CN117330765A - 胃泌素17的化学发光检测方法 - Google Patents

胃泌素17的化学发光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测胃泌素‑17的试剂盒，涉及生物检测技术领域，所述的试剂盒为磁微粒发光法检测试剂盒，包括磁微粒载体缓冲体系，每1L磁微粒载体缓冲体系中包括：3.0‑7.0g Na2HPO4·12H2O、0.1‑2.0g NaH2PO4、1.0‑10.0g NaCl、1.0‑20g牛血清白蛋白、50‑150g蔗糖、0.1‑20.0g 2‑羟乙基纤维素、1‑25g明胶、1‑25g羟基磷灰石、0.1‑1％吐温。本发明的试剂盒能够快速、简便地检测人外周血胃泌素‑17的含量，可用于慢性萎缩性胃炎等胃部疾病的辅助诊断。

Description

胃泌素17的化学发光检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及胃泌素17的化学发光检测方法。
背景技术
胃泌素(G17)是一种来源于胃部和肠道的多肽激素，主要由胃窦、十二指肠、近端空肠粘膜中的G细胞共同分泌，其主要作用是调节胃酸分泌，营养和促进胃肠粘膜生长，调节消化道功能及维持其结构完整。胃泌素的合成由胃泌素原、甘氨酸延伸型胃泌素，最后形成成熟胃泌素，成熟胃泌素包括G6、G14、G17、G34、G52、G71，其中G17是成熟胃泌素的主要分子形式。G17与肠嗜铬样细胞细胞膜上的CCK-B受体结合，使ECL细胞释放组胺，组胺与邻近壁细胞膜上的H2受体结合，从而刺激壁细胞分泌胃酸。G-17仅由胃窦部G细胞分泌，因此G-17是反映胃黏膜损伤情况的重要指标。通过检验血清中的胃泌素17(G-17)的水平，有助检测有否异常胃酸分泌或萎缩性胃炎发生。外周血清中G-17的检测可显著提升诊断的效能，具有重要的临床价值。
中国专利CN202011391200.6中公开了一种测定人体胃泌素G17含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，所述的试剂盒中包括磁分离试剂、R1试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液；R2试剂为碱性磷酸酶标记的胃泌素G17单克隆抗体稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液，R1试剂为样品稀释液，校准品液系列为含有不同浓度胃泌素G17抗原的稀释液；所述磁分离试剂为包被胃泌素G17单克隆抗体的免疫磁珠。该发明所述的试剂盒可以与全自动化学发光分析仪联用，加大了检测速度和检测通量，提高了检测效率，能很好地用于人体胃泌素G17的检测。
中国专利CN202010264802.9中公开了一种胃泌素-17的检测试剂盒及其制备方法和检测应用方法，该发明所述的试剂盒中包括组分I、组分II和胃泌素-17标准品，所述组分I采用包被磁球的抗胃泌素-17第一抗体，所述组分II采用近红外荧光染料直接或间接标记的抗胃泌素-17第二抗体；其中，所述抗胃泌素-17第一抗体、所述抗胃泌素-17第二抗体与待测样本中的胃泌素-17分别具有结合位点。该发明所述的胃泌素-17检测试剂盒，将磁珠提取分离与近红外荧光标记法结合起来，在保持磁珠比表面积大、吸附性强、悬浮稳定性好、有利于抗原抗体反应顺利进行的优点基础上，近红外荧光染料技术可以进一步实现灵敏度高、选择性好、背景干扰低的优点。
目前，提供一种操作简便、快捷、检测的准确度高、特异性强、重复性高的检测人外周血胃泌素17含量的方法对慢性萎缩性胃炎等胃部疾病仍具有重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测胃泌素-17的试剂盒，所述的试剂盒使用免疫学检测手段对胃泌素17进行血液检测，检测过程简便快速，检测结果的准确度高、特异性强、重复性高。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种检测胃泌素-17的试剂盒，所述的试剂盒为磁微粒发光法检测试剂盒，包括磁微粒载体缓冲体系，每1L磁微粒载体缓冲体系中包括：3.0-7.0gNa2HPO4·12H2O、0.1-2.0g NaH2PO4、1.0-10.0g NaCl、1.0-20g牛血清白蛋白、50-150g蔗糖、0.1-20.0g 2-羟乙基纤维素、1-25g明胶、1-25g羟基磷灰石、0.1-1％吐温。
优选地，每1L磁微粒载体缓冲体系中包括：5.6-5.9g Na2HPO4·12H2O、0.55-0.60gNaH2PO4、5.0-9.0g NaCl、1.0-10g牛血清白蛋白、70-135g蔗糖、0.5-10.0g 2-羟乙基纤维素、3-20g明胶、5-20g羟基磷灰石、0.1-0.3％吐温。
优选地，所述的磁微粒载体为胃泌素-17抗体磁微粒偶联物，所述的试剂盒中包括试剂B，所述的试剂B由胃泌素-17抗体磁微粒偶联物与磁微粒载体缓冲体系制备而成，所述的胃泌素-17抗体磁微粒偶联物的浓度为0.5-3μg/mL。
