이 전혀 없이 깨끗하였다. 구리 농도의 후속 분석을 위해 초순수를 각 용기에 첨가하여 HNO₃를 2%로 희석시켰다. 구리 농도는 실시예 3의 표 1에 나타낸 프로그램에 따라 흑연로 원자 흡수 분광광도계(ICE3500, Thermo)에 의해 결정되었다.

결과

심 초음파로 측정한 심장 기능 검사는 트리엔틴 처리된 마우스의 좌심실 박출에 의해 측정된 심장 기능이 트리엔틴의 저용량 처리에서 개선됨을 보여 주었고, 그러한 개선은 트리엔틴의 보다 많은 투여량에서 감소되었다(도 15 참조). 박출률의 개선은 하루에 33.49 mg/kg의 투여량으로 피크에 도달하였고, 더 높은 투여량의 경우 감소하였다. 이 실험은 심근 경색에 대한 트리엔틴 치료가 좁은-저용량 범위 내에서 효과적이라는 것을 제시하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 경색 부위의 구리 농도는 트리엔틴 처리에 반응하여 유의하게 증가하였다. 특히, 하루에 33.49 mg/kg 투여한 그룹에서, 경색 영역의 구리함량이 가장 높았다.

디스커션

본 연구는 마우스에서 심근 허혈성 경색증을 치료하기 위해 일련의 증가된 트리엔틴 투여량을 사용했다. 그 결과, 트리엔틴을 1일 33.49mg/kg의 투여량으로 처리한 그룹에서, 경색 영역의 구리 함량은 모든 실험 그룹 중 가장 높았으며, 이는 다른 실험 그룹에 비해 이 그룹에서 관찰된 박출률의 가장 높은 개선률과 일치한다. 보다 높은 트리엔틴 투여량에서, 경색 영역의 구리 함량 또는 박출률은 더 이상 개선되지 않았다.

이 실험에서 테스트한 투여량, 하루당 16.75, 33.49, 55.94, 및 78.25mg/kg은 인간 환자의 경우 하루에 약 150, 300, 500, 및 700mg을 투여하는 것과 동등하다. 반대로 윌슨병 환자의 혈청 구리 농도를 낮추어 병을 치료하는데 사용되는 트리엔틴 투여량은 소아 환자에게 하루에 약 500-700mg에서 일일 최대 1500mg이며, 성인 환자에게 하루에 약 750mg-1250mg에서 일일 최대 2000mg까지이다. 따라서, 허혈성 심장 조직에서 구리 수준을 보충하고 이 실험에서 관찰된 심장 기능을 회복시키는 가장 높은 효능을 갖는 트리엔틴의 투여량은 윌슨병 환자를 치료하는데 사용된 투여량보다 훨씬 적다. 이 실험의 결과는 좁은 저용량의 투여량 범위 내에서 심근 경색증에 대한 트리엔틴 치료가 효과적이라는 강력한 증거를 제공한다.

어떤 이론이나 가설에 구속되지 않고, 트리엔틴은 고농도의 조직이나 환경(허혈 후 혈청과 같은)에서 심장의 구리-박리된 허혈성 조직으로 구리를 전달하는 구리 전달 셔틀의 역할을 할 수 있다. 그 결과, 허혈성 조직에서 구리 결핍을 벗어나고 심혈관의 컨디션을 개선한다. 여러 간행물들은 심혈관 질환, 특히 심근 경색증을 앓고 있는 환자의 혈청 내 구리 수준의 상승을 기술하고있다. 예를 들어, 문헌 [ES Ford. Am. J. Epidem. 151 (12): 1182 (2000); E. Gomez et al. J. Trace Elements Med. Biol. 14: 65-70 (2000); 및 Singh MM et al. Angiology―Journal of Vascular Diseases, 504-506 (1985)]을 참조바란다.

실시예 6. 심부전 환자에서 트리엔틴 치료의 임상 연구

심부전 환자에게 저-투여량 트리엔틴 치료의 임상 효과를 평가하기 위한 임상 연구가 수행된다. 이 연구의 주요 목적은 심부전 환자를 치료할 때 치료 전과 후의 위약을 비교함으로써 트리엔틴의 효능을 평가하는 것이다.

이 연구는 감소된 박출률(예를 들어, LVEF ≤ 35 %)을 가진 심부전 환자들(예를 들어, NYHA 기능 유형 II 및 III)의 무작위화, 이중 맹검화, 위약-조절화된 임상 연구이다. 컨트롤 그룹의 환자는 표준 치료(SOC)와 1일 2회 위약을 투여받는다. 처리 그룹의 환자는 SOC에 1일 2회 150mg/용량의 트리엔틴의 경구 투여를 더한 것이 주어진다. 환자는 선별 검사, 기준선(0주), 치료 과정 동안, 그리고 치료 후에 평가된다.

이 연구의 1차 종점은 생존, 심부전과 관련된 입원, 또는 심부전과 관련된 바이오마커의 변화이다. 예를 들어, 시간의 흐름에 따라 순환하는 나트륨이뇨 펩티드의 수준은 심부전의 위험도를 단계화하는 데 사용되고, 그 결과 심부전의 심각성에 대한 바이오마커의 역할을 할 수 있다.

