CN117279521A - 用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物及用于改善骨代谢的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的技术问题在于提供:(1)用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、骨的用于改善骨代谢的组合物和/或用于抑制骨密度下降的组合物,其特征在于,含有通过在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的免疫细胞的培养上清或其处理物;(2)用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、骨的用于改善骨代谢的组合物和/或用于抑制骨密度下降的组合物,其特征在于,含有植物乳杆菌L‑137株(Lactobacillus plantarum L‑137)或其处理物。通过上述组合物来解决上述技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物及用于改善骨代谢的组合物。
背景技术
骨质疏松症为骨质变脆、容易骨折的疾病。骨中存在负责骨形成的成骨细胞与负责骨吸收的破骨细胞这两种细胞,然而有时会因破骨细胞活性化等,使得两种细胞的活性的平衡瓦解。并且,若保持骨吸收量相对于骨形成量相对上升的状态,则骨量减少,引起骨质疏松症。在日本国内,有约1000万人以上的患者,伴随高龄化,骨质疏松症的患者数量有增加的倾向。作为改善骨质疏松症的方法之一,已知有抑制破骨前体细胞(破骨细胞的前体细胞)向破骨细胞分化的方法等(专利文献1)。
另一方面,已知乳酸菌具有免疫赋活作用等(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2010-235534号公报
专利文献2:日本特开2010-6801号公报
发明内容
本发明要解决的技术问题
然而,通过在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的免疫细胞的培养上清会抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化、改善骨代谢是未知的。并且,乳酸菌植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137。以下,有时也称为“L-137株”)具有与上述免疫细胞的培养上清相同的作用是未知的。
解决技术问题的技术手段
本申请的发明人发现:(1)通过在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的培养物的培养上清具有抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用、骨代谢改善作用和/或骨密度下降抑制作用,优选具有抑制骨中的骨吸收特性的作用。另外,还得知:(2)乳酸菌植物乳杆菌L-137株具有与上述(1)的培养上清相同的效果;以及(3)(1)的培养上清与(2)L-137株对于骨质疏松症等的治疗或预防是有用的,进而反复进行研究,从而完成了本发明。
即,本发明为如下所示。
(1)一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物,其特征在于,其含有通过在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的培养上清或其处理物。
(2)一种用于改善骨代谢的组合物,其特征在于,其含有通过在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的培养上清或其处理物。
(3)根据所述(1)或(2)所述的组合物,其特征在于,乳酸菌为乳杆菌(Lactobacillus)属的菌。
(4)根据所述(1)~(3)中任一项所述的组合物,其特征在于,乳酸菌为植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)。
(5)一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物,其特征在于,其含有植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物。
(6)一种用于改善骨代谢的组合物,其特征在于,其含有植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物。
(7)根据所述(1)~(6)中任一项所述的组合物,其特征在于,其用于预防、改善和/或治疗骨质疏松症。
(8)根据所述(1)~(7)中任一项所述的组合物,其特征在于,其用于抑制骨密度下降。
(9)一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、用于改善骨代谢的组合物和/或用于抑制骨密度下降的组合物的制备方法,其特征在于,包括以下的工序(a)~(c)。
(a)在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞,得到培养物的工序;
