CN117305514A - 一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，将待检病毒以新鲜悬浮培养基做稀释得到待检病毒液；利用新鲜悬浮培养基稀释BHK悬浮细胞的细胞密度，然后向细胞悬液补加TPCK胰酶；将稀释的含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液加至96孔细胞板的细胞孔中；将稀释好的待检病毒液加入到加有细胞悬液的细胞孔中，同时设阴性对照孔；将滴加有待检病毒液的96孔细胞板至于二氧化碳恒温摇床中振荡培养；培养结束的96孔细胞板逐孔取样检测红细胞凝集价HA，各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0，按Reed‑Muench法计算病毒细胞半数感染量。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，具体涉及一种使用全悬浮细胞测定鸡新城疫病毒含量的方法，属于病毒检测技术领域。
背景技术
鸡新城疫(ND)也叫亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。具有很高的发病率和病死率，长期以来给我国的养禽业带来了巨大的威胁。我国将其列为一类动物疫病。
目前，防治鸡新城疫的主要措施是疫苗接种，疫苗又分为活疫苗和灭活疫苗两大类，这两类疫苗均需要制备大量的新城疫病毒作为制苗用抗原液，抗原液的质量控制主要通过提高制苗用抗原液的病毒含量，目前只有通过使用SPF鸡胚法来检测新城疫病毒的病毒含量，但SPF鸡胚法检测新城疫病毒的病毒含量有一定的局限性，包括SPF鸡胚需要提前采购，价格较高，且易受货源及运输条件的影响；SPF鸡胚需要孵化至9-10日龄才能使用，耗时长，且操作不便等等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中鸡胚法检测新城疫病毒含量存在的不足，而提供一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，本发明方法病毒培养方式多样，更适合于即将大规模应用的悬浮细胞培养法培养的新城疫病毒检测，并且耗时短，操作简便。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，包括以下步骤：
(1)将待检病毒以新鲜悬浮培养基做10倍倍比稀释，选择合适稀释度的待检病毒液备用；
(2)利用新鲜悬浮培养基调整状态良好的BHK悬浮细胞的细胞密度，稀释好的细胞悬液补加TPCK胰酶，混匀，备用；
(3)将步骤(2)中将密度调整好的、含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中；
(4)将步骤(1)中稀释好的待检病毒液加入到步骤(3)中的加有细胞悬液的细胞孔中，同时设阴性对照孔；
(5)将步骤(4)中的滴加有待检病毒液的96孔细胞板至于二氧化碳恒温摇床中振荡培养，检测过程中每日早晚手动振摇检测板各一次，使各检测孔细胞完全悬起；
(6)将步骤(5)中培养结束的96孔细胞板逐孔取样检测红细胞凝集价HA，各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0，按Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量。
上述技术方案中，步骤(1)中，待检病毒为鸡胚尿囊液，或者是悬浮培养的鸡新城疫病毒。
上述技术方案中，步骤(1)中，以BHK悬浮培养基10倍倍比稀释待检病毒，分别取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度的病毒液，备用。
上述技术方案中，步骤(2)中，利用新鲜的BHK悬浮培养基将状态良好的BHK悬浮细胞调整细胞密度至0.5-1.0×106cells/ml，稀释好的细胞悬液补加TPCK胰酶至3-10ug/ml混匀，备用。
上述技术方案中，步骤(2)中，稀释好的细胞悬液的细胞密度分为0.2×106cell/ml，0.5×106cell/ml，1.0×106cell/ml，1.5×106cell/ml和2.0×106cell/ml；每个细胞密度的细胞悬液分别补加TPCK胰酶。
上述技术方案中，步骤(2)中，补加TPCK胰酶优选至7ug/ml。
上述技术方案中，步骤(3)中，悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中时，加入量为100ul/孔。
上述技术方案中，步骤(4)中，将稀释好的待检病毒液加入到96孔细胞板的细胞孔中时，每孔10ul，每个稀释度设5个复孔；同时设阴性对照孔5孔，每孔补加新鲜BHK悬浮培养基10ul。
上述技术方案中，步骤(5)中，将96孔细胞板至于37℃、130rpm，5％二氧化碳恒温摇床中振荡培养，96h后停止培养。
与现有技术相比，具有以下特点：
1、病毒培养方式多样，传统鸡胚检测法主要用于鸡胚法培养的鸡新城疫病毒，本细胞检测法适用于传统的鸡胚法培养的新城疫病毒，更适合于即将大规模应用的悬浮细胞培养法培养的新城疫病毒检测。