进一步优选地，所述的胃泌素-17抗体磁微粒偶联物的浓度为1.7μg/mL。
优选地，所述的磁微粒载体缓冲体系的pH为6.2-8.0。
优选地，所述的吐温选自吐温20、吐温40、吐温60、吐温80中的一种或多种。
具体地，所述的磁微粒为FeO和/或Fe2O3磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，粒径为1-4μm。
进一步具体地，所述的磁微粒通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
再进一步具体地，所述的活性功能基团包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
优选地，所述的胃泌素-17抗体磁微粒偶联物的制备包括以下步骤：
(1)将磁微粒清洗后重悬；
(2)在磁微粒溶液中加入抗体进行反应；
(3)用缓冲液5清洗磁微粒偶联物，重悬，进行反应；
(4)清洗磁微粒偶联物，重悬，制成胃泌素-17抗体磁微粒偶联物；
步骤(3)中所述的每1L缓冲液5中包括7.5-8.0g Tris、8-10g NaCl、3.0-10.0g牛血清白蛋白、5-20g吐温20。
优选地，所述的缓冲液5的pH为7.3-7.8。
所述的步骤(1)中使用缓冲液3进行清洗和重悬，每1L缓冲液3中包括7-10gNa2B4O7·10H2O。
优选地，所述的缓冲液3的pH为9-11。
优选地，所述的步骤(1)中重悬的浓度为1-10mg/mL；进一步优选地，所述的重悬的浓度为5mg/mL。
所述的步骤(2)中包括：在磁微粒溶液中加入抗体和缓冲液3进行反应，再加入缓冲液4进行反应，每1L缓冲液4中包括470-530g K2HPO4。
优选地，所述的缓冲液4的pH为9-11。
优选地，所述的缓冲液4与磁微粒体积质量比为100:1-100:10；进一步优选地，所述的缓冲液4与磁微粒体积质量比为100：1。
优选地，所述的步骤(2)中磁微粒与胃泌素-17抗体质量比为100:(1-10)；进一步优选地，所述的磁微粒与胃泌素-17抗体质量比为100:1。
优选地，步骤(2)中所述的缓冲液3与磁微粒体积质量比为100:(1-10)；进一步优选地，所述的缓冲液3与磁微粒的体积质量比为100:1。
优选地，步骤(2)中反应的时间为5-60分钟；进一步优选地，步骤(2)中反应的时间为10分钟。
优选地，步骤(3)中所述的每1L缓冲液5中包括7.5g Tris、9g NaCl、3.5g的牛血清白蛋白、5mL吐温20。
优选地，所述的步骤(3)中重悬的浓度为1-10mg/mL；进一步优选地，所述的重悬的浓度为5mg/mL。
优选地，步骤(3)中反应的温度为37℃，反应的时间为16-24小时；
进一步优选地，步骤(3)中反应的时间为16小时。
优选地，所述的步骤(4)中使用缓冲液7进行清洗和重悬，每1L缓冲液7中包括9.0-30g Tris-HCl、8-10g NaCl、1.0-30g牛血清白蛋白、5.0-50g蔗糖、2.0-40g酶水解明胶、30-250g酶稳定剂、0.2-10g氯化镁、0.2-10g氯化锌。
进一步优选地，步骤(4)中每1L缓冲液7中包括24.2g Tris-HCl、9g NaCl、10g牛血清白蛋白、5g蔗糖、2.5g酶水解明胶、50g酶稳定剂、0.5g 1M氯化镁、0.5g 1M氯化锌。
优选地，所述的酶水解明胶的蛋白来源选自牛、羊、猪、驴、鱼中的一种或多种。
优选地，所述的每1L酶稳定剂中包括40g海藻糖、500g甘油、27g NaCl、30g牛血清白蛋白。
优选地，所述的缓冲液7的pH为7.4-8.2。
优选地，所述的步骤(4)中重悬的浓度为1-15mg/mL；进一步优选地，所述的重悬的浓度为10mg/mL。
优选地，所述的试剂A中酶标记胃泌素-17抗体偶联物的浓度为1-3μg/mL；
进一步优选地，所述的试剂A中酶标记胃泌素-17抗体偶联物的浓度为1.2μg/mL。
进一步优选地，所述的酶标记胃泌素-17抗体偶联物的制备包括以下步骤：
(1)活化胃泌素-17抗体和碱性磷酸酶；
(2)连接步骤(1)中活化后的胃泌素-17抗体和碱性磷酸酶；
(3)终止和纯化抗体偶联物，得到酶标抗体偶联物。
优选地，步骤(1)中胃泌素-17抗体的活化包括以下步骤：将2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)溶液加入胃泌素-17抗体溶液中进行活化，混匀后进行第一次反应，终止活化，将缓冲液2加入抗体溶液中，进行第二次反应，收集活化后的抗体；
优选地，步骤(1)中碱性磷酸酶(ALP)的活化包括以下步骤：在ALP溶液中加入(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)溶液，震荡混匀后，进行第一次反应，终止活化，将缓冲液2加入ALP溶液中，进行第二次反应，收集活化后的ALP；