(b)得到免疫细胞的培养上清或其处理物的工序,其包括从在工序(a)中得到的培养物中去除乳酸菌或其处理物及免疫细胞的步骤;及
(c)将在工序(b)中得到的培养上清或其处理物与载体和/或赋形剂混合的工序。
发明效果
根据本发明,可提供用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、用于改善骨代谢的组合物和/或用于抑制骨密度下降的组合物,优选提供用于预防、改善或治疗骨质疏松症的组合物。此外,还可提供这样的组合物的制备方法。
附图说明
图1示出了在破骨前体细胞中添加sRANKL(骨代谢研究用试剂)与免疫细胞的培养上清,经过48小时后对破骨前体细胞向破骨细胞的分化及骨吸收活性抑制进行评价的图表。
图2示出了在破骨前体细胞中添加sRANKL(骨代谢研究用试剂)与免疫细胞的培养上清,经过72小时后对破骨前体细胞向破骨细胞的分化及骨吸收活性抑制进行评价的图表。
图3示出了在破骨前体细胞中添加sRANKL(骨代谢研究用试剂)与L-137株,经过48小时后对破骨前体细胞向破骨细胞的分化及骨吸收活性抑制进行评价的图表。
图4示出了在破骨前体细胞中添加sRANKL(骨代谢研究用试剂)与L-137株,经过72小时后对破骨前体细胞向破骨细胞的分化及骨吸收活性抑制进行评价的图表。
图5示出了评价有无摄入含L-137株食品对人踵骨内的经标准化的超声传播速度(s-SOS)的影响的图表。白图表表示试验开始前,着色图表表示摄入组合物3个月后。Mean(+/-)SD、*:p<0.05v.s.试验开始前
具体实施方式
(1)免疫细胞的培养上清或其处理物
本发明包括用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物及骨的用于改善骨代谢的组合物,特别优选包括用于抑制骨吸收的组合物,所述组合物的特征在于,含有通过培养免疫细胞与乳酸菌或其处理物的混合物而得到的免疫细胞的培养上清或其处理物,优选实质上不含有为了得到培养上清而使用的该乳酸菌本身或其处理物本身。
另外,在本说明书中,有时也将破骨细胞的前体细胞简称为“破骨前体细胞”。此外,在本说明书中,“培养上清”通常是指通过例如离心分离对培养免疫细胞而得到的培养物进行分离而得到的上层澄清液。作为优选的离心分离的条件,例如可列举出1~40度、优选4~37度的温度、2000~20000rpm的转速等,但并不限定于此。
本发明中使用的乳酸菌没有特别限定,例如可使用属于乳杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属或双岐杆菌属等的乳酸菌等。进一步详细可列举出植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)或嗜热双歧杆菌(Bifidobacteriumthermophilum)、长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)或短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)等,但并不限定于此。
在本发明中,虽然没有特别限定,但免疫细胞优选为包含可吞噬(贪食)上述乳酸菌的细胞的细胞,优选为包含可吞噬植物乳杆菌属(Lactobacillus plantarum)的乳酸菌的细胞的细胞,更优选包含可吞噬植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137、保藏编号:FERM BP-08607号)的细胞的细胞。
另外,已知与本领域中广泛使用的乳杆菌属的乳酸菌、例如植物乳杆菌JCM1149株等相比,L-137株在细胞表面露出更多的脂磷壁酸(Lipoteichoic acid),容易被某种细胞吞噬(Int Immunopharmacol.2015,25(2)321-331)。详细情况不明,但这样的L-137株的性质可能对获得本发明的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制效果或骨代谢改善效果有用。
作为本发明中使用的优选的免疫细胞,例如可列举出包含巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞的细胞,但并不限定于此。免疫细胞可使用市售产品。作为这种市售产品,例如可适当列举出iQ Bioscience公司的IQB-MSP103、Charles RiverLaboratories Japan,Inc.、CLEA Japan,Inc.等推出的产品,但并不限定于此。
此外,作为本发明中使用的优选的破骨前体细胞,例如优选为利用RANKL(破骨细胞分化因子、receptor activator of NF-κB ligand)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor)等试剂分化诱导为破骨细胞的细胞,例如可列举出来自骨髓的单核细胞、巨噬细胞系的前体细胞、巨噬细胞样细胞等原代细胞、或它们的细胞株等,但并不限定于此。
