WO2022244447A1 - 破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨代謝改善用組成物 - Google Patents

破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨代謝改善用組成物 Download PDF

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cells
lactic acid
processed product
osteoclasts
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PCT/JP2022/013051
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翼 中嶋
幸平 北村
寛子 中井
義隆 廣▲瀬▼
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ハウスウェルネスフーズ株式会社
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a composition for suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and a composition for improving bone metabolism.
  • Osteoporosis is a disease that makes bones fragile and prone to fracture. Bone contains two types of cells: osteoblasts responsible for bone formation and osteoclasts responsible for bone resorption. Sometimes. If the state in which the amount of bone resorption relatively exceeds the amount of bone formation continues, bone mass decreases and osteoporosis develops. There are about 10 million or more patients in Japan, and the number of patients with osteoporosis tends to increase as the population ages. As one method for improving osteoporosis, it is known to suppress the differentiation of osteoclast precursor cells (osteoclast precursor cells) into osteoclasts (Patent Document 1). On the other hand, lactic acid bacteria are known to have an immunostimulatory effect (Patent Document 2).
  • JP 2010-235534 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-6801
  • the culture supernatant of immune cells obtained by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof suppresses the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and improves bone metabolism.
  • the lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum L-137 (hereinafter also referred to as "L-137 strain") has the same effect as the above-described immune cell culture supernatant. is not known.
  • the culture supernatant of a culture obtained by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof has an inhibitory effect on differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts, bone metabolism It has been found that it has an improving action and/or an inhibitory action on bone density loss, preferably an inhibitory action on bone resorption properties in bone.
  • the lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum L-137 strain has the same effect as the culture supernatant of (1) above, and (3) the culture supernatant of (1) and (2) L- 137 strain was found to be useful for the treatment or prevention of osteoporosis and the like, and further studies were conducted to complete the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A composition for suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts, characterized by containing a culture supernatant obtained by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof, or a processed product thereof. thing.
  • [2] A composition for improving bone metabolism, comprising a culture supernatant obtained by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof, or a processed product thereof.
  • [3] The composition according to [1] or [2] above, wherein the lactic acid bacterium belongs to the genus Lactobacillus.
  • a composition for suppressing osteoclast differentiation of osteoclast precursor cells comprising Lactobacillus plantarum L-137 or a processed product thereof.
  • a composition for suppressing differentiation of osteoclast progenitor cells into osteoclasts, improving bone metabolism and/or suppressing decrease in bone density comprising the following steps (a) to (c): Production method. (a) obtaining a culture by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof; (b) obtaining a culture supernatant of immune cells or a processed product thereof, comprising removing lactic acid bacteria or a processed product thereof and immune cells from the culture obtained in step (a), and (c) step ( Step of mixing the culture supernatant obtained in b) or its processed material with a carrier and/or an excipient
  • a composition for suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts a composition for improving bone metabolism and/or a composition for suppressing bone density loss, preferably a composition for preventing, improving or treating osteoporosis can provide things. Also, methods of making such compositions can be provided.
  • Fig. 1 shows differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and bone resorption activity after 48 hours after addition of sRANKL (bone metabolism research reagent) and culture supernatant of immune cells to osteoclast precursor cells.
  • FIG. 10 shows a graph evaluating inhibition.
  • Fig. 2 shows differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and bone resorption activity after 72 hours of addition of sRANKL (bone metabolism research reagent) and culture supernatant of immune cells to osteoclast precursor cells.
  • FIG. 10 shows a graph evaluating inhibition.
  • Figure 3 shows the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and suppression of bone resorption activity after 48 hours after adding sRANKL (reagent for bone metabolism research) and L-137 strain to osteoclast precursor cells.
  • FIG. 4 shows the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and suppression of bone resorption activity after 72 hours after addition of sRANKL (bone metabolism research reagent) and L-137 strain to osteoclast precursor cells. Shows the evaluated graph.
  • FIG. 5 shows a graph evaluating the influence of the presence or absence of intake of L-137 strain-containing food on the standardized ultrasound propagation velocity (s-SOS) in the human calcaneus. The white graph indicates before the start of the test, and the colored graph indicates 3 months after taking the composition.
  • the present invention contains an immune cell culture supernatant or a processed product thereof obtained by culturing a mixture of immune cells and lactic acid bacteria or a processed product thereof.
  • progenitor cells of osteoclasts may be abbreviated as "osteoclast progenitor cells”.
  • culture supernatant generally refers to a supernatant obtained by separating a culture obtained by culturing immune cells, for example, by centrifugation.
  • Preferable centrifugation conditions include, but are not limited to, a temperature of 1 to 40°C, preferably 4 to 37°C, and a rotation speed of 2000 to 20000 rpm.
  • lactic acid bacteria used in the present invention are not particularly limited, for example, lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, or Bifidus can be used. More specifically, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum , Lactobacillus paracasei, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis ( Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Lactococcus plantarum or Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium longum) or Bifidobacterium breve, but not limited thereto.
  • immune cells are preferably cells including cells that can eat (phagocytose) the lactic acid bacteria described above, preferably of the genus Lactobacillus plantarum.
  • Cells containing cells capable of consuming lactic acid bacteria, more preferably cells capable of consuming Lactobacillus plantarum L-137 is a cell containing
  • the L-137 strain exposes more lipoteichoic acid to the cell surface than the lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus commonly used in the field, such as the Lactobacillus plantarum JCM1149 strain. It is known to be easily eaten by seed cells (Int Immunopharmacol. 2015, 25(2) 321-331). Although the details are unknown, such properties of the L-137 strain may be useful for obtaining the effect of suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts or the effect of improving bone metabolism according to the present invention.
  • Preferred immune cells for use in the present invention include, but are not limited to, cells including macrophages, natural killer (NK) cells, dendritic cells, B cells, and T cells.
  • NK natural killer
  • Commercially available immune cells may be used. Suitable examples of such commercially available products include, but are not limited to, products handled by iQ Bioscience's IQB-MSP103, Japan Charles River Co., Ltd., Japan Clea Co., Ltd., and the like.
  • Preferred osteoclast progenitor cells used in the present invention include, for example, RANKL (receptor activator of NF- ⁇ B ligand), GM-CSF (Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor), and other reagents to induce differentiation into osteoclasts.
  • Cells derived from the cells are preferred, and examples thereof include, but are not limited to, primary cells such as bone marrow-derived monocytes, macrophage lineage progenitor cells, macrophage-like cells, and cell lines thereof.
  • the culture temperature and culture time may be appropriately selected depending on the cells to be used, and are not particularly limited.
  • the culture temperature is, for example, although not particularly limited, preferably 30 to 40 degrees, more preferably 35 to 37 degrees.
  • the culture time is not particularly limited, but is preferably 24 to 96 hours, more preferably 48 to 72 hours.
  • the medium used for culturing immune cells is not particularly limited, and for example, those containing inorganic salts, carbohydrates, amino acids, vitamins, proteins, peptides, fatty acids, lipids, serum and the like are preferably used.
  • a commercially available product may be used.
  • known synthetic general-purpose media preferably include, but are not limited to, RPMI1640, DMEM, MEM, MEM ⁇ , IMDM, McCoy's5A, and the like.
  • the culture method and medium for osteoclast precursor cells the same ones as those for immune cells described above can be preferably used.
  • the “processed product” of the immune cell culture supernatant is preferably a product obtained by purifying or processing the immune cell culture obtained by the method of the present invention and, if necessary, further centrifuging it. but not limited to these. Methods known in the art, such as gravity filtration, microfiltration, ultrafiltration, etc., may be used in purifying or processing the resulting culture. Preferable conditions for centrifugation include, but are not limited to, a temperature of 1 to 40° C., preferably 4 to 37° C., and a rotation speed of 2000 to 20000 rpm.