优选地，步骤(2)中胃泌素-17抗体和ALP的连接包括以下步骤：在胃泌素-17抗体溶液中的加入ALP溶液，混匀后进行反应；
优选地，步骤(3)中胃泌素-17抗体偶联物的终止和纯化包括以下步骤：在胃泌素-17抗体加入缓冲液1稀释的马来酰亚胺溶液，进行反应，在胃泌素-17抗体中加入乙醇胺溶液，混匀，将待纯化的抗体偶联物浓缩，纯化，纯化后的液体为酶标抗体偶联物。
优选地，步骤(1)所述的溶解2IT的溶液为缓冲液1，所述的每1L缓冲液1中包括14.8-15.1g乙醇胺和5.8-6.0g NaCl；进一步优选地，所述的每1L缓冲液1中包括14.8g乙醇胺和5.8g NaCl。
优选地，所述的缓冲液1的pH为7.3-7.6。
优选地，步骤(1)中所述的2IT的浓度为4.59-22.9mg/mL；进一步优选地，所述的2IT的浓度为13.76mg/mL。
优选地，所述的2-IT与胃泌素-17抗体摩尔比为(15-30):1；进一步优选地，所述的2-IT与胃泌素-17抗体摩尔比为15:1。
优选地，步骤(1)中所述的第一次反应的时间为20-40分钟；进一步优选地，第一次反应的时间为30分钟。
优选地，步骤(1)中胃泌素-17抗体与缓冲液2的质量体积比为1：(5-20)mg/μL；
进一步优选地，步骤(1)中胃泌素-17抗体与缓冲液2的质量体积比为1：5mg/μL。
优选地，第二次反应的时间为5-15分钟；进一步优选地，第二次反应的时间为10分钟。
优选地，第二次反应后还包括使用PD10脱盐柱除去过量的2IT的步骤。
优选地，步骤(1)中所述的SMCC的溶解溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。
进一步优选地，所述的SMCC的浓度为3.35-13.38mg/mL；再进一步优选地，所述的SMCC的浓度为6.69mg/mL。
优选地，所述的SMCC与ALP摩尔比为(15-60):1；进一步优选地，所述的SMCC与ALP摩尔比为15:1。
优选地，步骤(1)中所述的第一次反应的时间为20-40分钟；进一步优选地，第一次反应的时间为30分钟。
优选地，步骤(1)中ALP与缓冲液2的质量体积比为1：(10-50)mg/μL；进一步优选地，ALP与缓冲液2的质量体积比为1：50mg/μL。
优选地，步骤(1)中第二次反应的时间为5-15分钟；进一步优选地，步骤(1)中第二次反应的时间为10分钟。
优选地，步骤(1)中第二次反应后还包括使用PD10脱盐柱除去过量的2IT的步骤。
优选地，步骤(2)中胃泌素-17抗体与ALP的质量比为1：(2-1)；进一步优选地，步骤(2)中胃泌素-17抗体与ALP的质量比为1：1。
优选地，步骤(2)中反应的温度为2-8℃，反应的时间为12-18小时；
进一步优选地，步骤(2)中反应的时间为12小时。
优选地，步骤(3)中所述的马来酰亚胺的溶解溶剂为DMF。
优选地，步骤(3)中所述的马来酰亚胺的浓度为5-15mg/mL；进一步优选地，所述的马来酰亚胺的浓度为9.7mg/mL。
优选地，步骤(3)中所述的缓冲液1稀释后的马来酰亚胺的浓度为0.97mg/mL。
优选地，步骤(4)中所述的胃泌素-17抗体与马来酰亚胺溶液的质量体积比为1:10mg/μL。
优选地，步骤(3)中所述的反应的时间为10-20分钟；进一步优选地，步骤(3)中所述的反应的时间为15分钟。
优选地，步骤(3)中所述的胃泌素-17抗体与乙醇胺的质量体积比为1：(10-50)mg/μL；进一步优选地，所述的胃泌素-17抗体与乙醇胺的质量体积比为1：10mg/μL。
优选地，步骤(3)中所述的乙醇胺的浓度为100mM。
优选地，步骤(3)中浓缩为使用超滤浓缩管进行浓缩。
优选地，步骤(3)中浓缩后的胃泌素-17抗体偶联物的浓度为0.5-2mg/mL；进一步优选地，浓缩后的胃泌素-17抗体偶联物的浓度为0.5mg/mL。
优选地，步骤(3)中纯化使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化。
优选地，步骤(3)中纯化后的洗脱液为缓冲液2。
进一步优选地，所述的每1L缓冲液2中包括70-80g甘氨酸；再进一步优选地，所述的每1L缓冲液2中包括75g甘氨酸。
优选地，所述的试剂盒中还包括质控品和标准品。
进一步优选地，所述的质控品的制备为：用缓冲液6将G17重组蛋白溶解；所述的质控品的浓度为10pmol/mL或60pmol/mL。
进一步优选地，所述的标准品的制备包括：用缓冲液6将G17重组蛋白溶解；所述的标准品的浓度为5pmol/mL或50pmol/mL。
优选地，所述的每1L缓冲液6中包括12.0-15.0g Tris、5.0-50g牛血清白蛋白和1.0-30g甘氨酸。
进一步优选地，所述的缓冲液6中包括12g Tris、15g牛血清白蛋白和15g甘氨酸。
优选地，所述的缓冲液6的pH为7.6-8.8。
具体地，所述的标准品用于制作胃泌素-17标准溶液荧光信号标准曲线。
优选地，所述的试剂盒中还包括清洗液和发光底物；