以下,对在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞的方法进行说明。对于免疫细胞的培养方法,培养温度、培养时间可根据所使用的细胞适当选择,没有特别限定。培养温度例如没有特别限定,优选为30~40度,更优选为35~37度。此外,培养时间例如没有特别限定,优选为24~96小时,更优选为48~72小时。
作为在免疫细胞的培养中使用的培养基,没有特别限定,例如优选使用含有无机盐类、碳水化合物、氨基酸、维生素、蛋白质、肽、脂肪酸、脂质、血清等的培养基。也可以使用市售产品。例如作为公知的合成中广泛使用的培养基,可适宜地列举出RPMI1640、DMEM、MEM、MEMα、IMDM、McCoy’s5A等,但并不限定于此。
另外,对于破骨前体细胞的培养方法及培养基,可优选使用与上述免疫细胞相同的培养方法及培养基。
在本发明中,免疫细胞的培养上清的“处理物”优选为对利用本发明的方法得到的免疫细胞的培养物进行提纯或加工,并根据需要将其进一步离心分离而得到的物质,但并不限定于此。对得到的培养物进行提纯或加工时,可使用本领域中公知的例如自然过滤、微滤、超滤等方法。作为优选的离心分离的条件,例如可列举出1~40度(℃)、优选4~37度的温度、2000~20000rpm的转速等,但并不限定于此。另外,本发明的免疫细胞的培养上清或其处理物中,通常实质上不包含为了得到培养上清而使用的乳酸菌本身或其处理物本身及免疫细胞本身。
此外,在本发明中,可以直接使用免疫细胞的培养上清或其处理物,也可以通过冷冻干燥、低温干燥、喷雾干燥或L-干燥等或者组合这些方法制成粉末状进行使用。此外,这些处理物可以利用适当的溶剂(例如,水、醇、有机溶剂等)稀释进行使用,也可以添加适当的添加剂从而加工成凝胶或固体制剂等进行使用。
本发明的组合物中的免疫细胞的培养上清或其处理物的含量没有特别限定,在100质量%的组合物中,免疫细胞的培养上清或其处理物的含量例如可以在约0.1质量%~约100质量%的范围内,优选在约5质量%~约40质量%的范围内。
(2)植物乳杆菌L-137株
另外,作为与上述(1)不同的方案,本发明包含用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物及用于改善骨代谢的组合物,所述组合物的特征在于,含有乳酸菌植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137、保藏编号:FERM BP-08607号)。
对于破骨前体细胞及免疫细胞,如在上述(1)中说明所述。
本发明中所使用的乳酸菌植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(现:独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心,地址:邮政编码292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8 120号室),保藏编号:FERM BP-08607号(由平成7年11月30日保藏的FERM P-15317号进化转化)。另外,即使是植物乳杆菌L-137的变异株,只要具备植物乳杆菌L-137的特征则包含在植物乳杆菌L-137的范畴内。另外,其他乳酸菌与植物乳杆菌L-137株一同包含在本发明的组合物中。
本发明的组合物中的植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物的含量没有特别限定,在100质量%的组合物中,L-137株(Lactobacillusplantarum L-137)或其处理物的含量例如可以在约0.0001质量%~0.1质量%的范围内,优选在0.005~0.05质量%的范围内。
此外,在经口给予或注射给予时,本发明的植物乳杆菌L-137株(Lactobacillusplantarum L-137)或其处理物的摄入量可以根据摄入者的年龄及体重、症状、给予时间、剂型、给予方法、药剂的组合等决定。例如,以干燥灭活菌体计,设定一名成人(约60kg)每天优选摄入约0.5~200mg、更优选摄入约1~100mg、进一步优选摄入约2~50mg的植物乳杆菌L-137株。或者,以活菌换算,设定一名成人(约60kg)每天优选摄入约5×108~2×1011cfu(Colony forming unit;菌落形成单位)、更优选摄入约1×109~1×1011cfu的植物乳杆菌L-137。摄入次数可以为一天一次也可以分成多次而进行。当外用涂布时,可以根据所适用的皮肤面积适当选择植物乳杆菌L-137株或其处理物的涂布量,通常,相对于适用部位的面积约10cm2,该涂布量优选为每天约0.01~2.5mg,更优选为每天约0.02~1mg。可以使所述给予用量为每天一次或每天分为多次进行给予或适用。
关于上述(1)及(2)中记载的发明,以下,进一步对共通的部分进行说明。
[乳酸菌的培养]
在本发明中,植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)及其他乳酸菌可以为利用天然培养基、合成培养基及半合成培养基等培养基培养而得到菌株中的任一种。在本发明中,乳酸菌的培养可按照公知方法、本身已知的方法或根据这些方法的方法进行培养。
