CN117264885A - 一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法。是要解决现有肿瘤浸润性淋巴细胞的体外培养方法培养周期长、IL‑2使用量高的问题。方法：一、取肿瘤组织，进行肿瘤细胞的分离和消化；二：将消化的肿瘤细胞接种于12孔板，用TILs初始培养基培养过夜，收集悬浮细胞，离心后收集TILs；三、将TILs用TILs扩增培养基培养，再用TILs诱导培养基培养，最终收获TILs。本发明方法中极大的减少了IL‑2的用量，在培养21天即使细胞扩增约2000倍，而且TILs在较低血清浓度和无IL‑2的环境下能够在48h内保持高存活率。本发明用于培养肿瘤浸润性淋巴细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes，TILs)是离开血液循环，迁移到肿瘤附近的淋巴细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞等。TILs能够起到杀伤癌细胞的作用，肿瘤中TILs的数量是预测癌症患者预后和对免疫疗法反应的重要指标。
TILs疗法是将自身肿瘤内的肿瘤抗原特异性CD4+和CD8+细胞分离，体外扩增后回输到患者体内的一种免疫治疗肿瘤方法。该疗法具有高效性、特异性、副作用小等优点。TILs主要来源于手术切除或活检获取的肿瘤组织、恶性胸腹水及淋巴组织，分离出来的TILs在体外通过培养基中的细胞因子诱导扩增。
目前的TILs扩增方法受到肿瘤大小、肿瘤组织内TILs数量、肿瘤组织易污染等多种因素的影响，有超过60％的患者无法提取自体TILs。因TILs体外扩增的时间较长、成功率较低等，导致TILs在临床上的应用受到限制。TILs体外扩增的过程通常包括肿瘤组织或胸腹水内TILs收集，预扩增阶段进行初步扩增，快速扩增阶段三个部分。现有方法中，三个阶段的TILs扩增过程需要约8-10周，而这种过长的体外培养周期也会导致TILs衰竭，使得肿瘤的治疗效果大大降低。常用的扩增方案在培养基中加入白介素-2(IL-2)，高浓度的IL-2与TILs长时间共培养会降低CD8+T细胞百分比，最终影响TILs的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明是要解决现有肿瘤浸润性淋巴细胞的体外培养方法培养周期长、IL-2使用量高的问题，提供一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法。
本发明肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，包括以下步骤：
步骤一：取淋巴细胞浸润的肿瘤组织，进行肿瘤细胞的分离和消化；
步骤二：将消化的肿瘤细胞接种于12孔板，用TILs初始培养基培养过夜，收集培养基中悬浮细胞，以速度1000～1400×g离心5～10min后收集肿瘤浸润性淋巴细胞TILs；
步骤三：TILs扩增培养
将步骤二获得的TILs用TILs扩增培养基培养10～14天，每1～2天更换培养基；而后再利用TILs诱导培养基培养TILs 7天，每1～2天更换培养基，最终收获TILs；
其中所述TILs扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL硫酸链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、15mmol/L HEPES、1000μg/mL IL-6、25～50μg/ml牛垂体提取物、0.2～0.4μg/mL层粘蛋白、0.1～0.2μg/mL透明质酸、50～100ng/mL EGF、20～40ng/mL FGF-2、2～5ng/mLTGF-β1和25～55μg/mL PDGF；
所述TILs诱导培养基配方是在TILs扩增培养基中加入体积分数为1％的肿瘤抗原溶液。
进一步的，步骤一中肿瘤细胞的分离和消化方法具体为：
A、将淋巴细胞浸润的肿瘤组织用质量百分比浓度75％的乙醇浸泡，并用PBS冲洗肿瘤组织3～5次，剪去血块、结缔组织和坏死组织，用PBS冲洗3～5次；
B、将该肿瘤组织剪为0.5～1mm3小碎块，加入消化液，37℃震荡消化6～12h；所述消化液配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入50～100μg/mL I型胶原酶，100～200μg/mL II型胶原酶，200～400μg/mL IV型胶原酶，100μg/mL透明质酸酶和10μg/mL DNA酶；