  • the immune cell culture supernatant or treated product thereof of the present invention generally does not substantially contain the lactic acid bacteria used to obtain the culture supernatant, the treated product thereof, or the immune cells themselves.
  • the culture supernatant of immune cells or a processed product thereof may be used as it is, or may be used in powder form by freeze-drying, low-temperature drying, spray-drying, L-drying, or a combination thereof. good too.
  • the treated product may be diluted with an appropriate solvent (e.g., water, alcohol, organic solvent, etc.) and used, and may be used after adding an appropriate additive and processing such as gel or solid formulation. good too.
  • the content of the immune cell culture supernatant or its processed product in the composition of the present invention is not particularly limited, but in 100% by mass of the composition, for example, in the range of about 0.1% to about 100% by mass and preferably in the range of about 5% to about 40% by weight.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain Further, the present invention provides, as a different aspect from the above (1), lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum L-137 (Accession number: FERM BP -08607), a composition for suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and a composition for improving bone metabolism. Osteoclast precursor cells and immune cells are as described in (1) above.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) used in the present invention is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (now: National Institute of Technology and Evaluation Patent Organism Depository). Center; Address: Zip code 292-0818, Room 120, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan), Accession number: FERM BP-08607 (FERM P deposited on November 30, 1995) -15317). It should be noted that mutants of Lactobacillus plantarum L-137 having the characteristics of Lactobacillus plantarum L-137 fall under the category of Lactobacillus plantarum L-137. In addition to Lactobacillus plantarum L-137 strain, other lactic acid bacteria may be contained in the composition of the present invention.
  • the content of the Lactobacillus plantarum L-137 strain or its processed product in the composition of the present invention is not particularly limited, but is, for example, about 0.00% per 100% by mass of the composition. 0001 mass % to 0.1 mass %, preferably 0.005 to 0.05 mass %.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) or its processed product of the present invention is, in the case of oral or injection administration, the age and weight of the ingestor, symptoms, administration time, It can be determined depending on the dosage form, administration method, drug combination, and the like.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain per adult (about 60 kg) per day, Lactobacillus plantarum L-137 strain is preferably about 0.5 to 200 mg, more preferably about 1 to 100 mg, more preferably about 2 as dried dead cells. It is preferable to set up so that ⁇ 50 mg is taken.
  • Lactobacillus plantarum L-137 is preferably about 5 ⁇ 10 8 to 2 ⁇ 10 11 cfu (Colony forming unit) per adult (about 60 kg) per day in terms of viable bacteria, and more Preferably, it is set to ingest about 1 ⁇ 10 9 to 1 ⁇ 10 11 cfu.
  • the frequency of ingestion may be once a day or divided into multiple times.
  • the amount of Lactobacillus plantarum L-137 strain or its processed product can be selected as appropriate.
  • the above administration dose may be administered or applied in divided doses from once to several times per day.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain and other lactic acid bacteria may be cultured in any medium such as natural medium, synthetic medium and semi-synthetic medium.
  • lactic acid bacteria may be cultured according to a known method, a method known per se, or a method analogous thereto.
  • the medium is not particularly limited, and for example, one containing a nitrogen source and/or a carbon source is preferably used.
  • the nitrogen source is not particularly limited, and examples thereof include meat extract, peptone, gluten, casein, yeast extract, amino acids, and the like.
  • the carbon source is not particularly limited, and examples thereof include glucose, xylose, fructose, inositol, maltose, starch syrup, koji juice, starch, bagasse, wheat bran, molasses, and glycerin. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the medium may further contain minerals.
  • the inorganic substance is not particularly limited, and examples thereof include ammonium sulfate, potassium phosphate, magnesium chloride, salt, iron, manganese, molybdenum, and various vitamins. may
  • the culture temperature and culture time of Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) and other lactic acid bacteria are not particularly limited as long as the culture can be carried out efficiently. may be, for example, usually about 25 to 40° C., preferably about 27 to 35° C., and the culture time may be, for example, about 12 to 48 hours. Moreover, in one aspect of the present invention, lactic acid bacteria may be cultured by aeration shaking. Also, the pH of the medium is not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, it may be generally about pH 3-6, preferably about pH 4-6.
  • Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) and other lactic acid bacterium "processed product” is preferably a processed product of the lactic acid bacterium or a culture of the lactic acid bacterium, but limited to these not.
  • the bacteria may be viable or dead, but from the viewpoint of stability and ease of handling, it is preferable to use dead cells. This dead cell is also included in the processed product of lactic acid bacteria.
  • such a processed product may be used as it is, or may be used in the form of powder by freeze-drying, low-temperature drying, spray-drying, L-drying, or a combination thereof.
  • these treated products may be used after being diluted with an appropriate solvent (water, alcohol, organic solvent, etc.), or may be used after adding an appropriate additive to form a gel or solid.
  • a method for preparing dead cells of Lactobacillus plantarum L-137 and other lactic acid bacteria will be specifically described below.
  • the method for preparing the dead cells is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not lost.
  • a method of sterilizing the cells to make them dead (II) sterilizing the live cells of lactic acid bacteria in a culture solution to make them dead, and then removing the dead cells from the culture solution. It may be prepared by any method such as a method of separation.
  • a variety of methods commonly used in this field may be employed as the method for isolating the bacterial cells from the culture solution, and is not particularly limited.
  • a method of separating the culture solution and the bacterial cells by removing the supernatant from the culture solution by means of centrifugation or the like may be employed.
  • the separation operation may include a filtration step.
  • the sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include heat treatment, ultraviolet irradiation, formalin treatment, and the like.
  • the sterilization treatment may be performed on the collected viable cells or on the culture solution containing the viable cells.
  • the heating temperature is not particularly limited, but may be, for example, usually about 60 to 100 degrees (°C), preferably about 70 to 90 degrees.
  • the heating means a known method can be used, and there is no particular limitation.
  • means such as a heater may be used.
  • the heating time is not particularly limited as long as the sterilization treatment can be sufficiently completed.
  • the heating time may be usually about 5 to 40 minutes, preferably about 10 to 30 minutes after reaching the desired temperature.
  • the dead cells obtained as described above may be further subjected to grinding, crushing, freeze-drying, or the like to obtain a treated dead cell.
  • the treated dead cells can also be suitably used as dead cells.
  • composition of the present invention is characterized by having an effect of suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and/or an effect of improving bone metabolism.
  • the composition is useful for osteoporosis, osteogenesis imperfecta, hypercalcemia, osteomalacia, ostecalcification, osteolytic bone disease, osteonecrosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, inflammatory arthritis, bone marrow
  • the composition is used for the prevention, improvement or treatment of bone loss, bone fracture, or lumbago due to inflammation, cancer, aging, etc., or the prevention, improvement or treatment of osteoporosis, rheumatoid arthritis or bone fracture.
  • the composition is used for prevention, amelioration, or treatment of osteoporosis, but is not limited to these cases.
  • Another or further preferable example of the composition of the present invention includes, but is not limited to, a composition having a bone mineral density reduction inhibitory effect.
  • compositions of the present invention are for food and drink and/or pharmaceuticals (including veterinary drugs).
  • the composition of the present invention is used as an additive for food and drink.
  • Compositions for food and drink, food and drink additives, or pharmaceuticals are the above-described culture supernatant of the present invention or its processed product, or the L-137 strain or its processed product and a pharmaceutically acceptable A carrier, an additive and the like can be appropriately blended to form a formulation or the like. Formulation methods and formulation techniques for this purpose have been well established in the past, and may be followed.
