CN117327013A - 一种草乌甲素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种草乌甲素的制备方法。含有草乌甲素的药材经乙醇水溶液提取，得提取液；提取液浓缩得草乌甲素粗品，加水，经大孔吸附树脂富集，收集富含草乌甲素洗脱液，浓缩至干，加乙醇水溶液，静置，取上清液经脱色材料脱色，收集脱色液，拌样，经色谱填料柱层析，乙醇水溶液进行洗脱，收集草乌甲素洗脱液，浓缩至干，有机溶剂溶解，静置，重结晶，有机溶剂反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，纯度大于97.0%，水分小于0.5%。该方法得到的草乌甲素色泽好，纯度高，无有机溶剂残留，制备过程简单安全易行，成本较低，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物碱提取富集纯化技术领域，具体是含有草乌甲素的药材中对草乌甲素提取分离纯化工艺。
背景技术
生物碱从结构上分为有机胺类、吡咯烷类、吡啶类、异喹啉类、吲哚类、莨菪烷类、咪唑类、喹唑啉类、嘌呤类、甾体类、二萜类、其他类。在黄草乌、长喙乌头、龙头乌头、直缘乌头、拟康定乌头、显柱乌头、拳距爪叶乌头中均含有草乌甲素，详表见表1。草乌甲素属于二萜双酯类生物碱，乙醇、三氯甲烷或乙醚中易溶，在水中不溶；在稀盐酸或稀硫酸中极易溶解。草乌甲素具有较强的镇痛及明显的抗炎作用，维持时间长，无成瘾性，疗效确切，临床推广迅速。
在中国发明专利，一种草乌甲素的制备方法（公开号CN 115703740 A）公开了运用乙醇提取-调酸碱-有机溶剂萃取-两次硅胶才得到草乌甲素，在实际工业应用中溶剂用量较大，不利于工业化生产，且该工艺没有进行放大；一种草乌甲素的制备方法（公开号CN106008344 A）公开了运用乙醇提取-调酸碱-萃取-柱层析分离-结晶才制得纯品，富集过程用到乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂对人体伤害及环境污染较大，不利于工业化生产；专利：一种草乌甲素的高效提取分离方法（公开号CN 104326981A）、专利：草乌甲素的制备方法（公开号CN 102775349B）、专利：一种高纯度草乌甲素的制备方法（公开号CN 101555227 B）均采用传统的有机溶剂提取，调酸碱，然后硅胶或氧化铝柱层析-二乙胺的混合有机溶剂洗脱-重结晶；专利：一种草乌甲素的制备方法（公开号CN 101830849 B）中采用碱浸泡-汽油提取-上柱-重结晶，汽油在生产安全风险较大，工业化大生产较为困难。
本发明涉及生物碱提取富集纯化技术领域，不同于其他的是采用乙醇浸泡提取，提取液浓缩经大孔吸附树脂富集及脱色，脱色后经色谱填料柱层析，仅使用了乙醇水溶液及《中国药典》2020年版四部0861残留溶剂测定法规定的第三类及第四类有机溶剂。大孔吸附树脂及色谱填料均可反复使用，使用的色谱填料价格远低于C18、ODS等反相色谱填料，得到的草乌甲素色泽好，纯度高于《中国药典》2020年版二部规定草乌甲素含量97.0%。本发明得到的草乌甲素纯品无有机溶剂残留，制备过程简单安全易行，成本较低，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种草乌甲素的制备方法，该方法克服了现有技术的不足，尤其是提取富集纯化方法，该方法得到的草乌甲素纯品无有机溶剂残留，不仅所用溶剂易回收，可反复使用，而且树脂及色谱填料可反复使用，对环境污染较小，制备过程简单安全易行，成本较低，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。
本发明涉及一种从富含草乌甲素的药材中提取制备草乌甲素的方法及应用，包括以下步骤：
1）含有草乌甲素的药材经乙醇水溶液，得提取液，残渣弃去；
2）将步骤1）提取液浓缩至药材的0.25~1倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的2~5倍的水，备用；
3）将步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂富集，先用水洗脱，再用30%~60%乙醇水溶液洗脱，然后用70%~100%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；最后浓缩至干，加投药重量的0.5~1倍的90%~100%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）将步骤3）备用液经脱色材料，收集脱色液，拌样，备用；
5）将步骤4）拌样品经色谱填料柱层析，先用0%～40%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用50%～70%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用75%～90%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）将步骤5）干品用有机溶剂进行溶解，静置，重结晶，用有机溶剂反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干、研细，纯度大于97.0%；
7）将步骤6）反复洗涤的溶剂收集，回收溶剂至干，得干品，溶解拌样，备用，重复步骤5）和步骤6）。
所述步骤3）的大孔吸附树脂为AB-8、ADS-8、HJ-03、LK系列（如LK1300S、LK1600N、LK37）、HPD100其中的一种使用。
所述步骤4）的脱色材料为活性炭、硅藻土、氧化铝、硅胶或脱色树脂其中的一种使用。
所述步骤5）的色谱填料为UniPSN 30-300、UniPSN 30-500、LK1300SS其中的一种使用。
所述步骤6）的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚其中的一种使用。
所得草乌甲素纯品采用HPLC检测纯度大于97.0％，水分小于0.5％。
步骤6）和步骤7）所获得的样品采用高效液相色谱仪（HPLC）进行HPLC分析。
8）草乌甲素纯品中草乌甲素的含量采用高效液相色谱法进行检测，检测方法包括：
（1）色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH值至3.1±0.1）-乙腈（60∶40）为流动相；检测波长为260nm。
（2）对照品溶液的制备 取草乌甲素对照品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