进一步优选地，所述的发光底物为ALP催化的发光底物。
优选地，所述试剂盒的检测样本选自血清、血浆、全血、体液中的一种或多种；
进一步优选地，所述的体液包括但不限于血液、尿液、唾液、精液、组织液。
进一步优选地，所述的全血包括但不限于外周血、末梢血。
进一步优选地，所述的试剂盒的检测样本为血清。
再进一步优选地，所述的试剂盒的检测样本为人外周血。
优选地，本发明提供了一种胃泌素-17的检测方法，所述的检测方法包括使用上述的试剂盒，通过化学发光免疫法检测待测样本中的胃泌素-17的浓度。
优选地，所述的检测方法包括以下步骤：
(1)将试剂盒中的试剂A和试剂B与待测样品混合，进行反应，经磁分离，向沉淀物中加入发光底物，检测光信号强度；
(2)以步骤(1)所述的方法检测胃泌素-17的标准品的光信号强度，并获得胃泌素-17的浓度与光信号强度之间的标准曲线；
(3)将检测得到的待测样品的光信号强度与标准曲线对照，获得待测样品中的胃泌素-17的浓度。
优选地，步骤(1)中所述的反应的温度为37℃，反应的时间为10-30分钟。
进一步优选地，步骤(1)中所述的反应的时间为20分钟。
本发明的有益效果为：
1、本专利使用免疫学检测手段对胃泌素17进行血液检测，与影像学检测手段(主要为CT、核磁、胃镜)相比，本专利更能简便的反映样本的真实情况，减少了病人的痛苦、辐射伤害及等待时间。
2、本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，20分钟即可得到准确结果，检测时间较短，而CT、核素、胃镜检测时间较长。
3、本发明改进了磁微粒发光法中磁微粒载体的缓冲体系，使用本发明的磁微粒载体的缓冲体系检测胃泌素-17的准确度较高、空白限较低，并且批间差异小，具有较强的特异性。
附图说明
图1为制备试剂盒的工艺流程图。
图2为试剂盒中各组分的反应流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1
1.材料
1.1设备
蛋白纯化仪、低温高速离心机、分析天平、pH计、磁力搅拌器、磁分离架等。
实验材料的购买厂家：
乙醇胺购自国药集团，CAS为141-43-5；
甘氨酸购自国药集团，CAS为56-40-6；
六水合氯化镁购自国药集团，CAS为7791-18-6；
十水合四硼酸钠购自国药集团，CAS为1303-96-4；
酶水解明胶购自国药集团，CAS为68410-45-7；
十二水合磷酸氢二钠购自国药集团，CAS为10039-32-4；
牛血清白蛋白购自健楚生物，CAS为9048-46-8；
2-亚氨基硫烷盐酸盐购自普洛夫生物公司，CAS为4781-83-3；
碱性磷酸酶购自源叶生物公司，CAS为9001-78-9；
(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯购自超研生物公司，CAS为64987-85-5；
二甲基甲酰胺购自卡诺斯公司，CAS为68-12-2；
马来酰亚胺购自源叶生物公司，CAS为941-69-5；
抗胃泌素-17抗体1购自博尔迈公司，克隆号为MG17-110；
抗胃泌素-17抗体2购自博尔迈公司，克隆号为MG14-417；
磁微粒购自BioMag公司，粒径为1-4μm，铁离子外壳密度为50mg/mL，沉降系数为3-6s；
G17重组蛋白购自博尔迈公司，货号为G17-STD。
1.2缓冲液配方(配制量均为1L)
1.2.1缓冲液1
称取14.8g的乙醇胺、5.8g的NaCl加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为7.3，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表1缓冲液1配方
1.2.2缓冲液2
称取75g的甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表2缓冲液2配方
原料名称 称取量
甘氨酸 75g
纯化水 定容至1000mL
1.2.3缓冲液3
称取7.5g的Na2B4O7·10H2O加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为10.5，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表3缓冲液3配方
原料名称 称取量
十水合四硼酸钠 7.5g
pH值 10.5
纯化水 定容至1000mL
1.2.4缓冲液4
称取490g的K2HPO4加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为10.5，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表4缓冲液4配方
原料名称 称取量
磷酸氢二钾 490g
pH值 10.5
纯化水 定容至1000mL
1.2.5缓冲液5