  • oral agents such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, liquids, suspensions, emulsions, injections, infusions, suppositories, ointments
  • Parenteral agents such as patches
  • the mixing ratio of the carrier or additive may be appropriately set based on the range normally employed in the food and beverage, pharmaceutical, or veterinary fields.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or additives are not particularly limited, but examples of carriers include various carriers such as aqueous or oily bases, and examples of aqueous carriers include water, physiological saline, and ethanol. , glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylic acid, polysaccharide gum-based natural polymers, etc.
  • oily carriers include petrolatum, squalane, Suitable oils such as paraffin, waxes and the like include, but are not limited to.
  • additives include enzymes, pH adjusters, preservatives, bactericides, antioxidants, antifungal agents, shelf life improvers, bleaches, brighteners, flavors, sweeteners, acidulants, seasonings, and bitterness.
  • composition of the present invention when used for food and drink, such food and drink include health foods, foods with function claims, foods for specified health uses, and foods for the sick.
  • the form of food and drink is not particularly limited, but specific examples include tablets, granules, powders, and drinks as so-called nutritional supplements or supplements.
  • drinks such as tea drinks, soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks, noodles such as soba noodles, udon noodles, Chinese noodles, instant noodles, candies, candies, gums, chocolates, snacks , biscuits, jellies, jams, creams, baked sweets, breads and other sweets and breads, processed marine and livestock foods such as ham, sausages, hanpen, fish cakes, processed milk, fermented milk and other dairy products, salad oil, tempura oil, Oils and fats such as margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream, and dressings; seasonings such as sauces and sauces; retort pouch foods such as curries, stews, rice bowls, rice porridge and porridge; can include, but are not limited to.
  • composition of the present invention may contain any component known in the fields of medicine, pharmacy, veterinary medicine, animal husbandry, feed or food, as long as the effects of the present invention are not lost.
  • the method for confirming the effect of suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells to osteoclasts and/or the effect of improving bone metabolism is, for example, TRAP (tartaric acid resistance after addition of RANKL (receptor activator of NF- ⁇ B ligand) reagent) and methods for evaluating tartrate-resistant acid phosphatase activity.
  • RANKL known as a differentiation-inducing signal, binds to a receptor (RANK) on the plasma membrane of osteoclast precursors and induces differentiation into osteoclasts.
  • RANKL known as a differentiation-inducing signal
  • osteoclasts exhibit strong TRAP activity in the cytoplasm, differentiation into osteoclasts can be confirmed by evaluating TRAP activity after addition or administration of RANKL.
  • the TRAP activity here can be said to be an indicator of the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts, and suppression of TRAP activity is thought to suppress bone destruction and improve bone metabolism. It is also considered to be effective in confirming the presence or absence of suppression of osteoporosis.
  • "improved bone metabolism” means, for example, that the balance between bone formation and bone resorption in vivo becomes more favorable.
  • evaluation may be performed according to well-established methods in the relevant field, such as a method of detection and quantification using an enzymatic reaction), bone resorption assay (pit formation assay), and the like. As an example of these methods, reference can be made to the examples below.
  • the culture supernatant of the present invention or its processed product or Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) or A composition containing the treated product is confirmed to be superior in suppressing bone mineral density decrease compared to a composition containing neither the culture supernatant or the treated product, nor the L-137 strain or the processed product thereof. method.
  • the method for confirming the effect of suppressing bone density reduction is, for example, the ultrasonic wave propagation distance per unit time (m / sec), that is, the ultrasonic wave propagation speed in the bone (Speed Of Sound, SOS).
  • This method has no exposure to radiation and has the advantage that even pregnant women and children can be measured.
  • SOS is usually measured at the calcaneus, and has a strong correlation with bone density at sites such as the calcaneus that contain a large amount of cancellous bone. If the SOS value is high, the bone density is high.
  • SOS has different definitions and standard values depending on the measurement model and its manufacturer, and the standardized ultrasonic propagation velocity (standardized-SOS: s-SOS) is also used to ensure compatibility of measurement values between models. .
  • standardized-SOS s-SOS
  • Benus evo manufactured by Shibuya Kogyo Co., Ltd.
  • Other devices known in the art can also be used.
  • most of the bone strength (approximately 70%) can be explained by bone density alone, and this method is also effective for confirming whether or not osteoporosis is suppressed.
  • the above-mentioned SOS method is classified as a quantitative ultrasound measurement method (QUS), and there are other methods such as measuring the attenuation coefficient (BUA: broadband ultrasound attenuation). It can be used for evaluation of the composition of the invention.
  • known bone density measurement methods other than the above such as DEA (dual energy X ray absorptiometry) method, MD (microdensitometry) method, RA (radiographic absorptiometry) method, quantitative CT (QCT) measurement method, etc.
  • DEA dual energy X ray absorptiometry
  • MD microdensitometry
  • RA radiographic absorptiometry
  • QCT quantitative CT
  • the instruction manual or its packaging box may indicate that the composition has an effect of suppressing the differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and an effect of improving bone metabolism.
  • the culture supernatant or its processed product is preferably about 0.1 to 100% by weight, more preferably about 5 to 60% by weight, more preferably about It is preferably contained in an amount of 20 to 40% by weight.
  • the Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) or its processed product is preferably about 0.001 to 10% by weight, based on the total amount of the composition, More preferably about 0.01 to 1% by weight, still more preferably about 0.05 to 0.5% by weight.
  • the present invention preferably comprises the following steps (a) to (c), a method for producing a composition for suppressing differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and/or improving bone metabolism, including.
  • step (a) obtaining a culture by culturing immune cells in the presence of lactic acid bacteria or a processed product thereof; (b) obtaining a culture supernatant of immune cells or a processed product thereof, comprising removing lactic acid bacteria or a processed product thereof and immune cells from the culture obtained in step (a), and (c) step ( Step of mixing the culture supernatant obtained in b) or its processed material with a carrier and/or an excipient
  • the immune cells are not particularly limited, but the immune cells are lactic acid bacteria or a processed product thereof (preferably L -137 strain) is preferred.
  • a preferred example of removing lactic acid bacteria or a processed product thereof and immune cells from the mixture obtained in step (a) is, from the mixture, a method known in the art such as centrifugation. , but not limited to, removing lactic acid bacteria or processed products thereof and immune cells.
  • aqueous carriers include water, physiological saline, ethanol, glycerin, polyethylene glycol, propylene glycol, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyacrylic acid, polysaccharide gum-based natural polymers.
  • oily carriers include, but are not limited to, suitable oils and waxes such as petrolatum, squalane and paraffin.
  • step (c) preferred excipients used in the above step (c) have been well established in the food or pharmaceutical fields, and the present invention may follow them.
  • lactose, sucrose, mannitol, corn starch , powdered cellulose, calcium hydrogen phosphate, calcium carbonate and the like can be preferably used, but are not limited to these.
  • the composition of the present invention except that the culture supernatant of the present invention or its processed product, or Lactobacillus plantarum L-137 strain (Lactobacillus plantarum L-137) or its processed product is added to the composition, It can be appropriately processed and manufactured by a general composition manufacturing method. That is, the present invention further includes a method for producing a composition comprising the step of mixing the culture supernatant or its treated material, and optionally other ingredients. Alternatively, the present invention includes a method for producing a composition comprising the step of mixing Lactobacillus plantarum L-137 or a processed product thereof, and optionally other ingredients. .
  • each component is It is preferable to mix or stir by a known method or a method known per se so as to achieve uniformity. Methods of mixing or stirring are well established in the art and may be followed.