作为所述培养基,没有特别限定,例如优选使用含有氮源和/或碳源的培养基。作为所述氮源,没有特别限定,例如可列举出肉提取物、蛋白胨、谷蛋白、酪蛋白、酵母提取物或氨基酸等。作为所述碳源,没有特别限定,例如可列举出葡萄糖、木糖、果糖、肌醇、麦芽糖、糖稀、曲汁、淀粉、蔗渣、麸、糖蜜或甘油等。可以使用这些中的一种或组合使用两种以上。
除了所述氮源和/或碳源以外,所述培养基还可以进一步添加无机质。作为所述无机质,没有特别限定,例如可列举出硫酸铵、磷酸钾、氯化镁、食盐、铁、锰、钼或各种维生素类等,可以使用这些中的一种或组合使用两种以上。
只要能有效地进行培养,则植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)及其他乳酸菌的培养温度及培养时间没有特别限定,在本发明的一个方案中,培养温度例如通常可以为约25~40度(℃),优选为约27~35度,培养时间例如可以为约12~48小时。此外,在本发明的一个方案中,乳酸菌的培养可通过通气振荡来实施。此外,培养基的pH没有特别限定,在本发明的一个方案中,通常可以为约pH3~6,优选为约pH4~6。
〔乳酸菌的处理物〕
植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)及其他乳酸菌的“处理物”是指优选为将该乳酸菌进行加工而得到的物质或该乳酸菌的培养物,但并不限定于此。此外,菌可以为活菌,也可以为灭活菌体,从稳定性及操作容易性等角度出发,优选使用灭活菌体。该灭活菌体也可包含在乳酸菌的处理物中。
在本发明中,可以直接使用这样的处理物,也可以通过冷冻干燥、低温干燥、喷雾干燥或L-干燥等或者组合这些方法将其制成粉末状进行使用。此外,这些处理物可以利用适当的溶剂(水、醇、有机溶剂等)稀释进行使用,也可以添加适当的添加剂从而制成凝胶或固体制剂进行使用。
以下,对制作植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)及其他乳酸菌的灭活菌体的方法进行具体说明。
在本发明中,只要不损害本发明的效果则所述灭活菌体的制作方法没有特别限定,例如可通过下述方法中的任一种方法进行制作:(I)在培养结束后从培养液中分离出乳酸菌的活菌体后,对所述活菌体进行灭菌处理从而形成灭活菌体的状态的方法;(II)在培养液中对乳酸菌的活菌体进行灭菌处理形成灭活菌体的状态,然后从培养液中分离出所述灭活菌体的方法等。
作为从培养液中分离出菌体的方法,可采用该领域中通常使用的各种方法,没有特别限定。在本发明的一个方案中,具体而言,例如可采用通过离心分离等手段从培养液中去除上清,从而将培养液与菌体分离的方法等。另外,在该方案中,在向培养液中加入蒸馏水进行离心分离然后去除上清后,可以根据需要,反复进行几次向去除了上清的残留物中进一步加入蒸馏水进行离心分离的操作。在本发明的一个方案中,作为分离操作,还可以包括过滤工序。
接着,对植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)及其他乳酸菌的活菌体的灭菌处理方法进行具体说明。作为所述灭菌处理方法,没有特别限定,例如可列举出加热、紫外线照射、福尔马林处理等处理。另外,可以对所采集的活菌体进行所述灭菌处理,也可以对含有活菌体的培养液进行所述灭菌处理。
进行所述加热处理时,加热温度没有特别限定,例如通常可以为约60~100度(℃),优选为约70~90度。作为加热方法,可使用公知的方法,没有特别限定,例如可以为采用加热器等的方法。只要能够充分完成灭菌处理则加热时间没有特别限定,例如加热时间通常为达到所需的温度后的约5~40分钟,优选达到所需的温度后的约10~30分钟。
以上述方式得到的所述灭活菌体可以进一步进行磨碎、破碎或冷冻干燥处理等从而制成灭活菌体处理物。在本发明中,还可将所述灭活菌体处理物适用作灭活菌体。
[用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、骨的用于改善骨代谢的组合物、用于预防、改善或治疗骨质疏松症等的组合物、或者用于抑制骨密度下降的组合物]
本发明的组合物的特点在于具有抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的分化抑制作用和/或骨代谢改善作用。优选将组合物用于预防、改善或治疗骨质疏松症、成骨不全、高钙血症、骨软化症、骨钙流失症、骨溶解性骨病、骨坏死、类风湿性关节炎、骨关节炎、炎症性关节炎、骨髓炎、癌症或年龄增长等导致的骨损失、骨折或腰痛,更优选将组合物用于预防、改善或治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎或骨折,进一步优选将组合物用于预防、改善或治疗骨质疏松症,但并不限定于此。此外,进一步作为其他本发明的组合物优选实例可例举出组合物具有骨密度下降抑制作用的组合物,但并不限定于此。
作为本发明的组合物的优选的实例,为饮料食品用和/或医药品用(还包括兽药)。作为其他优选的实例,本发明的组合物可用作饮料食品用的添加剂。