称取7.5g的Tris、9.0g的NaCl、3.5g的牛血清白蛋白加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，量取5mL吐温20加入上述容器中，调试pH值为7.6，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表5缓冲液5配方
原料名称 称取量
三羟甲基氨基甲烷 7.5g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 3.5g
吐温20 5mL
pH值 7.6
纯化水 定容至1000mL
1.2.6缓冲液6
称取12.0g的Tris、15g的牛血清白蛋白、15g甘氨酸加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为8.5，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表6缓冲液6配方
原料名称 称取量
三羟甲基氨基甲烷 12.0g
牛血清白蛋白 15g
甘氨酸 15g
pH值 8.5
纯化水 定容至1000mL
1.2.7缓冲液7
称取24.2g的Tris-HCl、9.0g的NaCl、10g的牛血清白蛋白、5.0g的蔗糖、2.5g的酶水解明胶(蛋白来源可以是牛、羊、猪、驴等哺乳动物或鱼类中的一种或多种)、50mL酶稳定剂(40g海藻糖、500mL甘油、27g NaCl、30g牛血清白蛋白纯化水定容至1000mL)、0.5mL 1M氯化镁(1000mL纯化水中溶解95g氯化镁)、0.5mL 1M氯化锌(1000mL纯化水中溶解136g氯化锌)加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为8.0，并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表7缓冲液7配方
原料名称 称取量
Tris-HCl 24.2g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 10g
蔗糖 5.0g
酶水解明胶 2.5g
酶稳定剂 50mL
1M氯化镁 0.5mL
1M氯化锌 0.5mL
pH值 8.0
纯化水 定容至1000mL
1.2.8缓冲液8配方1
称取3.0g的Na2HPO4·12H2O、0.1g的NaH2PO4、1.0g的NaCl、1.0g的牛血清白蛋白、50g蔗糖、0.1g 2-羟乙基纤维素、1.0g明胶(蛋白来源可以是牛、羊、猪、驴等哺乳动物或鱼类中的一种或多种)、1.0g羟基磷灰石、0.1％吐温20加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值在6.2-8.0之间并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
表8缓冲液8
2.方法
2.1酶标记抗体1及纯化
2.1.1胃泌素-17抗体1的活化
胃泌素-17抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2IT)，用缓冲液1溶解至13.76mg/mL。按2IT与胃泌素-17抗体1摩尔比15:1的比例(即：1mg胃泌素-17抗体1加入10μL 2IT溶液)将2IT溶液加入胃泌素-17抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg胃泌素-17抗体1加入5μL缓冲液2的比例，将缓冲液2加入胃泌素-17抗体1溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的2IT，收集活化后的胃泌素-17抗体1。
2.1.2碱性磷酸酶(ALP)的活化
ALP的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2-4mg(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)，用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至6.69mg/mL。按SMCC与ALP摩尔比15:1的比例在ALP溶液中加入SMCC溶液(即：1mg ALP加入8.5μL SMCC溶液)。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg ALP加入50μL缓冲液2的比例，将缓冲液2加入ALP溶液中，室温反应10min。使用PD10脱盐柱除去过量的SMCC，收集活化后的ALP。
2.1.3胃泌素-17抗体1和ALP的连接
胃泌素-17抗体1和ALP的连接需在十万级洁净厂房内进行。按胃泌素-17抗体1与ALP质量比1:1的比例在胃泌素-17抗体1溶液中的加入ALP溶液(即：1.0mg抗体加入1.0mgALP)。震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12小时。