2、耗时短，操作简便，传统的鸡胚检测法需在接种病毒后培养120h，而方法只需要96h，且不需要提前采购并孵化鸡胚，细胞培养方便快捷稳定。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
下面结合具体的实施例对本发明进行阐述：
实施例1：
一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，测试细胞密度对检测灵敏度的影响，包括以下步骤：
(1)取一批次悬浮细胞培养鸡新城疫病毒Lasota株，以BHK悬浮培养基10倍系列稀释，分别取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度的病毒液，备用。
(2)利用新鲜BHK悬浮培养基调整状态良好的BHK悬浮细胞的细胞密度，将生长状态良好的BHK悬浮细胞以新鲜悬浮培养基分别调整细胞浓度至0.2×106cell/ml，0.5×106cell/ml，1.0×106cell/ml，1.5×106cell/ml和2.0×106cell/ml，每个细胞密度的细胞悬液各15ml，分别补加TPCK胰酶至7ug/ml，
(3)将步骤(2)中将密度调整好的、含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中，每孔100ul。
(4)将步骤(1)中稀释好的待检病毒液加入到步骤(3)中的加有细胞悬液的细胞孔中，每孔10ul，每个稀释度设5个复孔；同时设阴性对照孔5孔，每孔补加新鲜BHK悬浮培养基10ul。
(5)将步骤(4)中的滴加有待检病毒液的96孔细胞板至于37℃、130rpm，5％二氧化碳恒温摇床中振荡培养，检测过程中每日早晚手动振摇检测板各一次，使各检测孔细胞完全悬起；96h后停止培养。
(6)将步骤(5)中培养96h后的96孔细胞板逐孔取样检测红细胞凝集价HA，各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0，统计各稀释度HA阳性情况，计算各稀释度细胞感染的百分率，按Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量。
结果如表1所示，由表1可知，当细胞密度为0.5×106cell/ml或者1.0×106cell/ml时，新城疫病毒样品的病毒含量检测值最高，其他细胞密度实验组均低于以上两个细胞密度实验组。本发明实例说明，该病毒含量检测方法所使用的的细胞密度为0.5-1.0×106cell/ml时检测灵敏度最好。
表1为不同细胞密度待检病毒液的病毒感染率
实施例2：
一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，检测本发明方法对鸡胚毒和悬浮细胞毒检测的稳定性，包括以下步骤：
(1)分别选取两批次鸡胚法制备Lasota株病毒液(鸡胚法效价检测一致)和两批次BHK悬浮细胞培养制备Lasota株病毒液(鸡胚法效价检测一致)，分别以BHK悬浮培养基10倍系列稀释，分别取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度的病毒液，备用。
(2)将生长状态良好的BHK悬浮细胞以新鲜BHK悬浮培养基分别调整细胞浓度至0.5×106cell/ml，补加TPCK胰酶至7ug/ml。
(3)将步骤(2)中将密度调整好的、含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中，每孔100ul。
(4)将步骤(1)中稀释好的待检病毒液加入到步骤(3)中的加有细胞悬液的细胞孔中，每孔10ul，每个稀释度设5个复孔；同时设阴性对照孔5孔，每孔补加新鲜BHK悬浮培养基10ul。
(5)将步骤(4)中的96孔细胞板于37℃、130rpm，5％二氧化碳恒温摇床中振荡培养，检测过程中每日早晚手动振摇检测板各一次，使各检测孔细胞完全悬起，96h后停止培养。
(6)将培养96h后的检测板逐孔取样检测红细胞凝集价(HA)。各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0。按Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量。
结果如表2所示，由表2可知，该细胞检测法检测的两批次鸡胚毒的病毒含量差异不大，检测的悬浮细胞培养制备的病毒样品病毒含量检测结果一致。
表2不同病原的不同细胞密度待检病毒液的病毒感染率
本实施例说明，该细胞法病毒含量检测方法检测新城疫鸡胚源病毒和细胞源病毒具有良好的稳定性。
实施例3：
一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，检测本方法与鸡胚法病毒含量检测方法的平行性(一致性)，包括以下步骤：
1、鸡胚检测法分别选取一批次鸡胚法制备Lasota株病毒液和一批次BHK悬浮细胞培养制备Lasota株病毒液，以无菌PBS进行10倍系列稀释，取取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度的病毒，每个稀释度接种10日龄SPF鸡胚5枚，0.1ml/枚，37℃培养120h，各胚取样进行HA效价测定，HA效价不低于7log2，判定为感染。