  • Step of inducing differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts Evaluation of osteoclast differentiation using osteoclast precursor cell RAW264.7 (ECACC strain number 91062702; DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), a mouse-derived monocytic leukemia cell line that is induced to osteoclasts only by RANKL. gone.
  • Osteoclast precursor RAW264.7 cells were suspended in 10% FBS-containing MEM ⁇ medium at 7.0 ⁇ 10 4 cells/mL, and 50 ⁇ L of each suspension was added to a 96-well culture plate (3,500 cells/well). Further, sRANKL (Product No.
  • the final concentration of sRANKL is 100 ng / mL
  • the ratio of immune cell culture supernatant is 6.25%, 12.5%, 37.5% (v / v)
  • differentiation induction culture is performed in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 48 hours, 72 hours went.
  • TRAP activity measurement step After the differentiation-inducing culture, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of a fixing solution prepared by mixing acetone and ethanol at a ratio of 1:1 was added to the 96-well culture plate containing the cells. After 1 minute, the fixative was removed and air-dried for 30 minutes. Thereafter, the TRAP solution kit (product number NIB 47249000; Oriental Yeast) was operated, and the absorbance was measured at 415 nm using a plate reader.
  • a fixing solution prepared by mixing acetone and ethanol at a ratio of 1:1
  • Results The evaluation results are shown in Table 1 and Figures 1 and 2 below. After culturing for 48 hours and after culturing for 72 hours, the culture supernatant of the immune cells obtained above exhibited a concentration-dependent inhibitory effect on differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts and an inhibitory effect on bone resorption in bone. Indicated.
  • Osteoclast differentiation induction step Evaluation of osteoclast differentiation using osteoclast precursor cell RAW264.7 (ECACC strain number 91062702; DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), a mouse-derived monocytic leukemia cell line that is induced to osteoclasts only by RANKL. gone.
  • Osteoclast precursor RAW264.7 cells were suspended in 10% FBS-containing MEM ⁇ medium at 7.0 ⁇ 10 4 cells/mL, and 50 ⁇ L of each suspension was added to a 96-well culture plate (3,500 cells/well).
  • sRANKL Product No. 47187000; Oriental Yeast Co., Ltd.
  • MEM ⁇ medium containing 10% FBS was diluted to 267 ng/mL with MEM ⁇ medium containing 10% FBS, and 75 ⁇ L each was added to the 96-well culture plate to which the RAW264.7 cells were added.
  • dead cells of Lactobacillus plantarum L-137 were suspended in 10% FBS-containing MEM ⁇ medium to 134 ng/mL, 1.34 ⁇ g/mL, and 13.4 ⁇ g/mL, Each 75 ⁇ L of the RAW264.7 cells was added to the 96-well culture plate to make the total volume 200 ⁇ L.
  • the final concentration of sRANKL was 100 ng/mL
  • the final concentrations of L-137 dead cells were 50 ng/mL, 500 ng/mL, and 5 ⁇ g/mL
  • the differentiation-inducing culture was performed at 37°C in a 5% CO 2 incubator. , went 48 hours, 72 hours.
  • TRAP activity measurement step After the differentiation-inducing culture, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of a fixing solution prepared by mixing acetone and ethanol at a ratio of 1:1 was added to the 96-well culture plate containing the cells. After 1 minute, the fixative was removed and air-dried for 30 minutes. Thereafter, the TRAP solution kit (product number NIB 47249000; Oriental Yeast) was operated, and the absorbance was measured at 415 nm using a plate reader.
  • a fixing solution prepared by mixing acetone and ethanol at a ratio of 1:1
  • composition used As the composition of the present invention, a commercially available tablet containing 10 mg of heat-treated Lactobacillus plantarum L-137 strain per tablet (300 mg) (product name: Mamori Kaoru Lactobacillus L-137 Supplement) was used. . Although the tablet contains components other than strain L-137 (lactose, starch, sucrose fatty acid ester, etc.), these components do not particularly affect the following experiments.
  • compositions (1) and (2) are useful as a prophylactic/therapeutic agent for osteoporosis, food and drink, feed, pharmaceutical or quasi-drug, cosmetics, and the like.

Abstract

本発明の課題は、（１）乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養することにより得られる免疫細胞の培養上清又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用、骨の骨代謝改善用及び／又は骨密度低下抑制用組成物、（２）ラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用、骨の骨代謝改善用及び／又は骨密度低下抑制用組成物を提供することであり、上記組成物により、上記課題を解決する。

Description

破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨代謝改善用組成物
　本発明は、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨代謝改善用組成物に関する。
　骨粗鬆症は、骨が脆くなり、骨折しやすくなる病気である。骨中には骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の２種類の細胞が存在するが、破骨細胞が活性化する等して、両細胞の活性のバランスが崩れることがある。そして、骨形成量に対し骨吸収量が相対的に上回った状態が続くと、骨量が減少し、骨粗鬆症を発症する。国内では約１０００万人以上の患者がおり、高齢化に伴い、骨粗鬆症の患者数は増加傾向にある。骨粗鬆症を改善する方法の１つとして、破骨前駆細胞（破骨細胞の前駆細胞）に対し、破骨細胞への分化を抑制することなどが知られている（特許文献１）。
　一方、乳酸菌には、免疫賦活作用等があることが知られている（特許文献２）。