2.1.4胃泌素-17抗体1偶联物的终止和纯化
胃泌素-17抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。
(1)称取1-10mg马来酰亚胺，用DMF溶解至9.7mg/mL。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/mL马来酰亚胺溶液。
(2)按1mg胃泌素-17抗体1加入10μL 0.97mg/mL马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μL乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mM，即在6μL乙醇胺加入994μL缓冲液1。
(3)按1mg胃泌素-17抗体1加入10μL 100mM乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的胃泌素-17抗体1偶联物浓缩至0.5mg/mL。
(4)使用纯化蛋白分析仪和Superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体为酶标抗体偶联物。
2.2胃泌素-17抗体2偶联磁微粒
将磁微粒用缓冲液3清洗后，重悬至5mg/mL。按磁微粒与抗体2质量比100:1的比例在磁微粒溶液中加入抗体2，按缓冲液3与磁微粒体积质量比100:1的比例在上述混合物中加入缓冲液3，室温反应10min。按缓冲液4与磁微粒体积质量比100:1的比例在上述混合物中加入缓冲液4，在37℃环境中反应16小时。
用缓冲液5清洗磁微粒偶联物，重悬至5mg/mL。在37℃环境中反应24小时。用缓冲液7清洗磁微粒偶联物，重悬至10mg/mL。制成物为胃泌素-17抗体磁微粒偶联物。
磁微粒化学发光法检测胃泌素17
1、检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法测定G17的含量。样本中G17和试剂A中的G17胃泌素-17抗体1及试剂B中的G17抗体2结合，形成夹心结构。经洗涤，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中G17的浓度成正相关。
2、组分
2.1试剂盒组分
G17试剂盒由检测试剂条、校准品、质控品、二维码组成。其中检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本。校准品由含有两个浓度的G17抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；质控品由含有两个浓度的G17抗原和缓冲液配制而成；二维码中录入了当批次的标准曲线。具体步骤如图1所示。
表9试剂盒主要组分
试剂盒主要组分 装量
检测试剂条 10条
质控品1 200μL×1
质控品2 200μL×1
校准品1 200μL×1
校准品2 200μL×1
盒签二维码 1个
1.2试剂条组分
检测试剂条由试剂A、试剂B、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。试剂A为含一定浓度碱性磷酸酶标记的G17抗体1溶液；试剂B为含一定浓度磁微粒标记的G17抗体2溶液；清洗液用于反应过程的清洗；发光底物为ALP催化的发光底物；测读孔用于最终的检测读值。
表10试剂条主要组分
3.生产工艺
3.1校准品、质控品的生产
将G17重组蛋白作为校准品的原料。以缓冲液6将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度为5pmol/mL、50pmol/mL。
将G17重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液6将其溶解，充分混合后配制成2个质控品，浓度为10pmol/mL、60pmol/mL。
3.2试剂A的生产
将酶标记G17抗体偶联物作为试剂A的原料。以缓冲液7将其充分混匀配制成试剂A，试剂A中酶标记G17抗体偶联物的浓度为1.2μg/mL。
3.3试剂B的生产
将G17抗体磁微粒偶联物作为试剂B的原料。以缓冲液8将其充分混匀配制成试剂B，试剂B中G17抗体磁微粒偶联物的浓度为1.7μg/mL。
4.检测方法
采用北京美联泰科生物技术有限公司的全自动化学发光免疫分析仪进行检测。反应所需样本量为30μL，自动检验流程为：
①免疫反应：将30μL样本、50μL试剂B、50μL试剂A依次加入11号孔位，在37℃条件下反应20min。
②磁分离及清洗：在12号孔位加入300μL清洗液(1L清洗液中包括：Tirs1.5g、
氯化钠5g、吐温-20 1mL、曲拉通X100 0.15mL、PH 7.2)，将含磁微粒的混合物用磁力吸出11号孔位，在12号孔位脱磁。清洗2min后。在13、14号孔位分别进行1次磁分离及清洗。