作为饮料食品用、饮料食品用添加剂用或医药品用的组合物可将上述本发明的培养上清或其处理物、或者L-137株或其处理物进一步与药学上允许的载体、添加剂等进行适当掺合从而进行制剂化等。其制剂化方法或制剂化技术在以往已被充分确定,因此按照这些方法或技术进行实施即可。例如,作为医药品用时,具体而言,可制成片剂、包衣片片、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳剂等经口剂;注射剂、输液、栓剂、软膏、贴剂等非经口剂。关于载体或添加剂的掺合比例,根据饮料食品、医药品或兽医学领域中通常所采用的范围进行适当设定即可。
对于药学上允许的载体或添加剂没有特别限制,作为载体的实例,可列举出水性或油性基剂等各种载体,作为水性的载体,例如可列举出水、生理盐水、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、多糖胶类天然高分子类等,作为油性的载体,例如可列举出凡士林、角鲨烷、石蜡等适当的油类或蜡类等,但并不限定于此。
作为添加剂的实例,可列举出酶、pH调节剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、防霉剂、保鲜剂、漂白剂、光泽剂、香料、甜味剂、酸味剂、调味剂、苦味剂、乳化剂、增稠剂、稳定剂、凝胶化剂、糊料、赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等,但并不限定于此。与其相关的技术在以往已被充分确定,因此在本发明中按照这些技术进行实施即可。
此外,本发明的组合物为饮料食品用时,这样的饮料食品中包括健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品、病患用食品。饮料食品的形态没有特别限定,作为具体实例,例如可列举出作为所谓营养辅助食品或营养品的片剂、颗粒剂、散剂、健康饮品等。除此以外,例如可列举出茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料、营养饮料、果肉饮料、乳酸饮料等饮料;荞麦面、乌冬面、中华面,方便面等面类;糖、糖果、口香糖、巧克力、零食点心、饼干、果冻、果酱、奶油、烘焙点心、面包等点心及面包类;火腿、香肠、鱼糕、竹轮等水产·畜产加工食品;加工乳、发酵乳等乳制品;色拉油、天妇罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、打发奶油、调味汁等油脂及油脂加工食品;沙司、调味汁等调味剂;咖喱、炖菜、盖饭、粥、菜粥等蒸煮袋装食品;冰淇淋、冰糕等冰制点心等,但并不限定于此。与其相关的技术在以往已被充分确定,因此在本发明中按照这些技术进行即可。
另外,只要不损害本发明的效果,本发明的组合物中可以含有例如医学、药学、兽医学、畜产、饲料或食品等领域中已知的任意的成分。
〔抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用及骨代谢改善作用与其确认方法〕
作为确认本发明的组合物的效果的方法,例如可列举出确认下述效果的方法:与均不含培养上清或其处理物、或者L-137株或其处理物的组合物相比,含有本发明的培养上清或其处理物、或者含有植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物的组合物的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制活性和/或骨代谢改善活性优异。
具体而言,抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制效果和/或骨代谢改善效果的确认方法,例如可列举出添加RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)试剂后进行TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶:tartrate-resistant acid phosphatase)活性评价的方法等。作为分化诱导信号而已知的RANKL与破骨前体细胞的细胞膜上的受体(RANK)结合,并诱导向破骨细胞的分化。另一方面,破骨细胞由于对细胞质表现较强的TRAP活性,因此若评价添加或给予RANKL后的TRAP活性,则可确认进行了向破骨细胞的分化。即,此处的TRAP活性可以说是破骨前体细胞向破骨细胞分化的指标,此外,可认为若TRAP活性得以抑制,则骨破坏得以抑制,骨代谢也得以改善,因此,结果对确认有无骨质疏松症的抑制也是有效的。另外,在本申请的说明书中,骨代谢得以改善是指例如生物体内的骨形成与骨吸收的平衡处于更良好的状态。
另外,也可以使用除上述以外的公知的骨评价、骨分化确认用试剂,可按照ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay:利用特异抗体或抗原捕捉试剂溶液中所含的目标抗原或抗体、同时利用酶反应进行检测·定量的方法)、Bone resorption assay(pitformation assay)等本领域中已充分确立的方法进行评价。
作为上述方法的一个实例,可参照后述的实施例。
〔骨密度下降抑制作用与其确认方法〕