C、消化完成后用100μm网筛过滤，向滤液中加入2倍体积的RPMI1640培养基，以速度600×g离心5～10min后收集中层培养基，再次以速度1000×g离心5～10min，收集下层细胞，即获得消化的肿瘤细胞。
进一步的，步骤二中所述TILs初始培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL IFN-γ、2000IU/mL IL-2和20ng/mL TNF-α。
进一步的，步骤三中所述肿瘤抗原溶液的制备方法为：
步骤1、收集步骤二用TILs初始培养基培养过夜后的贴壁细胞，利用肿瘤扩增培养基进行培养，每3天进行一次换液，待细胞密度长至80％进行传代；
步骤2、取1×107～2×107个肿瘤细胞重悬于2～4mL无菌去离子水中，4℃放置30min，然后以速度4000×g离心5min，收集沉淀，即获得肿瘤细胞膜；向肿瘤细胞膜中加入2～4mL TILs扩增培养基重悬，0～4℃超声波破碎，得到肿瘤抗原溶液。
优选的，步骤1中所述肿瘤扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
优选的，步骤2中超声破碎参数为：超声0.2秒，停止2秒，2-3个周期。
本发明的有益效果：
1)传统的TILs扩增方法中含有高浓度IL-2的培养基，而高浓度的IL-2会导致培养的TILs中调节性T细胞数量增加，引起免疫抑制，带来副作用。本发明在TILs扩增培养基中添加牛垂体提取物、层粘蛋白、透明质酸、EGF、FGF-2、TGF-β1和PDGF。牛垂体提取物具有抗蛋白质氧化，抗膜破碎和DNA损伤诱导细胞坏死的作用。层粘蛋白诱导血管内皮钙粘蛋白重新分布，在免疫反应中控制转运，支持免疫细胞的生长和分化。透明质酸提供疏松多孔的环境，有利于维持细胞球形形态，保持TILs在体外的增殖能力和细胞活性。现有的TIL扩增方案中需要添加高剂量额IL-2(6000～12000IU/mL)，而且扩增周期较长，为5～7周。而本发明培养基中添加多数癌症病人血清中高表达的EGF，FGF-2，TGF-β1和PDGF细胞因子等，仅添加低浓度IL-2(2000IU/mL)或不添加IL-2。通过这些添加物的组合及浓度调整，促进有丝分裂，提高细胞因子与受体的亲和力，促进和保护TILs细胞扩增。
(2)根据不同来源的TILs生长特异性，利用多细胞因子组合及肿瘤特异性抗原加入，得到了专用的扩增和诱导培养基。不仅大大缩短TILs细胞体外培养扩增周期，在培养周期仅约21天即使细胞扩增约2000倍，而且TILs在较低血清浓度和无IL-2的环境下能够在48h内保持高存活率(>95％)。
(3)本发明利用高杀伤性TILs细胞扩增的方法所制备的TIL细胞含有更高比例的CD3+CD8+细胞(81.89％)及更低比例的CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞(2.15％)，且对肿瘤细胞的杀伤活性更强并且通过其他添加物替代培养基内的IL-2，提高了TILs细胞杀伤活性，提高TILs存活率，并且TILs对自体肿瘤细胞体外杀伤作用可达80％以上。因TILs来源于肿瘤组织，本身就具有穿过肿瘤微环境的优势，可解决目前血液来源的免疫细胞难以穿过肿瘤微环境屏障的问题，本发明所获得的TILs具有自体临床应用优势。
附图说明
图1为TILs肿瘤杀伤效果检测图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，包括以下步骤：
步骤一：取淋巴细胞浸润的肿瘤组织，进行肿瘤细胞的分离和消化；
步骤二：将消化的肿瘤细胞接种于12孔板，用TILs初始培养基培养过夜，收集培养基中悬浮细胞，以速度1000～1400×g离心5～10min后收集肿瘤浸润性淋巴细胞TILs；
步骤三：TILs扩增培养
将步骤二获得的TILs用TILs扩增培养基培养10～14天，每1～2天更换培养基；而后再利用TILs诱导培养基培养TILs 7天，每1～2天更换培养基，最终收获TILs；