이 연구의 2차 종점은 치료의 처음부터 끝까지 심장 구조 및 기능 변화를 포함 할 수 있다. 심장 구조와 기능은 심 초음파로 결정할 수 있다. 2차 종점으로 사용될 수 있는 예시적인 지표로는 좌심실 확장기말 부피, 좌심실 박출률, 및 E/E' 비율이 포함된다. 이 연구의 2차 종점은 6분 도보 거리 테스트, 증상 변화(NYHA 유형), 및 삶의 질 점수를 기반으로 한 기능 상태를 추가적으로 포함할 수 있다.

혈청 구리 수준과 다른 바이오마커가 상기 연구에서 3차 종점으로 모니터링될 수 있다.

안전성은 대상자에게서 보고된 자발적 유해 이벤트(AEs) 및 생체신호, ECG, 실험실 테스트, 등과 같은 기타 적절한 의료 및 안전 평가를 검토하여 평가한다.

SEQUENCE LISTING <110> Innolife CO., LTD. <120> USE OF TRIENTINE TO DELIVER COPPER TO ISCHEMIC TISSUE <130> OP160744 <150> PCT/CN2015/090528 <151> September 24, 2015 <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 1 GTCTGCAACATGGAAGGTATTG 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 2 GCAGGTCATAGGTGGTTTCT 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 3 GAGCTTCCTACAGCACAACA 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 4 CCAGGACTTATACCGGGATTTC 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 5 GGGTCACATCACCTAACATCAC 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 6 CCTTTCTGCTGTCCCAGATTAC 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 7 CCACGAAACTACCTTCAACTCC 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <400> 8 GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT 22

Claims

구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키는 방법.
구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포로 구리를 특이적으로 운반하는 방법.
구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 적어도 2개의 조직 복구 이벤트를 유도하는 방법.
구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직으로 줄기세포의 이동을 유도하는 방법.
구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
개체는 손상된(compromised) 조직 복구 시스템을 갖는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
개체는 손상된 조직 복구 시스템을 갖지 않는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
허혈성 조직은 허혈성 심장 조직, 허혈성 간 조직, 허혈성 뇌 조직, 허혈성 폐 조직, 허혈성 신장 조직, 허혈성 피부 조직, 허혈성 소화관 조직 및 허혈성 사지 조직으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 구리 이온을 추가로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되는, 방법.
제11항에 있어서,
구리 킬레이트 테트라민과 구리 이온의 복합체는 결정성(crystalline)인, 방법.
제12항에 있어서,
상기 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각-평면 기하학적 구조(square-planar geometry)를 취하고, 그리고 여기서 상기 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 조성물 내의 구리 이온은 구리 킬레이트 테트라민과 복합되지 않는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
구리 이온의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 유효량은 개체에서 세포 외 구리 수준을 낮추기에 불충분한, 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 경구 투여되는, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 유효량은 하루에 약 80mg 내지 약 450mg의 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 매일 적어도 2회 투여되는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 적어도 약 1개월 동안 투여되는, 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 투여는 적어도 약 0.005mg/L의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도하는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물의 투여는 적어도 약 1주 동안 적어도 약 0.005mg/L의 혈중 구리 킬레이트 테트라민을 유도하는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
개체에서 세포 내 구리 수준을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서,
개체에서 세포 내 구리 수준에 기초하여 상기 조성물의 투여량을 조정(adjusting)하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구리 킬레이트 테트라민 및 구리 이온을 포함하는 약학 조성물.
제25항에 있어서,
구리 킬레이트 테트라민은 트리엔틴인 약학 조성물.
제26항에 있어서,
상기 조성물은 트리엔틴과 구리 이온의 결정성 복합체를 포함하며, 여기서 구리 이온은 트리엔틴의 4개의 아민기에 의해 킬레이트되어 사각-평면 기하학적 구조를 취하고, 그리고 여기서 상기 결정성 복합체는 2개의 염화 이온 및 물 분자를 추가로 포함하는 약학 조성물.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 정제, 캡슐 또는 필(pill)로서 제형화되는 약학 조성물.
허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키기 위한 의약의 제조에서 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도.
허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리를 특이적으로 운반하기 위한 의약의 제조에서 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도.
허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키기 위한 의약의 제조에서 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물의 용도.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 구리 이온을 추가로 포함하는 용도.
허혈성 조직 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 세포 내 구리 수준을 증가시키기 위해 사용되는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물.
허혈성 조직 손상을 갖는 개체에서 허혈성 조직의 세포 내로 구리를 특이적으로 운반하기 위해 사용되는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물.
허혈성 손상을 갖는 개체의 허혈성 조직에서 구리-의존성 HIF-1 전사 활성을 촉진시키기 위해 사용되는 구리 킬레이트 테트라민을 포함하는 조성물.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 구리 이온을 추가로 포함하는 조성물.
허혈성 조직 손상과 연관된 질병 또는 컨디션의 치료를 위해 구리 킬레이트 테트라민 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 테트라민 조성물을 포함하는 키트.
제37항에 있어서, 구리 이온을 포함하는 구리-촉진 조성물을 추가로 포함하는 키트.