③读值：在15号孔位加入150μL发光底物(CAS：193884-53-6)，将含磁微粒的混合物用磁力吸出14号孔位，在15号孔位脱磁。碱性磷酸酶催化的发光底物发光后用自研仪器检测相对发光强度(RLU)，具体如图2所示。
④根据检测的校准品数值可获得一条G17浓度-发光值标准曲线(Y＝[(a-d)/(1+(X/c)^b)]+d)，该曲线使用四参数Logistic方程拟合。
⑤样本的检测值可以和这条曲线上获得唯一的浓度值对应，从而实现对未知样本的浓度检测。
5.检测指标
5.1准确度
将浓度约为100pmol/mL(允许偏差±10％)的胃泌素17(G17)液(A)加入到浓度范围0ng/mL-0.5pmol/mL的样本B中，所加入G17抗原与样本B之间的体积比例为1:9，根据下示公式计算回收率R，其回收率应在85％-115％范围内。
式中：
R—回收率；
V—样品A液的体积；
V0—血清样品B液的体积；
C—血清样品B液加入A液后的3次测量平均值；
C0—血清样品B液的3次测量平均值；
CS—样品A液的浓度。
5.2空白限
将不含任何分析物的样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，计算其平均值和标准差(SD)。平均值/>即为空白限，结果应≤0.5pmol/mL。
3.5线性区间
将接近线性区间上限的高值样本与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程(Yi＝Ai+B)。按下示公式计算线性回归的相关系数(r)，在0.5-100pmol/mL的线性区间内，相关系数r应≥0.990。
式中：
r————相关系数；
xi————稀释比例；
yi————各个样本测定结果均值；
————稀释比例的均值；
————样本测定结果总均值。
5.3重复性
同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值和标准差SD。按下式公式计算变异系数(CV)，结果CV≤10％。
式中：
s——样本测试值的标准差；
——样本测试值的平均值。
5.4批间差
用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值和标准差SD，根据公式得出变异系数(CV)，结果CV≤15％。
5.5特异性
在不含任何分析物的样本中分别加入不低于200ng/mL的胃蛋白酶原I(购自欧凯生物，货号为K3916)及100ng/mL的胃蛋白酶原II(购自欧凯生物，货号为K3926)，均测3次取均值，测定结果不高于0.5pmol/mL。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在，缓冲液8的组分和配比不同，具体如下：
表11.
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.6g
磷酸二氢钠 0.55g
氯化钠 5.0g
牛血清白蛋白 1.0g
蔗糖 70.0g
2-羟乙基纤维素 0.5g
明胶 3.0g
羟基磷灰石 5.0g
吐温20 1.0mL
pH值 6.5
纯化水 定容至1000mL
实施例2中缓冲液8的配制包括：
称取5.6g的Na2HPO4·12H2O、0.55g的NaH2PO4、5.0g的NaCl、1.0g的牛血清白蛋白、70g蔗糖、0.5g 2-羟乙基纤维素、3.0g明胶、5.0g羟基磷灰石、1.0mL吐温20加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为6.5并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
实施例3
实施例2与实施例1的区别在，缓冲液8的组分和配比不同，具体如下：
表12.
实施例3中缓冲液8的配制包括：
称取5.9g的Na2HPO4·12H2O、0.6g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、10.0g的牛血清白蛋白、135g蔗糖、10.0g 2-羟乙基纤维素、20.0g明胶、20.0g羟基磷灰石、3.0mL吐温20加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为8.0并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，缓冲液8的组分中用羟丙基甲基纤维素替换2-羟乙基纤维素，其余皆相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，缓冲液8的组分中用氟基磷灰石替换羟基磷灰石，其余皆相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，缓冲液8中羟基磷灰石的含量不同，其余皆相同。具体如下表所示。
表13.