其中所述TILs扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL硫酸链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、15mmol/L HEPES、1000μg/mL IL-6、25～50μg/ml牛垂体提取物、0.2～0.4μg/mL层粘蛋白、0.1～0.2μg/mL透明质酸、50～100ng/mL EGF、20～40ng/mL FGF-2、2～5ng/mLTGF-β1和25～55μg/mL PDGF；
所述TILs诱导培养基配方是在TILs扩增培养基中加入体积分数为1％的肿瘤抗原溶液。
传统的TILs扩增方法中含有高浓度IL-2的培养基，而高浓度的IL-2会导致培养的TILs中调节性T细胞数量增加，引起免疫抑制，带来副作用。本发明在TILs扩增培养基中添加牛垂体提取物、层粘蛋白、透明质酸、EGF、FGF-2、TGF-β1和PDGF。牛垂体提取物具有抗蛋白质氧化，抗膜破碎和DNA损伤诱导细胞坏死的作用。层粘蛋白诱导血管内皮钙粘蛋白重新分布，在免疫反应中控制转运，支持免疫细胞的生长和分化。透明质酸提供疏松多孔的环境，有利于维持细胞球形形态，保持TILs在体外的增殖能力和细胞活性。培养基中添加多数癌症病人血清中高表达的EGF，FGF-2，TGF-β1和PDGF细胞因子等。通过这些添加物的组合及浓度调整，促进有丝分裂，提高细胞因子与受体的亲和力，促进和保护TILs细胞扩增。
根据不同来源的TILs生长特异性，利用多细胞因子组合及肿瘤特异性抗原加入，得到了专用的扩增和诱导培养基。不仅大大缩短TILs细胞体外培养扩增周期，在培养周期仅约21天即使细胞扩增约2000倍，而且TILs在较低血清浓度和无IL-2的环境下能够在48h内保持高存活率(>95％)。
本发明利用高杀伤性TILs细胞扩增的方法所制备的TIL细胞含有更高比例的CD3+CD8+细胞(81.89％)及更低比例的CD4+CD25+FoxP3+Tregs细胞(2.15％)，且对肿瘤细胞的杀伤活性更强并且通过其他添加物替代培养基内的IL-2，提高了TILs细胞杀伤活性，提高TILs存活率，并且TILs对自体肿瘤细胞体外杀伤作用可达80％以上。因TILs来源于肿瘤组织，本身就具有穿过肿瘤微环境的优势，可解决目前血液来源的免疫细胞难以穿过肿瘤微环境屏障的问题，本发明所获得的TILs具有自体临床应用优势。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中肿瘤细胞的分离和消化方法具体为：
A、将淋巴细胞浸润的肿瘤组织用质量百分比浓度75％的乙醇浸泡，并用PBS冲洗肿瘤组织3～5次，剪去血块、结缔组织和坏死组织，用PBS冲洗3～5次；
B、将该肿瘤组织剪为0.5～1mm3小碎块，加入消化液，37℃震荡消化6～12h；
C、消化完成后用100μm网筛过滤，向滤液中加入2倍体积的RPMI1640培养基，以速度600×g离心5～10min后收集中层培养基，再次以速度1000×g离心5～10min，收集下层细胞，即获得消化的肿瘤细胞。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述消化液配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入50～100μg/mL I型胶原酶，100～200μg/mL II型胶原酶，200～400μg/mL IV型胶原酶，100μg/mL透明质酸酶和10μg/mL DNA酶。其它与具体实施方式二相同。
本实施方式中利用I型、II型及IV型胶原酶，搭配透明质酸酶和DNA酶进行肿瘤组织解离，因肿瘤组织细胞外基质成分一般较多且致密，消化程度较正常组织难把控，本实施方式通过对消化液成分及浓度进行调整，对消化时间进行控制，获得活性较好的解离细胞。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述TILs初始培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL IFN-γ、2000IU/mL IL-2和20ng/mLTNF-α。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述肿瘤抗原溶液的制备方法为：
步骤1、收集步骤二用TILs初始培养基培养过夜后的贴壁细胞，利用肿瘤扩增培养基进行培养，每3天进行一次换液，待细胞密度长至80％进行传代；