作为确认本发明的组合物的骨密度下降抑制效果的方法,例如可列举出确认下述效果的方法:与均不含培养上清或其处理物、或者L-137株或其处理物的组合物相比,含有本发明的培养上清或其处理物、或者植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物的组合物的骨密度下降抑制作用优异。
具体而言,作为骨密度下降抑制效果的确认方法,例如可列举出测定每单位时间的超声波传播距离(m/sec)、即测定骨内的超声波传播速度(Speed Of Sound、SOS)的方法。
本方法具有无需暴露于放射线而可以对孕妇或小孩进行测定的优点。SOS通常在踵骨出进行测定,其与像踵骨这样包含大量骨松质的部位的骨密度具有高相关性。当SOS的值较大时,骨密度较高。SOS的定义或基准值因测定机型或其制造公司而有所不同,为了确保机型间的测定值的互换性,也可使用标准化的超声波传播速度(standardized-SOS:s-SOS)。在本发明中,例如可使用Benus evo(SHIBUYA CORPORATION制造),也可使用本领域中公知的其他设备。另外,也存在仅以骨密度即可说明大部分(约7成左右)骨强度的说法,本方法对于确认有无抑制骨质疏松症也是有效的。
上述SOS法被分类为定量的超声波测定法(QUS:quantitative ultrasound),此外,还有测定宽带超声衰减(BUA:broadband ultrasound attenuation)的方法等,除SOS法以外的QUS法也可以用于本发明的组合物的评价等。此外,还可以使用除上述以外的公知的骨密度测定方法、例如DEA(dual energy X ray absorptiometry、双能X射线吸收法)法、MD(microdensitometry、微密度)法、RA(radiographic absorptiometry、射线吸收)法、定量CT(QCT)测定法等,还可以测定大腿骨、脊椎、桡骨等部位以代替上述踵骨,或者也可以测定踵骨以及大腿骨、脊椎、桡骨等部位,但并不限定于此。
将本发明的组合物制成饮料食品、动物用饲料、医药品(包括动物用医药)或准药品的形态时,鉴于本发明的组合物的作用,可在该饮料食品、饲料、医药品或准药品的附带说明书或其包装盒等上标示出其具有抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用及骨代谢改善作用的主旨。
在本发明的组合物中,相对于组合物的总量,优选包含约0.1~100重量%、更优选包含约5~60重量%、进一步优选包含约20~40重量%的培养上清或其处理物。
此外,在本发明的组合物中,相对于组合物的总量,优选包含约0.001~10重量%、更优选包含约0.01~1重量%、进一步优选包含约0.05~0.5重量%的植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物。
[用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物和/或用于改善骨代谢的组合物的制备方法]
本发明优选包括用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物和/或用于改善骨代谢的组合物的制备方法,其特征在于,包括以下的工序(a)~(c)。
(a)在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞,得到培养物的工序;
(b)得到免疫细胞的培养上清或其处理物的工序,其包括从在工序(a)中得到的培养物中去除乳酸菌或其处理物及免疫细胞的步骤;及
(c)将在工序(b)中得到的培养上清或其处理物与载体和/或赋形剂混合的工序
在上述工序(a)中,当使包含免疫细胞的培养液与乳酸菌或其处理物接触而得到混合物时,没有特别限定,优选免疫细胞吞噬(贪食)乳酸菌或其处理物(优选L-137株)。
此外,在上述工序(b)中,作为从在工序(a)中得到的混合物中去除乳酸菌或其处理物及免疫细胞的方法的优选的实例,可列举出通过离心分离等本领域公知的方法从该混合物中去除乳酸菌或其处理物及免疫细胞的方法,但并不限定于此。
另外,作为上述工序(c)中使用的优选的载体,以往在食品或医药领域已被充分确定,因此本发明中按照所确定的进行选择即可,例如可列举出水性或油性基剂等各种载体,作为水性的载体,例如可列举出水、生理盐水、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、多糖胶类天然高分子类等,作为油性的载体,例如可列举出凡士林、角鲨烷、石蜡等适当的油类或蜡类等,但并不限定于此。
此外,作为上述工序(c)中使用的优选的赋形剂,以往在食品或医药领域已被充分确定,因此本发明按照所确定的进行选择即可,例如可优选使用乳糖、白糖、甘露醇、玉米淀粉、粉状纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙等,但并不限定于此。
作为本发明的组合物,除了在组合物中添加本发明的培养上清或其处理物、或者植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物以外,还可以通过通常的组合物的制备方法进行适当加工及制备。即,本发明包含一种组合物的制备方法,该制备方法进一步含有将培养上清或其处理物与根据需要的其他成分混合的工序。或者,本发明包含一种组合物的制备方法,其含有将植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物与根据需要的其他成分混合的工序。