特開２０１０－２３５５３４号公報 特開２０１０－６８０１号公報
　しかしながら、乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる免疫細胞の培養上清が、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を抑制することや、骨代謝を改善することは知られていない。さらに、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137。以下、「Ｌ－１３７株」とも呼ぶことがある）が、上記した免疫細胞の培養上清と同様の作用を有することは知られていない。
　本発明者らは、（１）乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる培養物の培養上清が、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用、骨代謝改善作用及び／又は骨密度低下抑制作用、好ましくは、骨における骨吸収特性を抑制する作用を有することを見出した。さらに、（２）乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株が、上記（１）の培養上清と同様の効果を有すること、及び（３）（１）の培養上清と（２）Ｌ－１３７株とが、骨粗鬆症等の治療又は予防に有用であることを知得し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる培養上清又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物。
［２］乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる培養上清又はその処理物を含有することを特徴とする、骨代謝改善用組成物。
［３］乳酸菌がラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌であることを特徴とする、前記［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）であることを特徴とする、前記［１］～［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］ラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物。
［６］ラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有することを特徴とする、骨代謝改善用組成物。
［７］骨粗鬆症の予防、改善及び／又は治療用であることを特徴とする、前記［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］骨密度低下抑制用であることを特徴とする、前記［１］～［７］のいずれか１項に記載の組成物。
［９］以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用、骨代謝改善用及び／又は骨密度低下抑制用組成物の製造方法。
（ａ）乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して培養物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養物から、乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞を除去することを含む、免疫細胞の培養上清又はその処理物を得る工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養上清又はその処理物と、担体及び／又は賦形剤とを混合する工程
　本開示によれば、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物、骨代謝改善用及び／又は骨密度低下抑制作用組成物、好ましくは、骨粗鬆症の予防、改善又は治療用の組成物を提供することができる。また、そのような組成物の製造方法も提供できる。
図１は、破骨前駆細胞に、sRANKL（骨代謝研究用試薬）と免疫細胞の培養上清を加えて４８時間経過した後の、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化及び骨吸収活性抑制を評価したグラフを示す。 図２は、破骨前駆細胞に、sRANKL（骨代謝研究用試薬）と免疫細胞の培養上清を加えて７２時間経過した後の、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化及び骨吸収活性抑制を評価したグラフを示す。 図３は、破骨前駆細胞に、sRANKL（骨代謝研究用試薬）とＬ－１３７株を加えて４８時間経過した後の、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化及び骨吸収活性抑制を評価したグラフを示す。 図４は、破骨前駆細胞に、sRANKL（骨代謝研究用試薬）とＬ－１３７株を加えて７２時間経過した後の、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化及び骨吸収活性抑制を評価したグラフを示す。 図５は、Ｌ－１３７株含有食品の摂取の有無による、ヒト踵骨内の標準化された超音波伝播速度(s-SOS)への影響を評価したグラフを示す。白グラフは、試験開始前を示し、色付きグラフは、組成物摂取３ヶ月後を示す。Mean (+/-) SD、*: p < 0.05 v.s. 試験開始前
（１）免疫細胞の培養上清又はその処理物
　本発明は、免疫細胞と乳酸菌又はその処理物の混合物の培養により得られる免疫細胞の培養上清又はその処理物を含有し、好ましくは、培養上清を得るために用いた該乳酸菌又はその処理物自体は実質的に含まないことを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨の骨代謝改善用組成物、特に好ましくは、骨吸収抑制用組成物を含む。
　なお、本明細書において、破骨細胞の前駆細胞を、「破骨前駆細胞」と略称することもある。また、本明細書において、「培養上清」とは、通常、免疫細胞を培養して得られる培養物を、例えば、遠心分離によって分離した上澄み液のことである。好ましい遠心分離の条件としては、例えば、１～４０度、好ましくは、４～３７度の温度、２０００～２００００ｒｐｍの回転数等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明で用いられる乳酸菌は、特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、又はビフィズス属等に属する乳酸菌等を用いることができる。さらに詳しくは、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)、エンテロコッカス・フェーカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）又はビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）又はビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、特に限定されないが、免疫細胞は、好ましくは、上記した乳酸菌を食する（貪食する）ことが出来る細胞を含む細胞であり、好ましくは、ラクトバチルス・プランタラム属（Lactobacillus plantarum）の乳酸菌を食することが出来る細胞を含む細胞であり、より好ましくは、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６０７号）を食することが出来る細胞を含む細胞である。
　なお、Ｌ－１３７株は、当分野で汎用されているラクトバチルス属の乳酸菌、例えば、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９株等よりも、多くのリポテイコ酸（Lipoteichoic acid）を細胞表面に露出し、ある種の細胞に食べられやすいことが知られている（Int Immunopharmacol. 2015, 25(2) 321-331）。詳細は不明であるが、このようなＬ－１３７株の性質が、本発明の破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制効果又は骨代謝改善効果を得るために有用な可能性がある。
　本発明で用いられる好ましい免疫細胞として、例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞を含む細胞が挙げられるが、これらに限定されない。免疫細胞は市販品を用いてもよい。このような市販品として、例えば、iQ Bioscience社のIQB-MSP103、日本チャールスリバー株式会社、日本クレア株式会社などが取り扱う製品を好適に挙げることが出来るが、これらに限定されない。
　また、本発明で用いられる好ましい破骨前駆細胞としては、例えば、RANKL (receptor activator of NF-κB ligand)、GM-CSF (Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor)等の試薬により、破骨細胞へ分化誘導される細胞が好ましく、例えば、骨髄由来の単球、マクロファージ系の前駆細胞、マクロファージ様細胞などの初代細胞、あるいはそれらの細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下に、乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養する方法について説明する。　免疫細胞の培養方法について、培養温度、培養時間は、使用する細胞によって適宜選択してよく、特に限定されない。培養温度は、例えば、特に限定されないが、好ましくは、３０～４０度であり、より好ましくは、３５～３７度である。また、培養時間は、例えば、特に限定されないが、好ましくは、２４～９６時間であり、より好ましくは、４８～７２時間である。
　免疫細胞の培養に用いる培地としては、特に限定されず、例えば、無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、血清等を含有するものが好ましく用いられる。市販品を用いても良い。例えば公知の合成汎用培地としてはＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＩＭＤＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａなどが好適に挙げられるがこれらに限定されない。
　なお、破骨前駆細胞の培養方法及び培地についても、上記した免疫細胞と同様のものを好ましく用いることが出来る。
　本発明において、免疫細胞の培養上清の「処理物」とは、好ましくは、本発明の方法で得られる免疫細胞の培養物を精製又は加工し、必要に応じてこれをさらに遠心分離したものであるが、これらに限定されない。得られた培養物を精製又は加工する際に、当分野で公知の、例えば、自然濾過、精密濾過、限外濾過等の方法が用いられてよい。好ましい遠心分離の条件としては、例えば、１～４０度（℃）、好ましくは、４～３７度の温度、２０００～２００００ｒｐｍの回転数等が挙げられるが、これらに限定されない。なお本発明の免疫細胞の培養上清又はその処理物には、通常、培養上清を得るために用いた乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞自体は実質的に含まれない。