步骤2、取1×107～2×107个肿瘤细胞重悬于2～4mL无菌去离子水中，4℃放置30min，然后以速度4000～5000×g离心5～10min，收集沉淀，即获得肿瘤细胞膜；向肿瘤细胞膜中加入2～4mL TILs扩增培养基重悬，0～4℃超声波破碎，得到肿瘤抗原溶液。其它与具体实施方式一至四之一相同。
本实施方式利用低渗透压原理，将肿瘤细胞胀破，以获得含肿瘤特异性抗原的细胞膜，此方法可以有效去除细胞内的核酸及抑制免疫作用的一些蛋白成分，降低应用时对机体产生的不利影响；同时，肿瘤抗原制备过程中，利用超声方法将含肿瘤特异性抗原的细胞膜破碎，不仅能保证肿瘤抗原完整性，还能使其均匀分布于TILs扩增的体系中，保证TILs得到充分激活。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤1中所述肿瘤扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六不同的是：步骤2中超声破碎参数为：超声0.2秒，停止2秒，2-3个周期。其它与具体实施方式五或六相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：肿瘤细胞的获得
1、用质量百分比浓度为75％的乙醇浸泡淋巴细胞浸润的结肠癌肿瘤组织，并用PBS冲洗该肿瘤组织3次，剪去血块、结缔组织和坏死组织，再用PBS冲洗3次。
2、将该肿瘤组织剪为1mm3小碎块，加入含有胶原酶的RPMI1640培养基作为消化液，37℃震荡消化6h。
消化液配方为：RPMI1640培养基，100μg/mL I型胶原酶，200μg/mL II型胶原酶，400μg/mL IV型胶原酶，100μg/mL透明质酸酶和10μg/mL DNA酶。
3、消化完成后用100μm网筛过滤，加入2倍体积的RPMI1640培养基，以速度600×g离心5min后收集中层培养基，以速度1000×g再次离心5min获得肿瘤细胞。
实施例2：肿瘤浸润性淋巴细胞TILs和肿瘤细胞初步筛选
将获得的肿瘤细胞接种于12孔板，用TILs初始培养基将细胞稀释至1×105/mL，用TILs初始培养基培养过夜，收集培养基中的悬浮细胞，以速度1000×g离心5min后收集TILs。此过程中对细胞培养板孔中的贴壁细胞进行收集，用于自体肿瘤细胞培养。
TILs初始培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL IFN-γ、2000IU/mL IL-2和20ng/mL TNF-α。
实施例3：自体肿瘤细胞扩增培养及冻存
将实施例2获得的贴壁细胞，利用肿瘤扩增培养基进行培养，每1～2天进行一次换液，肿瘤扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素；待细胞密度长至80％进行传代，细胞传2～3代后进行冻存，细胞冻存密度为2×106/mL，冻存液为含10％ DMSO和10％人AB血清的RPMI1640培养基。
实施例4：肿瘤抗原制备(用于TILs诱导扩增培养)
取2×107个肿瘤细胞重悬于4mL无菌去离子水中，4℃放置30min，通过低渗溶胀原理，将细胞胀破，以速度4000×g离心5min，收集沉淀，获得肿瘤细胞膜。所获得肿瘤细胞膜中加入4mL肿瘤扩增培养基重悬，冰上超声波破碎(超声破碎参数为：超声0.2秒，停止2秒，2～3个周期)，制备获得肿瘤抗原溶液，-80℃条件下保存备用。
实施例5：TILs扩增培养
方法1：将实施例2获得的TILs利用TILs扩增培养基1培养20天，每2天更换培养基，最终收获TILs。
方法2：将实施例2获得的TILs利用TILs扩增培养基2培养20天，每2天更换培养基，最终收获TILs。
方法3：将实施例2获得的TILs利用TILs扩增培养基2培养10天，每2天更换培养基；而后再利用TILs诱导培养基进一步诱导细胞扩增7天，使其增加数量并提高肿瘤杀伤活性，最终收获TILs。
本实施例中，TILs扩增培养基分两种，即TILs扩增培养基1和TILs扩增培养基2。TILs扩增培养基1配方为：RPMI1640基础培养基中加入10％人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL硫酸链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、15mmol/LHEPES、100μg/mL IFN-γ、2000IU/mL IL-2和20ng/mL TNF-α。