2、细胞法检测
(1)选取上述两批次病毒样品分别以BHK悬浮培养基10倍系列稀释，分别取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度的病毒液，备用。
(2)将生长状态良好的BHK悬浮细胞以新鲜BHK悬浮培养基分别调整细胞浓度至0.5×106cell/ml，补加TPCK胰酶至7ug/ml；
(3)将步骤(2)中将密度调整好的、含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中，每孔100ul。
(4)将步骤(1)中稀释好的待检病毒液加入到步骤(3)中的加有细胞悬液的细胞孔中，每孔10ul，每个稀释度设5个复孔；同时设阴性对照孔5孔，每孔补加新鲜BHK悬浮培养基10ul。
(5)将步骤(4)中的96孔细胞板于37℃、130rpm，5％二氧化碳恒温摇床中振荡培养，检测过程中每日早晚手动振摇检测板各一次，使各检测孔细胞完全悬起，96h后停止培养。
(6)将培养96h后的检测板逐孔取样检测红细胞凝集价(HA)。各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0。按Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量。
结果如表3所示，由表3可知，分别用细胞法和鸡胚法检测的鸡胚毒的病毒含量差异不大，同时用两种方法检测悬浮细胞毒的病毒含量无差异。
表3不同检测方法下不同细胞密度待检病毒液的病毒感染率
本实施例说明，细胞法病毒含量检测方法与鸡胚法病毒含量检测方法检测新城疫病毒有良好的的一致性(平行性)。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种鸡新城疫病毒的病毒含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待检病毒以新鲜悬浮培养基做10倍倍比稀释，选择合适稀释度的待检病毒液备用；
(2)利用新鲜悬浮培养基调整状态良好的BHK悬浮细胞的细胞密度，稀释好的细胞悬液补加TPCK胰酶，混匀，备用；
(3)将步骤(2)中将密度调整好的、含TPCK胰酶的BHK悬浮细胞的细胞悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中；
(4)将步骤(1)中稀释好的待检病毒液加入到步骤(3)中的加有细胞悬液的细胞孔中，同时设阴性对照孔；
(5)将步骤(4)中的滴加有待检病毒液的96孔细胞板至于二氧化碳恒温摇床中振荡培养，检测过程中每日早晚手动振摇检测板各一次，使各检测孔细胞完全悬起；
(6)将步骤(5)中培养结束的96孔细胞板逐孔取样检测红细胞凝集价HA，各孔HA效价不低于1：2即判该孔为阳性，阴性对照孔HA应为0，按Reed-Muench法计算病毒细胞半数感染量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，待检病毒为鸡胚尿囊液，或者是悬浮培养的鸡新城疫病毒。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，以BHK悬浮培养基10倍倍比稀释待检病毒，分别取10-5、10-6、10-7、10-8四个稀释度的病毒液，备用。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，利用新鲜的BHK悬浮培养基将状态良好的BHK悬浮细胞调整细胞密度至0.5-1.0×106cells/ml，稀释好的细胞悬液补加TPCK胰酶至3-10ug/ml混匀，备用。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，稀释好的细胞悬液的细胞密度分为0.2×106cell/ml，0.5×106cell/ml，1.0×106cell/ml，1.5×106cell/ml和2.0×106cell/ml；每个细胞密度的细胞悬液分别补加TPCK胰酶。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，补加TPCK胰酶至7ug/ml。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，悬液以排枪加至96孔细胞板的细胞孔中时，加入量为100ul/孔。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，将稀释好的待检病毒液加入到96孔细胞板的细胞孔中时，每孔10ul，每个稀释度设5个复孔；同时设阴性对照孔5孔，每孔补加新鲜BHK悬浮培养基10ul。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，将96孔细胞板至于37℃、130rpm，5％二氧化碳恒温摇床中振荡培养，96h后停止培养。
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