　また、本発明においては、免疫細胞の培養上清又はその処理物を、そのまま用いてもよく、凍結乾燥、低温乾燥、噴霧乾燥、又はＬ－乾燥等やこれらを組み合わせて粉末状にして用いてもよい。また、当該処理物は、適切な溶媒（例えば、水、アルコール、有機溶剤等）で希釈して用いてもよく、適切な添加剤を加えて、ゲルや固形剤するなど加工して、用いてもよい。
　本発明の組成物中の、免疫細胞の培養上清又はその処理物の含有量は、特に限定されないが、組成物１００質量％中、例えば、約０．１質量％～約１００質量％の範囲であってもよく、好ましくは、約５質量％～約４０質量％の範囲であってよい。
（２）ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株
　さらに本発明は、上記（１）とは別の態様として、乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６０７号）を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物及び骨代謝改善用組成物を含む。
　破骨前駆細胞及び免疫細胞については、上記（１）で説明した通りである。
　本発明で用いられる乳酸菌ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（現：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター；住所：郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）に、受託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ　Ｐ－１５３１７号より移管）として寄託されている。なお、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７の変異株であっても、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７の特徴を備えるものはラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７の範疇である。なお、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株と共に他の乳酸菌が本発明の組成物に含まれていてもよい。
　本発明の組成物中の、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物の含有量は、特に限定されないが、組成物１００質量％中、例えば、約０．０００１質量％～０．１質量％の範囲であってもよく、好ましくは、０．００５～０．０５質量％の範囲であってよい。
　また、本発明のラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物の摂取量は、経口又は注射投与の場合は、摂取者の年齢及び体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、成人１人（約６０ｋｇ）１日当たり、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株を乾燥死菌体として、好ましくは約０．５～２００ｍｇ、より好ましくは約１～１００ｍｇ、さらに好ましくは約２～５０ｍｇ摂取されるように設定するのが好ましい。または、成人１人（約６０ｋｇ）１日当たり、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７を生菌換算で、好ましくは約５×１０８～２×１０１１ｃｆｕ（Ｃｏｌｏｎｙ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）、より好ましくは約１×１０９～１×１０１１ｃｆｕ摂取されるように設定するのが好ましい。摂取回数は、１日１回又は複数回に分けて行うことができる。外用塗布の場合も、適用する皮膚面積に応じて、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株又はその処理物の塗布量を適宜選択することができるが、通常、当該塗布量は、適用部位の面積約１０ｃｍ２に対して、１日につき、好ましくは約０．０１～２．５ｍｇ、より好ましくは約０．０２～１ｍｇである。前記の投与用量を、１日あたり、１回～数回に分けて投与又は適用するとよい。
　以下、上記（１）及び（２）で記載した発明について、共通の部分をさらに説明する。
［乳酸菌の培養］
　本発明において、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）及び他の乳酸菌は、天然培地、合成培地及び半合成培地等の培地で培養したものいずれであってもよい。本発明において、乳酸菌の培養は、公知方法、自体公知の方法又はそれらに準じる方法に従って行われてよい。
　前記培地としては、特に限定されず、例えば、窒素源及び／又は炭素源を含有するものが好ましく用いられる。前記窒素源としては、特に限定されず、例えば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、又はアミノ酸等が挙げられる。前記炭素源としては、特に限定されず、例えば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、澱粉、バガス、フスマ、糖蜜、又はグリセリン等が挙げられる。これらは１種で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
　前記培地は、前記窒素源及び／又は炭素源に加えて、さらに、無機質を添加してもよい。前記無機質としては、特に限定されず、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン又は各種ビタミン類等が挙げられ、これらを１種で又は２種以上を組合せて用いてもよい。
　ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）及び他の乳酸菌の培養温度及び培養時間は、培養が効率的に実施できれば特に限定されないが、本発明の１つの態様において、培養温度は、例えば、通常約２５～４０度（℃）、好ましくは約２７～３５度としてもよい、培養時間は、例えば、約１２～４８時間としてもよい。また、本発明の１つの態様において、乳酸菌の培養は、通気振盪により実施してもよい。また、培地のｐＨは、特に限定されないが、本発明の１つの態様において、通常約ｐＨ３～６、好ましくは約ｐＨ４～６としてもよい。
〔乳酸菌の処理物〕
　ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）及び他の乳酸菌の「処理物」とは、好ましくは、当該乳酸菌を加工したもの又は当該乳酸菌の培養物であるが、これらに限定されない。また、菌は、生菌でもよく、死菌体でもよいが、安定性及び取扱いの容易性等の観点から、死菌体を用いることが好ましい。この死菌体も、乳酸菌の処理物に含まれる。
　本発明においては、このような処理物を、そのまま用いてもよく、凍結乾燥、低温乾燥、噴霧乾燥、又はＬ－乾燥等やこれらを組み合わせて粉末状にして用いてもよい。また、これらの処理物は、適切な溶媒（水、アルコール、有機溶剤等）で希釈して用いてもよいし、適切な添加剤を加えて、ゲルや固形剤にして、用いてもよい。
　以下に、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）及び他の乳酸菌の死菌体を調製する方法について、具体的に説明する。
　本発明において、前記死菌体の調製方法は、本発明の効果を失しない限り、特に限定されないが、例えば、（Ｉ）培養終了後に乳酸菌の生菌体を培養液から分離した後に、前記生菌体を殺菌処理して死菌体の状態とする方法、（ＩＩ）培養液中で乳酸菌の生菌体を殺菌処理して死菌体の状態とし、その後に前記死菌体を培養液から分離する方法等のいずれの方法によって調製してもよい。
　培養液から菌体を分離する方法としては、この分野で通常用いられる種々の方法を採用してもよく、特に限定されない。本発明のひとつの態様において、具体的には、例えば、培養液から遠心分離等の手段によって上清を除くことによって、培養液と菌体とを分離する方法等を採用してもよい。なお、この態様においては、培養液に蒸留水を加えて遠心分離を行った後に上清を除去した後、所望により、上清を除去した残留物にさらに蒸留水を加えて遠心分離を行う操作を何度か繰り返してもよい。本発明のひとつの態様において、分離操作として濾過工程を含んでいてもよい。
　続いて、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）及び他の乳酸菌の生菌体の殺菌処理方法について具体的に説明する。前記殺菌処理方法としては、特に限定されず、例えば、加熱、紫外線照射、ホルマリン処理等の処理が挙げられる。なお、前記殺菌処理は、採取された生菌体に対して行ってもよく、生菌体を含んだ培養液に対して行ってもよい。
　前記加熱処理を行う場合、加熱温度は特に限定されないが、例えば、通常約６０～１００度（℃）、好ましくは約７０～９０度としてもよい。加熱手段としては、公知の方法を用いることができ、特に限定されないが、例えば、ヒーター等の手段であってもよい。加熱時間は、殺菌処理が十分に完了できれば特に限定されないが、例えば、加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５～４０分、好ましくは約１０～３０分としてもよい。
　上記のようにして得られた前記死菌体は、さらに摩砕、破砕又は凍結乾燥処理等を行い、死菌体処理物としてもよい。本発明においては、前記死菌体処理物も死菌体として好適に用いることができる。
［破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用、骨の骨代謝改善用、骨粗鬆症等の予防、改善若しくは治療用、又は骨密度低下抑制用組成物］
　本発明の組成物は、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用及び／又は骨代謝改善作用を有することを特長とする。好ましくは、組成物が、骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性関節炎、骨髄炎、癌又は加齢等による骨の喪失、骨折、又は腰痛の予防、改善又は治療に用いられる場合であり、より好ましくは、組成物が、骨粗鬆症、関節リウマチ、又は骨折の予防、改善又は治療に用いられる場合であり、さらに好ましくは、組成物が、骨粗鬆症の予防、改善又は治療に用いられる場合であるが、これらの場合に限定されない。別の、あるいは、さらなる本発明の組成物の好ましい例としては、組成物が骨密度低下抑制作用を有する組成物が挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の組成物の好ましい例としては、飲食品用及び／又は医薬品用（動物薬も含む）である。別の好ましい例としては、本発明の組成物は、飲食品用の添加剤として使用される。