在将培养上清或其处理物、或者植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarumL-137)或其处理物与其他成分混合的工序中,优选通过公知的方法或本身公知的方法进行混合或搅拌,使得各成分在组合物整体中变得均匀。混合或搅拌的方法在该领域中已被充分确定,因此按照所确定的方法进行实施即可。
实施例
以下,列举出实施例及比较例等对本发明进一步进行具体说明,但本发明并不受这些实施例的限定。
[试验例1]培养上清带来的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制及骨吸收活性抑制的评价
试验方法:<1.得到培养上清的工序>
将免疫细胞(购自CLEAJapan,Inc.的来自小鼠的脾细胞)以成为5.0×106cells/mL的方式悬浮于含10%FBS的RPMI1640培养基中,制成免疫细胞悬浮液。利用含10%FBS的RPMI1640以使植物乳杆菌L-137灭活菌体为1000ng/mL的方式进行悬浊,制成免疫细胞刺激用检测液。将免疫细胞刺激用检测液与免疫细胞悬浮液各100μL添加于96孔培养板中(免疫细胞最终浓度:2.5×106cells/mL、菌体最终浓度:500ng/mL),在5%CO2恒温箱内于37℃培养24小时,得到上清。对所得到的上清进行离心分离(条件:20℃、2,000rpm、20分钟),得到去除了L-137株与免疫细胞的培养上清。
<2.破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化诱导工序>
使用仅利用RANKL诱导为破骨细胞且为来自小鼠的单核细胞白血病细胞株的破骨细胞前体细胞RAW264.7(ECACC株编号91062702;DS Pharma Biomedical Co.,Ltd)进行破骨细胞分化评价。以使破骨前体细胞RAW264.7细胞为7.0×104cells/mL的方式利用含10%FBS的MEMα培养基将其悬浮,并以每孔50μL添加至96孔培养板(3,500cells/孔)中。进一步,利用含10%FBS的MEMα培养基将sRANKL(产品编号47187000;Oriental Yeast Co.,ltd.)稀释至267ng/mL,将其以每孔75μL添加至添加有上述RAW264.7细胞的96孔培养板中。进一步添加12.5μL、25μL、75μL的以L-137刺激的免疫细胞的培养上清。向添加了12.5μL的培养上清的孔中添加62.5μL的含10%FBS的MEMα培养基,向添加了25μL的培养上清的孔中添加50μL的含10%FBS的MEMα培养基,使总量为200μL。即,使sRANKL的最终浓度为100ng/mL、免疫细胞的培养上清比例为6.25%、12.5%、37.5%(v/v),在5%CO2恒温箱内于37℃进行48小时、72小时的分化诱导培养。
<3.TRAP活性测定工序>
分化诱导培养后,去除上清,以每孔100μL向加入有细胞的96孔培养板中添加以1:1的比例混合了丙酮与乙醇的固定液。经过1分钟后,去除固定液,风干30分钟。然后,按照TRAP solution kit(产品编号NIB 47249000;Oriental Yeast Co.,ltd.)进行操作,使用读板机在415nm下测定吸光度。
结果:评价结果如下述的表1及图1~2中记载所示。在48小时培养后及72小时培养后,上述得到的免疫细胞的培养上清显示出依赖于浓度的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用及骨中的骨吸收抑制作用。
[表1]
[试验例2]L-137株带来的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制及骨吸收活性抑制的评价
试验方法:<1.破骨细胞分化诱导工序>
使用仅利用RANKL诱导为破骨细胞且为来自小鼠的单核细胞白血病细胞株的破骨细胞前体细胞RAW264.7(ECACC株编号91062702;DS Pharma Biomedical Co.,Ltd)进行破骨细胞分化评价。以使破骨前体细胞RAW264.7细胞为7.0×104cells/mL的方式利用含10%FBS的MEMα培养基将其悬浮,并以每孔50μL添加至96孔培养板(3,500cells/孔)中。进一步,利用含10%FBS的MEMα培养基将sRANKL(产品编号47187000;Oriental Yeast Co.,ltd.)稀释至267ng/mL,将其以每孔75μL添加至添加有上述RAW264.7细胞的96孔培养板中。进一步使植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)的灭活菌体为134ng/mL、1.34μg/mL、13.4μg/mL的方式用含10%FBS的MEMα培养基将其悬浮,以每孔75μL添加至添加有RAW264.7细胞的96孔培养板中,使总量为200μL。即,使sRANKL的最终浓度为100ng/mL、L-137灭活菌体的最终浓度为50ng/mL、500ng/mL、5μg/mL,在5%CO2恒温箱内于37℃进行48小时、72小时的分化诱导培养。