（3）供试品溶液的制备 取本品约20mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
（4）测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
9）稳定性研究：按照《中国药典》2020年版四部9001稳定性研究有关技术指导原则要求进行加速条件下稳定性研究：
（1）将本发明所得草乌甲素装入棕色样品瓶中密封包装、在加速条件（温度40℃、相对湿度75%）下进行为期6个月的稳定性试验，结果见下表2：
（2）试验结果表明，本发明所得草乌甲素在加速条件（温度40℃，相对湿度75%）下放置6个月（相当于常温条件下保存3年），草乌甲素含量降低0.94%（按要求考察期内含量降幅应小于5%），本发明所得草乌甲素原料稳定。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作出进一步详细的描述。在附图中：
图1为草乌甲素对照品（中国食品药品检定研究院，批号100530-202103）的HPLC检测结果图；
图2为实施例1提供的制备方法所得到的草乌甲素的HPLC检测结果图；
图3为实施例2提供的制备方法所得到的草乌甲素的HPLC检测结果图；
图4为实施例3提供的制备方法所得到的草乌甲素的HPLC检测结果图；
图5为实施例4提供的制备方法所得到的草乌甲素的HPLC检测结果图；
图6为实施例5提供的制备方法所得到的草乌甲素的HPLC检测结果图；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，本领域技术人员可以通过借鉴本文内容，根据具体实际设备适当改进工艺参数实现。本发明的方法已经对草乌甲素制备进行了比较详细的描述，相关人员可在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更和组合，以实现和应用本发明方法。但本发明保护范围不局限于所述内容：
实施例1
1）取含有草乌甲素的直缘乌头药材60kg，粗碎，加3倍物料量的80%乙醇水溶液溶液浸泡，转移至不锈钢柱中渗漉提取，加9倍量80%乙醇水溶液进行提取，得提取液，备用；
2）步骤1）提取液浓缩至药材的1倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的5倍的水，备用；
3）步骤2）的备用液上样于AB-8大孔吸附树脂富集，先用水洗脱，再用30%乙醇水溶液洗脱，然后用80%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；浓缩至干，加投药重量的0.5 倍的90%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）步骤3）备用液经90%乙醇水溶液60℃温浸的活性炭脱色，收集90%乙醇水溶液过滤液，拌样，备用；
5）步骤4）拌样品经UniPSN 30-300色谱填料柱层析，先用饮用水进行洗脱，移弃；接着用50%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用80%乙醇水溶液溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）步骤5）干品用无水乙醇进行溶解，放置，静置，重结晶，用无水乙醇反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，即得草乌甲素，重量106.24g，转移率63.24%，经HPLC检测，纯度98.09%，水分0.45%。
实施例2
1）取含有草乌甲素的直缘乌头药材60kg，粗碎，加5倍物料量的85%乙醇水溶液溶液浸泡，转移至不锈钢柱中渗漉提取，加7倍量85%乙醇水溶液进行提取，得提取液，备用；
2）步骤1）提取液浓缩至药材的0.25倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的3倍的水，备用；
3）步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂LK1600N富集，先用水洗脱，再用50%乙醇水溶液洗脱，然后用90%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；浓缩至干，加投药重量的1倍的95%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）步骤3）备用液经95%乙醇水溶液60℃温浸硅藻土脱色，收集95%乙醇水溶液滤过液，拌样，备用；
5）步骤4）拌样品经UniPSN 30-500色谱填料柱层析，30%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用65%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用75%乙醇水溶液溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）步骤5）干品用乙酸乙酯进行溶解，放置，静置，重结晶，用乙酸乙酯反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，即得草乌甲素，重量102.67g，转移率61.11%，经HPLC检测，纯度97.95%，水分0.47%。
实施例3
1）取含有草乌甲素的直缘乌头药材60kg，粗碎，加5倍物料量的75%乙醇水溶液溶液浸泡，转移至不锈钢柱中渗漉提取，加12倍量75%乙醇水溶液进行提取，得提取液，备用；
2）步骤1）提取液浓缩至药材的0.5倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的4倍的水，备用；
3）步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂ADS-8富集，先用水洗脱，再用60%乙醇水溶液洗脱，然后用100%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；浓缩至干，加投药重量的0.8倍的100%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）步骤3）备用液经氧化铝进行脱色，收集醇洗脱液，拌样，备用；