　飲食品用、飲食品用添加剤用又は医薬品用である組成物は、上記した本発明の培養上清又はその処理物、あるいは、Ｌ－１３７株又はその処理物とさらに薬学的に許容される担体、添加剤等を適宜配合して製剤化等することができる。そのための製剤化方法や製剤化技術は従来十分に確立されているので、それに従ってよい。例えば、医薬品用の場合、具体的には、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤、注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、飲食品、医薬品又は獣医学分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。
　薬学的に許容される担体又は添加剤は特に制限されないが、担体の例としては、水性または油性基剤等の各種担体が挙げられ、水性の担体としては、例えば、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、多糖ガム系天然高分子類等が挙げられ、油性の担体としては、例えば、ワセリン、スクワラン、パラフィン等の適切な油類やワックス類等が挙げられるが、これらに限定されない。
　添加剤の例としては、酵素、ｐＨ調整剤、保存料、殺菌料、酸化防止剤、防カビ剤、日持向上剤、漂白剤、光沢剤、香料、甘味料、酸味料、調味料、苦味料、乳化剤、増粘剤、安定剤、ゲル化剤、糊料、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等が挙げられるが、これらに限定されない。これらに関する技術は、従来十分に確立されているので、本発明において、それらに従ってよい。
　また、本発明の組成物が、飲食品用である場合、このような飲食品には、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品が含まれる。飲食品の形態は特に限定されないが、具体例には、例えば、いわゆる栄養補助食品またはサプリメントとしての錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。これ以外には、例えば、茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子およびパン類、ハム、ソーセージ、はんぺん、ちくわ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット等の冷菓などを挙げることができるが、これらに限定されない。これらに関する技術は、従来十分に確立されているので、本発明において、それらに従ってよい。
　さらに、本発明の組成物には、本発明の効果を失しない限り、例えば、医学、薬学、獣医学、畜産、飼料又は食品等の分野で知られる任意の成分が含有されていてもよい。
〔破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用及び骨代謝改善作用とその確認方法〕
　本発明の組成物の効果を確認する方法としては、例えば、本発明の培養上清又はその処理物、あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有する組成物が、培養上清又はその処理物、あるいは、Ｌ－１３７株又はその処理物のいずれも含有しない組成物に比べて、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制活性及び／又は骨代謝改善活性に優れることを確認する方法が挙げられる。
　具体的には、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制効果及び／又は骨代謝改善効果の確認方法は、例えば、RANKL (receptor activator of NF-κB ligand) 試薬添加後のTRAP（酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ: tartrate-resistant acid phosphatase）活性の評価を行う方法等が挙げられる。分化誘導シグナルとして知られるRANKLは、破骨前駆細胞の細胞膜上の受容体(RANK)に結合し、破骨細胞への分化を誘導する。一方、破骨細胞は、細胞質に強いTRAP活性を示すため、RANKL添加後又は投与後のTRAP活性を評価すれば、破骨細胞へ分化したことを確認出来る。すなわち、ここでのTRAP活性は破骨前駆細胞が破骨細胞へ分化した指標と言え、また、TRAP活性が抑制されると骨破壊が抑制され、骨代謝も改善されると考えられるので、結果、骨粗鬆症の抑制の有無の確認にも有効であると考えられる。なお、本願明細書において、骨代謝が改善されるとは、例えば、生体内での骨形成と骨吸収のバランスがより好ましい状態になることを指す。
　その他、上記以外の公知の骨評価、骨分化確認用試薬を用いてもよく、ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay：試料溶液中に含まれる目的の抗原又は抗体を、特異抗体又は抗原で捕捉するとともに、酵素反応を利用し、検出・定量する方法）、Bone resorption assay（pit formation assay）等、当該分野において十分に確立されている方法に従って評価を行ってよい。
　これらの方法の一例として、後述の実施例を参照することができる。
〔骨密度低下抑制作用とその確認方法〕
　本発明の組成物の骨密度低下抑制効果を確認する方法としては、例えば、本発明の培養上清又はその処理物、あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有する組成物が、培養上清又はその処理物、あるいは、Ｌ－１３７株又はその処理物のいずれも含有しない組成物に比べて、骨密度低下抑制作用に優れることを確認する方法が挙げられる。
　具体的には、骨密度低下抑制効果の確認方法は、例えば、単位時間当たりの超音波伝播距離（m/sec）、すなわち、骨内における超音波伝播速度(Speed Of Sound、SOS)、を測定する方法が挙げられる。
　本方法は、被曝がなく、妊婦や子供でも測定できる利点がある。SOSは、通常、踵骨で測定され、踵骨のような海綿骨を多く含む部位の骨密度と強い相関を有する。SOSの値が大きい場合、骨密度は高い。SOSは測定機種やその製造会社ごとに定義や基準値が異なり、機種間の測定値の互換性を確保するため、標準化された超音波伝播速度(standardized-SOS：s-SOS)も使用される。本発明においては、例えば、Benus evo (澁谷工業株式会社製)を用いることが出来るが、当分野で公知の他の機器を用いることも出来る。なお、骨密度のみで骨強度のほとんど（約７割程度）が説明出来るとする説もあり、本方法は、骨粗鬆症の抑制の有無の確認にも有効である。
　上記したSOS法は、定量的超音波測定法(QUS: quantitative ultrasound)に分類され、他に、減衰係数 (BUA: broadband ultrasound attenuation)を測定する方法等もあり、SOS法以外のQUS法も本発明の組成物の評価等に用いることが出来る。また、上記以外の公知の骨密度測定方法、例えば、DEA (dual energy X ray absorptiometry) 法、MD (microdensitometry) 法、RA (radiographic absorptiometry) 法、定量的CT(QCT)測定法等を用いてもよく、上記した踵骨の代わりに、あるいは、踵骨と合わせて、大腿骨、脊椎、橈骨等の部位が測定されてもよいが、これらに限定されない。
　本発明の組成物を飲食品、動物用飼料、医薬品（動物用医薬も含む）、又は医薬部外品の形態に調製した場合、当該飲食品、飼料、医薬品、若しくは医薬部外品、その添付説明書又はその包装箱等には、本発明の組成物の作用に鑑みて、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用及び骨代謝改善作用を有する旨を表示することができる。
　本発明の組成物において、培養上清又はその処理物は、組成物の全量に対し、好ましくは、約０．１～１００重量％、より好ましくは約５～６０重量％、さらに好ましくは、約２０～４０重量％含まれることが好ましい。
　また、本発明の組成物において、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物は、組成物の全量に対し、好ましくは、約０．００１～１０重量％、より好ましくは、約０．０１～１重量％、さらに好ましくは、約０．０５～０．５重量％含まれることが好ましい。
［破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用及び／又は骨代謝改善用組成物の製造方法］
　本発明は、好ましくは、以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用及び／又は骨代謝改善用組成物の製造方法を含む。
（ａ）乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して培養物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた培養物から、乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞を除去することを含む、免疫細胞の培養上清又はその処理物を得る工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養上清又はその処理物と、担体及び／又は賦形剤とを混合する工程
　上記工程（ａ）において、免疫細胞を含む培養液と乳酸菌又はその処理物とを接触させて混合物を得る場合に、特に、限定されないが、免疫細胞が、乳酸菌又はその処理物（好ましくは、Ｌ－１３７株）を食べる（貪食する）ことが好ましい。
　また、上記工程（ｂ）において、工程（ａ）で得られた混合物から、乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞を除去することの好ましい例としては、該混合物から、遠心分離等の当分野で公知の方法により、乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞を除去することが挙げられるが、これらに限定されない。
　さらに、上記工程（ｃ）において用いられる、好ましい担体は、従来、食品又は医薬分野で十分に確立されているため、本発明もそれに従ってよいが、例えば、水性または油性基剤等の各種担体が挙げられ、水性の担体としては、例えば、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、多糖ガム系天然高分子類等が挙げられ、油性の担体としては、例えば、ワセリン、スクワラン、パラフィン等の適切な油類やワックス類等が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、上記工程（ｃ）において用いられる、好ましい賦形剤は、従来、食品又は医薬分野で十分に確立されているため、本発明もそれに従ってよいが、例えば、乳糖、白糖、マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。