TILs扩增培养基2配方为：RPMI1640基础培养基中加入10％人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL硫酸链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、15mmol/LHEPES、1000μg/mL IL-6、50μg/ml牛垂体提取物、0.4μg/mL层粘蛋白、0.2μg/mL透明质酸、100ng/mL EGF、40ng/mL FGF-2、5ng/mL TGF-β1和55μg/mL PDGF。
本实施例方法3中，TILs诱导培养基是在TILs扩增培养基2的基础上加入体积分数为1％的肿瘤抗原溶液而获得。
实施例6：TILs细胞台盼蓝计数：
将TILs细胞离心，用体积分数为1％的人AB血清重悬TILs，使体系中去除IL-2的作用后计算初始和48h后TILs细胞数，取10μL TILs细胞液与10μL 0.2％的台盼蓝混匀，打入计数板中，利用血球计数板对TILs进行计数。初始TILs细胞数，48h后TILs细胞数及细胞存活率如表1所示。
表1
| 方法1 | 方法2 | 方法3 | |
| 初始TILs细胞数 | 1.70×106个/mL | 1.70×106个/mL | 1.70×106个/mL |
| 48h后TILs细胞数 | 1.23×106个/mL | 1.61×106个/mL | 1.63×106个/mL |
| 细胞存活率 | 72.35％ | 94.71％ | 95.88％ |
由表1中的数据可知，方法2和方法3的TILs细胞存活率高于方法1。说明TILs扩增培养基2扩增后的TILs细胞对IL-2不具有依赖性，能够提高TILs在无IL-2环境的存活率，提高临床治疗注射进入患者后TILs的存活率和存活时间。
实施例7：体外增殖收获后TILs数量检测
利用血球计数板对扩增后的TILs进行密度计算，根据细胞密度及总体测出最终细胞总数，TILs扩增培养方法1获得的细胞扩增倍数约为230倍，方法2获得的细胞扩增倍数约为1200倍，方法3获得的细胞扩增倍数约为2000倍，如表2所示。
表2
| 方法1 | 方法2 | 方法3 | |
| 第0天TILs数 | 1.0×105个 | 1.0×105个 | 1.0×105个 |
| 扩增28天后TILs数 | 2.3×107个 | 12×107个 | 20×107个 |
| 细胞扩增倍数 | 230 | 1,200 | 2,000 |
由表2中的数据可知，方法3的细胞扩增倍数优于方法2，优于方法1。说明TILs扩增培养基2对TILs的扩增效果优于TILs扩增培养基1，并且方法3中加入的TILs诱导培养基能够进一步增加TILs的扩增倍数。
实施例8：流式细胞仪检测TILs细胞纯度：
取5mL培养至21天的TILs，以300×g离心3min，去除上清，PBS洗一遍，而后用PBS将TILs细胞密度调整为2×106个/mL，得到细胞悬液；分别取500μL细胞悬液加入到2个流式细胞上样管中，管1为实验管，其中分别加入5μL CD3和CD8抗体，管2为实验管，其中分别加入5μL CD3、CD8和FoxP3抗体，管3为同型对照管，其中分别加入同型对照抗体；室温避光孵育20min后，300×g离心3min，去除上清，再分别加入500μL PBS洗涤后，350×g离心2min，去除上清，最后分别用500μL PBS重悬上机检测，结果如表3所示。
表3
由表3中的数据可知，与方法2和方法1相比，方法3培养的细胞中效应T细胞比例增加、免疫抑制性调节T细胞(Treg)减少，提高CD8/Treg比率能够促进TILs对肿瘤细胞的杀伤作用。说明方法3扩增的TILs细胞具有更好的抗肿瘤作用。
实施例9：体外增殖收获后TILs对肿瘤细胞杀伤率情况检测
将扩增获得的TILs与自体肿瘤细胞共培养48小时，肿瘤细胞和TILs的体积比分别为1：5、1：10、1：20和1：30，CCK-8检测TILs对肿瘤细胞杀伤情况。结果如图1所示，表示方法1，/>表示方法2，/>表示方法3。方法1、方法2和方法3的1：30组中最高的细胞杀伤率分别可达约55％、61％和84％。方法3获得的细胞杀伤率达80％以上，方法3获得的细胞肿瘤杀伤率显著高于方法1和方法2，并且方法3与方法1和方法2相比具有显著性差异，但方法2与方法1无显著差异。