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于，缓冲液8不同，其余皆相同。缓冲液8具体如下表所示。
表14.
原料名称 称取量
十二水合磷酸氢二钠 5.6g
磷酸二氢钠 0.55g
氯化钠 9.0g
牛血清白蛋白 30.0g
蔗糖 70.0g
黄原胶 0.3g
海藻酸钠 0.5g
明胶 15.0g
吐温20 3.0mL
pH值 7.0
纯化水 定容至1000mL
对比例4中缓冲液8的配制包括：
称取5.6g的Na2HPO4·12H2O、0.55g的NaH2PO4、9.0g的NaCl、30.0g的牛血清白蛋白、70g蔗糖、0.3g黄原胶、0.5g海藻酸钠、15.0g明胶、3.0mL吐温20加入到一定量的纯化水中搅拌至完全溶解，调试pH值为7.0并定容至1000mL。用0.22μm的滤膜进行过滤。
实验结果：
实验结果如下表所示：
表15.
实验数据表明实施例1-3第14个月的重复性结果CV小于8％、与第0月的准确度结果偏差不超过10％。对比例1-4组在第14个月的结果的重复性结果CV大于30％、与第0月的准确度结果偏差超过70％。
表16.
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种检测胃泌素-17的试剂盒，其特征在于，为磁微粒发光法检测试剂盒，包括磁微粒载体缓冲体系，每1L磁微粒载体缓冲体系中包括：3.0-7.0gNa2HPO4·12H2O、0.1-2.0gNaH2PO4、1.0-10.0g NaCl、1.0-20g牛血清白蛋白、50-150g蔗糖、0.1-20.0g 2-羟乙基纤维素、1-25g明胶、1-25g羟基磷灰石、0.1-1％吐温。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每1L磁微粒载体缓冲体系中包括：5.6-5.9g Na2HPO4·12H2O、0.55-0.60g NaH2PO4、5.0-9.0g NaCl、1.0-10g牛血清白蛋白、70-135g蔗糖、0.5-10.0g 2-羟乙基纤维素、3-20g明胶、5-20g羟基磷灰石、0.1-0.3％吐温。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒载体为胃泌素-17抗体磁微粒偶联物，所述的试剂盒中包括试剂B，所述的试剂B由胃泌素-17抗体磁微粒偶联物与磁微粒载体缓冲体系制备而成，所述的胃泌素-17抗体磁微粒偶联物的浓度为0.5-3μg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磁微粒载体缓冲体系的pH为6.2-8.0。
5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的胃泌素-17抗体磁微粒偶联物的制备包括以下步骤：
(1)将磁微粒清洗后重悬；
(2)在磁微粒溶液中加入抗体进行反应；
(3)用缓冲液5清洗磁微粒偶联物，重悬，进行反应；
(4)清洗磁微粒偶联物，重悬，制成胃泌素-17抗体磁微粒偶联物；
步骤(3)中所述的每1L缓冲液5中包括7.5-8.0g Tris、8-10g NaCl、3.0-10.0g牛血清白蛋白、5-20g吐温20。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的步骤(1)中使用缓冲液3进行清洗和重悬，每1L缓冲液3中包括7-10g Na2B4O7·10H2O。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的步骤(2)中包括：在磁微粒溶液中加入抗体和缓冲液3进行反应，再加入缓冲液4进行反应，每1L缓冲液4中包括470-530gK2HPO4。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的步骤(4)中使用缓冲液7进行清洗和重悬，每1L缓冲液7中包括9.0-30g Tris-HCl、8-10g NaCl、1.0-30g牛血清白蛋白、5.0-50g蔗糖、2.0-40g酶水解明胶、30-250g酶稳定剂、0.2-10g氯化镁、0.2-10g氯化锌。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括试剂A，所述的试剂A为酶标记抗体偶联物和缓冲液7制备而成。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标记抗体偶联物的制备包括以下步骤：
(1)活化胃泌素-17抗体和碱性磷酸酶；
(2)连接步骤(1)中活化后的抗体和碱性磷酸酶；
(3)终止和纯化抗体偶联物，得到酶标抗体偶联物。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂A中酶标记抗体偶联物的浓度为1-3μg/mL。
12.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括质控品和标准品，所述的质控品的浓度包括10pmol/mL和60pmol/mL；所述的标准品的浓度包括5pmol/mL和50pmol/mL。
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