　本発明の組成物は、組成物中に本発明の培養上清又はその処理物、あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を添加する以外は、一般的な組成物の製造方法により、適宜加工及び製造することができる。すなわち、本発明は、さらに、培養上清又はその処理物と、所望により、その他の成分とを混合する工程を含有する組成物の製造方法を包含する。あるいは、本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物と、所望により、その他の成分とを混合する工程を含有する組成物の製造方法を包含する。
　培養上清又はその処理物、あるいは、ラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物と、その他の成分とを混合する工程では、各成分が、組成物全体において均一となるように、公知の方法又は自体公知の方法により混合又は撹拌することが好ましい。混合又は撹拌の方法は、当該分野において十分に確立されているので、その方法に従ってよい。
　以下に実施例及び試験例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［試験例１］培養上清による破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制及び骨吸収活性抑制の評価
試験方法：＜１．培養上清を得る工程＞
　免疫細胞（日本クレア株式会社より購入したマウス由来脾臓細胞）を5.0×106 cells/mLとなるように10%FBS含有RPMI1640培地に懸濁し、免疫細胞懸濁液とした。ラクトバチルス・プランタラムL-137死菌体が1000ng/mLとなるように10%FBS含有RPMI1640で懸濁し、免疫細胞刺激用検液とした。免疫細胞刺激用検液と免疫細胞懸濁液を100μLずつ、96well培養プレートに添加し（免疫細胞終濃度：2.5×106 cells/mL、菌体終濃度：500ng/mL）、5%CO2インキュベータ内で37℃、24時間培養し、上清を得た。得られた上清に対し遠心分離（条件：20℃、2,000rpm、20min）を行い、L-137株と免疫細胞を除去した培養上清を得た。
＜２．破骨前駆細胞の破骨細胞への分化誘導工程＞
　RANKLのみで破骨細胞に誘導される、マウス由来単球白血病細胞株である破骨細胞前駆細胞RAW264.7（ECACC株番号91062702；DSファーマバイオメディカル株式会社）を用いて破骨細胞分化評価を行った。破骨前駆細胞RAW264.7細胞を10%FBS含有MEMα培地で7.0×104cells/mLとなるように懸濁し、96well培養プレートに50μLずつ添加した（3,500cells/well）。さらに、sRANKL（製品番号47187000；オリエンタル酵母工業株式会社）を10%FBS含有MEMα培地で267ng/mLに希釈して、上記したRAW264.7細胞を添加した96well培養プレートに75μLずつ添加した。さらにL-137で刺激した免疫細胞の培養上清を12.5μL、25μL、75μL添加した。培養上清を12.5μL添加したwellには62.5μLの10%FBS含有MEMα培地を、培養上清を25μL添加したwellには50μLの10%FBS含有MEMα培地を添加し、全量を200μLとした。すなわちsRANKLの終濃度は100ng/mL、免疫細胞の培養上清割合は6.25%,12.5%,37.5%（v/v）として、分化誘導培養を5%CO2インキュベータ内で37℃、48時間、72時間行った。
＜３．TRAP活性測定工程＞
　分化誘導培養後、上清を除去し、アセトンとエタノールを1:1の割合で混合した固定液を100μLずつ細胞の入った96well培養プレートに添加した。1分経過後に固定液を除き、30分風乾させた。その後はTRAP solution kit(製品番号 NIB 47249000；オリエンタル酵母)に従い操作し、プレートリーダーを用いて415nmで吸光度を測定した。
結果：評価結果は下記の表１及び図１～２に記載の通りである。４８時間培養後及び７２時間培養後において、上記で得られた免疫細胞の培養上清は、濃度依存的に、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用及び骨における骨吸収抑制作用を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験例２］Ｌ－１３７株による破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制及び骨吸収活性抑制の評価
試験方法：＜１．破骨細胞分化誘導工程＞
　RANKLのみで破骨細胞に誘導される、マウス由来単球白血病細胞株である破骨細胞前駆細胞RAW264.7（ECACC株番号91062702；DSファーマバイオメディカル株式会社）を用いて破骨細胞分化評価を行った。破骨前駆細胞RAW264.7細胞を10%FBS含有MEMα培地で7.0×104cells/mLとなるように懸濁し、96well培養プレートに50μLずつ添加した（3,500cells/well）。さらに、sRANKL（製品番号47187000；オリエンタル酵母工業株式会社）を10%FBS含有MEMα培地で267ng/mLに希釈して、上記したRAW264.7細胞を添加した96well培養プレートに75μLずつ添加した。さらにラクトバチルス・プランタラムＬ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）の死菌体を10%FBS含有MEMα培地で134 ng/mL, 1.34 μg/mL, 13.4 μg/mLとなるように懸濁し、RAW264.7細胞を添加した96well培養プレートに75μLずつ添加し、全量を200μLとした。すなわちsRANKLの終濃度は100 ng/mL、L-137死菌体の終濃度は50 ng/mL, 500 ng/mL, 5 μg/mLとして、分化誘導培養を5%CO2インキュベータ内で37℃、48時間、72時間行った。
＜２．TRAP活性測定工程＞
　分化誘導培養後、上清を除去し、アセトンとエタノールを1:1の割合で混合した固定液を100μLずつ細胞の入った96well培養プレートに添加した。1分経過後に固定液を除き、30分風乾させた。その後はTRAP solution kit(製品番号 NIB 47249000；オリエンタル酵母)に従い操作し、プレートリーダーを用いて415nmで吸光度を測定した。
結果：評価結果は下記の表２及び図３～４に記載の通りである。４８時間培養後及び７２時間培養後において、乳酸菌Ｌ－１３７株は、濃度依存的に、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用及び骨吸収抑制作用を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［試験例３］乳酸菌Ｌ－１３７株を含有する組成物による骨密度低下抑制作用の評価
試験方法：＜１．使用した組成物＞
　本発明の組成物として、１錠 (300 mg)当たり、加熱処理されたラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株を10 mg含む市販の錠剤（製品名：まもり高める乳酸菌Ｌ－１３７　サプリメント）を用いた。錠剤には、Ｌ－１３７株以外の成分（乳糖、デンプン、ショ糖脂肪酸エステル等）も含まれているが、これらの成分は以下の実験に特に影響しない。
＜２．組成物の摂取とs-SOSの測定＞
　４０～７３歳の男女３１名の被験者を２群に分けた（非摂取群：１０名、Ｌ－１３７株摂取群：２１名）。Ｌ－１３７株摂取群にはＬ－１３７株を含有する上記組成物を１日１錠で３ヶ月間摂取させた。
　試験開始前及び組成物摂取３ヶ月後に各被験者の踵骨にて、s-SOSを測定した。被験者の片足踵周辺をエタノールで洗浄し、超音波検査用ゼリーを十分に塗布した。ゼリーが馴染んだ後、被験者の踵を装置計測部に挿入して、測定し、s-SOSを得た。
　被験者の踵骨のs-SOS 評価には、Benus evo (澁谷工業株式会社製)を用いて行った。
結果：評価結果は図５に記載の通りである。Ｌ－１３７株含有組成物非摂取群のs-SOS は、試験開始前から３ヶ月後にかけて、経日により有意に低下した（すなわち、骨密度が低下した）。これに対し、Ｌ－１３７株含有組成物摂取群のs-SOS は、試験開始前から組成物摂取３ヶ月の間、有意差は認められなかった（すなわち、骨密度低下が抑制された）。
　上記結果から、本発明の乳酸菌Ｌ－１３７株を含有する組成物が、骨密度低下抑制作用を示すことが明らかとなった。なお、Ｌ－１３７株の代わりに、試験例１の方法で得られた培養上清やその処理物を用いた組成物を用いた場合にも、同様の効果が期待できる。
　（１）本発明の免疫細胞の培養上清を含む組成物、及び（２）乳酸菌Ｌ－１３７株を含む組成物は、それぞれ、独立して、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制作用、骨代謝改善作用及び／又は骨密度低下抑制作用を有した。そのため、（１）及び（２）の組成物は、それぞれが、骨粗鬆症の予防・治療薬、さらには、飲食品、飼料、医薬品又は医薬部外品、及び化粧品等として有用である。

Claims (9)

  1. 　乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる培養上清又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物。
  2. 　乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して得られる培養上清又はその処理物を含有することを特徴とする、骨代謝改善用組成物。
  3. 　乳酸菌がラクトバチルス（Lactobacillus）属の菌であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 　ラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有することを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用組成物。
  6. 　ラクトバチルス・プランタラム Ｌ－１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）又はその処理物を含有することを特徴とする、骨代謝改善用組成物。
  7. 　骨粗鬆症の予防、改善及び／又は治療用であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 　骨密度低下抑制用であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 　以下の工程（ａ）～（ｃ）を含むことを特徴とする、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化抑制用、骨代謝改善用及び／又は骨密度低下抑制用組成物の製造方法。
    （ａ）乳酸菌又はその処理物の存在下に免疫細胞を培養して培養物を得る工程、
    （ｂ）工程（ａ）で得られた培養物から、乳酸菌又はその処理物及び免疫細胞を除去することを含む、免疫細胞の培養上清又はその処理物を得る工程、及び
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた培養上清又はその処理物と、担体及び／又は賦形剤とを混合する工程
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