<2.TRAP活性测定工序>
分化诱导培养后,去除上清,以每孔100μL向加入有细胞的96孔培养板中添加以1:1的比例混合了丙酮与乙醇的固定液。经过1分钟后,去除固定液,风干30分钟。然后,按照TRAP solution kit(产品编号NIB 47249000;Oriental Yeast Co.,ltd.)进行操作,使用读板机在415nm下测定吸光度。
结果:评价结果如下述的表2及图3~4中记载所示。在48小时培养后及72小时培养后,乳酸菌L-137株显示出依赖于浓度的抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用及骨吸收抑制作用。
[表2]
[试验例3]含有乳酸菌L-137株的组合物带来的骨密度下降抑制作用的评价
试验方法:<1.所使用的组合物>
作为本发明的组合物,使用每1片(300mg)中包含10mg经加热处理的植物乳杆菌L-137株的市售的片剂(产品名称:まもり高める乳酸菌L-137营养保健品)。片剂还可包含除L-137株以外的成分(乳糖、淀粉、蔗糖脂肪酸酯等),这些成分对以下的实验没有特别影响。
<2.组合物的摄入与s-SOS的测定>
将31名40~73岁的男女受试者分成2组(非摄入组:10名、L-137株摄入组:21名)。L-137株摄入组以一天一片的量摄入含有L-137株的上述组合物3个月。
在试验开始前及摄入组合物3个月后,对各受试者的踵骨测定s-SOS。用乙醇洗净受试者的一个脚跟周边,充分涂布超声波检查用凝胶。凝胶晕染后,向受试者的脚跟插入装置测定部进行测定,得到s-SOS。
使用Benus evo(SHIBUYACORPORATION制造)进行受试者的踵骨的s-SOS评价。
结果:评价结果如图5中记载所示。从试验开始前至3个月后,含L-137株组合物的非摄入组的s-SOS日渐显著下降(即骨密度下降)。与之相对,从试验开始前至3个月期间,含L-137株组合物的摄入组的s-SOS未看到显著差异(即,骨密度下降得以抑制)。
由上述结果可知,本发明的含有乳酸菌L-137株的组合物明显表现出了骨密度下降抑制作用。另外,使用采用了以试验例1的方法得到的培养上清或其处理物代替L-137株的组合物时,也可期待同样的效果。
工业实用性
(1)包含本发明的免疫细胞的培养上清的组合物、及(2)包含乳酸菌L-137株的组合物分别独立地具有抑制破骨前体细胞向破骨细胞分化的分化抑制作用、骨代谢改善作用和/或骨密度下降抑制作用。因此,(1)及(2)的组合物可用作骨质疏松症的预防·治疗药、进一步可用作饮料食品、饲料、医药品或准药品及化妆品等。
Claims (9)
1.一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物,其特征在于,其含有在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的培养上清或其处理物。
2.一种用于改善骨代谢的组合物,其特征在于,其含有在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞而得到的培养上清或其处理物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其特征在于,所述乳酸菌为乳杆菌(Lactobacillus)属的菌。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物,其特征在于,所述乳酸菌为植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)。
5.一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物,其特征在于,其含有植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物。
6.一种用于改善骨代谢的组合物,其特征在于,其含有植物乳杆菌L-137株(Lactobacillus plantarum L-137)或其处理物。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的组合物,其特征在于,其用于预防、改善和/或治疗骨质疏松症。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的组合物,其特征在于,其用于抑制骨密度下降。
9.一种用于抑制破骨前体细胞分化为破骨细胞的组合物、用于改善骨代谢的组合物和/或用于抑制骨密度下降的组合物的制备方法,其特征在于,包括以下的工序(a)~(c),
(a)在乳酸菌或其处理物的存在下培养免疫细胞,得到培养物的工序;
(b)得到免疫细胞的培养上清或其处理物的工序,其包括从在工序(a)中得到的培养物中去除乳酸菌或其处理物及免疫细胞的步骤;及
(c)将在工序(b)中得到的培养上清或其处理物与载体和/或赋形剂混合的工序。
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