综上所述，方法3的TILs培养基方法可以改善传统培养方案中高浓度IL-2对TILs的免疫抑制作用，显著增加肿瘤杀伤作用，并且将TILs扩增倍数进一步提高至约2000倍。
Claims (7)
1.一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤一：取淋巴细胞浸润的肿瘤组织，进行肿瘤细胞的分离和消化；
步骤二：将消化的肿瘤细胞接种于12孔板，用TILs初始培养基培养过夜，收集培养基中悬浮细胞，以速度1000～1400×g离心5～10min后收集肿瘤浸润性淋巴细胞TILs；
步骤三：TILs扩增培养
将步骤二获得的TILs用TILs扩增培养基培养10～14天，每1～2天更换培养基；而后再利用TILs诱导培养基培养TILs 7天，每1～2天更换培养基，最终收获TILs；
其中所述TILs扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μg/mL硫酸链霉素、10μg/mL硫酸庆大霉素、15mmol/L HEPES、1000μg/mL IL-6、25～50μg/ml牛垂体提取物、0.2～0.4μg/mL层粘蛋白、0.1～0.2μg/mL透明质酸、50～100ng/mL EGF、20～40ng/mL FGF-2、2～5ng/mLTGF-β1和25～55μg/mL PDGF；
所述TILs诱导培养基配方是在TILs扩增培养基中加入体积分数为1％的肿瘤抗原溶液。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于步骤一中肿瘤细胞的分离和消化方法具体为：
A、将淋巴细胞浸润的肿瘤组织用质量百分比浓度75％的乙醇浸泡，并用PBS冲洗肿瘤组织3～5次，剪去血块、结缔组织和坏死组织，用PBS冲洗3～5次；
B、将该肿瘤组织剪为0.5～1mm3小碎块，加入消化液，37℃震荡消化6～12h；
C、消化完成后用100μm网筛过滤，向滤液中加入2倍体积的RPMI1640培养基，以速度600×g离心5～10min后收集中层培养基，再次以速度1000×g离心5～10min，收集下层细胞，即获得消化的肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于所述消化液配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入50～100μg/mL I型胶原酶，100～200μg/mL II型胶原酶，200～400μg/mL IV型胶原酶，100μg/mL透明质酸酶和10μg/mL DNA酶。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于步骤二中所述TILs初始培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL IFN-γ、2000IU/mL IL-2和20ng/mLTNF-α。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于步骤三中所述肿瘤抗原溶液的制备方法为：
步骤1、收集步骤二用TILs初始培养基培养过夜后的贴壁细胞，利用肿瘤扩增培养基进行培养，每3天进行一次换液，待细胞密度长至80％进行传代；
步骤2、取1×107～2×107个肿瘤细胞重悬于2～4mL无菌去离子水中，4℃放置30min，然后以速度4000×g离心5min，收集沉淀，即获得肿瘤细胞膜；向肿瘤细胞膜中加入2～4mLTILs扩增培养基重悬，0～4℃超声波破碎，得到肿瘤抗原溶液。
6.根据权利要求5所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于步骤1中所述肿瘤扩增培养基配方为：以RPMI1640培养基作为基础培养基，加入体积分数10％的人AB血清、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
7.根据权利要求5所述的一种肿瘤浸润性淋巴细胞的培养方法，其特征在于步骤2中超声破碎参数为：超声0.2秒，停止2秒，2-3个周期。
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