5）步骤4）拌样品经LK1300SS色谱填料柱层析，40%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用70%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用90%乙醇水溶液溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）步骤5）干品用无水乙醇进行溶解，放置，静置，重结晶，用石油醚反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，即得草乌甲素，重量101.06g，转移率60.15%，经HPLC检测，纯度98.13%，水分0.38%。
实施例4
1）取含有草乌甲素的直缘乌头药材60kg，粗碎，加4倍物料量的80%乙醇水溶液溶液浸泡，转移至不锈钢柱中渗漉提取，加8倍量80%乙醇水溶液进行提取，得提取液，备用；
2）步骤1）提取液浓缩至药材的0.8倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的2倍的水，备用；
3）步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂HJ-03富集，先用水洗脱，再用50%乙醇水溶液洗脱，然后用90%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；浓缩至干，加投药重量的0.7倍的95%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）步骤3）备用液经95%乙醇水溶液60℃温浸的活性炭脱色，收集95%乙醇水溶液过滤液，拌样，备用；
5）步骤4）拌样品经LK1300SS色谱填料柱层析，40%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用55%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用90%乙醇水溶液溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）步骤5）干品用无水乙醇进行溶解，放置，静置，重结晶，用石油醚反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，即得草乌甲素，重量98.42g，转移率58.58%，经HPLC检测，纯度98.25%，水分0.34%。
实施例5
1）取含有草乌甲素的直缘乌头药材60kg，粗碎，加6倍物料量的80%乙醇水溶液溶液浸泡，转移至不锈钢柱中渗漉提取，加9倍量80%乙醇水溶液进行提取，得提取液，备用；
2）步骤1）提取液浓缩至药材的0.25倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的5倍的水，备用；
3）步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂HPD-100富集，先用水洗脱，再用40%乙醇水溶液洗脱，然后用85%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；浓缩至干，加投药重量的1倍的95%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）步骤3）备用液经硅胶脱色，收集90%乙醇水溶液过滤液，拌样，备用；
5）步骤4）拌样品经UniPSN 30-300色谱填料柱层析，20%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用60%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用85%乙醇水溶液溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）步骤5）干品用无水乙醇进行溶解，放置，静置，重结晶，用石油醚反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干，研细，即得草乌甲素，重量105.56g，转移率62.83%，经HPLC检测，纯度98.19%，水分0.41%。
Claims (6)
1.一种草乌甲素的制备方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：
1）含有草乌甲素的药材经乙醇水溶液提取，得提取液，残渣弃去；
2）将步骤1）提取液浓缩至药材的0.25~1倍，移弃油状物，得草乌甲素粗品，加投药重量的2~5倍的水，备用；
3）将步骤2）的备用液上样于大孔吸附树脂富集，先用水洗脱，再用30%~60%乙醇水溶液洗脱，然后用70%~100%乙醇水溶液洗脱，收集富含草乌甲素洗脱液；最后浓缩至干，加投药重量的0.5~1倍的90%~100%乙醇水溶液，静置，取上清液，备用；
4）将步骤3）备用液经脱色材料，收集脱色液，拌样，备用；
5）将步骤4）拌样品经色谱填料柱层析，先用0%～40%乙醇水溶液进行洗脱，移弃；接着用50%～70%乙醇水溶液洗脱，移弃；再用75%～90%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，经TLC薄层鉴别，洗脱液合并，回收溶剂至干，得干品；
6）将步骤5）干品用有机溶剂进行溶解，静置，重结晶，用有机溶剂反复洗涤至白色透明均一的晶体，烘干、研细，获得高纯度草乌甲素；
7）将步骤6）反复洗涤的溶剂收集，回收溶剂至干，得干品，溶解拌样，备用，重复步骤5）和步骤6）。
2.根据权利要求1所述的草乌甲素的制备方法，其特征在于，步骤3）的大孔吸附树脂为AB-8、ADS-8、HJ-03、LK1300S、LK1600N、LK37、HPD100其中的一种。
3.根据权利要求1所述的草乌甲素的制备方法，其特征在于，步骤4）的脱色材料为活性炭、硅藻土、氧化铝、硅胶、脱色树脂中的一种。
4.根据权利要求1所述的草乌甲素的制备方法，其特征在于，步骤5）的色谱填料为UniPSN 30-300、UniPSN 30-500、LK1300SS其中的一种。
5.根据权利要求1所述的草乌甲素的制备方法，其特征在于，步骤6）的有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚中的一种。
6.根据权利要求1所述的草乌甲素的制备方法，其特征在于，步骤7）所得高纯度草乌甲素采用HPLC检测纯度大于97.0％，水分小于0.5％。
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